Вплив супернатанта фетальних нейрогенних клітин на проліферативну активність у культурі клітин гліоми С6
Оцінювали вплив супернатанта фетальних нейрогенних клітин (ФНК) щура на проліферативну активність культивованих клітин гліоми мозку щура (клітинна лінія C6). Супернатант ФНК отримували із суспензії клітин мозку плодів щура на 14-ту добу гестації (Е14). До культурального середовища експериментальних...
Gespeichert in:
| Datum: | 2016 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , , , , |
| Sprache: | Ukrainian |
| Veröffentlicht: |
Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
2016
|
| Schriftenreihe: | Нейрофизиология |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/148327 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Вплив супернатанта фетальних нейрогенних клітин на проліферативну активність у культурі клітин гліоми С6 / Л.Д. Любич, В.М. Семенова, Т.А. Малишева, Л.П. Стайно, В.В. Васлович // Нейрофизиология. — 2016. — Т. 48, № 4. — С. 265-272. — Бібліогр.: 26 назв. — укр. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-148327 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1483272025-02-10T01:20:36Z Вплив супернатанта фетальних нейрогенних клітин на проліферативну активність у культурі клітин гліоми С6 Любич, Л.Д. Семенова, В.М. Малишева, Т.А. Стайно, Л.П. Васлович, В.В. Оцінювали вплив супернатанта фетальних нейрогенних клітин (ФНК) щура на проліферативну активність культивованих клітин гліоми мозку щура (клітинна лінія C6). Супернатант ФНК отримували із суспензії клітин мозку плодів щура на 14-ту добу гестації (Е14). До культурального середовища експериментальних культур додавали 0.10 мг/мл супернатанта та інкубували 48 год. Імуноцитохімічне забарвлення щодо маркера проліферації Ki-67 проводили з використанням кролячих моноклональних антитіл до цього протеїну. Після інкубації в присутності супернатанта ФНК у культурах клітин гліоми С6 з’являлися дегенеративні та некробіотично змінені пухлинні клітини із заокругленими цитоплазматичними тілами та редукцією відростків. В умовах дії ФНК порівняно з контрольними спостереженнями середня щільність клітин у 10 тест-полях зору в експериментальних культурах (0.04 мм2 ) ставала вірогідно меншою, ніж у контролі (332.0 ± ± 36.0 проти 569.5 ± 70.5; Р = 0.00026); середнє значення ядерно-цитоплазматичного співвідношення в пухлинних клітинах було дещо (невірогідно) зниженим – 0.28 ± 0.01 проти 0.32 ± 0.02 (P = 0.64), а частка клітин із множинними ядерцями – більш ніж удвічі меншою – 3.53 ± 0.33 і 7.97 ± 0.25 % (P = 0.053). Індекс мітозу культивованих пухлинних клітин, підданих впливу супернатанта, ставав вчетверо нижчим (1.10 ± 0.04 і 4.90 ± ± 0.09 %; P = 0.009), а частка пухлинних клітин, імунопозитивних щодо Ki-67, зменшувалась з 27.86 ± 2.91 до 10.47 ± 0.91 % (P = 0.0015). Спостережуваний антипроліферативний ефект супернатанта ФНК свідчить на користь можливості та доцільності розробки комплексної патогенетичної терапії злоякісних пухлин мозку із застосуванням препаратів, отриманих із ФНК. 2016 Вплив супернатанта фетальних нейрогенних клітин на проліферативну активність у культурі клітин гліоми С6 / Л.Д. Любич, В.М. Семенова, Т.А. Малишева, Л.П. Стайно, В.В. Васлович // Нейрофизиология. — 2016. — Т. 48, № 4. — С. 265-272. — Бібліогр.: 26 назв. — укр. https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/148327 591.881:591.81:616-006.484-092.9 uk Нейрофизиология application/pdf Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Ukrainian |
| description |
Оцінювали вплив супернатанта фетальних нейрогенних клітин (ФНК) щура на проліферативну активність культивованих клітин гліоми мозку щура (клітинна лінія C6). Супернатант ФНК отримували із суспензії клітин мозку плодів щура на 14-ту добу гестації
(Е14). До культурального середовища експериментальних культур додавали 0.10 мг/мл
супернатанта та інкубували 48 год. Імуноцитохімічне забарвлення щодо маркера проліферації Ki-67 проводили з використанням кролячих моноклональних антитіл до цього
протеїну. Після інкубації в присутності супернатанта ФНК у культурах клітин гліоми
С6 з’являлися дегенеративні та некробіотично змінені пухлинні клітини із заокругленими цитоплазматичними тілами та редукцією відростків. В умовах дії ФНК порівняно з
контрольними спостереженнями середня щільність клітин у 10 тест-полях зору в експериментальних культурах (0.04 мм2
) ставала вірогідно меншою, ніж у контролі (332.0 ±
± 36.0 проти 569.5 ± 70.5; Р = 0.00026); середнє значення ядерно-цитоплазматичного
співвідношення в пухлинних клітинах було дещо (невірогідно) зниженим – 0.28 ± 0.01
проти 0.32 ± 0.02 (P = 0.64), а частка клітин із множинними ядерцями – більш ніж удвічі
меншою – 3.53 ± 0.33 і 7.97 ± 0.25 % (P = 0.053). Індекс мітозу культивованих пухлинних клітин, підданих впливу супернатанта, ставав вчетверо нижчим (1.10 ± 0.04 і 4.90 ±
± 0.09 %; P = 0.009), а частка пухлинних клітин, імунопозитивних щодо Ki-67, зменшувалась з 27.86 ± 2.91 до 10.47 ± 0.91 % (P = 0.0015). Спостережуваний антипроліферативний ефект супернатанта ФНК свідчить на користь можливості та доцільності розробки комплексної патогенетичної терапії злоякісних пухлин мозку із застосуванням
препаратів, отриманих із ФНК. |
| author |
Любич, Л.Д. Семенова, В.М. Малишева, Т.А. Стайно, Л.П. Васлович, В.В. |
| spellingShingle |
Любич, Л.Д. Семенова, В.М. Малишева, Т.А. Стайно, Л.П. Васлович, В.В. Вплив супернатанта фетальних нейрогенних клітин на проліферативну активність у культурі клітин гліоми С6 Нейрофизиология |
| author_facet |
Любич, Л.Д. Семенова, В.М. Малишева, Т.А. Стайно, Л.П. Васлович, В.В. |
| author_sort |
Любич, Л.Д. |
| title |
Вплив супернатанта фетальних нейрогенних клітин на проліферативну активність у культурі клітин гліоми С6 |
| title_short |
Вплив супернатанта фетальних нейрогенних клітин на проліферативну активність у культурі клітин гліоми С6 |
| title_full |
Вплив супернатанта фетальних нейрогенних клітин на проліферативну активність у культурі клітин гліоми С6 |
| title_fullStr |
Вплив супернатанта фетальних нейрогенних клітин на проліферативну активність у культурі клітин гліоми С6 |
| title_full_unstemmed |
Вплив супернатанта фетальних нейрогенних клітин на проліферативну активність у культурі клітин гліоми С6 |
| title_sort |
вплив супернатанта фетальних нейрогенних клітин на проліферативну активність у культурі клітин гліоми с6 |
| publisher |
Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України |
| publishDate |
2016 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/148327 |
| citation_txt |
Вплив супернатанта фетальних нейрогенних клітин на проліферативну активність у культурі клітин гліоми С6 / Л.Д. Любич, В.М. Семенова, Т.А. Малишева, Л.П. Стайно, В.В. Васлович // Нейрофизиология. — 2016. — Т. 48, № 4. — С. 265-272. — Бібліогр.: 26 назв. — укр. |
| series |
Нейрофизиология |
| work_keys_str_mv |
AT lûbičld vplivsupernatantafetalʹnihneirogennihklítinnaprolíferativnuaktivnístʹukulʹturíklítinglíomis6 AT semenovavm vplivsupernatantafetalʹnihneirogennihklítinnaprolíferativnuaktivnístʹukulʹturíklítinglíomis6 AT mališevata vplivsupernatantafetalʹnihneirogennihklítinnaprolíferativnuaktivnístʹukulʹturíklítinglíomis6 AT stainolp vplivsupernatantafetalʹnihneirogennihklítinnaprolíferativnuaktivnístʹukulʹturíklítinglíomis6 AT vaslovičvv vplivsupernatantafetalʹnihneirogennihklítinnaprolíferativnuaktivnístʹukulʹturíklítinglíomis6 |
| first_indexed |
2025-12-02T10:58:23Z |
| last_indexed |
2025-12-02T10:58:23Z |
| _version_ |
1850393864352825344 |
| fulltext |
NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2016.—T. 48, № 4 265
УДК 591.881:591.81:616-006.484-092.9
Л. Д. ЛЮБИЧ1, В. М. СЕМЕНОВА1, Т. А. МАЛИШЕВА1, Л. П. СТАЙНО1,
В. В. ВАСЛОВИЧ1
ВПЛИВ СУПЕРНАТАНТА ФЕТАЛЬНИХ НЕЙРОГЕННИХ КЛІТИН НА
ПРОЛІФЕРАТИВНУ АКТИВНІСТЬ У КУЛЬТУРІ КЛІТИН ГЛІОМИ С6
Надійшла 10.09.15
Оцінювали вплив супернатанта фетальних нейрогенних клітин (ФНК) щура на пролі-
феративну активність культивованих клітин гліоми мозку щура (клітинна лінія C6). Су-
пернатант ФНК отримували із суспензії клітин мозку плодів щура на 14-ту добу гестації
(Е14). До культурального середовища експериментальних культур додавали 0.10 мг/мл
супернатанта та інкубували 48 год. Імуноцитохімічне забарвлення щодо маркера про-
ліферації Ki-67 проводили з використанням кролячих моноклональних антитіл до цього
протеїну. Після інкубації в присутності супернатанта ФНК у культурах клітин гліоми
С6 з’являлися дегенеративні та некробіотично змінені пухлинні клітини із заокруглени-
ми цитоплазматичними тілами та редукцією відростків. В умовах дії ФНК порівняно з
контрольними спостереженнями середня щільність клітин у 10 тест-полях зору в експе-
риментальних культурах (0.04 мм2) ставала вірогідно меншою, ніж у контролі (332.0 ±
± 36.0 проти 569.5 ± 70.5; Р = 0.00026); середнє значення ядерно-цитоплазматичного
співвідношення в пухлинних клітинах було дещо (невірогідно) зниженим – 0.28 ± 0.01
проти 0.32 ± 0.02 (P = 0.64), а частка клітин із множинними ядерцями – більш ніж удвічі
меншою – 3.53 ± 0.33 і 7.97 ± 0.25 % (P = 0.053). Індекс мітозу культивованих пухлин-
них клітин, підданих впливу супернатанта, ставав вчетверо нижчим (1.10 ± 0.04 і 4.90 ±
± 0.09 %; P = 0.009), а частка пухлинних клітин, імунопозитивних щодо Ki-67, змен-
шувалась з 27.86 ± 2.91 до 10.47 ± 0.91 % (P = 0.0015). Спостережуваний антипроліфе-
ративний ефект супернатанта ФНК свідчить на користь можливості та доцільності роз-
робки комплексної патогенетичної терапії злоякісних пухлин мозку із застосуванням
препаратів, отриманих із ФНК.
КЛЮЧОВІ СЛОВА: культури клітин гліоми C6, супернатант фетальних нейроген-
них клітин (ФНК), маркер проліферації Ki-67, індекс мітозу (ІМ), індекс проліфе-
рації (ІП).
1ДУ «Інститут нейрохірургії ім. акад. А. П. Ромоданова НАМН України»,
Київ (Україна).
Ел. пошта: lyubichld@gmail.com (Л. Д. Любич);
seveme22@rambler.ru (В. М. Семенова);
morpho.neuro@gmail.com (Т. А. Малишева).
ВСТУП
Незважаючи на постійне вдосконалення методів
діагностики і лікування злоякісних пухлин голов-
ного мозку, захворюваність на такі новоутворення
в Україні в 2013 р. за даними Національного кан-
цер-реєстру становила 5.6 на 100 тисяч населення,
а смертність – 3.9 % [1]. Найчисленнішу групу се-
ред пухлин ЦНС складають гліоми; найбільш зло-
якісними варіантами останніх є гліобластоми. Лі-
кування гліобластом зараз базується на хірургічних
втручаннях, променевій терапії та хіміотерапії; по-
чинають застосовуватися деякі новітні техноло-
гії [2]. Незважаючи на певний прогрес, середній
термін життя пацієнтів після діагностування гліо-
бластоми (медіана відповідного розподілу) на да-
ний час становить близько 15 місяців, а програді-
єнтний перебіг захворювання є майже неминучим.
У зв’язку з цим у нейроонкології сьогодні активно
розробляється новий напрямок – персоналізована,
або цілеспрямована (таргетна), специфічна терапія
гліом. Вона базується на пошуку певних прийомів
лікування для кожного пацієнта на основі виявлен-
ня унікального набору молекулярних змін (геном-
них та епігеномних мутацій) у клітинах пухлини із
застосуванням молекулярних маркерів [3], що під-
вищує ефективність лікувальних схем. Одним із
NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2016.—T. 48, № 4266
Л. Д. ЛЮБИЧ, В. М. СЕМЕНОВА, Т. А. МАЛИШЕВА та ін.
загальновизначених маркерів злоякісних клітин є
маркер проліферації Кі-67, який характеризує здат-
ність клітин новоутворення до безконтрольного
поділу (саме це й зумовлює їх біологічну агресив-
ність).
У дослідженнях механізмів канцерогенезу в го-
ловному мозку зараз широко використовуються
первинні та дисоційовані культури клітин, отримані
з різних гістологічних варіантів відповідних пух-
лин. Застосування таких моделей відкриває певні
перспективи для теоретичного обгрунтування но-
вих підходів у лікуванні цих нейроонкологічних за-
хворювань [4]. Первинна культура гліальних пух-
лин є загальновизнаною адекватною моделлю для
кількісної оцінки реакцій пухлинних клітин на пря-
мий вплив різних антибластичних чинників.
Одним із сучасних підходів у лікуванні гліом,
що зараз інтенсивно розробляється, є використан-
ня нейрогенних стовбурових та прогеніторних
клітин (НСК/НПК) [5–9]. Виявилося, що НПК у ми-
шей та щурів демонструють певні протипухлинні
властивості [10–14], проте механізми такої дії
поки залишаються нез’ясованими. Згідно з дани-
ми попередніх досліджень, клітини нервової систе-
ми плодів щурів 18–20-ї доби гестації (фетальні клітини
ЦНС) здатні пригнічувати клітини експериментальної
гліоми 101.8 в умовах як in vitro [15, 16], так і in vivo
(при гетеротрансплантації під капсулу нирки ми-
шей) [15]. В експериментах in vivo було показано
протипухлинний вплив супернатанта фетальних
клітин мозку щура 14–16-ї доби гестації у щурів із
гліомою 101.8 [17].
У нашій роботі ми оцінювали вплив супернатан-
та фетальних нейрогенних клітин (ФНК) щура на
проліферативну активність культивованих клітин
гліоми щура С6.
МЕТОДИКА
Матеріалом для культивування слугували клітини
гліоми головного мозку щурів (клітинна лінія С6).
Зразки було отримано від «Клітинного банку лі-
ній тканин людини та тварин» Інституту експери-
ментальної патології, онкології і радіобіології ім.
Р. Є. Кавецького НАН України (Київ). Досліджу-
вали контрольні культури, утримувані в стандарт-
них умовах культивування без впливу супернатан-
та ФНК (n = 8), та культури, піддані впливу 0.10
мг/мл цього супернатанта протягом 48 год культи-
вування (n = 8).
Супернатант ФНК отримували із суспензії
нейрогенних клітин мозку щура на 14-ту добу
гестації (Е14). Зразки нативної тканини моз-
ку щура, отримані в зазначені строки, звільняли
у фізіологічному розчині від оболонок, пере-
носили в середовище DМЕМ («Sigma», ФРН) і
диспергували за допомогою шприца з товстою
голкою. Клітини осаджували із суспензії, засто-
совуючи центрифугування протягом 5 хв при
1500 об./хв, відмивали в середовищі DMEM,
до осаду клітин додавали свіже середовище
DMEM та піддавали цей осад ресуспендуванню.
Життєздатність клітин у суспензії визначали за
допомогою стандартного цитотоксичного тесту
з 0.2 %-вим трипановим синім (“Merck”, ФРН).
Концентрацію клітин доводили до 6.0 ∙ 106 мл-1,
до отриманої клітинної суспензії додавали мітоген
конканавалін А (0.10 мг/мл) та утримували протя-
гом 2 год в інкубаторі (температура 37.0 ± 0.5 °С,
вологість 95 %, вміст СО2 5 %). Після інкубації
клітини осаджували за допомогою центрифугу-
вання протягом 5 хв при 1500 об./хв та відмивали
в середовищі DMEM. До осаду клітин додава-
ли свіже середовище DMEM, ресуспендували та
інкубували протягом 24 год. Після такої інкубації
клітини повторно осаджували, застосовуючи цен-
трифугування протягом 5 хв при 1500 об./хв,
відбирали отриманий супернатант, визначали в
ньому концентрацію білка, стандартизували до
концентрації останнього 0.1 мг/мл, аліквотизували
і зберігали при –20 ± 0.5 °С.
Для отримання первинних культур зраз-
ки клітин гліоми С6, що вміщували 106 оди-
ниць, висівали на покривні адгезивні скельця,
вкриті поліетиленіміном (“Sigma”, ФРН). Скель-
ця вміщували в чашки Петрі. Культуральне сере-
довище складалось із суміші середовища 199 та
DMEM (1:1) з додаванням 10 % ембріональної
телячої сироватки, 400 мг% глюкози та 0.2 од/мл
інсуліну. Культури клітин тримали у вуглекислот-
ному інкубаторі (37 °С, вологість 95 %, вміст СО2
5 %) та прижиттєво спостерігали з використанням
інвертованого мікроскопа “Eclips TS 100” (Японія).
Для дослідження впливу супернатанта ФНК
на первинні культури відбирали культури з
рівномірною зоною росту (n = 8), додавали до
культурального середовища 0.10 мг/мл супер-
натанта та інкубували протягом 48 год. Культу-
ри фіксували 10 %-вим формаліном і піддавали
цитологічному та імуноцитохімічному аналізу. Для
цитологічного дослідження культури забарвлювали
NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2016.—T. 48, № 4 267
ВПЛИВ СУПЕРНАТАНТА ФЕТАЛЬНИХ НЕЙРОГЕННИХ КЛІТИН
гематоксиліном Караччі.
Імуноцитохімічне забарвлення щодо марке-
ра проліферації Кі-67 проводили з використанням
кролячих моноклональних антитіл до цього марке-
ра (“Thermo Scientific”, США) та системи детекції
Ultra Vision Quanto Detection System HRP DAB
Chromogen (“Thermo Scientific”, США) згідно з по-
передньо відпрацьованою методикою. Для цього
фіксовані клітини культури регідрували; темпера-
турне «демаскування» антигенів проводили за до-
помогою нагрівання зразків у цитратному буфері
(0.01 М, рН 6.0) на водяній бані (95–99 ºС) протя-
гом 20 хв. Потім скельця з клітинами охолоджували
при кімнатній температурі протягом 20 хв і перено-
сили у фосфатний буфер (0.01 М, рН 6.0) на 5 хв.
Для блокування ендогенної пероксидази скельця з
культурами інкубували 10 хв у темряві з 3 %-вим
розчином Н2О2, після чого промивали 5 хв у фос-
фатному буфері, а для блокування неспецифічного
фонового забарвлення – інкубували 5 хв з реа-
гентом Ultra V block (“Thermo Scientific”, США).
Після промивання у буфері на скельця наносили
кролячі моноклональні антитіла до Кі-67 (“Thermo
Scientific”, США) у розведенні 1:100 та інкубували
20 хв при кімнатній температурі. Подальше забарв-
лення здійснювали із застосуванням стандартної
системи візуалізації Ultra Vision Quanto (“Thermo
Scientific”, США). Після промивання дистильо-
ваною водою культури додатково забарвлювали
гематоксиліном Майєра і заключали в бальзам. Па-
ралельно проводили постановку позитивного і не-
гативного (n = 8) контролів.
Мікроскопічне дослідження та фотореєстрацію
цитологічних препаратів первинних культур
здійснювали з використанням світлооптичного
фотомікроскопа Axiophot (“OPTON”, ФРН) з
об’єкт-мікрометром “Carl Zeiss” (ФРН). Визначен-
ня кількісних характеристик контрольних культур
та культур, підданих дії супернатанта, проводи-
ли в 10 тест-полях зору, застосовуючи стандарт-
ну вимірювальну шкалу (об’єкт-мікрометр).
Оцифровані зображення клітин аналізували з ви-
користанням комп’ютерного аналізатора зобра-
жень САІ-01АВН „SELMI” (Україна) та програм-
ного забезпечення «Кappa opto-electronics GmbH»
(ФРН). Цитологічний аналіз включав у себе визна-
чення індексу мітозу (ІМ) та індексу проліферації
(ІП). У перебігу морфометричного аналізу в 10
довільно вибраних тест-полях зору (0.04 мм2) для
кожного зразка при однаковому збільшенні (×800)
підраховували середню кількість клітин у межах
тест-поля (щільність), середні площі перерізів
ядер клітин і перерізів цитоплазми у тест-полі та
кількість ядерець в ядрах клітин. Значення ядер-
но-цитоплазматичного відношення встановлювали
як результат поділу площі перерізу ядер на площу
перерізу цитоплазми.
Підрахунок випадків мітозів виконували в трьох
спостереженнях культур кожного зразка також
у 10 випадково вибраних полях зору мікроскопа
(×800). У кожному вимірюванні підраховували не
менше 1000 клітин та визначали ІМ як нормова-
ну кількість клітин з проявами мітозу (%) щодо
загальної кількості клітин, прийнятої за 100 %.
Кількість Кі-67-імунопозитивних та негатив-
них клітин також визначали в 10 довільно вибра-
них полях зору для кожного зразка при однаковому
збільшенні (×800); ІП вираховували як нормовану
кількість Кі-67-імунопозитивних клітин (%), при-
ймаючи загальну кількість клітин за 100 %.
Статистичну обробку даних проводили з вико-
ристанням пакета статистичних програм «Statistica
6.0» (програмне забезпечення StatSoft Inc., США,
2003). Застосовували параметричні (t-критерій
Ст’юдента та двовибірковий t-тест із різними
дисперсіями) та непараметричні (критерій Ман-
на–Уїтні для порівняння незалежних груп) методи
варіаційної статистики. Нормальність розподілу
даних визначали за критерієм Шапіро–Уїлка. Ста-
тистично значущими вважали відмінності при
P < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Контрольні первинні культури гліоми С6 головно-
го мозку щурів. Протягом перших діб культивуван-
ня в мікроексплантаті спостерігалися розростання
пухлинних клітин недиференційованого феноти-
пу. Для них були характерними невелика площа
перерізу цитоплазми та ядра з помірними проявами
атиповості (рис. 1, A). В препаратах були наявни-
ми ущільнені клітинні мікроагрегати, розділені мо-
ношаровими ділянками клітин астроцитарного фе-
нотипу з вираженими відростками, які утворювали
ретикулярні структури (Б). Серед клітин з проява-
ми мітозу зустрічалися патологічні форми цього
процесу, що є характерною властивістю злоякісних
пухлин головного мозку.
У подальші строки спостереження (четверта–шо-
ста доби) в культурах гліоми С6 виявлялося розрих-
лення клітинних мікроагрегатів. Серед клітин пере-
NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2016.—T. 48, № 4268
Л. Д. ЛЮБИЧ, В. М. СЕМЕНОВА, Т. А. МАЛИШЕВА та ін.
Р и с. 1. Морфологія культивованих клітин гліоми С6 та вплив на неї супернатанта фетальних нейрогенних клітин – ФНК (світлова
мікроскопія, живі незабарвлені культури).
На А – друга доба, контроль. Множинні багатошарові мікроагрегати. На Б – третя доба, контроль. Утворення сіткоподібних
структур клітинами астроцитарного фенотипу. На В – Е – після інкубації із 0.10 мг/мл супернатанта ФНК протягом 48 год (В –
дистрофовані пухлинні клітини, клітини-тіні; Г – клітини-тіні; Д – редукція відростків; Е – дифузно розташовані окремі пухлинні
клітини з наявністю відростків).
20 мкм
20 мкм
20 мкм
20 мкм
20 мкм
20 мкм
А
А Б
В Г
Д Е
NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2016.—T. 48, № 4 269
ВПЛИВ СУПЕРНАТАНТА ФЕТАЛЬНИХ НЕЙРОГЕННИХ КЛІТИН
важали пухлинні одиниці астроцитарного фенотипу
уніполярної, трикутної або ромбоподібної форми з
довгими поодинокими відростками, які формува-
ли ретикулярну структуру. У недиференційованих
пухлинних клітинах середнє значення ІМ складало
4.90 ± 0.01 %.
На восьму-дев’яту добу культивування щільність
монокультури зменшувалася внаслідок десквамації
спонтанно загиблих пухлинних клітин; при цьо-
му з’являлася значна кількість апоптозних тілець.
Дані процеси охоплювали переважну кількість
клітин зони активного росту, за виключенням окре-
мих ділянок ретикулярних структур та клітинних
сфероїдних мікроагрегатів. Останні були оточені
моношаровими розростаннями недиференційованих
клітин.
Для дослідження впливу супернатанта ФНК
на п’яту-шосту добу відбирали культури з
рівномірною зоною росту. Морфометричний аналіз
таких препаратів культур у цей термін показав,
що середня кількість клітин у 10 довільно вибра-
них полях зору (0.04 мм2) становила 569.5 ± 70.5,
а середнє значення ядерно-цитоплазматичного
співвідношення у пухлинних клітинах дорівнювало
0.32 ± 0.02 (рис. 2, А). Частка клітин, в ядрах яких
візуалізувалося одне ядерце, становила 8.44 ± 0.91.
Клітини з двома ядерцями складали в середньому
4.53 ± 0.16, а з трьома і більше – 7.97 ± 0.25 % (Б).
Як відомо, наявність ядерець корелює з активністю
синтетичних транскрипційних і трансляційних
процесів в ядрі; мультиплікація ядерець є харак-
терною ознакою злоякісних гліом [18].
Частка пухлинних клітин, імунопозитивних щодо
Кі-67 (ІП), становила в середньому 27.86 ± 2.91 %
(рис. 2, В, 3). Ядерно-цитоплазматичне співвідно-
шення у проліферуючих (Кі-67-імунопозитивних)
клітинах статистично високозначуще перевищува-
ло цей показник у Кі-67-імунонегативних клітинах
(0.39 ± 0.04 порівняно з 0.24 ± 0.02; Р = 0.0070).
Таким чином, у стандартних умовах культиву-
вання клітини гліоми С6 головного мозку щурів
виявляли високу проліферативну активність.
У монокультурі переважала популяція клітин
недиференційованого фенотипу. В той же час части-
на пухлинних клітин демонстрували морфологічні
ознаки астроцитарного диференціювання, що
є підтвердженням астроцитарного походження
гліоми С6 щурів.
Дослідження впливу супернатанта ФНК на
первинні культури гліоми С6. Через 48 год інкубації
культур гліоми С6 із супернатантом ФНК (Е14)
0
2
4
6
8
10
12
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%
%
0
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
Р и с. 2. Кількісні показники первинних культур гліоми С6
у контролі (К) та в умовах впливу 0.10 мг/мл супернатанта
фетальних нейрогенних клітин протягом 48 год.
А – ядерно-цитоплазматичне співвідношення в клітинах
загальної популяції (1), Кі-67-позитивних (2) і Кі-67-
негативних (3) клітинах. Б – нормована кількість клітин з
одним (1), двома (2) та трьома і більше (3) ядерцями в ядрі. В –
нормована щільність клітин (кількість клітин у тест-полі зору):
1 – загальна щільність (даний показник у контролі прийнято за
100 %); 2 – щільність Кі-67-позитивних клітин.
К
К
1
1
1
2
2
2
3
3
К
ФНК
ФНК
ФНК
А
Б
В
у концентрації 0.10 мг/мл у зоні росту культур
з’являлися дистрофічно або некробіотично змінені
пухлинні клітини із заокругленими цитоплазма-
тичними тілами та гіперхромними ядрами, а та-
кож значна кількість клітин-тіней (рис. 1, В, Г).
Щільність клітинного моношару ставала меншою,
а частка пухлинних клітин з ознаками руйнування
А
NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2016.—T. 48, № 4270
Л. Д. ЛЮБИЧ, В. М. СЕМЕНОВА, Т. А. МАЛИШЕВА та ін.
Р и с. 3. Морфологічні зміни у первинних культурах гліоми С6 під впливом супернатанта фетальних нейрогенних клітин
(імуноцитохімічне забарвлення щодо Кі-67 із дозабарвленням гематоксиліном Майєра).
А, В, Д – контроль; Б, Г, Е – після інкубації із 0.10 мг/мл супернатанта протягом 48 год. Стрілками вказані апоптозні тільця.
20 мкм
20 мкм
10 мкм
20 мкм
20 мкм
10 мкм
А Б
В Г
Д Е
NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2016.—T. 48, № 4 271
ВПЛИВ СУПЕРНАТАНТА ФЕТАЛЬНИХ НЕЙРОГЕННИХ КЛІТИН
(редукція відростків, заокруглення цитоплазматич-
них тіл) – більшою (Д). Пухлинні клітини внаслідок
дистрофічних змін та руйнування цитоплазми набу-
вали вигляду «голих» ядер. У той же час у препара-
тах були присутні окремі пухлинні клітини з пооди-
нокими короткими ущільненими відростками (Е).
Середній ІМ (1.10 ± 0.04 %) був вірогідно нижчим
порівняно з контролем (Р = 0.009).
Результати морфометричного аналізу препаратів
дослідних культур у цей термін та порівняння з
контролем показали, що в умовах впливу суперна-
танта середня кількість клітин у 10 довільно ви-
браних полях зору (0.04 мм2) ставала статистично
високозначуще меншою (332.0 ± 36.0; Р = 0.00026).
Середній показник ядерно-цитоплазматично-
го співвідношення в пухлинних клітинах дещо
(невірогідно) знижувався (0.28 ± 0.01; Р > 0.05;
рис. 2, А). Частка клітин, в яких візуалізувалося
одне ядерце, становила 8.97 ± 0.26 % (Р = 0.068
порівняно з контролем). Клітини з двома ядерця-
ми складали в середньому 8.15 ± 0.16 % (Р = 0.28
порівняно з контролем), а кількість клітин з трьома
ядерцями і більше ставала меншою (3.53 ± 0.33 %;
Р = 0.053 порівняно з контролем; Б). Такі зміни
свідчать про певне зниження інтенсивності синте-
тичних транскрипційних і трансляційних процесів
в ядрах пухлинних клітин в умовах впливу ФНК.
Середній ІП під впливом супернатанта ФНК ста-
вав статистично високозначуще меншим (10.47 ±
± 0.91 %; Р = 0.0015 порівняно з контролем) (рис. 2,
В, 3). Ядерно-цитоплазматичне співвідношення в
проліферуючих (Кі-67-імунопозитивних) клітинах
у таких зразках практично не відрізнялося від цього
показника в Кі-67-імунонегативних клітинах (0.29 ±
± 0.02 порівняно з 0.27 ± 0.02). Одночасно, про-
те, виявлялася тенденція до зменшення ядерно-ци-
топлазматичного співвідношення в проліферуючих
клітинах після впливу ФНК (0.29 ± 0.02) порівняно
з відповідним показником у контрольних культурах
(0.39 ± 0.04; Р = 0.19).
Отже, результати дослідження впливу на
культивовані пухлинні клітини гліоми С6 супер-
натанта ФНК (Е14) у використаній концентрації
протягом 48 год свідчать про виражений
антипроліферативний ефект цього супернатанта;
останній, очевидно, вміщує певні високоактивні
агенти. Зокрема, відомо, що мультипотентні НПК
людини, щура і миші можуть експресувати як
прозапальні, так і супресорні цитокіни (IL-1a, IL-
1b, IL-6, IL-10, TGF-b1, TGF-b2, TNF-a, LIF) [19–
21]. За даними наших попередніх досліджень,
супернатант ФНК у своєму складі вміщує дві
основні фракції білків з молекулярними маса-
ми 67 (55 %) та 46 (44 %) кДа, а також мінорні
фракції, в яких визначаються BDNF, TGF-b1, IL-
1b та IL-4 [22]. У зв’язку з цим ми вважаємо, що
антипроліферативний ефект супернатанта ФНК зу-
мовлений в основному відповідними властивостя-
ми TGF-b1 (регуляція проліферації, диференціації
та виживання / апоптозу клітин [23–25]) та, мож-
ливо, BDNF (зв’язування з рецепторами супер-
родини фактора некрозу пухлин). BDNF активує
внутрішньоклітинні сигнальні каскади (NF-
kB, Jun-кіназу), які опосередковують ініціацію
програмованої загибелі клітини, тобто апоптозу
[26].
Таким чином, можна дійти висновку, що застосу-
вання первинної культури гліоми С6 головного моз-
ку щура є адекватною моделлю для оцінки впли-
ву супернатанта клітин фетального мозку щура на
клітини вказаної пухлини. В умовах дії супернатан-
та ФНК у концентрації 0.10 мг/мл на такі культури
протягом 48 год відбуваються зменшення загальної
кількості клітин у культурі (їх щільності), знижен-
ня ядерно-цитоплазматичного співвідношення в
проліферуючих клітинах, зменшення частки клітин
із множинними ядерцями та зниження ІМ та ІП.
Отримані результати потребують подальшого по-
глибленого аналізу. Проте вони вже зараз можуть
стати основою для теоретичного обгрунтування
комплексної патогенетичної терапії злоякісних пух-
лин головного мозку та для розробки препаратів із
ФНК.
Зразки культур клітин гліоми головного мозку щурів
були люб’язно надані нам «Клітинним банком ліній тканин
людини та тварин» Інституту експериментальної патології,
онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького НАН Украї-
ни. Дослідження було проведено на культивованих клітинах
гліоми головного мозку щурів; отже, методика експеримен-
тів не потребує підтвердження існуючим етичним стандар-
там для робіт на тваринах.
Автори даної роботи – Л. Д. Любич, В. М. Семенова,
Т. А. Малишева, Л. П. Стайно та В. В. Васлович – ствер-
джують про відсутність будь-яких конфліктів щодо комер-
ційних або фінансових відносин, відносин з організаціями
або особами, котрі будь-яким чином могли бути пов’язані з
дослідженням, а також взаємовідносин співавторів статті.
NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2016.—T. 48, № 4272
Л. Д. ЛЮБИЧ, В. М. СЕМЕНОВА, Т. А. МАЛИШЕВА та ін.
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ
1. “Рак в Україні, 2013–2014. Захворюваність, смертність,
показники діяльності онкологічної служби”, Бюл. Нац.
Канцерреєстру, № 16, 56-57 (2015).
2. L. Ampie, E. C. Woolf, and C. Dardis, “Immunotherapeutic
advancements for glioblastoma,” Front. Oncol., 5, 1-8 (2015).
3. Ch. I. Ene and E. C. Holland, “Personalized medicine for
gliomas,” Surg. Neurol. Int., 6, No. 1, S89-S95 (2015).
4. Ю. А. Зозуля, И. Г. Васильева, А. Я. Главацкий и др., “Фо-
тодинамическая терапия глиом головного мозга”, в кн.:
Глиомы головного мозга, под ред. Ю. А. Зозули, УИПК
«ЕксОб», Киев (2007), с. 495-501.
5. И. С. Брюховецкий, А. С. Брюховецкий, П. В. Мищенко и
др., “Cтволовые клетки в терапии злокачественных опу-
холей головного мозга: реальность и перспективы”, Клин.
практика. № 4, 45-57 (2013).
6. P. Achanta, N. I. Sedora Roman, and A. Quiñones-Hinojosa,
“Gliomagenesis and the use of neural stem cells in brain tumor
treatment,” Anticancer Agents Med. Chem., 10, No. 2, 121-130
(2010).
7. A. U. Ahmed, I. V. Ulasov, R. W. Mercer, and M. S. Lesniak,
“Maintaining and loading neural stem cells for delivery of
oncolytic adenovirus to brain tumors,” Methods Mol. Biol.,
797, 97-109 (2012).
8. M. S. Bovenberg, M. H. Degeling, and B. A. Tannous,
“Advances in stem cell therapy against gliomas,” Trends Mol.
Med., 19, No. 5, 281-291 (2013).
9. S. Ito, A. Natsume, S. Shimato, et al., “Human neural stem
cells transduced with IFN-beta and cytosine deaminase genes
intensify bystander effect in experimental glioma,” Cancer
Gene Ther., 17, No. 5, 299-306 (2010).
10. S. U. Kim, “Neural stem cell-based gene therapy for brain
tumors,” Stem Cell Rev., 7, No. 1, 130-140 (2011).
11. J. Y. Jeon, J. H. An, S. U. Kim, et al., “Migration of human
neural stem cells toward an intracranial glioma,” Exp. Mol.
Med., 40, No. 1, 84-91 (2008).
12. K. Staflin, M. Lindvall, T. Zuchner, and C. Lundberg,
“Instructive cross-talk between neural progenitor cells and
gliomas,” J. Neurosci. Res., 85, No. 10, 2147-2159 (2007).
13. K. Staflin, G. Honeth, S. Kalliomaki, et al., “Neural progenitor
cell lines inhibit rat tumor growth in vivo,” Cancer Res., 64,
No. 15, 5347-5354 (2004).
14. J. H. Walzlein, M. Synowitz, B. Engels, et al., “The
antitumorigenic response of neural precursors depends on
subventricular proliferation and age,” Stem Cells, 26, No. 11,
2945-2954 (2008).
15. Н. И. Лисяный, Г. М. Олейник, О. В. Маркова и др., “Влия-
ние клеток головного мозга на рост опухолей под капсулой
почки in vivo”, в кн.: Иммунная система головного мозга,
под ред. Н. И. Лисяного, ВИПОЛ, Киев (1999), с. 116-135.
16. В. М. Семенова, В. И. Цимбалюк, Л. П. Стайно и др., “Из-
учение противоопухолевых свойств различных популяций
клеток мозга в культуре нервной ткани”, в кн.: Иммунная
система головного мозга, под ред. Н. И. Лися ного, ВИПОЛ,
Киев (1999), c. 136-146.
17. М. І. Лісяний, Л. Д. Любич та О. Г. Хохлов, “Дослідження
протипухлинної дії прогеніторних нейроклітин (НК) при
експериментальній гліомі головного мозку у щурів”,
Імунологія та алергологія, № 3, 61-66 (2008).
18. В. М. Семенова, Экспериментальноморфологическая оцен-
ка эффективности антибластической терапии глиом го-
ловного мозга, Дис. … д-ра мед. наук, Киев (1992).
19. H. J. Klassen, K. L. Imfeld, I. I. Kirov, et al., “Expression of
cytokines by multipotent neural progenitor cells,” Cytokine,
22, Nos. 3/4, 101-106 (2003).
20. H. C. Chen, H. I. Ma, H. K. Sytwu, et al., “Neural stem cells
secrete factors that promote auditory cell proliferation via a
leukemia inhibitory factor signaling pathway,” J. Neurosci.
Res., 88, No. 15, 3308-3318 (2010).
21. J. Liu, C. Götherström, M. Forsberg, et al., “Human neural
stem/progenitor cells derived from embryonic stem cells and
fetal nervous system present differences in immunogenicity
and immunomodulatory potentials in vitro,” Stem Cell Res.,
10, No. 3, 325-337 (2013).
22. L. D. Liubich, V. M. Semenova, and L. P. Stayno, “Influence
of rat progenitor neurogenic cells supernatant on glioma 101.8
cells in vitro,” Biopolymers Cell, 31, No. 3, 200-208 (2015).
23. B. Kaminska, M. Kocyk, and M. Kijewska, “TGF beta
signaling and its role in glioma pathogenesis,” Adv. Exp. Med.
Biol., 986, 171-187 (2013).
24. J. Zhang, W. Yang, D. Zhao, et al., “Correlation between
TSP-1, TGF-β and PPAR-γ expression levels and glioma
microvascular density,” Oncol. Lett., 7, No. 1, 95-100 (2014).
25. A. M. Dubrovska and S. S. Souchelnytskyi, “Low-density
microarray analysis of TGFb1-dependent cell cycle regulation
in human breast adenocarcinoma MCG7 cell line,” Biopolymers
Cell, 30, No. 2, 107-117 (2014).
26. D. K. Binder and H. E. Scharfman, “Brain-derived neurotrophic
factor,” Growth Factors, 22, No. 3, 123-131 (2004).
|