Адаптерний протеїн Ruk/CIN85 модулює прояв ознак ракових стовбурових клітин (CSCs) у клітинах аденокарциноми молочної залози миші лінії 4Т1
На моделі клітин аденокарциноми молочної залози миші лінії 4Т1 зі стабільною надекспресією та пригніченою експресією адаптерного протеїну Ruk/CIN85 оцінено його внесок до ступеня прояву основних ознак ракових стовбурових клітин (CSCs). Встановлено, що рівень експресії факторів репрограмування Klf4...
Gespeichert in:
| Datum: | 2018 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , , , , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Ukrainian |
| Veröffentlicht: |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
2018
|
| Schriftenreihe: | Доповіді НАН України |
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/145828 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Адаптерний протеїн Ruk/CIN85 модулює прояв ознак ракових стовбурових клітин (CSCs) у клітинах аденокарциноми молочної залози миші лінії 4Т1 / І.Р. Горак, Г.В. Пасічник, Д.С. Геращенко, Л. Кнопфова, Л. Борсіг, Л.Б. Дробот // Доповіді Національної академії наук України. — 2018. — № 12. — С. 101-109. — Бібліогр.: 14 назв. — укр. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-145828 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1458282025-02-10T01:46:06Z Адаптерний протеїн Ruk/CIN85 модулює прояв ознак ракових стовбурових клітин (CSCs) у клітинах аденокарциноми молочної залози миші лінії 4Т1 Адаптерный белок Ruk/CIN85 модулирует проявление признаков раковых стволовых клеток (CSCs) в клетках аденокарциномы молочной железы мыши линии 4Т1 Adaptor protein Ruk/CIN85 modulates manifestation of cancer stem cells (CSCs) features in mouse breast adenocarcinoma 4T1 cells Горак, І.Р. Пасічник, Г.В. Геращенко, Д.С. Кнопфова, Л. Борсіг, Л. Дробот, Л.Б. Біохімія На моделі клітин аденокарциноми молочної залози миші лінії 4Т1 зі стабільною надекспресією та пригніченою експресією адаптерного протеїну Ruk/CIN85 оцінено його внесок до ступеня прояву основних ознак ракових стовбурових клітин (CSCs). Встановлено, що рівень експресії факторів репрограмування Klf4, Pou5f1/Oct4 та Nanog, а також поверхневих маркерів CSCs молочної залози Cd44 і Cd24 залежали від рівня експресії Ruk/CIN85: підвищувалися у разі up-регулювання й знижувалися у випадку down-регулювання цього адаптерного протеїну. Показано, що особливості змін транскриптому в субклонах 4Т1 з різним рівнем експресії Ruk/CIN85 корелювали з їх здатністю до формування мамосфер. На модели клеток аденокарциномы молочной железы мыши линии 4Т1 со стабильной сверхэкспрессией и подавленной экспрессией адаптерного белка Ruk/CIN85 проведена оценка его вклада в степень проявления основных признаков раковых стволовых клеток (CSCs). Установлено, что уровень экспрессии факторов репрограммирования Klf4, Pou5f1/Oct4 и Nanog, а также поверхностных маркеров CSCs молочной железы Cd44 и Cd24 зависели от уровня экспрессии Ruk/CIN85: повышались при up-регулировании и снижались при down-регулировании адаптерного белка. Показано, что особенности изменений транскриптома в субклонах 4Т1 с различным уровнем экспрессии Ruk/CIN85 коррелировали с их способностью к формированию маммосфер. Using mouse breast adenocarcinoma 4T1 cells with stable overexpression or knockdown of adaptor protein Ruk/ CIN85, its contribution to the manifestation of cancer stem cells features was estimated. It was demonstrated that the expression levels of reprogramming factors Klf4, Pou5f1/Oct4 and Nanog, as well as CSCs surface markers Cd44 and Cd24, depended on Ruk/CIN85 expression level: increased in the case of up-regulation and decreased in the case of down-regulation. It was found that the transcriptome patterns in 4T1 subclones with different expression levels of Ruk/CIN85 correlated with their ability to form mammospheres. Публікація містить результати досліджень, проведених при грантовій підтримці Державного фонду фундаментальних досліджень за конкурсним проектом Ф83, Національної наукової фундації Швейцарії в рамках наукової кооперації між Східною Європою та Швейцарією SCOPES, № IZ73ZO, та Українського науково-технологічного центру. 2018 Article Адаптерний протеїн Ruk/CIN85 модулює прояв ознак ракових стовбурових клітин (CSCs) у клітинах аденокарциноми молочної залози миші лінії 4Т1 / І.Р. Горак, Г.В. Пасічник, Д.С. Геращенко, Л. Кнопфова, Л. Борсіг, Л.Б. Дробот // Доповіді Національної академії наук України. — 2018. — № 12. — С. 101-109. — Бібліогр.: 14 назв. — укр. 1025-6415 DOI: doi.org/10.15407/dopovidi2018.12.101 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/145828 577.112+577.218+616-006.66 uk Доповіді НАН України application/pdf Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Ukrainian |
| topic |
Біохімія Біохімія |
| spellingShingle |
Біохімія Біохімія Горак, І.Р. Пасічник, Г.В. Геращенко, Д.С. Кнопфова, Л. Борсіг, Л. Дробот, Л.Б. Адаптерний протеїн Ruk/CIN85 модулює прояв ознак ракових стовбурових клітин (CSCs) у клітинах аденокарциноми молочної залози миші лінії 4Т1 Доповіді НАН України |
| description |
На моделі клітин аденокарциноми молочної залози миші лінії 4Т1 зі стабільною надекспресією та пригніченою
експресією адаптерного протеїну Ruk/CIN85 оцінено його внесок до ступеня прояву основних ознак ракових
стовбурових клітин (CSCs). Встановлено, що рівень експресії факторів репрограмування Klf4, Pou5f1/Oct4
та Nanog, а також поверхневих маркерів CSCs молочної залози Cd44 і Cd24 залежали від рівня експресії
Ruk/CIN85: підвищувалися у разі up-регулювання й знижувалися у випадку down-регулювання цього адаптерного протеїну. Показано, що особливості змін транскриптому в субклонах 4Т1 з різним рівнем експресії
Ruk/CIN85 корелювали з їх здатністю до формування мамосфер. |
| format |
Article |
| author |
Горак, І.Р. Пасічник, Г.В. Геращенко, Д.С. Кнопфова, Л. Борсіг, Л. Дробот, Л.Б. |
| author_facet |
Горак, І.Р. Пасічник, Г.В. Геращенко, Д.С. Кнопфова, Л. Борсіг, Л. Дробот, Л.Б. |
| author_sort |
Горак, І.Р. |
| title |
Адаптерний протеїн Ruk/CIN85 модулює прояв ознак ракових стовбурових клітин (CSCs) у клітинах аденокарциноми молочної залози миші лінії 4Т1 |
| title_short |
Адаптерний протеїн Ruk/CIN85 модулює прояв ознак ракових стовбурових клітин (CSCs) у клітинах аденокарциноми молочної залози миші лінії 4Т1 |
| title_full |
Адаптерний протеїн Ruk/CIN85 модулює прояв ознак ракових стовбурових клітин (CSCs) у клітинах аденокарциноми молочної залози миші лінії 4Т1 |
| title_fullStr |
Адаптерний протеїн Ruk/CIN85 модулює прояв ознак ракових стовбурових клітин (CSCs) у клітинах аденокарциноми молочної залози миші лінії 4Т1 |
| title_full_unstemmed |
Адаптерний протеїн Ruk/CIN85 модулює прояв ознак ракових стовбурових клітин (CSCs) у клітинах аденокарциноми молочної залози миші лінії 4Т1 |
| title_sort |
адаптерний протеїн ruk/cin85 модулює прояв ознак ракових стовбурових клітин (cscs) у клітинах аденокарциноми молочної залози миші лінії 4т1 |
| publisher |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| publishDate |
2018 |
| topic_facet |
Біохімія |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/145828 |
| citation_txt |
Адаптерний протеїн Ruk/CIN85 модулює прояв ознак ракових стовбурових клітин (CSCs) у клітинах аденокарциноми молочної залози миші лінії 4Т1 / І.Р. Горак, Г.В. Пасічник, Д.С. Геращенко, Л. Кнопфова, Л. Борсіг, Л.Б. Дробот // Доповіді Національної академії наук України. — 2018. — № 12. — С. 101-109. — Бібліогр.: 14 назв. — укр. |
| series |
Доповіді НАН України |
| work_keys_str_mv |
AT gorakír adapterniiproteínrukcin85modulûêproâvoznakrakovihstovburovihklítincscsuklítinahadenokarcinomimoločnoízalozimišílíníí4t1 AT pasíčnikgv adapterniiproteínrukcin85modulûêproâvoznakrakovihstovburovihklítincscsuklítinahadenokarcinomimoločnoízalozimišílíníí4t1 AT geraŝenkods adapterniiproteínrukcin85modulûêproâvoznakrakovihstovburovihklítincscsuklítinahadenokarcinomimoločnoízalozimišílíníí4t1 AT knopfoval adapterniiproteínrukcin85modulûêproâvoznakrakovihstovburovihklítincscsuklítinahadenokarcinomimoločnoízalozimišílíníí4t1 AT borsígl adapterniiproteínrukcin85modulûêproâvoznakrakovihstovburovihklítincscsuklítinahadenokarcinomimoločnoízalozimišílíníí4t1 AT drobotlb adapterniiproteínrukcin85modulûêproâvoznakrakovihstovburovihklítincscsuklítinahadenokarcinomimoločnoízalozimišílíníí4t1 AT gorakír adapternyibelokrukcin85moduliruetproâvleniepriznakovrakovyhstvolovyhkletokcscsvkletkahadenokarcinomymoločnoiželezymyšilinii4t1 AT pasíčnikgv adapternyibelokrukcin85moduliruetproâvleniepriznakovrakovyhstvolovyhkletokcscsvkletkahadenokarcinomymoločnoiželezymyšilinii4t1 AT geraŝenkods adapternyibelokrukcin85moduliruetproâvleniepriznakovrakovyhstvolovyhkletokcscsvkletkahadenokarcinomymoločnoiželezymyšilinii4t1 AT knopfoval adapternyibelokrukcin85moduliruetproâvleniepriznakovrakovyhstvolovyhkletokcscsvkletkahadenokarcinomymoločnoiželezymyšilinii4t1 AT borsígl adapternyibelokrukcin85moduliruetproâvleniepriznakovrakovyhstvolovyhkletokcscsvkletkahadenokarcinomymoločnoiželezymyšilinii4t1 AT drobotlb adapternyibelokrukcin85moduliruetproâvleniepriznakovrakovyhstvolovyhkletokcscsvkletkahadenokarcinomymoločnoiželezymyšilinii4t1 AT gorakír adaptorproteinrukcin85modulatesmanifestationofcancerstemcellscscsfeaturesinmousebreastadenocarcinoma4t1cells AT pasíčnikgv adaptorproteinrukcin85modulatesmanifestationofcancerstemcellscscsfeaturesinmousebreastadenocarcinoma4t1cells AT geraŝenkods adaptorproteinrukcin85modulatesmanifestationofcancerstemcellscscsfeaturesinmousebreastadenocarcinoma4t1cells AT knopfoval adaptorproteinrukcin85modulatesmanifestationofcancerstemcellscscsfeaturesinmousebreastadenocarcinoma4t1cells AT borsígl adaptorproteinrukcin85modulatesmanifestationofcancerstemcellscscsfeaturesinmousebreastadenocarcinoma4t1cells AT drobotlb adaptorproteinrukcin85modulatesmanifestationofcancerstemcellscscsfeaturesinmousebreastadenocarcinoma4t1cells |
| first_indexed |
2025-12-02T13:43:44Z |
| last_indexed |
2025-12-02T13:43:44Z |
| _version_ |
1850404267399053312 |
| fulltext |
101ISSN 1025-6415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2018. № 12
ОПОВІДІ
НАЦІОНАЛЬНОЇ
АКАДЕМІЇ НАУК
УКРАЇНИ
БІОХІМІЯ
Лікування злоякісних новоутворень людини включає комбінацію хірургічних, хіміоте-
рапевтичних, імунологічних та радіотерапевтичних підходів, особливості застосування
яких визначаються типом пухлин, стадією пухлинного процесу та прогностичними мар-
керами. Однак у багатьох випадках, незважаючи на зменшення розміру пухлини, її хірур-
гічне видалення (у випадку солідних пухлин) і подовження життя пацієнтів, мають місце
як локальні повторні рецидиви, так і дистантні метастази.
Згідно із сучасними уявленнями про біологію пухлинного росту, пухлина є гетеро-
генною ієрархічною системою, до складу якої входять клітини різних субпопуляцій, що від-
різняються за своїми біологічними властивостями. Однією з таких субпопуляцій є ра-
кові стовбурові клітини (cancer stem cells (CSCs); інша назва — клітини, що ініціюють роз-
виток пухлини, англ. tumor іnitiating сells (TICs)) — невелика субпопуляція пухлинних
клітин, здатних до самовідтворення. Крім цього, CSCs мають високий туморогенний і
© І.Р. Горак, Г.В. Пасічник, Д.С. Геращенко, Л. Кнопфова, Л. Борсіг, Л.Б. Дробот, 2018
doi: https://doi.org/10.15407/dopovidi2018.12.101
УДК 577.112+577.218+616-006.66
І.Р. Горак 1, Г.В. Пасічник 1, Д.С. Геращенко 1,
Л. Кнопфова 2, Л. Борсіг 3, Л.Б. Дробот 1
1 Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ
2 Університет Масарика, Брно, Чехія
3 Цюріхський університет, Швейцарія
E-mail: iryna.horak@gmail.com
Адаптерний протеїн Ruk/CIN85 модулює прояв
ознак ракових стовбурових клітин (CSCs) у клітинах
аденокарциноми молочної залози миші лінії 4Т1
Представлено академіком НАН України С.О. Костеріним
На моделі клітин аденокарциноми молочної залози миші лінії 4Т1 зі стабільною надекспресією та пригніченою
експресією адаптерного протеїну Ruk/CIN85 оцінено його внесок до ступеня прояву основних ознак ракових
стовбурових клітин (CSCs). Встановлено, що рівень експресії факторів репрограмування Klf4, Pou5f1/Oct4
та Nanog, а також поверхневих маркерів CSCs молочної залози Cd44 і Cd24 залежали від рівня експресії
Ruk/CIN85: підвищувалися у разі up-регулювання й знижувалися у випадку down-регулювання цього адап-
терного протеїну. Показано, що особливості змін транскриптому в субклонах 4Т1 з різним рівнем експресії
Ruk/CIN85 корелювали з їх здатністю до формування мамосфер.
Ключові слова: ракові стовбурові клітини, репрограмування, сфероїди, адаптерний протеїн Ruk/CIN85,
аденокарцинома молочної залози.
102 ISSN 1025-6415. Dopov. Nac. akad. nauk Ukr. 2018. № 12
І.Р. Горак, Г.В. Пасічник, Д.С. Геращенко, Л. Кнопфова, Л. Борсіг, Л.Б. Дробот
ме тастатичний потенціал, а також дають початок клітинам-нащадкам з різним ступенем
диферен ціювання. Для CSCs характерні такі властивості: експресія специфічних поверх-
невих маркерів (CD44, CD24, CD34, CD38, CD133 тощо), резистентність до радіо- та хі-
міотерапії, здатність формувати тривимірні структури (сфероїди) у неприкріпленому стані
за умов клонального пропагування в безсироватковому детермінованому середовищі in
vitro, а також активація низки сигнальних шляхів, таких як Notch, Wnt, Hedgehog,
PI3K/Akt, NF-kB, JAK/STAT [1]. Відомо, що прояв ознак CSCs тісно пов’язаний з явищем
епітеліально-мезенхімального переходу (ЕМТ), який є визначальним фактором для по-
силення інвазії та метастазування пухлинної клітини. Так, індукція ЕМТ як у нормальних
імморталізованих, так і в злоякісно трансформованих клітинах спричиняє зростання роз-
мірів популяції CSCs та резистентність таких клітин до цитостатиків [2]. У зв’язку з під-
вищеною стійкістю ракових стовбурових клітин до дії протипухлинних препаратів існує
нагальна потреба в з’ясуванні молекулярних механізмів, що забезпечують функціонування
CSCs, та створенні новітніх протипухлинних препаратів, скерованих на знищення CSCs.
Визначальними факторами, що зумовлюють виникнення і подальше функціонуван-
ня CSCs, є генетично і епігенетично детерміновані порушення в регулюванні сигнальних
мереж, залучених до контролю їх виживання і самовідтворення. Одними з основних ре-
гуляторних компонентів сигнальних мереж клітин є адаптерні (риштувальні) протеїни.
Таким протеїном, зокрема, є Ruk/CIN85 (Ruk — Regulator for ubiquitous kinase, CIN85 —
Cbl-interacting protein of 85K), повнорозмірна форма якого містить три SH3 домени (за-
безпечують взаємодію з пролінвмісними послідовностями інших протеїнів), збагачені на
пролін райони (взаємодіють з SH3 доменами інших протеїнів), та надспіралізований до-
мен, що бере участь у гомо- та гетеродимеризації. Завдяки взаємодії з численними зв’я зу-
вальними партнерами Ruk/CIN85 залучений до низки клітинних процесів, у тому числі ен-
доцитозу активованих рецепторних тирозинкіназ, регулювання актинового цитоскелета,
формування адгезивних контактів, інвазії та контролю апоптозу [3]. Результати поперед-
ніх експериментальних досліджень свідчать про значне підвищення експресії адаптерного
протеїну Ruk/CIN85 в пухлинах різного походження, в тому числі карциномах молочної
залози, товстої кишки, меланомах, у порівнянні з оточуючими умовно нормальними ткани-
нами, причому найвищий вміст Ruk/CIN85 спостерігається саме в зонах інвазивного росту
[4—6]. Беручи до уваги сказане, за мету дослідження ставилося оцінити вплив адаптерного
протеїну Ruk/CIN85 на прояв деяких ключових ознак CSCs молочної залози.
Матеріали і методи. Культура клітин. Сублінії клітин аденокарциноми молочної за-
лози миші лінії 4Т1 з різним рівнем експресії адаптерного протеїну Ruk/CIN85 культивува-
ли в середовищі RPMI 1640 з додаванням 10 % ембріональної телячої сироватки, 50 од./мл
пеніциліну, 100 мкг/мл стрептоміцину та 2 мМ L-глутаміну, при температурі 37 °С і 5 % CO2
у зволоженій атмосфері. Клітини пасажували у співвідношенні 1 : 4—1 : 6 кожні 2—3 доби
при досягненні 70—80 % конфлюенту.
Одержання субліній клітин лінії 4Т1 зі стабільною надекспресією та пригніченою експре-
сією адаптерного протеїну Ruk/CIN85. Сублінію клітин 4Т1 з надекспресією Ruk/CIN85
(RukUp) одержували шляхом кальцій-фосфатної трансфекції клітин дикого типу плазмі-
дою pRc/CMV2-Rukl, яка кодує повнорозмірну форму Ruk/CIN85, з подальшою селекцією
за наявності 1 мг/мл генетицину (G418). Для пригнічення експресії Ruk/CIN85 (сублінія
103ISSN 1025-6415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2018. № 12
Адаптерний протеїн Ruk/CIN85 модулює прояв ознак ракових стовбурових клітин (CSCs) у клітинах...
RukDown) клітини 4T1 інфікували лентивірусом, що кодує Ruk/CIN85-специфічну shRNA
у складі конструкції pLKO.1-shRuk/CIN85. Селекцію стабільно інфікованих клітин про-
водили за наявності 10 мкг/мл пуроміцину з подальшим субклонуванням. Щоб отрима-
ти відповідні контролі, клітини дикого типу були трансфіковані/інфіковані плазмідою без
вставки (сублінія Mock) або лентивірусом, що кодує shRNA, не специфічну до жодної по-
слідовності геному ссавців (сублінія Scr).
Ізолювання тотальної РНК та синтез кДНК. Тотальну РНК ізолювали з 1 · 106 клі-
тин колоночним методом, використовуючи комерційний набір innuPREP RNA mini Kit
(Analytical Jena AG, Німеччина), відповідно до рекомендацій виробника. Якість отриманої
РНК оцінювали за ступенем деградації смуг рибосомних РНК після електрофоретичного
розділення в агарозному гелі, а також за співвідношенням поглинання при 260/230 нм і
260/280 нм. кДНК синтезували із 1—2 мкг РНК з використанням Oligo-dT праймера, ко-
ристуючись комерційним набором RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit
(Thermo Scientific, США) відповідно до рекомендацій виробника.
Полімеразна ланцюгова реакція в реальному часі (qRT-PCR). Для qRT-PCR викорис-
товували комерційний набір Luminaris Color HiGreen High ROX qPCR Master Mix (Thermo
Scientific, США). Підбір праймерів здійснювали за допомогою програми Oligo 7, послі-
довності праймерів наведені в таблиці. Як референтний ген використовували Gapdh, від-
носний рівень експресії оцінювали методом ΔΔCt. Для оцінки специфічності ампліфікації
використовували криві плавлення.
Тест на сфероїдоутворення. Клітини висівали у 24-лунковий планшет (103 клітин/лун-
ку) з низькоадгезивною поверхнею (Corning, США) у детерміноване середовище такого
складу: середовище DMEM без індикатора та середовище F-12 у співвідношенні 1 : 1, з до-
даванням інсуліну (5 мкг/мл), гідрокортизону (0,5 мкг/мл), епідермального фактора росту
(20 нг/мл), фактора росту фібробластів (20 нг/мл), гепарину (0,5 од/мл), добавки для куль-
тури клітин В27, бичачого сироваткового альбуміну (1 %), пеніциліну (100 од/мл), стреп-
томіцину (100 мкг/мл). Після 7 діб культивування кількість первинних мамосфер підра-
ховували за допомогою інвертованого мікроскопа та збирали їх шляхом центрифугування
при 1000 об/хв. Ефективність сфероїдоутворення визначали як відсоток загальної кіль-
кості сфероїдів до загальної кількості живих клітин, висіяних на лунку планшета. Для оцін-
Послідовності праймерів для кількісної ПЛР
Ген Прямий праймер Зворотний праймер
Cd24 GCGAGCTTAGCAGATCTCCAC CGGTGCAACAGATGTTTGGT
Cd44 AGAGCACCCCAGAAAGCTAC GTAGTTGCACTCGTTGTGGG
Gapdh CATCGACGCACCATCCAACC TGGAAGGGTAACCAGTTGGGG
Klf4 AACATGCCCGGACTTACAAA TTCAAGGGAATCCTGGTCTTC
Myc TAACTCGAGGAGGAGCTGGA GCCAAGGTTGTGAGGTTAGG
Nanog TTGCTTACAAGGGTCTGCTACT ACTGGTAGAAGAATCAGGGCT
Pou5f1 TAGGTGAGCCGTCTTTCCAC GCTTAGCCAGGTTCGAGGAT
Sh3kbp1 CGCCAACTTTCACGCTGCTT TGACCTCACCCACGCTGATT
Sox2 CAGGAGAACCCCAAGATGCACAA AATCCGGGTGCTCCTTCATGTG
104 ISSN 1025-6415. Dopov. Nac. akad. nauk Ukr. 2018. № 12
І.Р. Горак, Г.В. Пасічник, Д.С. Геращенко, Л. Кнопфова, Л. Борсіг, Л.Б. Дробот
ки здатності ракових стовбурових клітин до трива-
лого самовідтворення in vitro проводили серійне
пасажування за таких самих умов протягом ще
трьох пасажів.
Статистичну обробку результатів проводи-
ли за допомогою програмного забезпечення Sta-
tistica (StatSoft, http://www.statsoft.com/Products/
STATISTICA-Features). Усі резуль тати наведено у
вигляді середнього значення та стандартної похиб-
ки щонайменше трьох не залежних дослідів. Попар-
ні порівняння здійснювали за допомогою двовибіркового t-тесту Стьюдента для незалеж-
них вибірок з нерівними дисперсіями. Різницю між групами вва жали статистично досто-
вірною при р < 0,05.
Результати та обговорення. Для дослідження внеску адаптерного протеїну Ruk/CIN85
до прояву ознак ракових стовбурових клітин було обрано клітинну лінію 4Т1 (АТСС
CRL-2539). Клітини лінії 4Т1 є високоінвазивними клітинами аденокарциноми молочної
залози миші, які відповідають тваринній моделі раку молочної залози людини на IV стадії.
Методом qRT-PCR встановлено, що рівень експресії повнорозмірної форми Ruk/CIN85
у клітинах 4Т1 з up-регулюванням адаптерного протеїну (сублінія RukUp) був утричі ви-
щим, ніж у контрольній сублінії Mock, тоді як у клітинах з down-регулюванням (сублі-
нія RukDown) — у 3,5 раза нижчим, ніж у контроль ній сублінії Scr (рис. 1).
Одним із ймовірних шляхів походження ра кових стовбурових клітин є дедиференцію-
вання та репрограмування клітин-попередників. Рівень експресії генів, пов’язаних із репро-
грамуванням, зокрема транскрипційних факторів (ТФ) Klf4, Pou5f1/Oct4, Sox2, Myc, а та-
кож Nanog, оці нювали за допомогою qRT-PCR. Показано, що в результаті надекспресії Ruk/
CIN85 у клітинах лінії 4Т1 дос товірно зростає рівень експресії ТФ Klf4 і Nanog, а у разі при-
гнічення експресії Ruk/CIN85 достовірно знижується рівень експресії ТФ Pou5f1/Oct4
(рис. 2, а). Транскрипційні фак тори KLF4, Myc, Oct4 i Sox2, «Фактори Яманаки», були
вперше ви користані Сінья Яма накою для одержання індукованих плюрипотентних стовбу-
рових клітин із дорослих фіб робластів миші [7]. Показано, що KLF4 необхідний для під-
тримання популяції CSCs, міграції та інвазії клітин раку молочної залози людини ліній
MCF-7 та MDA-MB231 [8]. Також на моделі клітин раку молочної залози миші лінії 4Т1
показано, що клітини 4Т1 з високим рівнем експресії Oct4 характеризуються експресією
специфічних маркерів CSCs, здатністю до формування мамосфер та значним туморогенним
потенціалом in vivo, і навпаки [9]. ТФ Nanog контролює підтримання плюрипотентного ста-
ну клітин та їх здатність до самовід творення, а високий рівень експресії цього ТФ стимулює
ріст пухлин та метастазування клітин раку молочної залози [10]. Отримані результати свід-
чать про те, що клітини 4Т1 з надекспресією Ruk/CIN85 перебувають у дедифереційовано-
му стані і, ймовірно, матимуть підвищений метастатичний потенціал in vivo.
Рис. 1. Рівень експресії адаптерного протеїну Ruk/CIN85 в
одержаних сублініях клітин 4Т1. * — p < 0,05 порівняно з
відповідним контролем (RukUp порівнювали з контроль-
ною сублінією Mock, RukDown — із сублінією Scr)
105ISSN 1025-6415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2018. № 12
Адаптерний протеїн Ruk/CIN85 модулює прояв ознак ракових стовбурових клітин (CSCs) у клітинах...
Для CSCs властива наявність специфічних поверхневих маркерів. Зокрема, CSCs мо-
лочної залози мають фенотип CD44+/CD24–/low. CD44 — це поверхневий глікопротеїн,
рецептор гіалуронової кислоти, залучений до диференціювання, міграції, ангіогенезу, ре-
гулювання проліферації та виживаності. Сигналювання, що залежить від поверхневого
глікопротеїну CD24, контролює процеси проліферації, диференціювання та апоптозу. Ви-
сокий коефіцієнт відношення CD44/CD24 вважається надійною характеристикою CSCs
раку молочної залози і є індикатором їх високого туморогенного потенціалу [11]. За резуль-
татами qRT-PCR нами встановлено, що рівень експресії Cd44 достовірно зростає в клітинах
сублінії RukUp і знижується у клітинах сублінії RukDown. Для гена Cd24 виявлено зво-
ротну залежність із рівнем експресії Ruk/CIN85 (див. рис. 2, б). Результати проведених до-
сліджень дають підставу зробити висновок, що у разі надекспресії адаптерного протеїну
Ruk/CIN85 у клітинах 4Т1 зростає розмір субпопуляції клітин CD44+/CD24–/low, які проявля-
ють ознаки CSCs, тоді як пригнічення експресії Ruk/CIN85 супроводжується зниженням
кількості таких клітин. Поряд із співвідношенням експресії CD44/CD24 для характерис-
тики CSCs раку молочної залози використовують такий показник, як рівень активності ен-
зиму детоксикації альдегіддегідрогенази (ALDH), яку пов’язують із міграцією та метаста-
зуванням пухлинних клітин. У попередніх дослідженнях на моделі аденокарциноми молоч-
ної залози людини лінії MCF-7 нами було виявлено, що активність ALDH зростає у разі
надекспресії Ruk/CIN85 [12], що свідчить про залучення адаптерного протеїну до регу-
лювання експресії й активності основних маркерів ракових стовбурових клітин.
Однією з ключових властивостей CSCs є їх здатність до самовідтворення та стійкість
до аноїкісу, що є передумовою підвищеної туморогенності. Тому на наступному етапі дос-
ліджено здатність субліній клітин 4Т1 з різним рівнем експресії Ruk/CIN85 до формуван-
ня сфероїдів (мамосфер) у разі культивування на низькоадгезивному пластику за детер-
мінованих умов. Виявлено, що клітини усіх досліджуваних субліній мають здатність ут-
Рис. 2. Рівень експресії генів, залучених до репрограмування (а), та поверхневих маркерів CSCs (б) у суб-
лініях клітин 4Т1 з різним рівнем експресії адаптерного протеїну Ruk/CIN85. * — p < 0,05 порівняно з
відповідним контролем
106 ISSN 1025-6415. Dopov. Nac. akad. nauk Ukr. 2018. № 12
І.Р. Горак, Г.В. Пасічник, Д.С. Геращенко, Л. Кнопфова, Л. Борсіг, Л.Б. Дробот
ворювати мамосфери, проте їх кількість та морфологія змінюється залежно від рівня
експресії адаптерного протеїну Ruk/CIN85. Контрольні клітини Mock та Scr, як і клітини
сублінії RukDown, формують компактні, зі щільними міжклітинними контактами сфе-
роїди правильної форми, тоді як сфероїди, утворені клітинами сублінії RukUp, мають не-
правильну форму і нерівні краї, що корелює зі зниженням міжклітинної адгезії і підви-
щенням міграційного потенціалу (рис. 3, а). Також встановлено, що клітини з надекспре-
сією Ruk/CIN85 формують достовірно більшу кількість сфероїдів порівняно з відповід ним
контролем, тоді як пригнічення експресії Ruk/CIN85 у клітинах лінії 4Т1 супроводжуєть-
ся зниженням їх здатності формувати сфероїди. У результаті серійного пасажування ви-
явлено, що на кожному з наступних трьох пасажів клітини з надекспресією Ruk/CIN85
формують достовірно більшу кількість сфероїдів, ніж відповідні контрольні клітини (див.
рис. 3, б), причому морфологія сфероїдів зберігається. З даних літератури відомо, що клі-
тини раку молочної залози людини, здатні до формування сфероїдів, характеризуються та-
кож й іншими ознаками CSCs, такими як експресія поверхневих маркерів CD44+/CD24–/low,
індукція генів, залучених до репрограмування і підтримання дедиференційованого стану,
резистентність до дії хіміотерапевтичних препаратів [13]. У попередніх дослідженнях на-
ми показано, що надекспресія Ruk/CIN85 у клітинах 4Т1 зумовлює зростання їх резис-
тентності до дії доксорубіцину [14], тоді як клітини MCF-7 з надекспресією адаптерного
протеїну характеризуються підвищенням резистентності до етопозиду та цисплатину, що
корелює з активацією мембранних ABC транспортерів, ALDH [12], а також зі зниженням
їх проліферативного потенціалу [5].
Рис. 3. Вплив зміни рівня експресії адап-
терного протеїну Ruk/CIN85 на здатність
до формування мамосфер клітинами лі-
нії 4Т1. а — зображення первинних сфе-
роїдів (мамосфер), утворених клітинами
досліджуваних субліній, збільшення ×100.
б — кількість сфероїдів, утворених сублі-
ніями клітин 4Т1. * — p < 0,05 порівняно
з відповідним контролем
107ISSN 1025-6415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2018. № 12
Адаптерний протеїн Ruk/CIN85 модулює прояв ознак ракових стовбурових клітин (CSCs) у клітинах...
Таким чином, надекспресія адаптерного протеїну Ruk/CIN85 у клітинах аденокарци-
номи молочної залози миші лінії 4Т1 спричиняє посилення прояву ознак ракових стов бу-
рових клітин, а саме: індукції транскрипційних факторів, які підтримують недиференці-
йований стан стовбурових клітин, та поверхневих маркерів, характерних для CSCs мо лочної
залози, а також до зростання здатності формувати мамосфери. Водночас пригнічення екс-
пресії Ruk/CIN85 зумовлює як втрату молекулярних маркерів CSCs, так і пригнічення
сфероїдоутворення. Отримані результати свідчать про потенційну роль адаптерного про-
теїну Ruk/CIN85 у контролі прояву ознак ракових стовбурових клітин.
Публікація містить результати досліджень, проведених при грантовій підтримці Дер-
жавного фонду фундаментальних досліджень за конкурсним проектом Ф83, Національної
наукової фундації Швейцарії в рамках наукової кооперації між Східною Європою та Швей-
царією SCOPES, № IZ73ZO, та Українського науково-технологічного центру.
ЦИТОВАНА ЛІТЕРАТУРА
1. Cojoc M., Mäbert K., Muders M.H., Dubrovska A. A role for cancer stem cells in therapy resistance: cellular
and molecular mechanisms. Semin. Cancer Biol. 2015. 31. P. 16—27. doi: https://doi.org/10.1016/j.semcancer.
2014.06.004
2. Mani S.A., Guo W., Liao M.J., Eaton E.N., Ayyanan A., Zhou A.Y., Brooks M., Reinhard F., Zhang C.C.,
Shipitsin M. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 2008.
133. P. 704—715. doi: https://doi.org/10.1016/j.cell.2008.03.027
3. Havrylov S., Redowicz M.J., Buchman V. L. Emerging roles of Ruk/CIN85 in vesicle-mediated transport,
adhesion, migration and malignancy. Traffic. 2010. 11. P. 721—731. doi: https://doi.org/10.1111/ j.1600-
0854.2010.01061.x
4. Cascio S., Farkas A.M., Hughey R.P., Finn O.J. Altered glycosylation of MUC1 influences its association
with CIN85: the role of this novelcomplex in cancer cell invasion and migration. Oncotarget. 2013. 4, № 10.
P. 1686—1697. doi: https://doi.org/10.18632/oncotarget.1265
5. Samoylenko A., Vynnytska-Myronovska B., Byts N., Kozlova N., Basaraba O., Pasichnyk G., Palyvoda K.,
Bobak Y., Barska M., Mayevska O., Rzhepetsky Y., Shuvayeva H., Lyzogubov V., Usenko V., Savran V.,
Volodko N., Buchman V., Kietzmann T., Drobot L. Increased levels of the HER1 adaptor protein Rukl/CIN85
contribute to breast cancer malignancy. Carcinogenesis. 2012. 33. P. 1976—1984. doi: https://doi.org/10.1093/
carcin/bgs228
6. Cascio S., Finn O. J. Complex of MUC1, CIN85 and Cbl in colon cancer progression and metastasis. Can-
cers (Basel). 2015. 7, № 1. P. 342—352. doi: https://doi.org/10.3390/cancers7010342
7. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult
fibroblast cultures by defined factors. Cell. 2006. 126, № 4. P. 663—676. doi: https://doi.org/10.1016/j.
cell. 2006.07.024
8. Yu F., Li J., Chen H., Fu J., Ray S., Huang S. & Ai W. Kruppel-like factor 4 (KLF4) is required for maintenance
of breast cancer stem cells and for cell migration and invasion. Oncogene. 2011. 30, № 18. P. 2161—2172. doi:
https://doi.org/10.1038/onc.2010.591
9. Kim R.-J., Nam J.-S. OCT4 expression enhances features of cancer stem cells in a mouse model of breast
cancer. Lab. Anim. Res. 2011. 27, № 2. P. 147—152. doi: https://doi.org/10.5625/lar.2011.27.2.147
10. Lu X., Mazur S.J., Lin T., Appella E., Xu Y. The pluripotency factor Nanog promotes breast cancer tumori-
genesis and metastasis. Oncogene. 2014. 33, № 20. P. 2655—2664. doi: https://doi.org/10.1038/onc.2013.209
11. Li W., Ma H., Zhang J., Zhu L., Wang C., Yang Y. Unraveling the roles of CD44/CD24 and ALDH1 as can cer
stem cell markers in tumorigenesis and metastasis. Sci. Rep. 2017. 7. 13856. doi: https://doi.org/10.1038/
s41598-017-14364-2
12. Пасiчник Г.В., Поворознюк О.О., Горак I.Р., Геращенко Д.С., Пономаренко О.В., Самойленко А.А.,
Биць Н.В., Дробот Л.Б. Надекспресiя адаптерного протеїну Ruk/CIN85 в аденокарциномних клiтинах
108 ISSN 1025-6415. Dopov. Nac. akad. nauk Ukr. 2018. № 12
І.Р. Горак, Г.В. Пасічник, Д.С. Геращенко, Л. Кнопфова, Л. Борсіг, Л.Б. Дробот
молочної залози людини лiнiї MCF-7 супроводжується підвищенням їх хiмiорезистентностi. Допов.
Нац. акад. наук Укр. 2013. № 12. С. 149—156.
13. Ji P., Zhang Y., Wang S.J., Ge H.L., Zhao G.P., Xu Y.C., Wang Y. CD44hiCD24lo mammosphere-forming
cells from primary breast cancer display resistance to multiple chemotherapeutic drugs. Oncol. Rep. 2016. 35,
№ 6. P. 3293—3302. doi: https://doi.org/10.3892/or.2016.4739
14. Horak I., Drobot L. Adaptor protein Ruk/CIN85 modulates chemoresistance of 4T1 breast cancer cells.
Ukr. Biochem. J. 2018. 90, № 3. P. 94—100. doi: https://doi.org/10.15407/ubj90.03.094
Надійшло до редакції 23.10.2018
REFERENCES
1. Cojoc, M., Mäbert, K., Muders, M.H. & Dubrovska, A. (2015). A role for cancer stem cells in therapy re si-
stance: cellular and molecular mechanisms. Semin. Cancer Biol., 31, pp. 16-27. doi: https://doi.org/ 10.1016/ j.
semcancer.2014.06.004
2. Mani, S.A., Guo, W., Liao, M.J., Eaton, E.N., Ayyanan, A., Zhou, A.Y., Brooks, M., Reinhard, F., Zhang, C.C.
& Shipitsin, M. (2008). The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells.
Cell., 133, pp. 704-715. doi: https://doi.org/10.1016/j.cell.2008.03.027
3. Havrylov, S., Redowicz, M.J. & Buchman, V.L. (2010). Emerging roles of ruk/cin85 in vesicle-mediated
transport, adhesion, migration and malignancy. Traffic, 11, pp. 721-731. doi: https://doi.org/10.1111/
j.1600-0854.2010.01061.x
4. Cascio, S., Farkas, A.M., Hughey, R.P. & Finn, O.J. (2013). Altered glycosylation of MUC1 influences its
association with CIN85: the role of this novelcomplex in cancer cell invasion and migration. Oncotarget, 4,
No. 10, pp. 1686-1697. doi: https://doi.org/10.18632/oncotarget.1265
5. Samoylenko, A., Vynnytska-Myronovska, B., Byts, N., Kozlova, N., Basaraba, O., Pasichnyk, G., Palyvoda, K.,
Bobak, Y., Barska, M., Mayevska, O., Rzhepetsky, Y., Shuvayeva, H., Lyzogubov, V., Usenko, V., Savran, V.,
Volodko, N., Buchman, V., Kietzmann, T. & Drobot, L. (2012). Increased levels of the HER1 adaptor protein
Rukl/CIN85 contribute to breast cancer malignancy. Carcinogenesis, 33, pp. 1976-1984. doi: https://doi.
org/10.1093/carcin/bgs228
6. Cascio, S. & Finn, O. J. (2015). Complex of MUC1, CIN85 and Cbl in colon cancer progression and metas-
tasis. Cancers (Basel), 7, No. 1, pp. 342-352. doi: https://doi.org/10.3390/cancers7010342
7. Takahashi, K. & Yamanaka, S. (2006). Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and
adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 126, No. 4, pp. 663-676. doi: https://doi.org/10.1016/j.cell.
2006.07.024
8. Yu, F., Li, J., Chen, H., Fu, J., Ray, S., Huang, S. & Ai, W. (2011). Kruppel-like factor 4 (KLF4) is required
for maintenance of breast cancer stem cells and for cell migration and invasion. Oncogene, 30, No. 18,
pp. 2161-2172. doi: https://doi.org/10.1038/onc.2010.591
9. Kim, R.-J. & Nam, J.-S. (2011). OCT4 expression enhances features of cancer stem cells in a mouse model
of breast cancer. Lab. Anim. Res., 27, No. 2, pp. 147-152. doi: https://doi.org/10.5625/lar.2011.27.2.147
10. Lu, X., Mazur, S.J., Lin, T., Appella, E. & Xu, Y. (2014). The pluripotency factor Nanog promotes breast cancer
tumorigenesis and metastasis. Oncogene, 33, No. 20, pp. 2655-2664. doi: https://doi.org/10.1038/onc.2013.209
11. Li, W., Ma, H., Zhang, J., Zhu, L., Wang, C. & Yang, Y. (2017). Unraveling the roles of CD44/CD24 and
ALDH1 as cancer stem cell markers in tumorigenesis and metastasis. Sci. Rep., 7, 13856. doi: https://doi.
org/10.1038/s41598-017-14364-2
12. Pasichnyk, G.V., Povorozniuk, O.O., Horak, I.R., Gerashchenko, D.S., Ponomarenko, O.V., Samoylenko, A.A.,
Byts, N.V. & Drobot, L.B. (2013). Overexpression of adaptor protein Rukl/CIN85 in human breast adeno-
carcinoma cell line MCF-7 is accompanied by increased chemoresistance. Dopov. Nac. akad. nauk Ukr., № 12,
pp. 149-156 (in Ukrainian).
13. Ji, P., Zhang, Y., Wang, S.J., Ge, H.L., Zhao, G.P., Xu, Y.C. & Wang, Y. (2016). CD44hiCD24lo mammosphe-
re-forming cells from primary breast cancer display resistance to multiple chemotherapeutic drugs. Oncol.
Rep., 35, No. 6, pp. 3293-3302. doi: https://doi.org/10.3892/or.2016.4739
14. Horak, I. & Drobot, L. (2018). Adaptor protein Ruk/CIN85 modulates chemoresistance of 4T1 breast cancer
cells. Ukr. Biochem. J., 90, No. 3, pp. 94-100. doi: https://doi.org/10.15407/ubj90.03.094
Received 23.10.2018
109ISSN 1025-6415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2018. № 12
Адаптерний протеїн Ruk/CIN85 модулює прояв ознак ракових стовбурових клітин (CSCs) у клітинах...
И.Р. Горак 1, Г.В. Пасечник 1, Д.С. Геращенко 1,
Л. Кнопфова 2, Л. Борсиг 3, Л.Б. Дробот 1
1 Институт биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины, Киев
2 Университет Масарика, Брно, Чехия
3 Цюрихский университет, Швейцария
E-mail: iryna.horak@gmail.com
АДАПТЕРНЫЙ БЕЛОК Ruk/CIN85 МОДУЛИРУЕТ ПРОЯВЛЕНИЕ
ПРИЗНАКОВ РАКОВЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК (CSCs) В КЛЕТКАХ
АДЕНОКАРЦИНОМЫ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ МЫШИ ЛИНИИ 4Т1
На модели клеток аденокарциномы молочной железы мыши линии 4Т1 со стабильной сверхэкспрес-
сией и подавленной экспрессией адаптерного белка Ruk/CIN85 проведена оценка его вклада в степень
проявления основных признаков раковых стволовых клеток (CSCs). Установлено, что уровень экспрессии
факторов репрограммирования Klf4, Pou5f1/Oct4 и Nanog, а также поверхностных маркеров CSCs мо-
лочной железы Cd44 и Cd24 зависели от уровня экспрессии Ruk/CIN85: повышались при up-регулирова-
нии и снижались при down-регулировании адаптерного белка. Показано, что особенности изменений
транскриптома в субклонах 4Т1 с различным уровнем экспрессии Ruk/CIN85 коррелировали с их спо-
собностью к формированию маммосфер.
Ключевые слова: раковые стволовые клетки, репрограммирование, сфероиды, адаптерный белок Ruk/CIN85,
аденокарцинома молочной железы.
I.R. Horak1, G.V. Pasichnyk1, D.S. Gerashchenko1,
L. Knopfova2, L. Borsig3, L.B. Drobot1
1 Palladin Institute of Biochemistry of the NAS of Ukraine, Kiev
2 Masaryk University, Brno, Czech Republic;
3 Zurich University, Switzerland.
E-mail: iryna.horak@gmail.com
ADAPTOR PROTEIN Ruk/CIN85 MODULATES MANIFESTATION
OF CANCER STEM CELLS (CSCs) FEATURES
IN MOUSE BREAST ADENOCARCINOMA 4T1 CELLS
Using mouse breast adenocarcinoma 4T1 cells with stable overexpression or knockdown of adaptor protein Ruk/
CIN85, its contribution to the manifestation of cancer stem cells features was estimated. It was demonstrated
that the expression levels of reprogramming factors Klf4, Pou5f1/Oct4 and Nanog, as well as CSCs surface mar-
kers Cd44 and Cd24, depended on Ruk/CIN85 expression level: increased in the case of up-regulation and
decreased in the case of down-regulation. It was found that the transcriptome patterns in 4T1 subclones with
different expression levels of Ruk/CIN85 correlated with their ability to form mammospheres.
Keywords: cancer stem cells, reprogramming, spheroids, adaptor protein Ruk/CIN85, breast adenocarcinoma.
|