Конфокальна мікроскопія у центрі користування унікальними приладами при Інституті харчової біотехнології та геноміки НАНУ

Показані можливості використання потенціалу конфокальної мікроскопії для біологічних та біомедичних досліджень у Центрі колективного користування коштовними приладами при Інституті харчової біотехнології та геноміки НАН України. Розглянуто основні принципи конфокальної мікроскопії та історія її ст...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	2009
Hauptverfasser:	Блюм, Я.Б., Шеремет, Я.О., Красиленко, Ю.А., Ємець, А.І.
Format:	Artikel
Sprache:	Ukrainian
Veröffentlicht:	Видавничий дім "Академперіодика" НАН України 2009
Schlagworte:	Світ інновацій
Online Zugang:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/15007
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Конфокальна мікроскопія у центрі користування унікальними приладами при Інституті харчової біотехнології та геноміки НАНУ / Я.Б. Блюм, Я.О.Шеремет, Ю.А. Красиленко, А.І. Ємець // Наука та інновації. — 2009. — Т. 5, № 2. — С. 82-91. — Бібліогр.: 24 назв. — укр.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-15007
record_format	dspace
spelling	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-150072025-02-09T11:43:35Z Конфокальна мікроскопія у центрі користування унікальними приладами при Інституті харчової біотехнології та геноміки НАНУ Конфокальная микроскопия в центре коллективного пользования уникальными приборами при Институте пищевой биотехнологии и геномики НАНУ Confocal microscopy in the centre of collective exploitation of cost expensive equipment at the Institute of food biotechnology and genomics of National academy of sciences of Ukraine Блюм, Я.Б. Шеремет, Я.О. Красиленко, Ю.А. Ємець, А.І. Світ інновацій Показані можливості використання потенціалу конфокальної мікроскопії для біологічних та біомедичних досліджень у Центрі колективного користування коштовними приладами при Інституті харчової біотехнології та геноміки НАН України. Розглянуто основні принципи конфокальної мікроскопії та історія її становлення. Охарактеризовано принцип роботи конфокального мікроскопа LSM 510 META (Carl Zeiss, Німеччина) та продемонстровано його переваги. Наведені приклади використання можливостей конфокального мікроскопа фахівцями відділу геноміки та біотехнології Інституту харчової біотехнології та геноміки, а також інших наукових установ. Показаны возможности использования потенциала конфокальной микроскопии для биологических и биомедицинских исследований в Центре коллективного пользования ценными приборами при Институте пищевой биотехнологии и геномики НАН Украины. Рассмотрены основные принципы конфокальной микроскопии и история ее становления. Охарактеризован принцип работы конфокального микроскопа LSM 510 META (Carl Zeіss, Германия) и продемонстрированы его преимущества. Приведены примеры использования возможностей конфокального микроскопа специалистами отдела геномики и биотехнологии Института пищевой биотехнологии и геномики, а также других научных учреждений. The paper describes the possibilities for confocal microscopy usаge in biological and biomedical investigations in the Centre of Collective Exploitation of Cost Expensive Equipment at the Institute of Food Biotechnology and Genomics of National Academy of Sciences of Ukraine. Main principles of confocal microscopy and history of its establishment are considered. Principle of confocal microscope LSM 510 META (Carl Zeiss, Germany) operation is characterized and its advantages for conducting of investigations in the fields of cell biology, genomics, biomedicine and biotechnology are described. The examples of confocal microscope application by staff of the Department of Genomics and Biotechnology of the Institute and other scientific organizations are presented. 2009 Article Конфокальна мікроскопія у центрі користування унікальними приладами при Інституті харчової біотехнології та геноміки НАНУ / Я.Б. Блюм, Я.О.Шеремет, Ю.А. Красиленко, А.І. Ємець // Наука та інновації. — 2009. — Т. 5, № 2. — С. 82-91. — Бібліогр.: 24 назв. — укр. 1815-2066 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/15007 uk application/pdf Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Світ інновацій Світ інновацій
spellingShingle	Світ інновацій Світ інновацій Блюм, Я.Б. Шеремет, Я.О. Красиленко, Ю.А. Ємець, А.І. Конфокальна мікроскопія у центрі користування унікальними приладами при Інституті харчової біотехнології та геноміки НАНУ
description	Показані можливості використання потенціалу конфокальної мікроскопії для біологічних та біомедичних досліджень у Центрі колективного користування коштовними приладами при Інституті харчової біотехнології та геноміки НАН України. Розглянуто основні принципи конфокальної мікроскопії та історія її становлення. Охарактеризовано принцип роботи конфокального мікроскопа LSM 510 META (Carl Zeiss, Німеччина) та продемонстровано його переваги. Наведені приклади використання можливостей конфокального мікроскопа фахівцями відділу геноміки та біотехнології Інституту харчової біотехнології та геноміки, а також інших наукових установ.
format	Article
author	Блюм, Я.Б. Шеремет, Я.О. Красиленко, Ю.А. Ємець, А.І.
author_facet	Блюм, Я.Б. Шеремет, Я.О. Красиленко, Ю.А. Ємець, А.І.
author_sort	Блюм, Я.Б.
title	Конфокальна мікроскопія у центрі користування унікальними приладами при Інституті харчової біотехнології та геноміки НАНУ
title_short	Конфокальна мікроскопія у центрі користування унікальними приладами при Інституті харчової біотехнології та геноміки НАНУ
title_full	Конфокальна мікроскопія у центрі користування унікальними приладами при Інституті харчової біотехнології та геноміки НАНУ
title_fullStr	Конфокальна мікроскопія у центрі користування унікальними приладами при Інституті харчової біотехнології та геноміки НАНУ
title_full_unstemmed	Конфокальна мікроскопія у центрі користування унікальними приладами при Інституті харчової біотехнології та геноміки НАНУ
title_sort	конфокальна мікроскопія у центрі користування унікальними приладами при інституті харчової біотехнології та геноміки нану
publisher	Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
publishDate	2009
topic_facet	Світ інновацій
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/15007
citation_txt	Конфокальна мікроскопія у центрі користування унікальними приладами при Інституті харчової біотехнології та геноміки НАНУ / Я.Б. Блюм, Я.О.Шеремет, Ю.А. Красиленко, А.І. Ємець // Наука та інновації. — 2009. — Т. 5, № 2. — С. 82-91. — Бібліогр.: 24 назв. — укр.
work_keys_str_mv	AT blûmâb konfokalʹnamíkroskopíâucentríkoristuvannâuníkalʹnimipriladamipriínstitutíharčovoíbíotehnologíítagenomíkinanu AT šeremetâo konfokalʹnamíkroskopíâucentríkoristuvannâuníkalʹnimipriladamipriínstitutíharčovoíbíotehnologíítagenomíkinanu AT krasilenkoûa konfokalʹnamíkroskopíâucentríkoristuvannâuníkalʹnimipriladamipriínstitutíharčovoíbíotehnologíítagenomíkinanu AT êmecʹaí konfokalʹnamíkroskopíâucentríkoristuvannâuníkalʹnimipriladamipriínstitutíharčovoíbíotehnologíítagenomíkinanu AT blûmâb konfokalʹnaâmikroskopiâvcentrekollektivnogopolʹzovaniâunikalʹnymipriboramipriinstitutepiŝevojbiotehnologiiigenomikinanu AT šeremetâo konfokalʹnaâmikroskopiâvcentrekollektivnogopolʹzovaniâunikalʹnymipriboramipriinstitutepiŝevojbiotehnologiiigenomikinanu AT krasilenkoûa konfokalʹnaâmikroskopiâvcentrekollektivnogopolʹzovaniâunikalʹnymipriboramipriinstitutepiŝevojbiotehnologiiigenomikinanu AT êmecʹaí konfokalʹnaâmikroskopiâvcentrekollektivnogopolʹzovaniâunikalʹnymipriboramipriinstitutepiŝevojbiotehnologiiigenomikinanu AT blûmâb confocalmicroscopyinthecentreofcollectiveexploitationofcostexpensiveequipmentattheinstituteoffoodbiotechnologyandgenomicsofnationalacademyofsciencesofukraine AT šeremetâo confocalmicroscopyinthecentreofcollectiveexploitationofcostexpensiveequipmentattheinstituteoffoodbiotechnologyandgenomicsofnationalacademyofsciencesofukraine AT krasilenkoûa confocalmicroscopyinthecentreofcollectiveexploitationofcostexpensiveequipmentattheinstituteoffoodbiotechnologyandgenomicsofnationalacademyofsciencesofukraine AT êmecʹaí confocalmicroscopyinthecentreofcollectiveexploitationofcostexpensiveequipmentattheinstituteoffoodbiotechnologyandgenomicsofnationalacademyofsciencesofukraine
first_indexed	2025-11-25T22:28:20Z
last_indexed	2025-11-25T22:28:20Z
_version_	1849803095321608192
fulltext	82 ВСТУП У 2004 р. Національна академія наук Ук� раїни започаткувала програму забезпечення своїх наукових установ унікальними прилада� ми, для того щоб не допустити відставання у розвитку сучасних напрямів фундаменталь� ної науки та прикладних дисциплін. Зокрема, відсутність новітнього інфраструктурного за� безпечення українських дослідницьких уста� нов уповільнювала процес одержання передо� вих знань у різних галузях сучасної біології. Реалізація цієї програми закупівель дала мож� ливість уже в березні 2005 р. створити при ус� тановах Відділення загальної біології НАН України два Центри колективного користу� вання коштовними приладами унікального обладнання (згідно з Розпорядженням № 104 Президії НАН України від 18 лютого 2005 р.). Одним із них став Центр колективного корис� тування приладами (ЦККП) для геноміки та молекулярної біотехнології рослин ("Ген� тест") (керівник центру — канд. біол. наук В.І. Корховий) у складі відділу геноміки та біотехнології Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України. На початку створення Центру були визна� чені головні напрямки його сервісної діяль� ності. Основні з них: клітинна біологія рослин, розроблення но� вих аспектів інженерії рослин; клітинна та генетична інженерія рослин; Я.Б. Блюм, Я.О. Шеремет, Ю.А. Красиленко, А.І. Ємець КОНФОКАЛЬНА МІКРОСКОПІЯ У ЦЕНТРІ КОРИСТУВАННЯ УНІКАЛЬНИМИ ПРИЛАДАМИ ПРИ ІНСТИТУТІ ХАРЧОВОЇ БІОТЕХНОЛОГІЇ TA ГЕНОМІКИ НАНУ* Наука та інновації. 2009. Т. 5. № 2. С. 82–91. © Я.Б. БЛЮМ, Я.О. ШЕРЕМЕТ, Ю.А. КРАСИЛЕНКО, А.І. ЄМЕЦЬ, 2009 * Стаття підготовлена на основі матеріалів доповіді, виголошеної академіком Блюмом Я.Б. на Науковій кон� ференції "Наукоємна продукція та технології. Технічне забезпечення науково�дослідних лабораторій", що відбулася в Києві у жовтні 2008 року у рамках Форуму "Комплексне забезпечення лабораторій в Україні". Показані можливості використання потенціалу конфокальної мікроскопії для біологічних та біомедичних досліджень у Центрі колективного користування коштовними приладами при Інституті харчової біотехнології та геноміки НАН України. Розглянуто основні принципи конфокальної мікроскопії та історія її становлення. Охарактеризовано принцип роботи кон' фокального мікроскопа LSM 510 META (Carl Zeiss, Німеччина) та продемонстровано його переваги. Наведені приклади ви' користання можливостей конфокального мікроскопа фахівцями відділу геноміки та біотехнології Інституту харчової біотех' нології та геноміки, а також інших наукових установ. К л ю ч о в і с л о в а: Центр колективного користування коштовними приладами, конфокальна мікроскопія, мікроскоп LSM 510 META, клітинна біологія, біомедицина, біотехнологія, цитоскелет. N 2-09.qxd 21.04.2009 15:27 Page 82 геноміка рослин та біоінформатика; методи детекції генетично модифікованого матеріалу; розробка наукових засад біобезпеки. У зв'язку з переходом відділу геноміки та біотехнології з Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України до Дер� жавної установи "Інститут харчової біотехно� логії та геноміки Національної академії наук України", створеної згідно з постановою Пре� зидії НАН України від 02.07.08 № 194 "Про перейменування Інституту харчової хімії і технології НАН України та його подальший розвиток", Центр також перейшов до вищез� гаданої установи. Відповідно головним зав� данням Центру продовжує бути сприяння проведенню високотехнологічних експери� ментальних робіт у галузі клітинної біології, геноміки та біотехнології в Інституті харчової біотехнології та геноміки НАН України, на� дання кваліфікованих послуг вченим установ відділення загальної біології та інших відді� лень НАН України, а також розвиток співпра� ці НАН України з іншими науковими та ос� вітніми закладами. ЦККП Інституту харчової біотехнології та геноміки Національної академії наук України надає послуги в отриманні наукових резуль� татів за допомогою п'яти сучасних приладів, у тому числі конфокального лазерного сканую� чого мікроскопа LSM 510 META (Carl Zeiss, Німеччина). Цей мікроскоп було введено в експлуатацію на початку 2006 р., і на сьогодні він є найсучаснішим приладом не лише в сис� темі установ Національної академії наук, але й інших науково�освітніх закладів України. ЩО ТАКЕ КОНФОКАЛЬНА МІКРОСКОПІЯ? Конфокальна мікроскопія — це сучасний метод і незамінний інструмент для візуаліза� ції та дослідження внутрішньо� і позаклітин� них структур та аналізу клітинних процесів у біологічних та біомедичних дослідженнях [1]. Характерними рисами, що вирізняють конфо� кальну лазерну скануючу мікроскопію з по� між інших різновидів світлової мікроскопії, є її покращена просторова та часова роздільна здатність [2]; високий рівень контрастності зоб� ражень; можливість проведення мультиспект� ральних досліджень з розділенням сигналів від різноманітних флюорохромів; отримання три� вимірного зображення об'єкту (так звана 3D� реконструкція); детальне дослідження визначе� ної ділянки препарату завдяки селективному опроміненню лазером [3]. Конфокальна мікрос� копія дозволяє отримувати "оптичні зрізи" жи� вих та фіксованих препаратів завтовшки до 100 мкм [4]. Зазвичай сучасні конфокальні ска� нуючі мікроскопи обладнані трьома�п'ятьма лазерними системами, що контролюються акустично�оптичним фільтрами для точного регулювання довжини хвилі та інтенсивності лазерного випромінювання. Завдяки наявнос� ті фотопомножувачів із квантовою ефектив� ністю в ультрафіолетовому діапазоні спектра такі мікроскопи дають можливість проводити дослідження у діапазоні 400÷759 нм [3, 4]. Фактично конфокальний мікроскоп спромож� ний виявити присутність окремої молекули [5]. Проте, незважаючи на покращену розділь� ну здатність конфокального мікроскопа, де� талізація зображень, отриманих за допомогою електронного мікроскопа, чіткіша [6]. ІСТОРІЯ СТАНОВЛЕННЯ КОНФОКАЛЬНОЇ МІКРОСКОПІЇ Первинна ідея конфокальної мікроскопії, запатентована у 1961 р., належить М. Мінськи, який всередині 1950�х рр. під час підготовки дисертаційної роботи у Гарвардському універ� ситеті зрозумів необхідність саме прижиттєвих досліджень нефіксованих препаратів нейрон� ної сітки тканин мозку як таких, що макси� мально відтворюють дійсні процеси у ткани� нах мозку [7]. Проте на той час функціональ� на модель конфокального мікроскопа так і не була створена, оскільки не існувало відповід� них джерел освітлення та програмного забез� печення для аналізу великих обсягів графіч� ної інформації. Подальшого розвитку ідея Світ інновацій Наука та інновації. № 2, 2009 83 N 2-09.qxd 21.04.2009 15:27 Page 83 Світ інновацій Наука та інновації. № 2, 200984 М. Мінськи набула у роботах Д.М. Еггера та М. Петрана [4], які наприкінці 1960�х рр. впер� ше сконструювали багатопроменевий конфо� кальний мікроскоп на основі обертального дис� ка Ніпкова для досліджень in vivo немічених зрізів тканин мозку. Надалі Д. Еггер продовжив пошуки і у 1973 р. опублікував перші інформа� тивні конфокальні зображення клітин [4]. Про� тягом 1970—80�х років інтерес до можливостей конфокальної мікроскопії зростав, відбувався посилений розвиток комп'ютерних та лазерних технологій, винайдення новітніх алгоритмів об� робки цифрових зображень [4]. Ідеї М. Мінськи отримали практичне вті� лення у 1979 р., коли датський фізик Ф. Бра� кендорф розробив лазерний скануючий кон� фокальний мікроскоп, а К. Шепард сформу� лював основи теорії формування зображень [4]. Т. Вільсон, Б. Амос і Д. Уайт у 1985 р. про� демонстрували можливість використання кон� фокальної мікроскопії для дослідження флюо� ресцентних препаратів [8]. Перші комерційні прилади з'явилися у 1987 р. Протягом 1990�х рр. відбулося стрімке вдосконалення волоконної оптики, винайдення нових фізичних та хіміч� них методів просвітлення лінз, тонких діелект� ричних покриттів, детекторів із низьким рів� нем шуму [1, 4], а "коеволюція" конфокальних мікроскопів та флуоресцентних барвників призвела до появи і вдосконалення чисельних синтетичних молекулярних маркерів та барв� ників природного походження, зокрема зеле� ного флюоресцентного білка (Green Fluores� cent Protein — GFP) із медузи Aequorea victoria та його модифікованих аналогів — жовтого, червоного тощо [9]. Рис. 1. Схематичне зображення проход� ження лазерних променів та принципові складові конфокального мікроскопа [4] N 2-09.qxd 21.04.2009 15:27 Page 84 ПРИНЦИП РОБОТИ КОНФОКАЛЬНОГО МІКРОСКОПА Основний принцип конфокальної мікрос� копії полягає в збігу фокальних площин мік� роскопа (рис. 1) [4, 10, 11]. У об'єктива оптич� ного мікроскопа є дві площини — фокальна, де розміщується досліджуваний об'єкт, та співвідносна до неї конфокальна площина, ку� ди об'єкт проектується. Ця проекція, зазви� чай, і розглядається спостерігачем через оку� ляр. Точкова конфокальна діафрагма ("pinho� le") розміщена в конфокальній площині так, що її проекція точно збігається з фокусом джере� ла монохроматичного випромінювання. Принцип та схема роботи сучасного лазер� ного конфокального мікроскопа такі: когере� нтне світло, випромінюване лазером, прохо� дить через отвори двох точкових діафрагм (перед джерелом випромінювання та перед детектором фотопомножувача). Оскільки ла� зерне випромінювання відбивається дих� роїчним дзеркалом та сканується вздовж пре� парату у певній фокальній площині, вторинна флюоресценція повертається крізь препарат у тій самій фокальній площині та фокусується як конфокальна точка на детекторі апертури точкової діафрагми. При цьому діаметр точ� кової діафрагми контролює товщину оптич� ного зрізу, оскільки відсікає флюоресцентне світло, що виходить від об'єкта поза зоною фокальної площини. Таким чином формуєть� ся певний "просторовий фільтр", що дає мож� ливість знімати інформацію тільки в окремих тонких оптичних площинах зразка на відміну від традиційної люмінесцентної мікроскопії, яка забезпечує детектування флюоресценції з усієї освітленої (в тому числі позафокусної) частини зразка, створюючи при цьому неко� нтрастне зображення з невисокою роздільною здатністю. Значна частина флюоресцентного випромінювання над і під фокальною площи� ною об'єктива не є конфокальною відносно точкової діафрагми (промені поза фокальною площиною) і формує широкі диски Ейрі у площині апертури. Лише незначна кількість позафокусного флюоресцентного випроміню� вання проходить через апертуру точкової ді� афрагми, а решту периферійного світла фото� помножувач не реєструє, тому воно не відіграє суттєвої ролі у формуванні конфокального зображення. Отже, спрощена схема отримання зобра� ження за допомогою лазерного скануючого конфокального мікроскопа виглядає так: ла� зерний промінь сканує флюоресцентний зра� зок; надалі точкова діафрагма затримує "шу� мове" світло і на чутливий детектор потрап� ляє лише світло від досліджуваного об'єкта у фокусі. Отримані дані об'єднуються у зобра� ження вже при обробці цифрових сигналів. Кінцеве зображення є тонким висококонтра� стним оптичним зрізом зразка в площині XY з достатньо інформативною роздільною здатніс� тю. Якщо фокусну площину зсувати відносно осі Z, то можна отримати тривимірне об'ємне зображення. Спеціальна система незалежних скануючих дзеркал, розташованих у взаємно перпендикулярних площинах, дає змогу пе� реміщувати лазерний фокус у середині зразка в площині XY. Змінена таким чином в кожній точці (пікселі) інтенсивність флюоресценції надає можливості отримувати тонкий XY "оптичний зріз". Завдяки позиційному пере� міщенню зразка уздовж вісі Z з'являється можливість проводити крок за кроком поша� рове Z�оптичне секціонування. Подальша комп'ютерна тривимірна обробка "оптичних зрізів" та їх реконструкція дає можливість от� римати контрастне по всьому об'єму триви� мірне флюоресцентне зображення досліджу� ваного об'єкта. За цими параметрами можна відтворити зображення будь�якого "оптично� го зрізу" зразка, навіть вертикального у попе� речних площинах XZ або YZ, що абсолютно не можливо для звичайної світлової мікрос� копії. Світ інновацій Наука та інновації. № 2, 2009 85 N 2-09.qxd 21.04.2009 15:27 Page 85 Світ інновацій Наука та інновації. № 2, 200986 КОНФОКАЛЬНИЙ ЛАЗЕРНИЙ СКАНУЮЧИЙ МІКРОСКОП Сarl Zeiss LSM 510 META Конфокальний лазерний скануючий мікро� скоп Carl Zeiss LSM 510 META призначений для кількісного обчислення та аналізу цифро� вих зображень (рис. 2), зокрема для визначен� ня інтенсивності флюоресценції барвників, відстаней між окремими клітинними структу� рами, динаміки роботи іонних каналів [1, 10, 12]. Дана модель мікроскопа дає можливість швидко детектувати та обчислювати спект� ральні характеристики флюоресцентних барв� ників, піки емісії яких наближені один до одно� го, або є такими, що перекриваються [13, 14]. Програмне забезпечення Carl Zeiss надає можливості аналізувати ряд важливих пара� метрів (зокрема ступінь колокалізації мічених структур, концентрацію іонів за інтенсивністю флюоресценції); знімати множинні часові се� рії мультифлюоресцентних зображень; здійс� нювати три� і чотиривимірну реконструкцію об'єктів; анімувати серію "оптичних зрізів"; ви� мірювати просторові параметри; використову� вати метод відновлення флюоресценції після фотовідбілювання (FRAP) для отримання кількісної та якісної інформації про кінетику внутрішньоклітинних транспортних процесів, а також метод флюоресцентного резонансно� го переносу енергії (FRET) для дослідження міжмолекулярних та білок�білкових взаємо� дій [15]. Конфокальний мікроскоп LSM 510 META — це одна з останніх модифікацій лазерних ска� нуючих модулів [14]. Основною його відмін� ністю від інших конфокальних мікроскопів спорідненого класу є заміна двох (з чотирьох) конфокальних одноканальних детекторів на один поліхроматичний 32�канальний META� детектор. Розкладене на спектральні складові емітоване світло після проходження через конфокальну діафрагму незалежно детек� тується у 32�х чутливих каналах. Відповідно кожна одиниця зображення, окрім тривимір� них координат, має ще й інформацію про спект� ральний розподіл інтенсивності ("lambda stacks", λ�зрізи). Описана технологія отрима� ла назву "емісійного відбитка пальців", оскіль� ки вона дозволяє із високим ступенем вірогід� ності реєструвати кожен флюоресцентний компонент як окремий канал. Навіть у випад� ку незначного перекриття (накладання) спек� трів емісії флюоресцентних барвників скану� вання зображення із використанням методу мультитрекінгу дає можливість одночасно ви� користовувати кілька окремих лазерних ліній і відповідних каналів сканування з індивіду� Рис. 2. Конфокальний лазерний сканую� чий мікроскоп LSM 510 META (Carl Zeiss, Німеччина) N 2-09.qxd 21.04.2009 15:27 Page 86 альними точковими діафрагмами для отри� мання чіткого розділеного мультифлюоресце� нтного зображення. Одночасне поєднання двох підходів — муль� титрекінгу та "емісійної дактилоскопії" в мо� делі мікроскопа LSM 510 META — дає можли� вість повністю усунути проблему перекриття флюоресцентних спектрів при мультифлюо� ресцентному аналізі. Окрім описаного раніше 32�канального поліхроматичного META�де� тектора до складу скануючого модуля конфо� кального мікроскопа LSM 510 META входять ще META�компоненти з двома одноканальни� ми детекторами. Скануюча роздільна здатніс� ть приладу становить від 4 � 1 до 2048 � 2048 пікселів, вільне скануюче обертання — 360° з кроком 1°, максимальне поле сканування — 18 мм у діагональному напрямку. Також мікроскоп надає можливості використовувати одночас� но до 8�и каналів на 13 � 2 швидкостях. Мо� дель LSM 510 може мати до 4�х незалежних конфокальних каналів з індивідуальними точковими діафрагмами (концепція "multiple pinhole"), що є важливим для дійсної конфо� кальної архітектури, оскільки товщина "оп� тичного зрізу" залежить від довжини хвилі флюоресцентного барвника і розміру точко� вої діафрагми. Існує потреба автоматичного налаштування розміру точкової діафрагми кожного з 32�х каналів для отримання серії "оптичних зрізів" мультифлюоресцентного зображення. Саме автоматизації встановлення потрібного розміру точкової діафрагми завдя� чує отримання високої просторової роздільної здатності при максимальній інтенсивності сигналу [13, 14]. До складу лазерного модуля приладу вхо� дять температурно�стабілізований акустично� оптичний регульований фільтр, спроможний миттєво і неперервно протягом мікросекунд� ного інтервалу (<5 мксек) змінювати і контро� лювати інтенсивність випромінювання кожної з 6�и різних лазерних ліній від 0 до 100 %. За наявності акусто�оптичної системи площина сканування чи фотовідбілювання може мати довільну геометричну форму і площину (фун� кція Region оf Interest). У мікроскопі наявні лазери видимого діапазону світла (VIS) (ар� гоновий — 458, 477, 488, 514 нм, гелій�неоно� вий — 543 нм, гелій�неоновий — 633 нм) та ла� зер ультрафіолетового діапазону (UV) (діод� ний — 405—430 нм) [13, 14]. Електронний модуль мікроскопа являє со� бою єдине DSP�управління мікроскопом, VIS та UV лазерними модулями, сканувальним мо� дулем та іншими додатковими компонентами. Крім того, прилад укомплектовано систем� ним блоком (2,8 GHz; 1024 MB DDR� SDRAM; 120 GB Hard disk 7200; CD�RW, DVD; NVIDIA Quarto 4/2xDVI 128 MB) і станцією з двома моніторами високої розділь� ної здатності [13, 14]. У мікроскопі LSM 510 META в моторизованому і керованому специ� фічним програмним забезпеченням оптично� му модулі наявні об'єктиви EC Plan�Neofluar (10x/0.30, 20x/0.5, 40x/0.6 Korr, 40x/1.30 Oil DIC, 63x/0.75 Korr) та Plan�Apochromat (63x/ 1.4 Oil DIC) на базі інвертованого мікроскопа Axiovert 200 M [13, 14]. ДОСЛІДЖЕННЯ, ВИКОНАНІ У ЦЕНТРІ КОЛЕКТИВНОГО КОРИСТУВАННЯ ЗА ДОПОМОГОЮ ЛАЗЕРНОГО СКАНУЮЧОГО КОНФОКАЛЬНОГО МІКРОСКОПА LSM 510 META Як уже зазначалося вище, використання в дослідженнях гена GFP та його різних моди� фікацій, що поклало початок новій ері у вив� ченні структури та функцій живої клітини [9], дає можливість досліджувати складові живих клітин та різноманітні внутрішньоклітинні процеси, а також зміни структури різних тка� нин у реальному часі. Результати різноманіт� них експериментів, виконаних співробітниками відділу геноміки і біотехнології з використан� ням ліній рослин або їх клітин, що експресують GFP у поєднанні з різними білками рослин, на� ведені на рис. 3. Так наприклад, нами була використана лі� нія модельної рослини Arabidopsis thaliana, яка експресує хімерний ген GFP, злитий з одним Світ інновацій Наука та інновації. № 2, 2009 87 N 2-09.qxd 21.04.2009 15:27 Page 87 Наука та інновації. № 2, 200988 Світ інновацій Рис. 3. Зображення біологічних об'єктів, отримані за допомогою мікроскопа LSM 510 META: А (1—12) — гамма�ту� булін (FITC) та хромосоми (пропідіум йодид) у клітинах коренів мутантних рослин Nicotiana sylvestris; Б — oрганізація мікротрубочок in vivo у трихобластах та атрихобластах зони диференціації кореня Arabidopsis thaliana (GFP�MAP4); В — візуалізація структури хроматину за допомогою DAPI у клітинах Nicotiana tabacum; клітини сус� пензійної культури Nicotiana tabacum BY�2 (GFP�MBD) in vivo: Г — організація кортикальних мікротрубочок; Д — веретено поділу; Е — фрагмопласт; Ж — серія оптичних зрізів (Z�серія) продихових клітин листкової пластинки му� тантної лінії Arabidopsis thaliana (GFP�TUA6) з інтервалом 0,3—0,5 мкм; З — тривимірна реконструкція отриманої Z�серії організації мікротрубочок у продихових клітинах листкової пластинки Arabidopsis thaliana (GFP�TUA6) за допомогою програмного забезпечення Image Axiovision (Carl Zeiss, Німеччина). Масштаб — 20 мкм. N 2-09.qxd 21.04.2009 15:27 Page 88 із геном білку, асоційованого з мікротрубоч� ками, що дає можливість візуалізувати такі найважливіші структури клітин, як мікротру� бочки, які приймають участь у підтриманні архітектури будь�якої еукаріотичної клітини, поділі клітин, транспорті везикул і органел, а також у відповіді на фактори навколишнього середовища тощо. Одночасно ці структури є мішенями для ряду речовин, які проявляють протиракову, антипротозойну, антигельмінт� ну, протигрибкову та гербіцидну активність, тому їх дослідження має величезне значення для розвитку різних прикладних та фунда� ментальних напрямків біологічної та медич� ної наук. З використанням вищезазначеної лінії Ara� bidopsis нами були проведені фундаментальні дослідження, пов'язані з вивченням функціо� нального значення ролі фосфорилювання ту� буліну (основного білка мікротрубочок) за за� лишками серину/треонину та тирозину в рос� линній клітині [16, 17], а також з'ясована роль фосфорилювання тубуліну у формуванні ме� ханізмів холодостійкості рослинних клітин [18]. Нами також вивчалася функціональна роль процесів нітротирозилювання мікротру� бочок у клітинах і тканинах під дією оксиду азоту (NO) [19] та його роль у процесах фор� мування стійкості до ультрафіолету В, дія якого здатна викликати виражену апоптотич� ну відповідь у рослинних клітинах (Литвин Д.І., Ємець А.І. та Блюм Я.Б.). Разом з білоруськими колегами нами були отримані трансгенні лінії українських та біло� руських сортів льону [20—22], котрі характери� зуються різною стійкістю до полягання. Перене� сений у такі рослини за допомогою генетичної трансформації хімерний ген GFP�тубулін дає можливість вивчати кореляцію між особливос� тями організації мікротрубочок і локалізацією целюлозних фібрил, які безпосередньо прийма� ють участь у формуванні механічної стійкості клітин стебла льону до полягання. Нами також вивчався механізм дії фенілкар� баматних гербіцидів на клітини рослин [23, 24] та нових синтезованих сполук з класу динітроанілінів на мікротрубочки рослин (Ємець А.І., Ожерєдов С. П. та Блюм Я.Б.). У рамках співпраці з науково�дослідними установами НАН України були проведені дос� лідження різного спрямування. Зокрема вив� чалися особливості бактеріальної корозії, яка є наслідком діяльності мікроорганізмів, що утворюють біоплівку на різноманітних пове� рхнях (відділ загальної та ґрунтової мікробіо� логії Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України); візуалізація процесів накопичення кальцію в рослинних клітинах після обробки гербіцидами динітро� анілінового ряду та їх композиціями з ко� мерційними гербіцидами інших хімічних класів (Інститут фізіології рослин і генетики НАН України); накопичення алкалоїдів в ка� лусній культурі лікарської рослини рауволь� фії зміїній Rauwolfia serpentina L. (відділ гене� тики клітинних популяцій Інституту моле� кулярної біології і генетики НАН України); дослідження колокалізації білків в культурі клітин раку молочної залози (Інститут моле� кулярної біології і генетики НАН України). Також були проведені роботи по дослідженню вдосконалення методів лабораторної діагнос� тики вірусних інфекцій людини, зокрема дос� лідження особливості репродукції ряду рота� вірусних інфекцій в культурі клітин К2 (На� ціональна медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Щупика Міністерства охорони здоров'я України); аналіз трансформованих ліній льону�довгунця Linum usitatissimum L. на наявність експресії зеленого флюоресцентно� го білка в клітинах стебла (Інститут генетики та цитології НАН Білорусії); розробка нових технологій діагностики та лікування онколо� гічних захворювань, а саме дослідження метас� тазування у клітини сечового міхура та проста� ти людини (Національний інститут раку Мі� ністерства охорони здоров'я України). Від 2009 р. Центр колективного користу� вання, почавши функціонувати на базі Інсти� туту харчової біотехнології та геноміки НАН Світ інновацій Наука та інновації. № 2, 2009 89 N 2-09.qxd 21.04.2009 15:27 Page 89 України, включився до роботи по вирішенню проблем, які стосуються біотехнології мікро� організмів, обміну вторинних метаболітів рос� лин, а також розвитку нанобіотехнології. ЛІТЕРАТУРА 1. Robert H.W. Confocal optical microscopy // Rep. Prog. Phys. — 1996. — 59. P. 427—471. 2. Rowland R.E., Nickless E.M. Confocal microscopy opens the door to 3�dimensional analysis of cells // Bioscene. — 2000. — 26(3). — P. 1—7. 3. Verveer P.J., Gemkow M.J., Jovin T.M. A comparison of image restoration approaches applied to three�dimensio� nal confocal and wide�field fluorescence microscopy // J. Microscopy. — 1999. — 193. — P. 50—61. 4. Сlaxon N.S., Fellers T.J., Davidson M.W. Laser scanning confocal mictroscopy // Olympus Fluoview Resource Center. National High Magnetic Field Laboratory. Ret� rieved on 2007�07�25. 5. Peternam E.A.J., Sosa H., Moerner W.E. Single molecule spectroscopу and microscopу for biomedical motors // Ann. Rev. Phys. Chem. — 2004. — 55. — P. 79—96. 6. Pawley J. Fundamental limits in confocal microscopy, in J. B.Pawley (ed.) // Handbook of biological confocal microscopy, New York: Plenum Press. — 1995. — P. 19— 37. 7. Minsky M. Memoir on inventing the confocal scanning microscopy // Scanning. — 1988. — 10. — P. 128—138. 8. Amos W.B., White J.G. How the confocal laser scanning microscope entered biological research // Biol. Cell. — 2003. — 95. — P. 335—342. 9. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W., Prasher D.C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression // Science. — 1994. — 263. — P. 802—805. 10. Confocal laser scanning microscopy: application in re� search and teaching, design, function. Methods // Mic� roscopy from Carl Zeiss. 45�0039 e/04.05. — 2004. — P. 1—23. 11. Murray J. Confocal microscopy, deconvolution, and structured illumination methods, in R. D. Goldman and D. L. Spector (eds.) // Live Cell Imaging: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press. — 2005. — P. 239—280. 12. Wilhelm S., Grobler B., Gluch M., Haramut H. Confocal Laser Scanning Microscopy: Optical image formation and electronic signal processing // Jena, Germany: Carl Zeiss Advanced Imaging Microscopy. — 2003. — P. 258. 13. Wright S.J., Wright D.J. Introduction to confocal micros� copy, in B. Matsumoto (ed.), Cell Biological Applica� tions of Confocal Microscopy. New York: Academic Press // Meth. Cell Biol. — 2002. — 70. — P. 1—85. 14. Carl Zeiss website on contrasting techniques in light microscopy: www.zeiss.de/contrasts. 15. Chen Y., Mills J.D., Periasamy A. Protein localization in living cells and tissues using FRET and FLIM // Diffe� rentiation. — 2003. — 71. — P. 528—541. 16. Шеремет Я.А., Емец А.И., Вербелен Ж.�П., Блюм Я.Б. Влияние ингибитора протеинфосфатаз, окадаино� вой кислоты, на морфологию корня Arabidopsis thaliana и организацию кортикальных микротрубо� чек в его клетках // Цитология и генетика. — 2009. — T. 43, N 1. — С. 3—12. 17. Yemets A., Sheremet Ya., Vissenberg K., Van Orden J., Verbelen J.�P., Blume Ya.B. Effects of tyrosine kinase and phosphatase inhibitors on microtubules in Arabidopsis root cells // Cell Biol. Int. — 2008. — 32, N 6. — P. 630— 637. 18. Шеремет Я.О., Ємець А.І., Блюм Я.Б. З'ясування ролі фосфорилювання тубуліну по залишкам тирозину у формуванні механізмів холодостійкості рослинних клітин. Фактори експериментальної еволюції орга� нізмів: Зб. наук. пр. / Укр. т�во генетиків і селекціо� нерів ім. М.І. Вавилова — К.: Логос, 2008. — Т. 5. — С. 454—458. 19. Емец А.И., Красиленко Ю.А., Шеремет Я.А., Блюм Я.Б. Реорганизация микротрубочек как ответ на реа� лизацию сигнальных каскадов оксида азота (ІІ) в растительной клетке // Цитология и генетика. — 2009. — Т. 43, № 2. — С. 3—12. 20. Баер Г.Я., Баер О.А., Шиша Е.Н., Лемеш В.А., Картель Н.А., Емец А.И., Блюм Я.Б. Визуализация микротру� бочек в клетках льна�долгунца с использованием хи� мерного гена GFP�TUA6. Фактори експерименталь� ної еволюції організмів: Зб. наук. пр. / Укр. т�во гене� тиків і селекціонерів ім. М.І. Вавилова. — К.: Логос, 2008, Т. 5, С. 343—348. 21. Гузенко Е.В., Лемеш В.А., Емец А.И., Блюм Я.Б., Кар� тель Н.А. Трансформация различных генотипов ль� на�долгунца с помощью Agrobacterium tumefaciens: предварительные результаты. Фактори експеримен� тальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. / Укр. т�во генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавилова. — К.: Ло� гос, 2008. — Т. 5. — С. 268—273. 22. Емец А.И., Баер Г.Я., Баер О.А., Шиша Е.Н., Шеремет Я.А., Гузенко Е.В., Лемеш В.А., Картель Н.А., Блюм Я.Б. Трансформация льна�долгунца химерным ге� ном GFP�TUA6 для изучения роли микротрубочек в формировании устойчивости к полеганию. Геном рослин: Зб. наук. пр. V Міжн. конф. 13—16 жовтня 2008 р. / Південний біотех. Центр в рослинництві УААН. — Одеса, 2008. — С. 71—74. 23. Стельмах О.А., Емец А.И., Блюм Я.Б. Мутанты Nico� tiana sylvestris L., устойчивые к изопропил�N�фенил� карбамату, обладают повышенной стабильностью Світ інновацій Наука та інновації. № 2, 200990 N 2-09.qxd 21.04.2009 15:27 Page 90 Світ інновацій Наука та інновації. № 2, 2009 91 ЦОМТов // Цитология и генетика. — 2007. — 41, № 6. — C. 3—10. 24. Yemets A., Stelmakh O., Blume Ya.B. Effects of the herbi� cide isopropyl�N�phenyl carbamate on microtubules and MTOCs in lines of Nicotiana sylvestris resistant and sen� sitive to its action // Cell Biol. Int. — 2008. — 32, N 6. — P. 623—629. Я.Б. Блюм, Я.О. Шеремет, Ю.А. Красиленко, А.И. Емец КОНФОКАЛЬНАЯ МИКРОСКОПИЯ В ЦЕНТРЕ КОЛЛЕКТИВНОГО ПОЛЬЗОВАНИЯ УНИКАЛЬНЫМИ ПРИБОРАМИ ПРИ ИНСТИТУТЕ ПИЩЕВОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ И ГЕНОМИКИ НАНУ Показаны возможности использования потенциала конфокальной микроскопии для биологических и био� медицинских исследований в Центре коллективного пользования ценными приборами при Институте пище� вой биотехнологии и геномики НАН Украины. Рас� смотрены основные принципы конфокальной микрос� копии и история ее становления. Охарактеризован принцип работы конфокального микроскопа LSM 510 META (Carl Zeіss, Германия) и продемонстрированы его преимущества. Приведены примеры использования возможностей конфокального микроскопа специалиста� ми отдела геномики и биотехнологии Института пище� вой биотехнологии и геномики, а также других научных учреждений. К л ю ч е в ы е с л о в а: Центр коллективного пользо� вания дорогостоящими приборами, конфокальная мик� роскопия, микроскоп LSM 510 META, клеточная биоло� гия, биомедицина, биотехнология, цитоскелет. Ya.B. Blume, Ya.О. Sheremet, Yu.А. Krasylenko, А.I. Yemets CONFOCAL MICROSCOPУ IN THE CENTRE OF COLLECTIVE EXPLOITATION OF COST EXPENSIVE EQUIPMENT AT THE INSTITUTE OF FOOD BIOTECHNOLOGY AND GENOMICS OF NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF UKRAINE The paper describes the possibilities for confocal micros� copy usаge in biological and biomedical investigations in the Centre of Collective Exploitation of Cost Expensive Equipment at the Institute of Food Biotechnology and Ge� nomics of National Academy of Sciences of Ukraine. Main principles of confocal microscopy and history of its estab� lishment are considered. Principle of confocal microscope LSM 510 META (Carl Zeiss, Germany) operation is char� acterized and its advantages for conducting of investiga� tions in the fields of cell biology, genomics, biomedicine and biotechnology are described. The examples of confocal mic� roscope application by staff of the Department of Genomics and Biotechnology of the Institute and other scientific or� ganizations are presented. K e y w o r d s: Centre of Collective Exploitation of Cost Ex� pensive Equipment, confocal microscopy, microscope LSM 510, cell biology, biomedicine, biotechnology, cytoskeleton. Надійшла до редакції 14.01.09. N 2-09.qxd 21.04.2009 15:27 Page 91

Конфокальна мікроскопія у центрі користування унікальними приладами при Інституті харчової біотехнології та геноміки НАНУ

Institution

Ähnliche Einträge