Возрастные изменения фосфолипаза D-зависимого сигнального пути инсулина в неокортексе крыс

Возрастные изменения фосфолипаза D-зависимого сигнального пути инсулина в неокортексе крыс

Инсулин участвует в обеспечении нормального функционирования ЦНС; фосфолипаза D является неотъемлемой частью сигнального каскада этого гормона. С возрастом происходят изменения липидного спектра клеток, что влечет за собой нарушение работы различных сигнальных путей, в том числе пути инсулина. В н...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
Bibliographische Detailangaben
Datum:2013
Hauptverfasser: Бабенко, Н.А., Харченко, В.С.
Format: Artikel
Sprache:Russian
Veröffentlicht: Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України 2013
Schriftenreihe:Нейрофизиология
Online Zugang:https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/148048
Tags: Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:Возрастные изменения фосфолипаза D-зависимого сигнального пути инсулина в неокортексе крыс / Н.А. Бабенко, В.С. Харченко // Нейрофизиология. — 2013. — Т. 45, № 2. — С. 136-143. — Бібліогр.: 56 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-148048
record_format dspace
spelling nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1480482025-02-23T19:14:16Z Возрастные изменения фосфолипаза D-зависимого сигнального пути инсулина в неокортексе крыс Вікові зміни фосфоліпаза D-залежного сигнального шляху інсуліну в неокортексі щурів Бабенко, Н.А. Харченко, В.С. Инсулин участвует в обеспечении нормального функционирования ЦНС; фосфолипаза D является неотъемлемой частью сигнального каскада этого гормона. С возрастом происходят изменения липидного спектра клеток, что влечет за собой нарушение работы различных сигнальных путей, в том числе пути инсулина. В настоящей работе установлено, что содержание церамидов и свободных жирных кислот в неокортексе старых (24-­месячных) крыс заметно выше, чем у 3­месячных животных. В данных условиях способность инсулина активировать фосфолипазу D резко снижается. Инкубация ткани неокортекса молодых животных в присутствии экзогенного С2-­церамида или пальмитиновой кислоты (предшественника сфинголипидов) приводит к увеличению содержания эндогенных церамидов. Этот процесс сопровождается подавлением стимулированного инсулином образования фосфатидилэтанола (продукта реакции трансфосфатидилирования этанола фосфолипазой D). Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что в ходе старения активность фосфолипаза D­-зависимого звена сигнального каскада инсулина в неокортексе существенно ослабляется; важную роль в данном процессе играет церамид. Інсулін бере участь у забезпеченні нормального функціонування ЦНС; фосфоліпаза D є невід’ємною частиною сигнального каскаду цього гормону. З віком відбуваються зміни ліпідного спектра клітин, що спричинює порушення роботи різноманітних сигнальних шляхів, у тому числі інсуліну. У даній роботі встановлено, що вміст церамідів і вільних жирних кислот у неокортексі старих (24­-місячних) щурів є помітно вищим, ніж у 3­місячних тварин. У даних умовах здатність інсуліну активувати фосфоліпазу D різко знижується. Інкубація тканини неокортексу молодих тварин у присутності екзогенного С2-­цераміду або пальмітинової кислоти (попередника сфінголіпідів) призводить до збільшення вмісту ендогенних церамідів. Цей процес супроводжується пригніченням стимульованого інсуліном утворення фосфатидилетанолу (продукту реакції трансфосфатидилування етанолу фосфоліпазою D). Таким чином, отримані результати свідчать про те, що з віком активність фосфоліпаза D-­залежної ланки сигнального каскаду інсуліну в неокортексі значно послаблюється; важливу роль у даному процесі відіграє церамід. 2013 Article Возрастные изменения фосфолипаза D-зависимого сигнального пути инсулина в неокортексе крыс / Н.А. Бабенко, В.С. Харченко // Нейрофизиология. — 2013. — Т. 45, № 2. — С. 136-143. — Бібліогр.: 56 назв. — рос. 0028-2561 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/148048 591.139:[577.15+577.175.72]:616.831.3 ru Нейрофизиология application/pdf Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
language Russian
description Инсулин участвует в обеспечении нормального функционирования ЦНС; фосфолипаза D является неотъемлемой частью сигнального каскада этого гормона. С возрастом происходят изменения липидного спектра клеток, что влечет за собой нарушение работы различных сигнальных путей, в том числе пути инсулина. В настоящей работе установлено, что содержание церамидов и свободных жирных кислот в неокортексе старых (24-­месячных) крыс заметно выше, чем у 3­месячных животных. В данных условиях способность инсулина активировать фосфолипазу D резко снижается. Инкубация ткани неокортекса молодых животных в присутствии экзогенного С2-­церамида или пальмитиновой кислоты (предшественника сфинголипидов) приводит к увеличению содержания эндогенных церамидов. Этот процесс сопровождается подавлением стимулированного инсулином образования фосфатидилэтанола (продукта реакции трансфосфатидилирования этанола фосфолипазой D). Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что в ходе старения активность фосфолипаза D­-зависимого звена сигнального каскада инсулина в неокортексе существенно ослабляется; важную роль в данном процессе играет церамид.
format Article
author Бабенко, Н.А.
Харченко, В.С.
spellingShingle Бабенко, Н.А.
Харченко, В.С.
Возрастные изменения фосфолипаза D-зависимого сигнального пути инсулина в неокортексе крыс
Нейрофизиология
author_facet Бабенко, Н.А.
Харченко, В.С.
author_sort Бабенко, Н.А.
title Возрастные изменения фосфолипаза D-зависимого сигнального пути инсулина в неокортексе крыс
title_short Возрастные изменения фосфолипаза D-зависимого сигнального пути инсулина в неокортексе крыс
title_full Возрастные изменения фосфолипаза D-зависимого сигнального пути инсулина в неокортексе крыс
title_fullStr Возрастные изменения фосфолипаза D-зависимого сигнального пути инсулина в неокортексе крыс
title_full_unstemmed Возрастные изменения фосфолипаза D-зависимого сигнального пути инсулина в неокортексе крыс
title_sort возрастные изменения фосфолипаза d-зависимого сигнального пути инсулина в неокортексе крыс
publisher Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
publishDate 2013
url https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/148048
citation_txt Возрастные изменения фосфолипаза D-зависимого сигнального пути инсулина в неокортексе крыс / Н.А. Бабенко, В.С. Харченко // Нейрофизиология. — 2013. — Т. 45, № 2. — С. 136-143. — Бібліогр.: 56 назв. — рос.
series Нейрофизиология
work_keys_str_mv AT babenkona vozrastnyeizmeneniâfosfolipazadzavisimogosignalʹnogoputiinsulinavneokorteksekrys
AT harčenkovs vozrastnyeizmeneniâfosfolipazadzavisimogosignalʹnogoputiinsulinavneokorteksekrys
AT babenkona víkovízmínifosfolípazadzaležnogosignalʹnogošlâhuínsulínuvneokorteksíŝurív
AT harčenkovs víkovízmínifosfolípazadzaležnogosignalʹnogošlâhuínsulínuvneokorteksíŝurív
first_indexed 2025-11-24T15:15:55Z
last_indexed 2025-11-24T15:15:55Z
_version_ 1849685291330174976
fulltext NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2013.—T. 45, № 2136 УДК 591.139:[577.15+577.175.72]:616.831.3 Н. А. БАБЕНКО1, В. С. ХАРЧЕНКО1 ВОЗРАСТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ФОСФОЛИПАЗА D-ЗАВИСИМОГО СИГНАЛЬНОГО ПУТИ ИНСУЛИНА В НЕОКОРТЕКСЕ КРЫС Поступила 05.12.12 Инсулин участвует в обеспечении нормального функционирования ЦНС; фосфолипаза D является неотъемлемой частью сигнального каскада этого гормона. С возрастом про- исходят изменения липидного спектра клеток, что влечет за собой нарушение работы различных сигнальных путей, в том числе пути инсулина. В настоящей работе уста- новлено, что содержание церамидов и свободных жирных кислот в неокортексе старых (24­месячных) крыс заметно выше, чем у 3­месячных животных. В данных условиях способность инсулина активировать фосфолипазу D резко снижается. Инкубация ткани неокортекса молодых животных в присутствии экзогенного С2­церамида или пальмити- новой кислоты (предшественника сфинголипидов) приводит к увеличению содержания эндогенных церамидов. Этот процесс сопровождается подавлением стимулированно- го инсулином образования фосфатидилэтанола (продукта реакции трансфосфатиди- лирования этанола фосфолипазой D). Таким образом, полученные результаты свиде- тельствуют о том, что в ходе старения активность фосфолипаза D­зависимого звена сигнального каскада инсулина в неокортексе существенно ослабляется; важную роль в данном процессе играет церамид. КЛЮчЕВЫЕ СЛОВА: старение, неокортекс, диафрагма, инсулин, фосфолипаза D, церамид. 1 Научно­исследовательский институт биологии Харьковского нацио­ нального университета им. В. Н. Каразина, Харьков (Украина). Эл. почта: babenko@univer.kharkov.ua (Н. А. Бабенко); kharchenko_vitalina@meta.ua (В. С. Харченко). ВВЕДЕНИЕ В настоящее время показано, что инсулин оказы- вает модулирующее воздействие на рост нейро- нов и глиальных клеток ЦНС, их выживание, диф- ференцирование, миграцию, экспрессию генов в этих клетках, синтез белка, сборку цитоскелета и формирование межнейронных синапсов [1]. Ин- сулин синтезируется b­клетками поджелудочной железы и транспортируется с цереброспинальной жидкостью в мозг [2], где пересекает гемато­эн- цефалический барьер; транспорт осуществляется главным образом посредством собственных рецеп- тор­транспортных систем [3, 4]. Кроме того, аль- тернативным источником инсулина в мозгу являет- ся его синтез de novo [5, 6]. Рецепторы инсулина широко распространены по всей ЦНС [5, 7]. Боль- ше всего таких рецепторов локализуются в обо- нятельной луковице, гипоталамусе, коре головно- го мозга, мозжечке, гиппокампе и полосатом теле [8, 9]. Показано, что ослабление передачи нейро- химического сигнала инсулина, наблюдаемое при развитии ряда нейродегенеративных патологий, от- рицательно влияет на функционирование нейронов и глии, метаболизм глюкозы, энергетический мета- болизм, а также структуру и функции волокон бе- лого вещества [10]. В настоящее время установлено, что фосфоли- паза D (ФЛД) является важным компонентом со- ответствующих сигнальных путей. Активация это- го фермента и образование фосфатидной кислоты (ФК) сопровождают многие клеточные процессы, например везикулярный транспорт и митогенез, а также влияют на выживание клеток [11–13]. Ак- тивность ФЛД в нервной системе изменяется под действием нейротрансмиттеров, факторов роста и гормонов, в том числе инсулина [14, 15]. ФЛД уча- ствует в обеспечении пролиферации нервных кле- ток, процессов экзо­ и эндоцитоза нейротрансмит- теров и рецепторов [16], формирования аксонов [17] и образования ацетилхолина [18]. NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2013.—T. 45, № 2 137 ВОЗРАСТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ФОСФОЛИПАЗА D­ЗАВИСИМОГО СИГНАЛЬНОГО ПУТИ В нашей лаборатории было показано, что у ста- рых организмов ФЛД­зависимая передача сигнала инсулина в клетках печени и скелетной мускула- туры подавляется [19, 20]. Ингибирование актива- ции ФЛД инсулином в тканях­мишенях имеет кри- тическое значение для обмена глюкозы в клетках и коррелирует со снижением поглощения глюкозы и синтеза гликогена. Это проявляется как в условиях старения, так и при моделировании состояния ре- зистентности к действию гормона у молодых жи- вотных. Установлено, что накопление в клетках сфинголипида церамида входит в число причин развития возрастной резистентности гепатоцитов к действию гормона. Одной из основных мишеней действия церамидов в стимулированных под влия- нием инсулина клетках печени является ФЛД. Церамид представляет собой биологически ак- тивный компонент мембран клеток [21]. Повыше- ние количества церамидов наблюдается в тканях го- ловного мозга при старении [22], резистентности к инсулину и сопутствующих нейродегенеративных заболеваниях [23, 24]. Церамиды, индуцируя секре- цию цитокинов [25] и/или NO [26] клетками астро- глии, интенсифицируют в нейронах образование активных форм кислорода [27]. В результате это- го увеличивается активность b­секретазы ВАСЕ1 и стрессрегулируемых киназ (cdk5 и GSK­3), что мо- жет приводить к образованию b­амилоида, гипер- фосфорилированию белка tau [28] и гибели нейро- нов [29]. Известно, что церамид является ингибитором ФЛД; показано, однако, что активность указанного фермента в условиях развития нейродегенератив- ных заболеваний увеличивается. Это связывают с ролью ФЛД в защите нервных клеток от гибели в результате апоптоза [30]. Церамид подавляет ак- тивность ФЛД в глиальных клетках [31]. В то же время продукт реакции, катализируемой ФЛД, т. е. ФК, оказывает ингибирующее действие на образо- вание церамида в результате активации сфингоми- елиназы [32]; данный эффект способствует выжи- ванию клеток. В настоящее время вопросы о том, в чем заклю- чаются механизмы развития возрастных нейродеге- неративных изменений мозга, а также какова связь этого патологического процесса с сигнальным пу- тем инсулина, остаются в значительной мере от- крытыми. Роль церамидов в регуляции активности гормончувствительной ФЛД в мозгу изучена слабо. В настоящей работе мы пытались выяснить харак- тер возрастных изменений ФЛД­зависимого звена передачи сигнала инсулина и роль церамида в раз- витии резистентности коры головного мозга крыс к действию упомянутого гормона в старости. МЕТОДИКА Все исследования на животных проводили с со- блюдением Международных принципов Европей- ской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для экспериментов и дру- гих научных целей (Страсбург, 1985), и националь- ных Общих этических принципов экспериментов на животных (Украина, 2001). В экспериментах ис- пользовали 3­ и 24­месячных крыс­самцов линии Вистар (n = 11 в обеих группах) массой 200–250 (3­месячные животные) и 400–480 (24­месячные крысы) г. После декапитации мозг и диафрагму извлекали, неокортекс выделяли на льду. Кусоч- ки ткани неокортекса 3­месячных крыс инкуби- ровали в бикарбонатном буфере Кребса–Рингера (pH 7.4) с добавлением 0.1 % альбумина в тече- ние 90 мин при 37 °С в присутствии D­эритро­N­ ацетилсфингозина (С2­церамида, 5 мкг на 1 мл сре- ды инкубации; “Amersham”, Великобритания) либо 0.75 мМ пальмитиновой кислоты (ПК 16:0) (“Sig- ma”, США) или этанола в эквивалентном объеме (контроль). Перед внесением образцов неокортек- са среда инкубации была комплексирована в соот- ношении 16:1 с альбумином сыворотки крупного рогатого скота (BSA; “Sigma”, США), как описано Чавесом и соавт. [33]. Кусочки ткани диафрагмы 3­ и 24­месячных крыс инкубировали на протяжении 90 мин в упомянутом выше буфере (pH 7.4) в при- сутствии [14С]H3COONa (10 мкКи/мл). После вклю- чения метки ткани отмывали в бикарбонатном бу- фере (pH 7.4) с 0.1 % альбумина. Для определения активности ФЛД в тканях нео­ кортекса и диафрагмы крыс 3­ и 24­месячного воз- раста использовали метод, основанный на обра- зовании фосфадилэтанола (ФЭТ – фосфолипида, образование которого опосредуется исключитель- но ФЛД путем трансфосфатидилирования) в при- сутствии 50–300 мМ этанола [12, 34, 35]. ФЭТ, в отличие от ФК, метаболизируется очень медлен- но и ввиду этого может использоваться как инди- катор активации ФЛД в стимулированных клетках. Для определения активности ФЛД перед внесени- ем гормона в среду инкубации ткань неокортекса и диафрагмы преинкубировали 10 мин с 300 мМ этанола; затем в среду инкубации вносили 10 нМ NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2013.—T. 45, № 2138 Н. А. БАБЕНКО, В. С. ХАРЧЕНКО инсулина (“Индар”, Украина) или 0.9 % NaCl (в контрольных опытах) и через 5 или 30 мин оста- навливали реакцию путем добавления холодной (+3 °С) смеси хлороформ:метанол (1:2 по объему). Экстракцию липидов проводили по методу Блая–Дайера [36]. Разделение отдельных липидов выполняли путем тонкослойной хроматографии в системах растворителей. Для ФЭТ использовали смесь этилацетат:изооктан:уксусная кислота:вода, 130:20:30:100 по объему, а для свободных жир- ных кислот (СЖК) – гексан:диэтиловый эфир: ле- дяная уксусная кислота, 73:25:2 по объему. Для разделения фосфатидилхолина (ФХ) и сфинголи- пидов использовали диэтиловый эфир (система 1) и смесь хлороформ:метанол:вода (40:10:1 по объ- ему; система 2). Пятна липидов на хроматограм- мах идентифицировали, сравнивая со стандартами. Содержание СЖК в пробах определяли по методу Марча–Вейнстейна [37], фосфолипидов – по мето- ду Бартлета [38]. Для количественного определе- ния содержания церамидов в клетках пятна липи- дов переносили в пробирки и элюировали смесью xлороформа с метанолом (1:1 по объему) с после- дующим элюированием метанолом. Объединённые элюаты выпаривали в вакууме и подвергали гидро- лизу в 0.5 М растворе НСl в метаноле при 65 °С в течение 15 ч. Массу церамидов устанавливали по высвобождению длинноцепочечных оснований после гидролиза липидов [39]. Содержание белка определяли по методу Лоури [40]. Для межгруппо- вых сравнений использовали t­критерий Стьюден- та, для сравнения данных, полученных в результате множественного воздействия, – многофакторный дисперсионный анализ. РЕЗУЛЬТАТЫ Установлено, что инсулин активирует ФЛД как в ткани неокортекса, так и в классической мишени для действия гормона – мышечной ткани взрослых животных. Под действием инсулина в ткани нео- кортекса 3­месячных крыс уровень ФЭТ на 5­й мин инкубации увеличивался на 34, а на 30­й мин – на 78 % (pис. 1, А). Одновременно снижался уровень субстрата ФЛД, т. е. ФХ, на 62 и 54 % на 5­й и 30­й Р и с. 1. Влияние инсулина (Инс.) на содержание фосфатидилэтанола – А, Б и фосфатидилхолина – Б, Г (нмоль/мг белка) в ткани неокортекса крыс разного возраста. А, Б – 3­месячные, В, Г – 24­месячные (старые) крысы. *Различия при сравнении с группой контроля (Контр., введение физиологического раствора) значимы, Р < 0.05. Под диаграммами указано время измерений после введений (мин). Р и с. 1. Вплив інсуліну (Інс.) на вміст фосфатидилетанолу – А, Б і фосфатидилхоліну – Б, Г (нмоль/мг білка) у тканині неокортексу щурів різного віку. A Контр. нмоль/мг белка нмоль/мг белка Контр. 5 мин 5 мин30 мин 30 мин Инс. 90 90 350 350 75 75 300 300 60 60 250 250 45 45 200 200 30 30 150 150 100 100 15 15 50 50 0 0 0 0 Инс.Контр. Контр.Инс. Инс. В Б Г NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2013.—T. 45, № 2 139 ВОЗРАСТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ФОСФОЛИПАЗА D­ЗАВИСИМОГО СИГНАЛЬНОГО ПУТИ мин соответственно по сравнению с контролем (Б). При инкубации ткани диафрагмы 3­месячных жи- вотных с инсулином на 5­й мин содержание ФЭТ увеличивалось в среднем на 22 ± 8 %, а уровень ФХ снижался на 23 ± 7 % (P < 0.05) по сравнению с контролем (физиологический раствор инсулина; рис. 1). У 24­месячных (старых) животных содержание ФЭТ и ФХ в изученные промежутки времени дей- ствия инсулина на неокортекс не отличалось стати- стически значимо от контрольных значений (рис. 1, В, Г). В диафрагме 24­месячных крыс, инкубиро- ванной в присутствии гормона в течение 5 мин, содержание ФЭТ в контроле соответствовало 146.0 ± 9.1, а при действии инсулина – 149.3 ± ± 6.2 имп/мин·мг белка. В то же время уровень ФХ соответствовал 331.9 ± 31.7 имп/мин·мг белка для контроля по отношению к инсулину и 343.2 ± ± 26.8 имп/мин·мг белка для образцов, на которые воздействовали гормоном. Учитывая тот факт, что СЖК и церамиды играют важную роль в развитии резистентности мышеч- ной ткани и клеток печени к действию инсулина у старых организмов [19, 20], следующим этапом ра- боты было изучение содержания липидов в ткани неокортекса взрослых и старых крыс. Содержание СЖК в неокортексе 3­месячных крыс составляло в среднем 145.1 ± 2.9 нмоль/мг белка. У 24­месячных крыс этот показатель был выше, составляя 196.6 ± ± 10.4 нмоль/мг белка, и эти различия оказались статистически значимыми по сравнению с пока- зателями 3­месячных животных (Р < 0.05). Сред- ний уровень церамидов у 3­месячных крыс рав- нялся 157.5 ± 4.6, а у 24­месячных крыс – 226.3 ± ± 8.5 нмоль/мг белка (Р < 0.05). На следующем этапе данной работе мы моде- лировали повышение содержания СЖК и церами- да в ткани неокортекса молодых животных, подоб- ное тому, которое наблюдается у старых животных. Для этого ткань неокортекса 3­месячных животных культивировали в присутствии экзогенных ПК 16:0 или С2­церамида. Уровни эндогенных церамидов в нервной ткани повышались (рис. 2) при действии как С2­церамида, так и ПК 16:0 (на 50 и 43 % соот- ветственно). При воздействии на ткань неокортек- са ПК 16:0 также повышалось содержание СЖК (на 49 %; рис. 2). В условиях инкубирования ткани коры головно- го мозга 3­месячных крыс с экзогенными ПК 16:0 или C2­церамидом статистически значимых из- менений в содержании ФЭТ после кратковремен- ной стимуляции ткани инсулином не наблюдалось (рис. 3). Р и с. 2. Влияния пальмитиновой кислоты (темные столбцы) и С2­церамида (серые столбцы) на содержание свободных жирных кислот и церамида (А и Б соответственно, нмоль/мг белка) в ткани неокортекса 3­месячных крыс (белые столбцы – контроль). Остальные обозначения те же, что и на рис. 1. Р и с. 2. Впливи пальмітинової кислоти (темні стовпчики) та С2­цераміду (сірі стовпчики) на вміст вільних жирних кислот і цераміду (А і Б відповідно, нмоль/мг білка) в тканині неокортексу 3­місячних щурів (білі стовпчики – контроль). Р и с. 3. Влияние пальмитиновой кислоты (А) и экзогенного С2­ церамида (Б) на содержание фосфатидилэтанола в неокортексе 3­месячных крыс. Для белых столбцов время измерений после введений 5, для темных – 30 мин. Остальные обозначения те же, что и на рис. 1. Р и с. 3. Вплив пальмітинової кислоти (А) та екзогенного С2­цераміду (Б) на вміст фосфатидилетанолу в неокортексі 3­місячних щурів. AA A Б Б нмоль/мг белка нмоль/мг белка 300 200 100 100 50 0 0 Контр. Контр.Инс. Инс. NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2013.—T. 45, № 2140 Н. А. БАБЕНКО, В. С. ХАРЧЕНКО ОБСУЖДЕНИЕ Нейротрансмиттеры, факторы роста и гормоны, включая инсулин, индуцируют активацию ФЛД в клетках­мишенях. ФЛД катализирует гидролиз ФХ с образованием ФК и холина. Как продукт реак- ции катализируемой ФЛД (ФК), так и сам фермент участвуют в процессах передачи сигналов и транс- мембранного транспорта [11–13]. ФК представ- ляет собой отрицательно заряженный липид. Его молекулы, будучи встроенными в мембрану, изме- няют ее местную кривизну, тем самым облегчая формирование везикул и/или их слияние с плазма- тической мембраной клеток мозга в ходе эндо­ и экзоцитоза [41, 42], реализуемых при высвобож- дении нейромедиаторов [43] или поглощении ре- цепторов к ним [44]. Другой продукт активации ФЛД – холин – является необходимым компонен- том синтеза ацетилхолина в холинергических ней- ронах [18]. Кроме участия в образовании биоло- гически активных продуктов, ФЛД играет одну из ключевых ролей в росте аксонов нервных клеток и формировании синапсов [17, 45]. Повышение экс- прессии и активности ФЛД в культурах нервных клеток сопровождается усилением роста аксонов и синаптогенеза, а ингибирование фермента приво- дит к полному подавлению формирования аксонов и синапсов [45]. В присутствии этанола в результате специфи- ческой для ФЛД реакции трансфосфатидилирова- ния происходит образование ФЭТ, который явля- ется маркером активации ФЛД [12]. Полученные в нашей работе данные свидетельствуют о том, что ФЛД в тканях коры головного мозга взрослых крыс при кратковременном действии инсулина ак- тивируется. В то же время инсулин практически не оказывает стимулирующего влияния на ФЛД в тка- ни неокортекса 24­месячных животных. Возраст- ные особенности регуляции инсулином активно- сти ФЛД в неокортексе подобны тем изменениям, которые обнаруживаются в классической мишени действия гормона – мышечной ткани. Наши резуль- таты согласуются с данными исследований, про- веденных на синаптосомах коры головного мозга крыс 4­ и 28­месячного возраста [15]. Авторы ци- тируемой работы, используя меченый [14С]ФХ, по- казали, что внесение инсулина в среду инкубации синаптосом коры мозга крыс способствовало обра- зованию [14С]ФЭТ у 4­месячных животных; это яв- ляется свидетельством активации ФЛД у молодых животных. Подобный эффект, однако, отсутство- вал в синаптосомах старых (28­месячных) живот- ных [15]. ФЛД локализуется в клетках и в их внутренних компартментах (таких, как аппарат Гольджи и эн- доплазматический ретикулум), а также в липид- ных рафтах плазматической мембраны [46]. При стимуляции агонистами ФЛД, благодаря своему РН­домену, может поступать из внутриклеточных компартментов и встраиваться в рафты плазматиче- ской мембраны [47]. Упомянутые рафты (“плоты”) представляют собой мембранные домены, обога- щенные холестеролом и сфинголипидами. Данные молекулярные структуры являются платформами, обеспечивающими белок­липидные и белок­белко- вые взаимодействия, необходимые для процессов трансдукции клеточных сигналов [48]. При старе- нии, а также при нейродегенеративных заболевани- ях происходит изменение липидного спектра мем- бран в целом и рафтов в частности. Хан и соавт. показали [49], что в случае болезни Альцгейме- ра в мозгу снижается содержание сфингомиелина и увеличивается содержание церамида. Это может приводить к изменениям в структуре мембранных липидных рафтов и, как следствие, к нарушению функционирования связанных с ними молекул. В настоящем исследовании и в работах, прове- денных в нашей лаборатории ранее, было установ- лено, что содержание СЖК и церамида в неокортек- се 24­месячных крыс повышено [50]. В настоящей же работе продемонстрировало, что повышение со- держания СЖК и церамида кореллирует с подавле- нием активации ФЛД инсулином. Кроме того, мы обнаружили, что с возрастом содержание церамида увеличивается и в клетках других типов, в частно- сти в клетках тканей­мишеней инсулина (таких, как гепатоциты и мышечные клетки диафрагмы крыс), в то время как активация ФЛД в ответ на кратко- временное действие инсулина отсутствует [19, 20]. В настоящее время считают, что церамид может непосредственно влиять на ФЛД, ингибируя дан- ный фермент. Церамид может конкурировать с ко- факторами ФЛД за связывание с каталитическим ядром этого фермента и ингибировать активацию ФЛД под влиянием ФК и лизоФК [51]. Церамид также частично блокирует транслокацию активато- ров ФЛД (белка ARF и протеинкиназы C) [52]. Он может подавлять транскрипцию ФЛД [53]. Кроме того, действие церамида может быть опосредован- ным. Накопление церамидов в липидных рафтах мембран может приводить к нарушению физиче- ских свойств этих структур и ингибированию сиг- NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2013.—T. 45, № 2 141 ВОЗРАСТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ФОСФОЛИПАЗА D­ЗАВИСИМОГО СИГНАЛЬНОГО ПУТИ нальных молекул, связанных с ними (в том числе ФЛД) [54]. Для выяснения роли церамидов в нарушении ак- тивации инсулином ФЛД в неокортексе старых ор- ганизмов в настоящей работе активность данного фермента изучали в неокортексе зрелых молодых животных в условиях повышенного (под действи- ем ПК 16:0 или С2­церамида) содержания эндоген- ных церамидов. ПК 16:0 является предшественни- ком синтеза сфинголипидов в различных тканях, причем доступность субстрата является лимити- рующим фактором этого процесса. Введение ПК в среду культивирования астроглиальных клеток усиливает процесс синтеза сфинголипидов и цера- мида de novo [55]. В нашей работе инкубация тка- ней неокортекса в присутствии ПК 16:0 приводи- ла к повышению содержания и СЖК, и церамида. Можно полагать, что увеличение в клетках уровня предшественника сфинголипидов – ПК 16:0 – явля- ется важной причиной повышения содержания це- рамидов в неокортексе. D­эритро­N­ацетилсфингозин (С2­церамид) ча- сто используется в исследованиях процессов, опосредуемых этим и подобными агентами, как аналог, который легко проникает в клетки и мо- делирует действие эндогенных церамидов. Пока- зано, что короткоцепочечные С2­ и С6­церамиды могут утилизироваться в клетках путем образо- вания сфингозина и сфинганина и использования данных соединений в синтезе длинноцепочечных церамидов и более сложных сфинголипидов [56]. Мы использовали экзогенный С2­церамид как ин- струмент, который приводит к повышению содер- жания эндогенных церамидов в ткани коры голов- ного мозга молодых крыс, подобному аналогичным сдвигам у старых животных. Полученные данные согласуются с результатами предыдущих исследо- ваний на гепатоцитах и клетках диафрагмы моло- дых крыс при модулировании у них содержания церамида вследствие воздействия его предшествен- ников [19, 20]. Введение в среду инкубации инги- битора серинпальмитоилтрансферазы мириоцина предотвращало индукцию накопления эндогенных церамидов под влиянием короткоцепочечных це- рамидов [20]. Мириоцин нормализовал также со- держание эндогенных церамидов в гепатоцитах старых крыс и гепатоцитах молодых животных, культивируемых в присутствии как С2­церамида, так и ПК 16:0. Данное наблюдение указывает на то, что активация синтеза церамида de novo является одной из важных причин его накопления в клетках печени. Эндогенные С2­церамид и ПК 16:0 полно- стью подавляли активирующее действие инсулина как на ФЛД, так и на обмен глюкозы в гепатоци- тах молодых животных. Учитывая эти данные и ре- зультаты настоящей работы, можно предположить, что накопление вновь синтезированного церамида в клетках неокортекса, подвергнутых действию эн- догенных предшественников, у молодых крыс и в клетках интактного неокортекса старых животных является важной причиной развития состояния ре- зистентности соответствующих тканей к действию инсулина. Таким образом, показано, что в ткани неокортек- са молодых животных инсулин активирует ФЛД. В старости же происходит резкое снижение чув- ствительности ткани коры головного мозга к дей- ствию данного гормона. Большое значение для развития возрастной резистентности неокортекса к действию инсулина имеет изменение липидно- го спектра мембран клеток, в частности повыше- ние содержания церамидов, которое наблюдает- ся при старении. Церамид, являясь ингибитором ключевых компонентов сигнальных путей инсули- на в мозгу (таких, как Akt/протеинкиназа В, ARF, протеинкиназа С и ФЛД), может приводить к су- щественным нарушениям функционирования дан- ного сигнального каскада и формирования физио- логических ответов. Учитывая тот факт, что ФЛД играет существенную роль в функционировании мозга и является мишенью действия церамидов в неокортексе, можно предположить, что индуциро- ванное сфинголипидом подавление функциониро- вания ФЛД­зависимого сигнального пути инсулина может являться важной причиной нарушений рабо- ты мозга в старости и/или фактором, содействую- щим развитию нейродегенеративных патологий. Н. А. Бабенко1, В. С. Харченко1 ВІКОВІ ЗМІНИ ФОСФОЛІПАЗА D­ЗАЛЕЖНОГО СИГ- НАЛЬНОГО ШЛЯХУ ІНСУЛІНУ В НЕОКОРТЕКСІ ЩУРІВ 1Науково­дослідний інститут біології Харківського національного університету ім. В. Н. Каразіна, Харків (Україна). Р е з ю м е Інсулін бере участь у забезпеченні нормального функціо- нування ЦНС; фосфоліпаза D є невід’ємною частиною сиг- нального каскаду цього гормону. З віком відбуваються змі- NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2013.—T. 45, № 2142 Н. А. БАБЕНКО, В. С. ХАРЧЕНКО ни ліпідного спектра клітин, що спричинює порушення роботи різноманітних сигнальних шляхів, у тому числі ін- суліну. У даній роботі встановлено, що вміст церамідів і вільних жирних кислот у неокортексі старих (24­місячних) щурів є помітно вищим, ніж у 3­місячних тварин. У даних умовах здатність інсуліну активувати фосфоліпазу D різко знижується. Інкубація тканини неокортексу молодих тва- рин у присутності екзогенного С2­цераміду або пальміти- нової кислоти (попередника сфінголіпідів) призводить до збільшення вмісту ендогенних церамідів. Цей процес су- проводжується пригніченням стимульованого інсуліном утворення фосфатидилетанолу (продукту реакції трансфос- фатидилування етанолу фосфоліпазою D). Таким чином, отримані результати свідчать про те, що з віком активність фосфоліпаза D­залежної ланки сигнального каскаду інсулі- ну в неокортексі значно послаблюється; важливу роль у да- ному процесі відіграє церамід. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. K. H. Lee, A. S. Calikoglu, P. Ye, and A. J. D’Ercole, “Insulin­ like growth factor­I (IGF­I) ameliorates and IGF binding protein­1 (IGFBP­1) exacerbates the effects of undernutrition on brain growth during early postnatal life: studies in IGF­I and IGFBP­1 transgenic mice,” Pediat. Res., 45, No. 3, 331­ 336 (1999). 2. C. R. Plata­Salamán, “Insulin in the cerebrospinal fluid,” Neurosci. Biobehav. Rev., 15, No. 2, 243­258 (1991). 3. Y. Yu, A. Kastin, and W. Pan, “Reciprocal interactions of insulin and insulin-like growth factor I in receptor-mediated transport across the blood­brain barrier,” Endocrinology, 147, 2611­2615 (2006). 4. Z. Laron, “Insulin and the brain,” Arch. Physiol. Biochem., 115, No. 2, 112­116 (2009). 5. W. Zhao, H. Chen, H. Xu, et al., “Brain insulin receptors and spatial memory. Correlated changes in gene expression, tyrosine phosphorylation, and signaling molecules in the hippocampus of water maze trained rats,” J. Biol. Chem., 274, No. 49, 34893­34902 (1999). 6. R. Schechter, T. Yanovitch, M. Abboud, et al., “Effects of brain endogenous insulin on neurofilament and MAPK in fetal rat neuron cell cultures,” Brain Res., 808, No. 2, 270­278 (1998). 7. J. Havrankova, J. Roth, and M. Brownstein, “Insulin receptors are widely distributed in the central nervous system of the rat,” Nature, 272, No. 56, 827­829 (1978). 8. M. Salkovic­Petrisic and S. Hoyer, “Central insulin resistance as a trigger for sporadic Alzheimer­like pathology: an experimental approach,” J. Neural. Transm., Suppl., No. 72, 217­233 (2007). 9. S. M. de la Monte and J. R. Wands, “Review of insulin and insulin­like growth factor expression, signaling, and malfunction in the central nervous system: relevance to Alzheimer’s disease,” J. Alzheimers Dis., 7, No. 1, 45­61 (2005). 10. S. M. de la Monte, “Insulin resistance and Alzheimer’s disease,” Biochem. Mol. Biol. Reports, 42, No. 8, 475­481 (2009). 11. S. Cockcroft, “Signalling roles of mammalian phospholipase D1 and D2,” Cell. Mol. Life Sci., 58, No. 11, 1674­1687 (2001). 12. J. H. Exton, “Phospholipase D – structure, regulation and function,” Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol., 144, 1­94 (2002). 13. G. M. Jenkins and M. A. Frohman, “Phospholipase D: a lipid centric review,” Cell. Mol. Life Sci., 62, Nos. 19/20, 2305­ 2316 (2005). 14. J. Klein, V. Chalifa, M. Liscovitch, and K. Löffelholz, “Role of phospholipase D activation in nervous system physiology and pathophysiology,” J. Neurochem., 65, No. 4, 1445­1455 (1995). 15. G. A. Salvador, S. J. Pasquare, M. G. Ilincheta de Boschero, and N. M. Giusto, “Differential modulation of phospholipase D and phosphatidate phosphohydrolase during aging in rat cerebral cortex synaptosomes,” Exp. Gerontol., 37, No. 4, 543­552 (2002). 16. T. G. Oliveira and G. Di Paolo, “Phospholipase D in brain function and Alzheimer’s disease,” Biochim. Biophys. Acta, 1801, No. 8, 799­805 (2010). 17. Y. Kanaho, Y. Funakoshi, and H. Hasegawa, “Phospholipase D signalling and its involvement in neurite outgrowth,” Biochim. Biophys. Acta, 1791, No. 9, 898­904 (2009). 18. D. Zhao, M. A. Frohman, and J. K. Blusztajn, “Generation of choline for acetylcholine synthesis by phospholipase D isoforms,” BioMed Centr. Neurosci., 2, 16 (2001). 19. Н. А. Бабенко, В. С. Харченко, “Роль церамидов в нарушении инсулинового сигналинга в диафрагме крыс в условиях in vivo и in vitro”, Пробл. ендокрин. патології, № 1, 37­43 (2009). 20. N. A. Babenko and V. S. Kharchenko, “Ceramides inhibit phospholipase D-dependent insulin signaling in liver cells of old rats,” Biochemistry, 77, № 2, 180­186 (2012). 21. Y. A. Hannun and L. M. Obeid, “Principles of bioactive lipid signalling: lessons from sphingolipids,” Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 9, No. 2, 139­150 (2008). 22. N. A. Babenko and Y. A. Semenova, “Effects of long­term fish oil­enriched diet on the sphingolipid metabolism in brain of old rats,” Exp. Gerontol., 45, No. 5, 375­380 (2010). 23. S. M. de la Monte, M. Tong, V. Nguyen, et al., “Ceramide­ mediated insulin resistance and impairment of cognitive-motor functions,” J. Alzheimers Dis., 21, No. 3, 967­984 (2010). 24. S. M. de la Monte, E. Re, L. Longato, and M. Tong, “Dysfunctional pro­ceramide, ER stress, and insulin/IGF signaling networks with progression of Alzheimer’s disease,” J. Alzheimers Dis., 30, Suppl. 2, S217­S229 (2012). 25. K. Lieb, B. L. Fiebich, M. Berger, et al., “The neuropeptide substance P activates transcription factor NF­kappa B and kappa B­dependent gene expression in human astrocytoma cells,” J. Immunol., 159, 4952­4958 (1997). 26. K. Pahan, F. G. Sheikh, M. Khan, et al., “Sphingomyelinase and ceramide stimulate the expression of inducible nitric­ oxide synthase in rat primary astrocytes,” J. Biol. Chem., 273, No. 5, 2591­2600 (1998). 27. T. Wei, C. Chen, J. Hou, et al., “Nitric oxide induces oxidative stress and apoptosis in neuronal cells,” Biochim. Biophys. Acta, 1498, No. 1, 72­79 (2000). 28. A. Szutowicz and W. Lysiak, “Regional and subcellular distribution of ATP­citrate lyase and other enzymes of acetyl­ CoA metabolism in rat brain,” J. Neurochem., 35, No. 4, 775­ 785 (1980). 29. K. Ayasolla, M. Khan, A. K. Singh, and I. Singh, “Inflammatory mediator and beta­amyloid (25­35)­induced ceramide generation and iNOS expression are inhibited by vitamin E,” Free Radical. Biol. Med., 37, No. 3, 325­338 (2004). NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2013.—T. 45, № 2 143 ВОЗРАСТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ФОСФОЛИПАЗА D­ЗАВИСИМОГО СИГНАЛЬНОГО ПУТИ 30. J. Klein, “Functions and pathophysiological roles of phospholipase D in the brain,” J. Neurochem., 94, No. 6, 1473­ 1487 (2005). 31. S. Yoshimura, H. Sakai, K. Ohguchi, et al., “Changes in the activity and mRNA levels of phospholipase D during ceramide­ induced apoptosis in rat C6 glial cells,” J. Neurochem., 69, No. 2, 713­720 (1997). 32. B. Schatter, S. Jin, K. Löffelholz, and J. Klein, “Cross­talk between phosphatidic acid and ceramide during ethanol­ induced apoptosis in astrocytes,” BioMed Centr. Pharmacol., 5, 3 (2005). 33. J. A. Chavez, W. L. Holland, J. Bar, et al., “Acid ceramidase overexpression prevents the inhibitory effects of saturated fatty acids on insulin signaling,” J. Biol. Chem., 280, No. 20, 20148­20153 (2005). 34. G. L. Moehren, J. B. Gustavsson, and J. B. Hoek, “Activation and desensitization of phospholipase D in intact rat hepatocytes,” J. Biol. Chem., 269, No. 2, 838­848 (1994). 35. P. Huang, Y. M. Altshuller, J. C. Hou, et al., “Insulin­stimulated plasma membrane fusion of Glut4 glucose transporter­ containing vesicles is regulated by phospholipase D1,” Mol. Biol. Cell, 16, No. 6, 2614­2623 (2005). 36. E. G. Bligh and W. J. Dyer, “A rapid method of total lipid extraction and purification,” Can. J. Biochem. Physiol., 37, No. 8, 911­917 (1959). 37. J. B. March and D. B. Weinstein, “Simple charring method for determination of lipids,” J. Lipid Res., 7, No. 4, 574­580 (1966). 38. G. R. Bartlett, “Phosphorus assay in column chromatography,” J. Biol. Chem., 234, No. 3, 466­468 (1959). 39. C. J. Lauter and E. G. Trams, “A spectrophotometric determination of Sphingosine,” J. Lipid Res., 3, 136­138 (1962). 40. O. N. Lowry, N. J. Rosebrough, A. L. Farr, and R. J. Randal, “Protein measurement with the folin phenol reagent,” J. Biol. Chem., 193, 365­375 (1951). 41. M. G. Roth, “Molecular mechanisms of PLD function in membrane traffic,” Traffic, 9, No. 8, 1233­1239 (2008). 42. Y. Humeau, N. Vitale, S. Chasserot­Golaz, et al., “A role for phospholipase D1 in neurotransmitter release,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, No. 26, 15300­15305 (2001). 43. E. Sarri, I. Böckmann, U. Kempter, et al., “Regulation of phospholipase D activity in synaptosomes permeabilized with Staphylococcus aureus alpha­toxin,” FEBS Lett., 440, No. 3, 287­290 (1998). 44. M. Scarselli and J. G. Donaldson, “Constitutive internalization of G protein-coupled receptors and G proteins via clathrin- independent endocytosis,” J. Biol. Chem., 284, No. 6, 3577­ 3585 (2009). 45. M. S. Yoon, C. Yon, S. Y. Park, et al., “Role of phospholipase D1 in neurite outgrowth of neural stem cells,” Biochem. Biophys. Res. Commun., 329, No. 3, 804­811 (2005). 46. M. Czarny, Y. Lavie, G. Fiucci, and M. Liscovitch, “Localization of phospholipase D in detergent­insoluble, caveolin­rich membrane domains. Modulation by caveolin­1 expression and caveolin­182­101,” J. Biol. Chem., 274, No. 5, 2717­2724 (1999). 47. G. Du, Y. M. Altshuller, N. Vitale, et al., “Regulation of phospholipase D1 subcellular cycling through coordination of multiple membrane association motifs,” J. Cell Biol., 162, No. 2, 305­315 (2003). 48. L. J. Pike, “Growth factor receptors, lipid rafts and caveolae: an evolving story,” Biochim. Biophys. Acta, 1746, No. 3, 260­ 273 (2005). 49. X. Han, S. Rozen, S. H. Boyle, et al., “Metabolomics in early Alzheimer’s disease: identification of altered plasma sphingolipidome using shotgun lipidomics,” PLoS One, 6, No. 7, e21643 (2011). 50. Л. X. M. Хассунех, Я. О. Семенова, О. А. Красільнікова, Н. О. Бабенко, “Вікові особливості вмісту сигнальних ліпідів у печінці та мозку щурів”, Фізіол. журн., 52, № 6, 79­84 (2006). 51. A. Abousalham, C. Liossis, L. O’Brien, and D. N. Brindley, “Cell­permeable ceramides prevent the activation of phospholipase D by ADP­ribosylation factor and RhoA,” J. Biol. Chem., 272, 1069­1075 (1997). 52. A. Gidwani, H. A. Brown, D. Holowka, and B. Baird, “Disruption of lipid order by short­chain ceramides correlates with inhibition of phospholipase D and downstream signaling by Fc epsilonRI,” J. Cell Sci., 116, 3177­3187 (2003). 53. S. Mebarek, H. Komati, F. Naro, et al., “Inhibition of de novo ceramide synthesis upregulates phospholipase D and enhances myogenic differentiation,” J. Cell Sci., 120, Part 3, 407­416 (2007). 54. I. N. Singh, L. M. Stromberg, S. G. Bourgoin, et al., “Ceramide inhibition of mammalian phospholipase D1 and D2 activities is antagonized by phosphatidylinositol 4,5­bisphosphate,” Biochemistry, 40, 11227­11233 (2001). 55. S. Patil, D. Balu, J. Melrose, and C. Chan, “Brain region­ specificity of palmitic acid­induced abnormalities associated with Alzheimer’s disease,” BioMed Centr. Res. Notes, 4, 1­20 (2008). 56. N. D. Ridgway and D. L. Merriam, “Metabolism of short­chain ceramide and dihydroceramide analogues in Chinese hamster ovary (CHO) cells,” Biochim. Biophys. Acta, 1256, No. 1, 57­ 70 (1995).

Ähnliche Einträge