ДНК-топоизомеразы пролиферирующих животных клеток
При стимулировании пролиферации фибробластов китайского хомячка добавлением к культуре свежей эмбриональной сыворотки удельная активность топоизомеразы 1 в частично очищенных препаратах из клеточных ядер, выделенных на разных сроках после стимуляции, резко возрастает, достигая максимума на 10-м часу...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Дата: | 1985 |
| Автори: | , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1985
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152197 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | ДНК-топоизомеразы пролиферирующих животных клеток / В.В. Терских, И.Б. Бронштейн, И.И. Громова, А.В. Тимофеев, К.А. Кафиани // Биополимеры и клетка. — 1985. — Т. 1, № 1. — С. 32-40. — Бібліогр.: 15 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-152197 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Терских, В.В. Бронштейн, И.Б. Громова, И.И. Тимофеев, А.В. Кафиани, К.А. 2019-06-08T15:14:11Z 2019-06-08T15:14:11Z 1985 ДНК-топоизомеразы пролиферирующих животных клеток / В.В. Терских, И.Б. Бронштейн, И.И. Громова, А.В. Тимофеев, К.А. Кафиани // Биополимеры и клетка. — 1985. — Т. 1, № 1. — С. 32-40. — Бібліогр.: 15 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.000012 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152197 577.152.5 При стимулировании пролиферации фибробластов китайского хомячка добавлением к культуре свежей эмбриональной сыворотки удельная активность топоизомеразы 1 в частично очищенных препаратах из клеточных ядер, выделенных на разных сроках после стимуляции, резко возрастает, достигая максимума на 10-м часу, за 10 ч до массового вступления клеток в S-фазу. Этот результат указывает на роль топоизомеразы 1 в контроле клеточной пролиферации. С целью разработки подхода к выделению и изучению ДНК-последовательностей, с которыми топоизомераза взаимодействует в клетке, изучалось образование ковалентных комплексов, образуемых высокоочищенным препаратом топоизомеразы I с кольцевой суперспиральной ДНК (плазмиды рВRЗ22), а также с ДНК из ядер фибробластов китайского хомячка. Описаны выделение и характеристика комплексов путем седиментации и равновесного ультрацентрифугирования, что позволяет изучать как белковый, так и нуклеиновый компоненты таких комплексов. При стимулюванні проліферації фібробластів китайського хом’ячка додаванням до культури свіжої ембріональної сироватки питома активність топоізомерази I у частково очищених препаратах з клітинних ядер, виділених на різних термінах після стимуляції, різко зростає, досягаючи максимуму на 10-тій год, за 10 год до масового вступу клітин у S-фазу. Цей результат вказує на роль топоізомерази I у контролі клітинної проліферації. Для розробки підходу до виділення і вивчення ДНК-послідовностей, з якими топоізомераза взаємодіє в клітині, вивчали утворення ковалентних комплексів, сформованих високоочищеним препаратом топоізомерази I з кільцевою суперспіральною ДНК (плазміди рВRЗ22), а також з ДНК із ядер фібробластів китайського хом’ячка. Описано виділення комплексів та наведено їхні характеристики в результаті седиментації і рівноважного ультрацентрифугування, що дозволяє вивчати як білковий, так і нуклеїновий компоненти таких комплексів. Chinese hamster fibroblasts were stimulated to proliferate by adding 10 % embryonic serum to the culture. Specific activity of type 1 topoisomerase in partially purified nuclear extracts, prepared at various times after serum addition, markedly increased, peaking at the 10th hour, 10 hour before a mass entry of the cells into the S-phase. This indicates a role of topoisomerase I in the control of cell proliferation. With the aim of developing an approach to isolation and analysis DNA sequences that are the targets for topoisomerases in the cell, complex formation between the highly purified topoisomerase I and circular supertwisted DNA (of the plasmid pBR322) or nuclear DNA of Chinese hamster fibroblasts was studied. Isolation and characterization of the complexes by sedimentation and equilibrium density centrifugation are described, which allows characterizing the protein as well as the DNA moieties of the complexes. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Клеточная биология ДНК-топоизомеразы пролиферирующих животных клеток ДНК-топоізомерази тваринних клітин, які проліферують DNA-topoisomerases of proliferating animal cells Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
ДНК-топоизомеразы пролиферирующих животных клеток |
| spellingShingle |
ДНК-топоизомеразы пролиферирующих животных клеток Терских, В.В. Бронштейн, И.Б. Громова, И.И. Тимофеев, А.В. Кафиани, К.А. Клеточная биология |
| title_short |
ДНК-топоизомеразы пролиферирующих животных клеток |
| title_full |
ДНК-топоизомеразы пролиферирующих животных клеток |
| title_fullStr |
ДНК-топоизомеразы пролиферирующих животных клеток |
| title_full_unstemmed |
ДНК-топоизомеразы пролиферирующих животных клеток |
| title_sort |
днк-топоизомеразы пролиферирующих животных клеток |
| author |
Терских, В.В. Бронштейн, И.Б. Громова, И.И. Тимофеев, А.В. Кафиани, К.А. |
| author_facet |
Терских, В.В. Бронштейн, И.Б. Громова, И.И. Тимофеев, А.В. Кафиани, К.А. |
| topic |
Клеточная биология |
| topic_facet |
Клеточная биология |
| publishDate |
1985 |
| language |
Russian |
| container_title |
Биополимеры и клетка |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
ДНК-топоізомерази тваринних клітин, які проліферують DNA-topoisomerases of proliferating animal cells |
| description |
При стимулировании пролиферации фибробластов китайского хомячка добавлением к культуре свежей эмбриональной сыворотки удельная активность топоизомеразы 1 в частично очищенных препаратах из клеточных ядер, выделенных на разных сроках после стимуляции, резко возрастает, достигая максимума на 10-м часу, за 10 ч до массового вступления клеток в S-фазу. Этот результат указывает на роль топоизомеразы 1 в контроле клеточной пролиферации. С целью разработки подхода к выделению и изучению ДНК-последовательностей, с которыми топоизомераза взаимодействует в клетке, изучалось образование ковалентных комплексов, образуемых высокоочищенным препаратом топоизомеразы I с кольцевой суперспиральной ДНК (плазмиды рВRЗ22), а также с ДНК из ядер фибробластов китайского хомячка. Описаны выделение и характеристика комплексов путем седиментации и равновесного ультрацентрифугирования, что позволяет изучать как белковый, так и нуклеиновый компоненты таких комплексов.
При стимулюванні проліферації фібробластів китайського хом’ячка додаванням до культури свіжої ембріональної сироватки питома активність топоізомерази I у частково очищених препаратах з клітинних ядер, виділених на різних термінах після стимуляції, різко зростає, досягаючи максимуму на 10-тій год, за 10 год до масового вступу клітин у S-фазу. Цей результат вказує на роль топоізомерази I у контролі клітинної проліферації. Для розробки підходу до виділення і вивчення ДНК-послідовностей, з якими топоізомераза взаємодіє в клітині, вивчали утворення ковалентних комплексів, сформованих високоочищеним препаратом топоізомерази I з кільцевою суперспіральною ДНК (плазміди рВRЗ22), а також з ДНК із ядер фібробластів китайського хом’ячка. Описано виділення комплексів та наведено їхні характеристики в результаті седиментації і рівноважного ультрацентрифугування, що дозволяє вивчати як білковий, так і нуклеїновий компоненти таких комплексів.
Chinese hamster fibroblasts were stimulated to proliferate by adding 10 % embryonic serum to the culture. Specific activity of type 1 topoisomerase in partially purified nuclear extracts, prepared at various times after serum addition, markedly increased, peaking at the 10th hour, 10 hour before a mass entry of the cells into the S-phase. This indicates a role of topoisomerase I in the control of cell proliferation. With the aim of developing an approach to isolation and analysis DNA sequences that are the targets for topoisomerases in the cell, complex formation between the highly purified topoisomerase I and circular supertwisted DNA (of the plasmid pBR322) or nuclear DNA of Chinese hamster fibroblasts was studied. Isolation and characterization of the complexes by sedimentation and equilibrium density centrifugation are described, which allows characterizing the protein as well as the DNA moieties of the complexes.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152197 |
| citation_txt |
ДНК-топоизомеразы пролиферирующих животных клеток / В.В. Терских, И.Б. Бронштейн, И.И. Громова, А.В. Тимофеев, К.А. Кафиани // Биополимеры и клетка. — 1985. — Т. 1, № 1. — С. 32-40. — Бібліогр.: 15 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT terskihvv dnktopoizomerazyproliferiruûŝihživotnyhkletok AT bronšteinib dnktopoizomerazyproliferiruûŝihživotnyhkletok AT gromovaii dnktopoizomerazyproliferiruûŝihživotnyhkletok AT timofeevav dnktopoizomerazyproliferiruûŝihživotnyhkletok AT kafianika dnktopoizomerazyproliferiruûŝihživotnyhkletok AT terskihvv dnktopoízomerazitvarinnihklítinâkíprolíferuûtʹ AT bronšteinib dnktopoízomerazitvarinnihklítinâkíprolíferuûtʹ AT gromovaii dnktopoízomerazitvarinnihklítinâkíprolíferuûtʹ AT timofeevav dnktopoízomerazitvarinnihklítinâkíprolíferuûtʹ AT kafianika dnktopoízomerazitvarinnihklítinâkíprolíferuûtʹ AT terskihvv dnatopoisomerasesofproliferatinganimalcells AT bronšteinib dnatopoisomerasesofproliferatinganimalcells AT gromovaii dnatopoisomerasesofproliferatinganimalcells AT timofeevav dnatopoisomerasesofproliferatinganimalcells AT kafianika dnatopoisomerasesofproliferatinganimalcells |
| first_indexed |
2025-11-26T00:08:38Z |
| last_indexed |
2025-11-26T00:08:38Z |
| _version_ |
1850593139769737216 |
| fulltext |
25. Kaufmann S. ΗCoffey D. S., Shaper / . H. Considerations on the isolation of rat
liver nuclear matrix, nuclear envelope and pore complex-lamina.—Exp. Cell Res.,
1981, 132, N 1, p. 105—123.
26. Вокуркова ΗЗбарский И. Б. Особенности электрофоретической картины белков
ядерного матрикса гепатомы 27 крыс и действие на нее некоторых ингибиторов
протеиназ.—Вопр. мед. химии, 1982, 28, № 6, с. 113—117.
27. Fields А. P., Kaufmann S. H.f Shaper /. Я. Isolation, chemical characterization and
immuno-localization of an acidic non-histone protein to the nucleolus of rat liver nuc-
lei.—In: 8-th Nucle(ol)ar Workshop (Banvuis. 23—30 Juin 1983). Banvuls, 1983,
p. 30.
28. Gerace L., Blobel G. The nuclear envelope lamina is reversiblv depolymerized during
mitosis.—Cell, 1980, 19, N 1, p. 277—287.
29. Hemminki K. Labelling of histones and non-hisiones in lung nuclear matrix and
chromatin fractions.—Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem., 1977, 358, N 9, S. 1125—1131.
30. Кузьмина С. Η., Бульдяева Т. В., Збарский И. Б. Белки ядерного матрикса и их
биосинтез в клетках печени крысы и гепатомы Зайделя.— Биохимия, 1980, 45, JSfo 8,
с. 1417—1424.
31. Kuehl L. Nuclear protein synthesis.— In: The Cell Nucleus / Ed. H. Busch. New York:
Acad, press, 1974, v. 3, p. 345—375.
32. Избирательное подавление хлорамфениколом биосинтеза белков в клетках асцитных
опухолей. / Т. В. Бульдяева и др.— Эксперим. онкология, 1984, 6, №4, с. 35—38.
Ин-т биология развития Получено 03.09.84
им. Н. К. Кольцова АН СССР, Москва
УДК 577.152.5
ДНК-ТОПОИЗОМЕРАЗЫ
ПРОЛИФЕРИРУЮЩИХ ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК
В. В. Терских, И. Б. Бронштейн,
И. И. Громова, А. В. Тимофеев, К. А. Кафиани
Введение. ДНК-топоизомеразы представляют собой своеобразную
группу генетических ферментов, которые катализируют переходы меж-
ду различными конформационными или топологическими формами
ДНК. Основные реакции, катализируемые топоизомеразами: суперспи-
рализация или релаксация кольцевых двухцепочечных молекул ДНК,
катенация и декатенация (зацепление и разъединение) одно- и двух-
цепочечных колец ДНК, завязывание и развязывание узлов в коль-
цевых молекулах ДНК, соединение двух одноцепочечных колец с комп-
лементарной последовательностью в полностью дуплексную кольцевую
молекулу [1—3]. Топоизомеразы также способны осуществлять инсер-
цию и эксцизию вирусных Д Н К и соединение цепей Д Н К с образова-
нием новых последовательностей. Благодаря наличию таких активно-
стей ДНК-топоизомеразы могут играть весьма важную роль в таких
основных генетических процессах, как репликация, рекомбинация, ре-
парация и транскрипция, а также в структурных перестройках Д Н К
в составе хроматина.
Большинство реакций, осуществляемых топоизомеразами, связано
с переносом сегментов цепей Д Н К с одной стороны замкнутой струк-
туры на другую, что требует внесения временных одноцепочечных (в
случае топоизомераз I типа) или двухцепочечных (в случае топо-
изомераз II типа) разрывов фосфодиэфирной связи в ДНК,
которая затем замыкается ферментом. Энергия, нужная для восста-
новления фосфодиэфирной связи, сохраняется в промежуточном кова-
лентном фермент-субстратном комплексе, обычно в фосфотирозиновой
связи между молекулой фермента и одним из возникших концов цепи
в месте ее разрыва [4]. Собственно конформационные изменения Д Н К
могут не требовать макроэргических кофакторов, а происходить за
счет свободной энергии суперспирализации (в случае топоизомераз
I типа), но могут и нуждаться в АТФ (топоизомеразы II типа).
Функции топоизомераз в животных клетках практически не изу-
чены. Для выяснения этих функций необходимо использование клеточ-
32 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 1
ных систем, осуществляющих определенные генетические, онтогенети-
ческие либо физиологические функции или процессы и позволяющих
выделение, идентификацию и анализ ферментов и ДНК-последова-
тельностей, с которыми данный фермент взаимодействует.
Одной из важнейших функций клетки является деление. Сведения
об участии топоизомераз в процессах клеточной репродукции противо-
речивы: по одним данным [5—8] активность топоизомераз коррелиру-
ет, а по другим [9] — не коррелирует с пролиферативной активностью
клеток. В настоящей работе изучались топоизомеразы фибробластов
китайского хомячка в связи с их пролиферативной активностью. Ниже
приводятся свидетельства в пользу участия топоизомеразы типа I в
подготовке клеток к делению.
В данной статье описано также выделение ДНК-последовательно-
стей, которые связываются с топоизомеразой при реакции in vitro.
Разработка такой техники открывает путь к выделению и идентифика-
ции тех участков хромосомной ДНК, которые преимущественно взаи-
модействуют с топоизомеразами в живой клетке и тем самым к выяс-
нению конкретных функций топоизомераз в превращениях и экспрес-
сии ДНК.
Материалы и методы. К у л ь т у р а к л е т о к . Использовали перевиваемую куль-
туру фибробластов китайского хомячка, линия 431. Стационарные культуры получа-
ли, выращивая клетки во флаконах в среде 199, содержащей 0,5 % эмбриональной
телячьей сыворотки (ЭТС) в течение 6—7 дней. Клеточную пролиферацию стимули-
ровали сменой истощенной среды на свежую, содержащую 10 % ЭТС. В качестве
контрольных использовали нестимулированные культуры. В разные сроки после сти-
муляции клетки снимали со стекла резиновым шпателем в буфере NaCl — 150 мМ,
Na-P—10 мМ, рН 7,6 и три раза промывали в том же буфере. Из полученной
суспензии отбирали пробы клеток, фиксировали их 70%-ным этанолом и окрашива-
ли красителем Hoechst 33258. Пролиферативную активность определяли методом про-
точной цитофлюориметрии (ЦФМ) на приборе Epics-TM (Coultronix) по гистограм-
мам относительного распределения клеток по фазам пролиферативного цикла.
В ы д е л е н и е и о ч и с т к а т о п о и з о м е р а з ы I. Для выделения фермен-
та клетки исходной суспензии осаждали при 4000 g и суспендировали в буфере
Na-P — 5 мМ, рН 7,2, MgCl2 — 5 мМ, Д Т Т — 1 мМ, фенилметилсульфонилфторид
(ФМСФ) — 1 мМ. Через 30 мин набухания клетки гомогенизировали в этом же бу-
фере в стеклянном гомогенизаторе. Ядра осаждали при 2000 g 5 мин, промывали в
буфере Na-P — 5 мМ, рН 7,2, Д Т Т — 1 мМ, ФМСФ — 1 мМ, снова осаждали и сус-
пендировали в том же буфере. К суспензии добавляли ЭДТА до конечной концент-
рации 5 мМ и равный объем буфера трис-НС1 — 50 мМ, рН 7,5, NaCl — 2 Μ, ДТТ —
5 мМ, ФМСФ — 1 мМ. Для осаждения ДНК из лизата добавляли равный объем бу-
фера трис-НС1 — 50 мМ, рН 7,5, NaCl — 1 Μ, полиэтиленгликоль (ПЭГ-6000) — 18 %,
ДТТ — 5 мМ, ФМСФ — 1 мМ. Через 40 мин выпавший осадок удаляли центрифуги-
рованием при 5000 g 20 мин. Надосадочную жидкость наносили на колонку с гид-
роксиапатитом (НТР, «Віо-Rad», США) 1,5X5 см, уравновешенным 20 мМ К-Р
буфером с 5 мМ ДТТ и 10 % глицерина. Для элюции белка использовали градиент
К-Р — 0,02 — 1 Μ объемом 50 мл. Активные фракции, содержащие топоизомеразу
I типа, диализовали против буфера трис-НС1 — 25 мМ, рН 7,2, ДТТ — 5 мМ, глице-
р и н — 1 0 % , ЭДТА—1 мМ, NaCl —0,2 Μ. Отдиализованный ферментный препарат
наносили на колонку с гепарин-сефарозой (1X2,5 см) со скоростью 4 мл/ч. Топоизо-
меразу элюировали 30 мл градиента 0,2—2,0 Μ NaCl со скоростью 1,8 мл/ч. Фрак-
ции, содержащие топоизомеразу, объединяли и диализовали против буфера трис-
НС1 —50 мМ, рН 7,2, ДТТ — 5 мМ, ЭДТА—1 мМ, глицерин — 20 %. Для длитель-
ного хранения в препарат добавляли БСА до конечной концентрации 200 мкг/мл.
Концентрации белка определяли по Бредфорду [10].
В ы д е л е н и е п л а з м и д н о й и к л е т о ч н о й Д Н К . Немеченную и мечен-
ную 3Н-тимидином ДНК плазмиды pBR322 выделяли как описано ранее [И, 12].
Для выделения ДНК из фибробластов китайского хомячка клетки отмывали от сре-
ды буфером трис-НС1 — 25 мМ, рН 7,6, NaCl —0,15 Μ и осаждали центрифугирова-
нием при 4000 g 15 мин. Клеточный осадок суспендировали в буфере SEDTA: NaCl —
0,1 Μ, NaOH —0,05 Μ, ЭДТА —0,05 Μ, рН 7,8, снова осаждали и суспендировали
33 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 1
в том же буфере и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе. После гомоге-
низации добавляли NaCl, SDS и протеиназу К до конечной концентрации 0,25 М,
0,2 % и 100 мкг/мл соответственно. Инкубацию с протеиназой проводили 3 ч при
37 °С и 20 ч при 25 °С. После двух депротеипизаций фенолом ДНК диализовали про-
тив буфера трис-НС1 —20 мМ, рН 7,6, NaCl — 80 мМ, ЭДТА—10 мМ. Обработку
РНКазой проводили при 37°С 3 ч (концентрация РНКазы 100 мкг/мл). ДНК после
4-кратной фенольной депротеинизации осаждали этанолом.
Фрагменты ДНК получали дроблением ультразвуком 22 кГц, 2,5 мин в буфере
трис-НС1—10 мМ, рН 7,5, ЭДТА — 0,1 мМ, концентрация ДНК составляла 0,5 мг/мл.
Размер полученных фрагментов определяли электрофорезом в агарозном геле. В ка-
честве маркеров использовали Hindlll — гидролизат ДНК фага λ и Alul — гидро-
лизат pBR322.
Э л е к т р о ф о р е з Д Н К . Электрофорез проводили в агарозном геле (1 % -ном —
для определения топоизомеразной активности; 1,8%-ном — для определения размера
фрагментов) в буфере трис-НС1 — 40 мМ, рН 7,8, Na-ацетат — 20 мМ, ЭДТА — 2 мМ.
После электрофореза ДНК в геле окрашивали бромистым этидием и фотографирова-
ли в УФ-свете.
О б р а з о в а н и е и в ы д е л е н и е к о в а л е п т н ы х к о м п л е к с о в т о п о -
и з о м е р а з ы с Д Н К . Реакционная смесь объемом 250 мкл содержала 50 или
135 мМ NaCl, 50 мМ трис-HCl, рН 7,1, 0,5 мМ ЭДТА, 3 мМ ДТТ, 10% глицерина,
20 мкг/мл бычий сывороточный альбумин (БСА), 300 ед. топоизомеразы, 20 мкг
3H-pBR322 ДНК. Через 20 мин инкубации при 30 °С реакцию останавливали 25 мкл
0,5 Η NaOH и нейтрализовали среду 25 мкл 0,5 Η НС1 и 25 мкл 0,5 Μ трис-НСІ,
ρ Η 7,5. После остановки реакции объем доводили до 500 мкл 10 мМ трис-НСІ,
рН 7,5. Центрифугировали па Spinco L2 65 В в роторе SW-65 40 ч при 35000 об/мин
и 4 °С. Радиоактивность определяли па фильтрах в толуоловом сцинтилляторе.
О п р е д е л е н и е р е л а к с и р у ю щ е й а к т и в н о с т и т о п о и з о м е р а -
з ы I. Реакционная смесь для определения топоизомеразной активности содержала
50 мМ трис-НСІ, рН 7,5, 200 мМ NaCl, 5 мМ ДТТ, 0,5 мМ ЭДТА, 20 % глицерина,
100 мкг/мл БСА, 0,5—1,0 мкг суперспиральной ДНК pBR322. Реакцию проводили в
10 мкл при 30 °С и останавливали добавлением 25 мкл смеси, содержащей SDS (2 %),
10 % фикола, 10 мМ ЭДТА и бромфеноловый синий.
О п р е д е л е н и е д е к а т е н и р у ю щ е й а к т и в н о с т и т о п о и з о м е р а -
з ы II. Реакцию декатенирования проводили в буфере, содержащем 50 мМ трис-НСІ,
рН 7,5, 120 мМ КС1, 6 мМ MgCl2, 3 мМ ДТТ, 1 мМ АТФ, 10 % глицерина, 2 мкг ДНК
кинетопластов трипапозомиды Crithidia oncopelti. О наличии активности судили по вы-
ідспленшо макси- и мини-колец из сети кинетопластной ДНК.
Результаты и обсуждение. Динамика топоизомеразной активности
при индуцированной пролиферации в культуре клеток. Чтобы выяс-
нить отношение ДНК-топоизомераз к механизмам регуляции клеточ-
ных делений, мы использовали культуру фибробластов китайского хо-
мячка, стимулированную к пролиферации, как описано в разделе «Ма-
териалы и методы». Рис. 1 показывает, что массовое вступление кле-
ток в S-фазу наступает на 20-м часу после смены среды. Активность
топоизомеразы I типа определяли в частично очищенных ядерных
экстрактах, так как ранее было обнаружено, что сырые ядерные экст-
ракты не проявляют активности с Д Н К pBR322, видимо, вследствие
наличия ингибитора в ядрах. Удельная активность ядерной топоизоме-
разы, определяемая по релаксации суперспиральной плазмидной ДНК,
быстро повышается уже к 4-му часу и достигает максимума на 10-м
часу после смены среды, а затем медленно понижается. Таким обра-
зом, топоизомеразная активность — один из параметров раннего отве-
та клеток на пролиферативный стимул.
Чтобы проверить возможное влияние утечки фермента из ядер
при их выделении на результаты и (или) наличие топоизомеразной
активности в цитоплазме клеток, определяли релаксирующую актив-
ность в постъядерной фракции в каждой из использованных порций
клеток (после осаждения ядер в 5 мМ Na-P-буфере). С плазмидной
Д Н К pBR322 она не определялась и могла быть выявлена лишь с
Д Н К вируса SV40, которая, по нашим данным, является намного луч-
34 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 1
шим субстратом для топоизомеразы I клеток китайского хомячка, чем
Д Н К pBR322. Кривая 2 на рис. 1 показывает изменения топоизоме-
разной активности в цитоплазме стимулированных клеток, определен-
ной по релаксации Д Н К SV40, и позволяет заключить, что форма кри-
вой 1 не зависит от возможной утечки фермента из ядерной в цито-
плазматическую фракцию.
Таким образом, в клетках, стимулированных к пролиферации сме-
ной среды, происходит сильная активация (или синтез de novo) ядер-
ной топоизомеразы I, пик которой приблизительно на 10 ч опережает
пик пролиферативной активности. Полученный результат согласуется
с высказанной еще Виноградом и Вонгом [1—3] идеей о значении
Рис. 1. Изменение топоизомеразной ак-
тивности в клеточном цикле фиброблас-
тов китайского хомячка: 1 — активность
топоизомеразы (% релаксированной ДНК
pBR322), отнесенная к единице белка
в надосадочной жидкости после осаж-
дения ПЭГ-6000 нуклеиновых кислот и
части белков из лизата выделенных
ядер; 2 — процент клеток в S — G2-cj)a-
зах клеточного цикла, определенный пу-
тем ЦФМ; 3 — активность топоизоме-
разы в цитоплазме. По оси абсцисс —
время после смены среды с 0,5 % ЭТС
на среду с 10 % ЭТС.
Ед./мг бел на
12
5+6,
2
hamster fibroblasts: Fig. I. Topoisomerase activity during the cell cycle of
topoisomerase activity (% of relaxed DNA pBR322) per unit of protein in the super-
natant after PEG-6000 precipitation of nucleic acids and some proteins from the lysa-
te of isolated nuclei (1)\ percentage of cells in S-C2 phases of cell cycle determined
by cytophotometry (2)\ topoisomerase activity in the cytoplasm (3). Abscissa: the time
after 10 % embryonic serum addition.
суперспирализации в контроле репликации ДНК. В разное время по-
являлись как подтверждения, так и опровержения этой идеи. Резуль-
таты опытов с клетками яичников китайского хомячка, где было вы-
явлено влияние этидия бромида на репликацию Д Н К [13], свидетель-
ствовали о значении суперспирализации в этом процессе, а угнетение
репликации Д Н К в этих клетках новобиоцином указывало на топоизо-
меразы как на фактор контроля синтеза Д Н К [14]. Определение топо-
изомеразной активности (без дифференцирования типа фермента) в
синхронизированных лимфоцитах человека показало высокую актив-
ность в S-фазе и низкую — в G0 и Gi [6]. Обнаружение значительной
части топоизомеразной активности ядра, прочно связанной с мембран-
ной фракцией (фракция содержит малую часть ядерной Д Н К и обла-
дает способностью к репликации in vitro), указывает на топоизомера-
зу как на компонент аппарата репликации хромосомной Д Н К [15]. В
более поздних работах проводили дифференцирование топоизомераз
I и II типов, и эти работы не выявили роли топоизомеразы типа I в
контроле синтеза Д Н К и клеточной пролиферации. Так, в регенериру-
ющей печени крыс, по данным Шампу [9] и Дюге с сотр. [5, 6], ак-
тивность типа I не коррелирует с синтезом ДНК, тогда как активность
типа II обнаруживает четкую корреляцию [5]. Корреляция активно-
сти топоизомеразы I с пролиферативной активностью была ранее по-
казана также для животных клеток в культуре. В работе [7] с фибро-
бластами человека и мыши при стимуляции делений эпидермальным
фактором роста были выявлены изменения активности топоизомеразы
II с динамикой, близкой к описанной нами динамике активности топо-
изомеразы I в стимулированных фибробластах китайского хомячка.
Таким образом, участие топоизомеразы I в контроле синтеза Д Н К и
пролиферации показано здесь впервые.
Механизм роста топоизомеразной активности, происходящего при
стимуляции клеточных далений, неясен. В случае дробящихся яиц
морского ежа, где ооцит содержит лишь небольшой запас топоизоме-
35 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 1
раз, а после оплодотворения тотальная активность возрастает (при
циклических колебаниях топоизомеразной активности, коррелирующих
с S-периодами) в 400 раз параллельно росту числа клеток, по-види-
мому, происходит синтез топоизомераз de novo [8].
Учитывая низкий уровень активности топоизомеразы I в покоя-
щихся клетках (рис. 1), можно предположить, что и в нашей клеточ-
ной системе рост топоизомеразной активности также обеспечивается
синтезом фермента. В отношении фибробластов человека и мыши, сти-
Рис. 2. Разделение топоизомераз I и II типа на гидроксиапатите и определение их
активности электрофоретическим анализом продуктов реакции релаксации ДНК
рВК322: / — топоизомеразная активность I типа; II— топоизомеразная активность II
типа; ДНК I — суперспиральная ДНК pBR322; ДНК 1° — релаксированная ДНК
pBR322; кт. ДНК — кипетопластная ДНК Crithidia oncopelti. Концентрация белка оп-
ределена по Бредфорду [10].
Fig. 2. Separation of topoisomerase I and II on hydroxylapatite and their activity de-
termined by electrophoretic analysis of DNA pBR322 relaxation products: I — topoiso-
merase I activity; II — topoisomerase II activity; ДНК I — supertwisted DNA pBR322;
ДНК II —relaxed DNA pBR322; КТ ДНК — kinetoplast DNA Crithidia oncopelti
The concentration of protein was determined according to Bradford [10].
мулированных эпидермальным фактором роста, имеется свидетельст-
во в пользу биосинтеза топоизомеразы II, так как повышение ее ак-
тивности наблюдается сначала и полирибосомах, а затем в ядре [7].
Изучение механизма контроля уровня топоизомераз в стимулирован-
ных клетках составит предмет наших дальнейших исследований.
В ы д е л е н и е и х а р а к т е р и с т и к а к о в а л е н т н ы х к о м п -
л е к с о в т о п о и з о м е р а з ы I с п л а з м и д н о й и к л е т о ч н о й
Д Н К . Исходя из вероятной роли ДНК-топоизомераз в регуляции
пролиферации и в генетических процессах, большой интерес представ-
ляет изучение сайт-специфичности этих ферментов при их действии
in vitro и определение ДНК-последовательностей, с которыми топо-
изомеразы взаимодействуют in vivo В тех ИЛИ ИНЫХ генетических, он-
тогенетических или физиологических ситуациях. Удобную возможность
36 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 1
изучать эти вопросы создает сам механизм топоизомеразной реакции,
а именно образование ковалентного комплекса фермента с Д Н К как
промежуточного этапа реакции [1—3, 9]. Это обстоятельство не только
освобождает исследователя
от необходимости примене-
ния химических реагентов
или таких воздействий, как
УФ-облучение, необходимых
при изучении аналогичных
вопросов в отношении дру-
гих белков (гистонов, неги-
стоновых белков и т. д.), но
и позволяет однозначно
идентифицировать ДНК-
последовательности, с кото-
рыми фермент взаимодейст-
вует in situ.
В наших экспериментах
использовали высокоочи-
Рис. 3. Образование топоизоме-
разой І ковалентного комплекса с
ДНК pBR322 (центрифугирование
в градиенте плотности Cs2S04).
Л, Б. Топоизомеразную реакцию
проводили и останавливали, как
описано в «Материалах и методах»
(А—в присутствии 50 мМ NaCl;
Б — в присутствии 135 мМ NaCl).
В. Фракции 28—32 (625 мкл, 650
имп.) объединяли и диализовали
против буфера 10 мМ трис-НС1,
рН 7,5, 1 мМ NaCl. Реакцию фос-
форилирования проводили при
37°С 30 мин в 250 мкл (50 мМ
трис-HCl, рН 9,6, 10 мМ MgCl2,
5 мМ ДТТ, 70 имп. 3Н-ДНК из
диализованных фракций 30—34,
5 мкКи 33Р-АТФ с удельной ак-
тивностью 500 Ки/мМ) с 3 ед. по-
линуклеотидкиназы. После фосфо-
рилирования образец делили на две
части. К одной из них добавляли
NaCl и протеиназу К до конечных
концентраций 100 мМ и 300 мкг/мл
соответственно. Инкубировали при
37 °С 60 мин. 1 — фосфорилиро-
ванный ДНК-топоизомеразный
комплекс без обработки протеина-
зой К; 2 — фосфорилированный
ДНК-топоизомеразный комплекс,
обработанный протеиназой К-
Центрифугирование и измерение
радиоактивности проводили как
описаио выше. В качестве марке-
ра использовали 3Н-ДНК pBR322
и БСА.
Fig. 3. Covalent complex formati-
on between topoisomerase I and
pBR322 (Cs2S04 density gradient
centrifugation.
имп/мин[5н]
имп/мин[5н]
1500г
pCszS04
-л 1,6
100L
500-
имп/мин[32р] ρ = 1,44
1000
щенный препарат топоизомеразы I, свободный от ДНКаз и топоизомеразы
II типа, полученный, как описано выше. Для реакции применяли супер-
спиральную Д Н К pBR322, меченную in vivo 3Н-тимидином, который
добавляли в культуру Е. coli во сремя амплификации плазмиды. Реак-
цию с топоизомеразой останавливали защелочиванием и смесь подвер-
37 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 1
гали равновесному ультрацентрифугированию в градиенте плотности
CS2SO4. Результаты этой части работы представлены на рис. 3.
Рис. 3 показывает, что меченный 3Н материал распределяется в
зоне между свободной Д Н К и свободным белком, то есть этот мате-
риал имеет значения плавучей плотности, свойственные ДНК-белко-
вым комплексам с широким распределением весовых соотношений бе-
лок— ДНК. Распределение значений плавучей плотности комплексов
зависит от величины ионной силы при топоизомеразной реакции (рис.
3, А, Б).
Рис. 4. Анализ нуклеазоустой-
чивой части ДНК-топоизоме-
разного комплекса седимента-
цией в 20—40 %-ном глицери-
новом градиенте. Обработку
комплекса ДНКазой II (100
мкг/мл) проводили в 75 мМ
Na-ацетатном буфере, рН 4,9,
при 37 °С в течение 24 ч. Пос-
ле окончания реакции диализо-
вали против 50 мМ трис-НСІ»
рН 9,5 и фосфорилировали поли-
нуклеотидкиназой, как описано
выше. Образец делили на две
части, одну из которых обра-
батывали протеинкиназой К
(1,3 мг/мл) при 37 °С 12 ч.
Глицериновый градиент (20—
40 %) готовили на буфере трис-
НСІ—50 мМ, рН 7,2, NaCl —
1 Μ, ЭДТА — 1 мМ. Центрифу-
гировали в роторе SW-65 24 ч
при 52000 об/мин. 3 —БСА;
1 — ДНК-белковый комплекс,
обработанный ДНКазой II; 2—
ДНК-белковый комплекс, обра-
ботанный ДНКазой II и протеи-
назой К.
Fig. 4. Analysis of nuclease-stable part of DNA-topoisomerase complex by sedimenta-
tion in 20-40 % glycerine gradient BSA (3); DNA-protein complex treated with DNAse
II (1)\ DNA-protein complex treated with DNAse II and proteinkinase К (2).
Все показанные на рис. З, Б 3Н-ДНК-содержащие фракции могут
быть дополнительно помечены путем инкубации с γ-меченной АТФ и
полинуклеотидкиназой, из чего следует, что фермент образует свобод-
ные 5'-гидроксильные концы, а сам связывается с З'-фосфатной груп-
пой в месте разрыва фосфодиэфирной связи в ДНК.
Продемонстрированный метод позволяет выделять и характеризо-
вать даже очень малые количества материала из любой интересую-
щей зоны градиента плавучей плотности. В качестве примера на рис.
ЗБ показаны результаты опыта, где зона с плавучей плотностью
1,21 г/см3, содержащая лишь 40 имп/мин - 1 меченной 3Н ДНК, была фос-
форилирована при помощи полинуклеотидкиназы и подвергнута пов-
торному центрифугированию в градиенте Cs 2S0 4 (рис. 3, В). Мечен-
ный 33Р материал, содержащий более 1000 имп/мин, выявляется чаще
в той же плотностной зоне, свидетельствуя о реальности выделения
индивидуальных по составу комплексов по данной методике.
В выделенном указанным путем материале можно изучать как
белковый, так и нуклеиновый компоненты комплексов топоизомера-
за — ДНК. Так, рис. З, В показывает, что связь фермента с Д Н К сох-
раняется при обработке фосфорилированных по Д Н К комплексов про-
теиназой К: частичный протеолиз таких комплексов приводит к повы-
шению средней плавучей плотности, но лишь малая часть меченой
Д Н К появляется в зоне свободной ДНК.
Для характеристики белковой части комплексов Д Н К гидролизо-
вали ДНКазой II, а оставшийся связанным с топоизомеразой нуклеа-
зоустойчивый фрагмент Д Н К фосфорилировали при помощи полинук-
имп/мин[32р] 4,6 S А595
38 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 1
леотидкиназы и подвергали седиментации в градиенте концентрации
глицерина. Из рис. 4 видно, что коэффициент седиментации меченно-
го таким образом фермента составляет от 5,3 S до 6,9 S. После обра-
ботки фермента протеиназой К меченный 33Р фрагмент сохраняется
на ферменте, однако коэффициент седиментации белка снижается до
2,3—3,9 S.
В описанных опытах топоизомераза взаимодействовала с плаз-
мидным суперспиральным ДНК-субстратом. Для применения указан-
ного подхода к клеточным Д Н К требовалось прежде всего убедиться,
Рис. 5. Образование ковалентных комплексов между топоизомеразой I и ДНК из
фибробластов китайского хомячка. Топоизомеразную реакцию проводили в 150 мМ
NaCl 1 мин и останавливали добавлением NaOH. В реакции использовали фрагмен-
ты ДНК, полученные обработкой ультразвуком. После диализа фосфорилировали по-
линуклеотидкиназой с использованием 32Р-АТФ. Центрифугировали в градиенте плот-
ности Cs2S04 в роторе SW-65 48 ч при 35000 об/мин и 10 °С. 1 — ДНК, обработан-
ная топоизомеразой и полинуклеотидкиназой; 2 — ДНК, не обработанная топоизо-
меразой.
Fig. 5. Covalent complex formation between topoisomerase I and Chinese hamster fib-
roblast DNA.
что фермент способен взаимодействовать также с линейной ДНК. Для
этого ядерную Д Н К фибробластов китайского хомячка обрабатывали
ультразвуком до образования фрагментов средней длиной 1000 пар
нуклеотидов, вносили избыток гомологичной топоизомеразы I, оста-
навливали реакцию защелочиванием и смесь центрифугировали до
равновесия в градиенте плотности CS2SO4. Рис. 5 показывает, что
комплексы действительно образуются, причем преобладает компонент
с плавучей плотностью 1,36 г/см3. Таким образом, топоизомераза I
клеток китайского хомячка эффективно взаимодействует с гомологич-
ной линейной ДНК, что указывает на перспективность использования
метода для изучения специфических комплексов между топоизомера-
зами и клеточными ДНК.
Описанный метод может также оказаться полезным для получе-
ния информации о функциональном многообразии топоизомераз путем
сравнения их наборов в клетках в процессе мейоза, пролиферации,
дифференцировки или канцерогенеза. Характеристика полинуклеотид-
ной части комплексов, выделенных из таких клеток, позволит выяснить
сайт-специфичность действия топоизомераз и природу ДНК-последо-
39 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 1
вательностей, с которыми эти ферменты взаимодействуют irt situ,
так как это по существу естественный метод пришивки функционально
важного белка в момент и в месте осуществления им своей функции.
DNA-TOPOISOMERASES OF PROLIFERATING ANIMAL CELLS
V. V. Terskikh, /. В. Bronstein, I. I. Gromova, Α. V. Timofeev, K. A. Kafiani
Institute of Molecular Biology, Academy of Sciences of the USSR, Moscow
S u m m a r y
Chinese hamster fibroblasts were stimulated to proliferate by adding 10 % embryonic
serum to the culture. Specific activity of type 1 topoisomerase in partially purified nucle-
ar extracts, prepared at various times after serum addition, markedly increased, peaking
at the 10th hour, 10 hour before a mass entry of the cells into the S-phase. This indi-
cates a role of topoisomerase I in the control of cell proliferation. With the aim of de-
veloping an approach to isolation and analysis DNA sequences that are the targets for
topoisomerases in the cell, complex formation between the highly purified topoisomera-
se I and circular supertwisted DNA (of the plasmid pBR322) or nuclear DNA of Chi-
nese hamster fibroblasts was studied. Isolation and characterization of the complexes
by sedimentation and equilibrium "density centrifugation are described, which allows
characterizing the protein as well as the DNA moieties of the complexes.
1. Gellert M. DNA topoisomerases.—Ann. Rev. Biochem., 1981, 50, p. 879—910.
2. Бронштейн И. Б., Кафиани К. А. Белки, изменяющие конформацию ДНК и их
предполагаемая роль в генетической рекомбинации.— Успехи совр. биологии, 1983,
96, № 1, с. 13—27.
3. Терещенко О. Д., Хайдарова Н. В. ДНК-топоизомеразы эукариотов.— Успехи совр.
биологии, 1983, 96, № 1, с. 28—45.
4. Klevati L., Tse У.-С. Chemical modification of essential tyrosine residues in DNA to-
poisomerases.— Biochim. et biophys. acta, 1983, 745, N 1, p. 175—180.
5. DNA topoisomerases from rat liver: physiological variations / M. Duguet, C. Lavanot,
F. Harper et al.— Nucl. Acids Res., 1983, 1 1 , N4, p. 1059—1075.
6. Rosenberg Β. Α., Ungers G., Deutsch J. F. Variations of DNA swivel activity during
the mammalian cell cycle.—Nucl. Acids Res., 1976, 3, N 12, p. 3305—3311.
7. Epidermal growth factor—induced topoisomerase (s). Intracellular translocation and
relation to DNA synthesis / R. Miskimins, W. K. Miskimins, H. Bernstein, N. Shimi-
zu.—Exp. Cell Res!, 1983, 146, N 1, p. 53—62.
8. Poccia D. L., LeVine DWang J. C. Activity of a DNA topoisomerase (nicking—
closing enzyme) during sea urchin development and the cell cycle.— Develop. Biol.,
1978, 64, N2, p. 273—283.
9. Champoux / . / . Proteins that affect DNA conformation.— Ann. Rev. Biochem., 1978,
47, p. 449—479.
10. Bradford Μ. M. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram qu-
antities of protein utilizing the principle of protein dye binding.— Analyt. Biochem.,
1976, 72, N 2, p. 248—254.
1 1 . Бронштейн И. Б., Шахбазян Г. К., Кафиани К. А. Выделение и свойства эндоде-
зоксирибонуклеазы из яйцеклеток вьюна.— Биохимия, 1983, 48, №1, с. 92—103.
12. Шахбазян Г. КБронштейн И. Б., Кафиани К. А. Выделение и характеристика
ДНК-топоизомеразы из ооцитов вьюна.— Биохимия, 1984, 49, №8, с. 1211 —1220.
13. Mattern Μ. RPainter R. В. Dependence of mammalian DNA replication on DNA
supercoiling. I. Effects of ethidium bromide on DNA synthesis in permeable Chi-
nese hamster ovary cells.— Biochim. et biophys. acta, 1979, 563, N 2, p. 293—305.
14. Mattern M. R., Painter R. B. Dependence of mammalian DNA replication on DNA
supercoiling. II. Effects of novobiocin on DNA synthesis in Chinese hamster ovary
cells.—Biochim. et biophys. acta, 1979, 563, N2, p. 306—312.
15. Yoshida S., Ungers G.f Rosenberg В. H. DNA swivel activity in a nuclear membra-
ne fraction.—Nucl. Acids Res., 1977, 4, N 1, p. 223—228.
Ин-т молекулярной биологии АН СССР, Москва Получено 03.09.84
40 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 1
|