Усиление активности генетического аппарата зародышей костистых рыб после микроинъекции нмРНК
В развивающихся зародышах костистых рыб искусственно при помощи микроинъекции увеличивали содержание низкомолекулярных PHK (нмРНК). Введенные в зародыш вьюна меченные радиоизотопами нмРНК накапливаются в ядрах клеток развивающегося зародыша. Параллельно нарастает перемещение из ядра негистоновых бел...
Saved in:
| Published in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Date: | 1985 |
| Main Authors: | , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1985
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152194 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Усиление активности генетического аппарата зародышей костистых рыб после микроинъекции нмРНК / В.П. Корж, Т.А. Буракова, А.Л. Мазин, А.А. Нейфах // Биополимеры и клетка. — 1985. — Т. 1, № 1. — С. 14-20. — Бібліогр.: 32 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-152194 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Корж, В.П. Буракова, Т.А. Мазин, А.Л. Нейфах, А.А. 2019-06-08T15:03:53Z 2019-06-08T15:03:53Z 1985 Усиление активности генетического аппарата зародышей костистых рыб после микроинъекции нмРНК / В.П. Корж, Т.А. Буракова, А.Л. Мазин, А.А. Нейфах // Биополимеры и клетка. — 1985. — Т. 1, № 1. — С. 14-20. — Бібліогр.: 32 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.00000E https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152194 591.392 В развивающихся зародышах костистых рыб искусственно при помощи микроинъекции увеличивали содержание низкомолекулярных PHK (нмРНК). Введенные в зародыш вьюна меченные радиоизотопами нмРНК накапливаются в ядрах клеток развивающегося зародыша. Параллельно нарастает перемещение из ядра негистоновых белков (НГБ). Инъекция нмРНК приводит к увеличению интенсивности включения радиоактивных предшественников в ДНК (на стадии поздней бластулы), в PHK (на стадиях поздней бластулы и гаструлы) и в белок (на стадиях поздней бластулы, гаструлы и раннего органогенеза). Таким эффектом в разной степени обладают нмРНК костистых рыб, насекомых, амфибий и млекопитающих. Опыты, проведенные на зародышах форели, подтвердили эти результаты. Полученные данные свидетельствуют о важной роли нмРНК в регуляции активности генома зародыша в раннем эмбриональном развитии костистых рыб. У зародках костистих риб, що розвиваються, штучно за допомогою мікроін’єкції збільшували вміст низькомолекулярних PHK (нмРНК). Введені в зародок в’юна мічені радіоізотопами нмРНК накопичуються в ядрах клітин зародка, що розвивається. Паралельно інтенсифікується переміщення з ядра негістонових білків (НГБ). Ін’єкція нмРНК призводить до зростання інтенсивності включення радіоактивних попередників у ДНК (на стадії пізньої бластули), в PHK (на стадіях пізньої бластули і гаструли) і в білок (на стадіях пізньої бластули, гаструли і раннього органогенезу). Таким ефектом різною мірою володіють нмРНК костистих риб, комах, амфібій і ссавців. Досліди, проведені на зародках форелі, підтвердили ці результати. Отримані дані свідчать про важливу роль нмРНК у регуляції активності геному зародка в ранньому ембріональному розвитку костистих риб. Amount of snRNA was increased artificially by microinjection into developing embryos of teleost fishes. Radiolabelled snRNA after microinjection into loach embryo is concentrated in cell nuclei. Transport of nonhistone proteins into nuclei increases simultaneously. snRNA injection enhances the incorporation of radiolabelled precursors into DNA (late blastula), RNA (late blastula–gastrula), proteins (late blastula–gastrula–early organogenesis). Such effects are characteristic of snRNA from teleost fishes, insects, amphibia and mammalia. Experiments with trout embryos support these results. The data obtained show the important role of snRNA in embryo genome activity regulation at early embryogenesis of teleost fishes. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Биополимеры и регуляция генома Усиление активности генетического аппарата зародышей костистых рыб после микроинъекции нмРНК Посилення активності генетичного апарату зародків костистих риб після мікроін'єкції нмРНК Enhancement of genetic apparatus of teleost fish embryos after snRNA microinjection Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Усиление активности генетического аппарата зародышей костистых рыб после микроинъекции нмРНК |
| spellingShingle |
Усиление активности генетического аппарата зародышей костистых рыб после микроинъекции нмРНК Корж, В.П. Буракова, Т.А. Мазин, А.Л. Нейфах, А.А. Биополимеры и регуляция генома |
| title_short |
Усиление активности генетического аппарата зародышей костистых рыб после микроинъекции нмРНК |
| title_full |
Усиление активности генетического аппарата зародышей костистых рыб после микроинъекции нмРНК |
| title_fullStr |
Усиление активности генетического аппарата зародышей костистых рыб после микроинъекции нмРНК |
| title_full_unstemmed |
Усиление активности генетического аппарата зародышей костистых рыб после микроинъекции нмРНК |
| title_sort |
усиление активности генетического аппарата зародышей костистых рыб после микроинъекции нмрнк |
| author |
Корж, В.П. Буракова, Т.А. Мазин, А.Л. Нейфах, А.А. |
| author_facet |
Корж, В.П. Буракова, Т.А. Мазин, А.Л. Нейфах, А.А. |
| topic |
Биополимеры и регуляция генома |
| topic_facet |
Биополимеры и регуляция генома |
| publishDate |
1985 |
| language |
Russian |
| container_title |
Биополимеры и клетка |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Посилення активності генетичного апарату зародків костистих риб після мікроін'єкції нмРНК Enhancement of genetic apparatus of teleost fish embryos after snRNA microinjection |
| description |
В развивающихся зародышах костистых рыб искусственно при помощи микроинъекции увеличивали содержание низкомолекулярных PHK (нмРНК). Введенные в зародыш вьюна меченные радиоизотопами нмРНК накапливаются в ядрах клеток развивающегося зародыша. Параллельно нарастает перемещение из ядра негистоновых белков (НГБ). Инъекция нмРНК приводит к увеличению интенсивности включения радиоактивных предшественников в ДНК (на стадии поздней бластулы), в PHK (на стадиях поздней бластулы и гаструлы) и в белок (на стадиях поздней бластулы, гаструлы и раннего органогенеза). Таким эффектом в разной степени обладают нмРНК костистых рыб, насекомых, амфибий и млекопитающих. Опыты, проведенные на зародышах форели, подтвердили эти результаты. Полученные данные свидетельствуют о важной роли нмРНК в регуляции активности генома зародыша в раннем эмбриональном развитии костистых рыб.
У зародках костистих риб, що розвиваються, штучно за допомогою мікроін’єкції збільшували вміст низькомолекулярних PHK (нмРНК). Введені в зародок в’юна мічені радіоізотопами нмРНК накопичуються в ядрах клітин зародка, що розвивається. Паралельно інтенсифікується переміщення з ядра негістонових білків (НГБ). Ін’єкція нмРНК призводить до зростання інтенсивності включення радіоактивних попередників у ДНК (на стадії пізньої бластули), в PHK (на стадіях пізньої бластули і гаструли) і в білок (на стадіях пізньої бластули, гаструли і раннього органогенезу). Таким ефектом різною мірою володіють нмРНК костистих риб, комах, амфібій і ссавців. Досліди, проведені на зародках форелі, підтвердили ці результати. Отримані дані свідчать про важливу роль нмРНК у регуляції активності геному зародка в ранньому ембріональному розвитку костистих риб.
Amount of snRNA was increased artificially by microinjection into developing embryos of teleost fishes. Radiolabelled snRNA after microinjection into loach embryo is concentrated in cell nuclei. Transport of nonhistone proteins into nuclei increases simultaneously. snRNA injection enhances the incorporation of radiolabelled precursors into DNA (late blastula), RNA (late blastula–gastrula), proteins (late blastula–gastrula–early organogenesis). Such effects are characteristic of snRNA from teleost fishes, insects, amphibia and mammalia. Experiments with trout embryos support these results. The data obtained show the important role of snRNA in embryo genome activity regulation at early embryogenesis of teleost fishes.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152194 |
| citation_txt |
Усиление активности генетического аппарата зародышей костистых рыб после микроинъекции нмРНК / В.П. Корж, Т.А. Буракова, А.Л. Мазин, А.А. Нейфах // Биополимеры и клетка. — 1985. — Т. 1, № 1. — С. 14-20. — Бібліогр.: 32 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT koržvp usilenieaktivnostigenetičeskogoapparatazarodyšeikostistyhrybposlemikroinʺekciinmrnk AT burakovata usilenieaktivnostigenetičeskogoapparatazarodyšeikostistyhrybposlemikroinʺekciinmrnk AT mazinal usilenieaktivnostigenetičeskogoapparatazarodyšeikostistyhrybposlemikroinʺekciinmrnk AT neifahaa usilenieaktivnostigenetičeskogoapparatazarodyšeikostistyhrybposlemikroinʺekciinmrnk AT koržvp posilennâaktivnostígenetičnogoaparatuzarodkívkostistihribpíslâmíkroínêkcíínmrnk AT burakovata posilennâaktivnostígenetičnogoaparatuzarodkívkostistihribpíslâmíkroínêkcíínmrnk AT mazinal posilennâaktivnostígenetičnogoaparatuzarodkívkostistihribpíslâmíkroínêkcíínmrnk AT neifahaa posilennâaktivnostígenetičnogoaparatuzarodkívkostistihribpíslâmíkroínêkcíínmrnk AT koržvp enhancementofgeneticapparatusofteleostfishembryosaftersnrnamicroinjection AT burakovata enhancementofgeneticapparatusofteleostfishembryosaftersnrnamicroinjection AT mazinal enhancementofgeneticapparatusofteleostfishembryosaftersnrnamicroinjection AT neifahaa enhancementofgeneticapparatusofteleostfishembryosaftersnrnamicroinjection |
| first_indexed |
2025-11-26T10:13:29Z |
| last_indexed |
2025-11-26T10:13:29Z |
| _version_ |
1850618583691821056 |
| fulltext |
Биополимеры
и регуляция
генома
УДК 591.392
УСИЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА
ЗАРОДЫШЕЙ КОСТИСТЫХ РЫБ
ПОСЛЕ МИКРОИНЪЕКЦИИ нмРНК
В. П. Корж, Т. А. Буракова, А. Л. Мазин, А. А. Нейфах
Введение. Функции низкомолекулярных РНК <нмРНК> исследованы
до сих пор недостаточно. В обзорах по нмРНК упоминается ряд внут-
риклеточных процессов, которые протекают с участием нмРНК [1, 2],
однако надежные доказательства известны в единичных случаях. В
частности установлено, что нмРНК участвуют в терминации трансля-
ции секретируемых белков [3]. Появление нескольких гипотез, описы-
вающих участие нмРНК в сплайсинге высокомолекулярных Р Н К [4—
8], сыграли инициирующую роль в повышении интереса к исследова-
нию нмРНК. Недавно были получены первые доказательства в поль-
зу этих гипотез [9, 10].
Значительный интерес привлекает возможность участия низкомо-
лекулярных Р Н К в регуляции транскрипции. При использовании си-
стемы изолированных ядер наблюдают в основном ингибирующий
эффект нмРНК или же его отсутствие [И—13], а в живых клетках
нмРНК стимулируют транскрипцию [14, 15]. При этом активные
фракции нмРНК, выявленные в опытах, способны стимулировать
транскрипцию и в системе изолированных ядер [16].
Ранее нами было показано, что после инъекции в оплодотворен-
ные яйцеклетки вьюна 0,35 М NaCl экстракта ядер, полученного из
зародышей вьюна на стадии гаструлы, включение меченых предшест-
венников в РНК после активации транскрипции возрастает [17]. Да-
лее мы показали, что фракция нмРНК обладает стимулирующим
транскрипцию действием. Предварительное сообщение о результатах
этой работы было опубликовано ранее [18].
В данной работе мы описали эффект усиления синтеза основных
макромолекул клетки на ранних стадиях развития зародышей костис-
тых рыб—вьюна (Misguruus fossilis L.) и форели (Salmo gairdnerii)
вследствие введения нмРНК, исследовали распределение инъецирован-
ных нмРНК между клеточными компартментами, связь распределения
нмРНК с внутриклеточным перемещением негистоновых белков (НГБ).
Появление в клетках зародыша гомо- и гетерологичных нмРНК при-
водит к значительному усилению включения радиоактивных предше-
ственников в макромолекулы клетки (ДНК, Р Н К и белок). Инъециро-
ванные нмРНК накапливаются в ядрах клеток зародыша и это коорди-
нирует с переходом НГБ из цитоплазмы в ядра клеток.
Материалы и методы. Уридин-5-3Н (1,03 ТБк/мМ = 28 Ки/мМ); тимидин-2-14С
(2,0 ГБк /мМ = 55,2 мКи/мМ); Д, Л-лейцин-2-3Н (0,32 Т Б к / м М = 8 , 7 Ки/мМ); Д, Л-
триптофан-14С (0,25 Г Б к / м М = 7 , 1 мКи/мМ); Л-триптофан-3Н2 (1,65 ТБк/мМ =
= 45 К и / м М ) — ф и р м ы «Изотоп», СССР; агароза («Sigma», США); протеиназа К
{«Boehringer», ФРГ) ; сефароза 4В («Pharmacia», Швеция); диэтилпирокарбонат («Koch-
14 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, ,т.1 №1
Light», Англия); стекловолоконные фильтры GF/A («Whatman», Англия). Остальные
реактивы марки «хч». Зрелые яйца вьюна получали с октября по июнь по принятому
методу [19], используя стимуляцию хорионическим гонадотропином человека. Зрелые
яйца форели получали на рыбзаводе (г. Конаково Калининской обл.) в декабре 1983 г.
В ы д е л е н и е н м Р Н К . Экстракт ядер в 0,35 М NaCl получали, как описано ра-
нее [17]. Из экстракта методом фенольной депротеинизации с предварительной обра-
боткой протеиназой К выделяли нуклеиновые кислоты, которые разделяли электрофоре-
тически в горизонтальном блоке агарозы в трис-ацетатном буфере (рН 7,0). Поскольку
в этих условиях Д Н К остается на старте, обработку ДНКазой не производили. В неко-
торых случаях экстракт предварительно очищали от Д Н К на колонке сефарозы 4В, как
описано ранее [17]. После электрофореза из геля выделяли участки, содержащие от-
дельные фракции, замораживали их при —20 °С и затем выдавливали буфер, который,
содержит нмРНК. РНК осаждали этанолом, осадок растворяли в буфере для микро-
инъекций (0,1 М трис-HCl, рН 7,3). Все растворы для выделения, очистки и микро-
инъекции РНК обрабатывали ингибитором РНКаз диэтилпирокарбонатом. Выделение
нмРНК лягушки, таракана и млекопитающих (опухоль Кребса) проводили методом
термической фенольной депротеинизации при 65 сС с последующей очисткой электро-
форезом. Меченые нмРНК получали, культивируя зародыши ььюна на стадии ранней-
средней гаструлы в среде, которая содержала 3Н-уридин (50 мКи/мл) в течение 16—
18 ч при 21 °С. Дальнейшее выделение нмРНК вьюна проводили, как указано выше.
М е ч е й и е Н Г Б я й ц е к л е т о к в ь ю н а . НГБ вьюна метили, инъецируя 3Н-
триптофан с хорионическим гонадотропином по 0,5 мКи каждой самке. В развивающих-
ся зародышах 3Н метятся в основном фракции НГБ, синтезированные в оогенезе. Для
изучения фракций, синтезированных в раннем эмбриогенезе, в составе которых будет
метиться в основном фракция короткоживущих НГБ, бластодермы вьюна инкубирова-
ли в двойном растворе Гольфретера с 14С-триптофаном (20—50 мКи/мл) в течение
1 ч. Затем клетки разрушали и отделяли ядра от бластодермы центрифугированием в-
градиенте сахарозы.
М и к р о и н ъ е к ц и и н м Р Н К в я й ц е к л е т к и в ь ю н а . Проводили по из-
вестному методу [20]. Через 0,5—1,5 и 8—10 ч после оплодотворения яйцеклетки груп-
пами помещали на предметное стекло и, удалив воду, с помощью стеклянной микро-
пипетки в каждое яйцо вводили по 20 нл раствора нмРНК- В качестве контроля исполь-
зовали яйцеклетки, которым вводили равный объем буфера для микроинъекций. Инку-
бацию зародышей производили при 16 °С. Микроиньекцчи эмбрионов форели проводили,
помещая оплодотворенные яйцеклетки через 3—4 ч после оплодотворения в культу-
ральные чашки Петри (Д —50 мм) по 6—8 штук. Зародыш плотно фиксировали бран-
шами хирургического пинцета и инъецировали 100 нл раствора нмРНК в центр желтка.
Яйцевые оболочки зародышей форели непрозрачны, и наблюдать за продвижением
микропипетки практически невозможно, но поскольку зародыши достаточно велики,
точность инъекции обеспечена. Экзоваты не образуются. Зародыши хорошо переносили
инъекцию, и не менее 90 % оперированных зародышей выживали в течение всего опыта.
Зародышей форели инкубировали при 11 °С.
И н к у б а ц и я з а р о д ы ш е й с р а д и о а к т и в н ы м и п р е д ш е с т в е н -
н и к а м и и о п р е д е л е н и е р а д и о а к т и в н о с т и . Эмбрионы вьюна на нуж-
ной стадии развития освобождали от оболочек 1 % -ным раствором трипсина и, отделив
от желтка, инкубировали с мечеными предшественниками (3Н-уридин, 14С-тимидин„
3Н-лейцин, 50 мКи/мл) в течение 1 ч. Инкубацию останавливали, добавляя ТХУ до 10 %.
Радиоактивность измеряли, нанося аликвоты гомогенатов на стекловолоконные фильтры
GF / А, в толуольном сцинтилляторе и выражали результаты в имп/мин/Агео и л и
имп/мин/зародыш, сравнивая опыт с контролем. Эмбрионы форели освобождали от
яйцевых оболочек хирургически. Инкубацию и измерение радиоактивности произво-
дили, как указано выше.
Результаты. Влияние нмРНК иа биосинтез макромолекул. Введе-
ние нмРНК в оплодотворенные яйцеклетки вьюна приводит к усиле-
нию включения радиоактивных предшественников основных классов
макромолекул клетки (ДНК, РНК, белка). Этот эффект проявляется
только после того, как произошла активация транскрипции (рис. 1).
Усиление включения 14С-тимидина (в 2,0—3,0 раза) ограничено пе-
риодом бластулы (6—10 ч развития) и снижается до уровня контро-
ля с переходом зародышей к гаструляции. Повышенное включение
15 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, ,т.1№1
3Н-уридина наблюдается дольше (6—20 ч, бластула—гаструла), до-
стигает максимума на 7-м часу развития (в четыре раза выше, чем в
контроле) и снижается до уровня контроля к началу органогенеза.
Введение нмРНК усиливает уже начавшуюся транскрипцию, а не сдви-
гает ее начало. Увеличение включения 3Н-лейцина заметно уже на
стадии 7—8 ч развития с максимумом на стадии 20 ч развития (конец
гаструлы), после чего включение уменьшается. Форма соответствую-
щей кривой наводит на мысль о том, что увеличение включения в бе-
лок является следствием усиления транскрипции.
Результаты опытов по инъекции нмРНК в зародыши форели пред-
ставлены в таблице. В данном случае происходит увеличение включе-
Рис. 1. Динамика включения радио-
активных предшественников в мак-
ромолекулы развивающихся зароды-
шей вьюна после инъекции нмРНК:
1 — включение в Д Н К (14С-тими-
дин); 2 — включение в Р Н К (3Н-
уридин); 3—включение в бело к
(3Н-лейцин); 4 — контроль. По оси
абсцисс — время развития зародыша,
ч; по оси ординат — включение пред-
шественников (имп/мин/А2бо) в опыте
относительно контроля.
Fig. 1. Dynamics of radiolabeled
precursor incorporation into macro-
molecules of loach embryos after
snRNA injection: (14C) thymidine in-
corporation into DNA (J); (3H) uridi-
ne incorporation into RNA (2)\ (3H)
leucine incorporation into protein (3)\
control (4).
ния радиоактивных предшественников: 3Н-уридина в 1,6—2,0 раза,
3Н-лейнина примерно в 4,0 раза. Повышение включения происходит
на тех же стадиях развития, что и у вьюна: максимум включения в
Р Н К наблюдали после активации транскрипции, снижение — с пере-
ходом к органогенезу. Увеличение включения в белок закономерно от-
стает от усиления включения в РНК. В этих опытах использовали чу-
жеродные нмРНК (из лягушки и таракана).
Чужеродные нмРНК после микроинъекции в развивающиеся эм-
брионы вьюна обладают тем же эффектом (рис. 2). В этом случае
усиление включения в РНК не столь выражено, как при инъекции
гомологичных РНК. Дополнительная инъекция нмРНК на стадии
Увеличение включения радиоактивных предшественников в ТХУ-нерастворимую
фракцию после инъекции нмРНК в развивающиеся зародыши форели
Enhancement of the Incorporation of Radiolabelled Precursors into TCA-Precipitated
Fraction after snRNA Injection into Developing Trout Embryos
Время развития, сут
3 (9-я стадия—перед
морфогенетической
функцией)
5 (12-я стадия—начало
формирования осевых
структур)
7 (14-я стадия—10 пар
сомитов)
нмРНК 8Н-уридин 3Н-лейцин 3Н-уридин 3Н-лейцин 3Н-уридин 3Н-лейцин
о*/к** о /к о / к о / к О/К О/к
Опыт 1'
таракана 4,25 — — — — —
лягушки
Опыт 2
таракана
лягушки
0,88
1,40
0,92
0„74;
1,22
1,94
1,60
3,24)
l,44i
0,65
1,58
0,84
3,82
* О—опыт; ** К — контроль.
16 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, ,т. 1 №1
8—10 ч (поздняя бластула — ранняя гаструла) не вызывает дальней-
шего увеличения включения предшественников.
Введение нмРНК приводит к перемещению НГБ в ядра клеток.
Изучая транспорт НГБ в клетках после инъекции нмРНК, мы оце-
нивали поведение двух фракций НГБ: 1 — НГБ, синтезированных по
мере созревания яйцеклетки (3Н-триптофан вводили с гонадотрогш-
ном), которые вследствие длительности эксперимента (48—60 ч) были
представлены в основном долгоживущими белками; 2 — новосинтези-
рованных белков, которые метились и переносились в ядра в течение
1 ч и поэтому были представлены в основном короткоживущими бел-
ками (рис. 3, А). Анализ кривых, которые отражают соотношение
1 2 5 4
Рис. 2. Усиление включения 3Н-уридина после инъекции чужеродных нмРНК разви-
вающимся зародышам вьюна, имп/мин/А2бо' / — контроль; 2 — нмРНК таракана;
3 — нмРНК лягушки; 4 — нмРНК млекопитающих (опухоль Кребса).
Fig. 2. The enhancement of (3H) uridine incorporation after injection of heterologeous
snRNA into developing loach embryos (cpm / OD26o) control (1)\ cockroach snRNA
(2); f rog snRNA (3); mammalian snRNA (Krebs carcinoma) (4).
Рис. 3. Координированный перенос нмРНК и НГБ из цитоплазмы в ядра клеток раз-
вивающихся зародышей вьюна. Л. Транспорт НГБ. Накопление в ядрах новосинтези-
рованиых белков (14С-триптофан) после инъекции нмРНК (1) и в контроле (2). На-
копление в ядрах запасенных белков (3Н-триптофан) после инъекции нмРНК (3) и
в контроле (4). По оси абсцисс — время развития зародышей в ч при 21 °С; по оси
ординат — соотношение радиоактивности фракций ядер и цитоплазмы. Б. Распределе-
ние суммарной фракции нмРНК, меченных 3Н-уридином, в клетках зародышей вьюна
на стадии ранней-средней гаструлы: ядра (7); цитоплазма (2).
Fig. 3. The coordinated transport of snRNA and nonhistone proteins from cytoplasm
into cell nuclei of developing loach embryos. A. Transport of nonhistone proteins. Ac-
cumulation of newly synthetized proteins in nuclei (14C triptophan): af ter snRNA
injection (1) and in control (2). Accumulation of stored proteins (3H triptophan) in
nuclei: after snRNA injection (1) and in control (2). Б. Distribution of total snRNA
fraction labelled with (3H) uridine in loach embryo cells at the early-middle gastrula
stage: nuclei (1); cytoplasm (2).
концентрации метки в ядре и цитоплазме (в пересчете на единицу
•объема) показывает, что и запасенные (долгоживущие), и новосинте-
зированные (короткоживущие) белки накапливаются в ядрах клеток
опытных зародышей интенсивнее, чем в контроле. Иными словами, на
стадиях 9—12 ч развития, когда в клетках развивающегося зародыша
имеется избыток нмРНК, транспорт НГБ из цитоплазмы в ядра воз-
растает. Однако уже на стадии 14 ч развития этот эффект исчезает.
Нами были поставлены дополнительные опыты для изучения внут-
риклеточного перемещения введенных нмРНК. Оказалось, что после
инъекции меченные 3Н-уридином нмРНК быстро покидают цитоплаз-
му и избирательно накапливаются в ядрах зародышей (рис. 3, Б).
Обсуждение результатов. Представленные результаты показыва-
ют, что в разных опытах эффект усиления включения предшественни-
ков проявляется в разной степени. Причинами этого могут быть ис-
пользование партий икры, полученных от разных самок и в разное
17 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, ,т.1 №1
время года — от октября до июня, и использование препаратов
нмРНК, которые также были получены из разных партий икры в
разное время года.
Время влияния нмРНК на биосинтез макромолекул ограничено
указанными периодами раннего эмбриогенеза. Повторная инъекция
нмРНК на стадиях поздней бластулы — ранней гаструлы не приводит
к дальнейшему усилению интенсивности включения предшественников
или удлинению периода их действия. Возможны несколько объясне-
ний этого: 1) нмРНК, введенные на поздних стадиях развития, не про-
никают в клетки зародыша и остаются в желтке; 2) по мере дифферен-
цировки клеток происходит изменение регуляции на фоне увеличения
содержания эндогенных нмРНК и, следовательно, ограничения воз-
можностей экзогенных нмРНК; 3) изменяется компетенция зароды-
шей, что выражается в снижении числа доступных сайтов регуляции.
На стадии 6 ч развития зародыш вьюна претерпевает существен-
ные перестройки — деление клеток десинхронизуется, удлиняется кле-
точный цикл, активируется геном зародыша [21]. Эти принципиально
важные события как-то взаимосвязаны с появлением в клетках нмРНК,
синтез которых выявлен на 4, 5—6-м часу развития [22], т. е. до и
во время перестройки программы развития. К этому времени клетки
зародыша уже обеспечены НГБ, синтезированными в оогенезе [21].
Переход НГБ — вероятных регуляторов активности генов — в ядра
клеток происходит в форме РНП, т. е. в комплексе с РНК. Отправной
точкой этого процесса может быть появление в клетках зародыша
нмРНК. Вследствие появления в клетках нмРНК образуются РНП,
которые переходят в ядра клеток зародыша. В этом проявляется бел-
ково-транспортная функция нмРНК [31]. НГБ участвуют в регуляции
транскрипции. Как мы увидим ниже, полученные результаты можно
истолковать в пользу именно такой последовательности событий.
Действительно, увеличение содержания нмРНК в развивающихся
зародышах вьюна приводит к усилению активности аппарата биосин-
теза макромолекул, но не затрагивает стадию активации транскрип-
ции. Очевидно, определяющую роль в активации генома зародыша
выполняют иные механизмы, например изменение соотношения Д Н К
и цитоплазмы [23]. Увеличение содержания нмРНК усиливает интен-
сивность тех процессов, которые уже начались, т. е. содержание
нмРНК в зародыше можно рассматривать в качестве фактора, лими-
тирующего эти процессы. Интенсивность включения предшественников
в Р Н К под действием нмРНК может возрасти почти в четыре раза (а
иногда и более), следовательно, можно говорить о том, что на ранних
стадиях развития зародыш обладает существенным запасом молекул,
необходимых для обеспечения работы аппарата транскрипции и, по
аналогии, других звеньев аппарата биосинтеза макромолекул.
Графики, представленные на рис. 1, показывают среднюю кар-
тину событий, но в опытах по исследованию динамики изменения
включения предшественников мы заметили, что если на каком-то из
этапов наблюдается резкое усиление включения предшественников, то
за этим следует крутое падение интенсивности включения (ниже уров-
ня контроля). Если подъем интенсивности включения был более плав-
ным, снижение также происходило плавно. Хорошей иллюстрацией
этому могут служить результаты экспериментов с зародышами форе-
ли (таблица). Можно сказать, что графики, представленные на рис. 1,
обозначают период потенциальной способности или компетенции за-
родышей интенсифицировать биосинтез макромолекул при увеличе-
нии содержания нмРНК. В пределах этого периода максимальный
уровень интенсивности включения и его продолжительность определя-
ются, с одной стороны, интенсивностью стимула (содержанием актив-
ных фракций нмРНК?), с другой — запасными ресурсами клеток (раз-
мерами пула нуклеотидов, АТФ и т. д.). Возможно, снижение стиму-
ляции задается противодействием механизмов регуляции, которые
действуют по принципу обратной связи.
18 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, ,т.1 №1
Эффект усиления включения предшественников в макромолекулы
характерен не только для эмбрионов вьюна. Эти наблюдения были
подтверждены опытами на зародышах форели. Ранее Краузе и Рин-
гетте [15] уже наблюдали активацию транскрипции в культуре фиб-
робластов под действием нмРНК из опухолевых клеток. Связь перио-
дов накопления нмРНК и периодов усиления активности генома была
выявлена в оогенезе ксенопуса [24] и, наоборот, исчезновение нмРНК
в эмбриогенезе форели из клеток сопровождается угнетением транс-
крипции [25].
После инъекции нмРНК накапливаются в ядрах клеток. Парал-
лельно и координированно усиливается перемещение в ядра НГБ, ко-
торые в настоящее время рассматриваются в качестве возможных кан-
дидатов на роль регуляторов активности генома. Правда, до сих пор
в опытах in vivo эти предположения подтвердить не удалось [26]. Из-
быток НГБ в клетках, вероятно, характерен для многих объектов, и
именно это обстоятельство может объяснить кажущееся отсутствие
эффекта регуляции в опытах по микроинъекции НГБ.
Инициированное инъекцией нмРНК накопление в ядрах клеток
НГБ, которое мы отметили у вьюна, соответствует наблюдениям,
проведенным на других объектах [24, 27, 32], и может быть исполь-
зовано как подтверждение предположений о важной роли нмРНК в
транспорте НГБ [27, 31]. Исследования последних лет позволили кон-
кретизировать некоторые детали участия нмРНК в жизнедеятельности
клетки. Ныне полагают, что нмРНК участвуют в узнавании промото-
ров [28], процессинге мРНК, полиаденилировании мРНК [29], форми-
ровании З'-конца [30], сплайсинге [10].
Механизм усиления макромолекулярных синтезов, который был
выявлен нами, пока исследован недостаточно, однако уже сейчас мож-
но связать эти события с координированным перемещением в ядра
клеток нмРНК и НГБ. Дальнейшие исследования на этой перспектив-
ной модели позволят, как мы полагаем, выявить более тонкие меха-
низмы, которые лежат в основе этих событий.
ENHANCEMENT OF GENETIC APPARATUS
OF TELEOST FISH EMBRYOS AFTER snRNA MICROINJECTION
V. P. Korzh, T. A. Burakova, A. A. Neyfakh
N. K. Koltsov Institute of Developmental Biology,
Academy of Sciences of the USSR, Moscow
A. L. Mazin
M. V. Lomonosov State University, Moscow
S u m m a r y
Amount of snRNA was increased artificially by microinjection into developing embryos
of teleost fishes. Radiolabeled snRNA after microinjection into loach embryo is concent-
rated in cell nuclei. Transport of nonhistone proteins into nuclei increases simultaneously.
snRNA injection enhances the incorporation of radiolabeled precursors into DNA (late
blas tula) , RNA (late blastula — gast rula) , proteins (late blastula — g a s t r u l a — early
organogenesis) . Such effects are characteristic of snRNA from teleost fishes, insects,
amphibia and mammalia. Experiments with trout embryos support these results. The data
obtained show the important role of snRNA in embryo genome activity regulation at
early embryogenesis of teleost fishes.
1. Murray VHolliday R. Mechanism for RNA splicing of gene transcripts.— FEBS
Lett., 1979, 106, N 1, p. 5—7.
2. Are snRNPs involved in splicing? / M. R. Lerner, J. A. Boyle, S. M. Mount, J. A. Ste-
itz.— Nature, 1980, 283, N 5743, p. 220—224.
3. Rogers J., Wall R. A mechanism for RNA splicing.—Proc. Nat. Acad. <Sci. USA, 1980,
77, N 1. p. 1877—1879.
4. Novel model for RNA splicing that involves a small nuclear RNA / Y. Ohshima,
M. I ton, N. Okada, T. Miyata .—Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1981, 78, N 7 , p. 4471—
4474.
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 1 4 - 4 - 7 3 7 19
5. Gojobori Т., Masatoshi N. Inter RNA homology and possible roles of small RNAs.—
J. Mol. EvoL, 1981, 17, N 4, p. 245—250.
6. A small nuclear ribonucleoprotein is required for splicing of adenoviral early RNA
sequences / V. Yang, M. R. Lerner, J. A. Steitz, S. J. Flint.— Proc. Nat. Acad. Sci.,
USA, 1981, 78, N 3, p. 1371 — 1375.
7. Splicing of messenger RNA precursors is inhibited by antisera to small nuclear ri-
bonucleoprotein / R. Padgett , S. M. Mount, J. A. Steitz, P. Sharp.—Cell , 1983, 35, N 1,
p. 101 — 107.
8. Плюснин A. 3., Козлов А. П. Низкомолекулярные ядерные РНК.— Успехи совр.
биологии, 1979, 88, № 3, с. 322—336.
9. snRNAs, snRNPs arid RNA processing / H. Busch, R. Reddy, L. Rothblum,
Y. C. Choi.—Ann. Rev. Biochem., 1982, 51, p. 617 -654 .
10. Walter P., Blobel G. Signal recognition particle contains a 7S RNA essential for
protein translocation across the endoplasmic reticulum.— Nature, 1982, 299, N5885,
p. 691—699.
11. Козлов А. П., Плюснин A. 3., Евтушенко В. И. Изучение влияния низкомолекуляр-
ных ядерных Р Н К на синтез Р Н К в изолированных ядрах.— Молекуляр. биология,
1978, 12, № 1, с. 91—99.
12. Изучение влияния низкомолекулярных Р Н К на активность РНК-полимеразы II в
ядрах печени крысы / А. П. Козлов, А. 3. Плюснин, В. И. Евтушенко, И. Ф. Сейц.—
Биохимия, 1979, 44, № 1, с. 27—32.
13. Дзидзигури Д. В., Туманишвили Г. Д. Факторы ядерного сока, регулирующие РНК-
полимеразную активность.— В кн.: Тез. докл. Респ. науч. конф. по энзимологии.
Тбилиси, 1981, с. 36.
14. Kanehisa Т., Oki Т., Ikuta К. Part ial specificity of low-molecular weight RNA that
stimulates RNA synthesis in various tissues.— Arch. Biochem. and Biophys., 1974,
165, N 1, p. 146—152.
15. Krause M. O., Ringuette M. Low molecular weight nuclear RNA from SV40 trans-
formed WI38 cells; effect on transcription of W138 chromatine in vitro.— Biochem.
and Biophys. Res. Communs, 1977, 76, N 3, p. 796—803.
16. Specific small nuclear RNAs from SV40-transformed cells stimulate transcription
initiation in nontransformed isolated nuclei / M. Ringuette, K. Gordon, J. Szvszko,
M. Krause.—Can. J. Biochem., 1982, 60, N 3. p. 262—280.
17. Активация синтеза Р Н К в зародышах вьюна после инъекции экстракта ядер, по-
лученного с помощью 0,35 М NaCl / Т. А. Буракоьа, В. П. Корж, Н. А. Шостак,
А. А. Нейфах.— Молекуляр. биология, 1980, 14, № 4, с. 922—927.
18. Буракова Т. А., Корж В. П., Нейфах А. А. Инъекция низкомолекулярных Р Н К в
эмбрионы вьюна активирует синтез макромолекул.— Докл. АН СССР, 1984, 274„
№ 2, с. 413—416.
19. Нейфах А. А. Использование метода радиационной инактивации ядер для исследо-
вания их функции в раннем развитии рыб.— >KvpH. общ. биологии, 1959, 20, № 3,
с. 202—213.
20. Корж В. П. Микроинъекции макромолекул и митохондрий в яйца вьюна.— Онтоге-
нез, 1981, 12, № 2, с. 187—192.
21. Нейфах А. А., Тимофеева М. # . Проблемы регуляции в молекулярной биологик
развития.— М. : Наука, 1978.— 337 с.
22. Соловьева И. А., Тимофеева М. # . Низкомолекулярные Р Н К в эмбриогенезе вью-
на.— Молекуляр. биология, 1973, 7, № 6, с. 908—917.
23. Newport J., Kirshner М. A major developmental transition in early Xenopus embryos.
II. Control of the onset of transition.—Cell, 1982, 30, N 3, p. 687—696.
24. Zeller R., Nyffenegger Т., De Robertis E. M. xNucleocytoplasmic distribution of
snRNPs and stockpiled snRNA-binding proteins during oogenesis and early develop-
ment in Xenopus laevis.— Cell, 1983, 32, N 2, p. 425—4o4.
25. Nebiolo G., Dixon G. H. Characterization an subcellular localization of low molecu-
lar weight RNAs in developing trout test is .—J. Cell Biol., 1982, 95, N 2, p. 740a.
26. Караванов А. А., Афанасьев Б. Негистоновые белки хроматина.— Молекуляр. био-
логия, 1983, 17, № 2, с. 213—233.
27. De Robertis Е. М., Lienhard S., Parisot R. F. Intracellular t ransport of microinjec-
ted 5S and small nuclear RNAs.—Nature, 1982, 295, N 5757, p. 572—577.
28. Krause M. O., Sohn U., Szyszko J. Promoter recognition by a small nuclear RNA.—
J. Cell Biol., 1983, 97, N 5, p. 358a.
29. Berget S. M. Are U4 small nuclear ribonucleoproteins involved in polyadenylation.—
Nature, 1984, 309, N 5964, p. 179—181.
30. Biochemical complementation with RNA in the Xenopus oocyte: a small RNA is requi-
red for the generation of 3' histone mRNA termini / G. Galli, H. Hofstetter,.
H. G. Stunnenberg, M. L. Birnstiel.—Cell, 1983, 34, N 3 , p. 823—828.
31. Мазин A. JI. Низкомолекулярные Р Н К эукариот: биогенез, субклеточная локализа-
ция, функции.— Молекуляр. биология, 1983, 17, № 4, с. 755—783.
32. Forbes D., Kornberg Т. ВKirshner М. Small nuclear RNA transcription and ribo-
nucleoprotein assembly in early Xenopus development.— J. Cell Biol., 1983, 97, N U
p. 62—72.
Ин-т биологии развития Получено 20.08.84
им. Н. К- Кольцова АН СССР, Москва
МГУ им. М. В. Ломоносова
20 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, ,т. I, № I
|