Иммуноморфологическое и биохимическое изучение внутриклеточной локализации триптофанил-тРНК-синтетазы высших организмов
Исследовали внутриклеточное распределение триптофанил-тРНК-синтетазы (ТРС, КФ 6.1.1.2) в культивируемых клетках почки крупного рогатого скота с использованием очищенных моноспецифинеских поликлональных, а также моноклональных антител к цитоплазматическому ферменту, применяя световую и электронную ми...
Saved in:
| Published in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Date: | 1985 |
| Main Authors: | , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1985
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152201 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Иммуноморфологическое и биохимическое изучение внутриклеточной локализации триптофанил-тРНК-синтетазы высших организмов / Е.Л. Палей, В.Н. Баранов, Н.Е. Зиновьев, Л.Л. Киселев // Биополимеры и клетка. — 1985. — Т. 1, № 2. — С. 70-79. — Бібліогр.: 28 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859807299742203904 |
|---|---|
| author | Палей, Е.Л. Баранов, В.Н. Зиновьев, Н.Е. Киселев, Л.Л. |
| author_facet | Палей, Е.Л. Баранов, В.Н. Зиновьев, Н.Е. Киселев, Л.Л. |
| citation_txt | Иммуноморфологическое и биохимическое изучение внутриклеточной локализации триптофанил-тРНК-синтетазы высших организмов / Е.Л. Палей, В.Н. Баранов, Н.Е. Зиновьев, Л.Л. Киселев // Биополимеры и клетка. — 1985. — Т. 1, № 2. — С. 70-79. — Бібліогр.: 28 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Биополимеры и клетка |
| description | Исследовали внутриклеточное распределение триптофанил-тРНК-синтетазы (ТРС, КФ 6.1.1.2) в культивируемых клетках почки крупного рогатого скота с использованием очищенных моноспецифинеских поликлональных, а также моноклональных антител к цитоплазматическому ферменту, применяя световую и электронную микроскопию, Количественное содержание ТРС в цитоплазме клеток варьировало в широких пределах. Установлено присутствие ТРС на свободных полисомах и в виде крупных скоплений в цитозоле, на полисомах, связанных с мембранами гранулярного эндоплазматического ретикулума (ГЭР) и с наружной ядерной мембраной. Продукт иммуноцитохимической реакции не выявлен в ядрах, митохондриях, комплексе Гольджи и в области скопления микрофиламентов. При биохимическом исследовании изолированных митохондрий из тканей быка, а также нормальных и опухолевых тканей человека стало возможным выявление с помощью иммунопреципитации и иммуноблотинга ТРС в этих органеллах. Показано наличие общих антигенных детерминант у цитоплазматической и митохондриальной ТРС человека и быка, хотя моноклональные антитела выявляют между ними антигенное различие.
Досліджували внутрішньоклітинний розподіл триптофаніл-тРНК-синтетази (ТРС, КФ 6.1.1.2) у культивованих клітинах нирки великої рогатої худоби з використанням очищених моноспецифічних поліклональних, а також моноклональних антитіл до цитоплазматичного ферменту, застосовуючи світлову та електронну мікроскопію. Кількісний вміст ТРС у цитоплазмі клітин варіював у широких межах. Встановлено присутність ТРС на вільних полісомах і у вигляді великих скупчень в цитозолі, на полісомах, зв’язаних з мембранами гранулярного ендоплазматичного ретикулуму (ГЕР) і з зовнішньою ядерною мембраною. Продукт імуноцитохімічної реакції не виявлено в ядрах, мітохондріях, комплексі Гольджі і в області скупчення мікрофіламентів. При біохімічному дослідженні ізольованих мітохондрій з тканин бика, а також нормальних і пухлинних тканин людини стало можливим виявлення за допомогою імунопреципітації і імуноблотингу ТРС у цих органелах. Показано наявність загальних антигенних детермінант у цитоплазматичній і мітохондріальній ТРС людини і бика, хоча моноклональні антитіла виявляють між ними антигенну відмінність.
Intracellular distribution of tryptophanyl-tRNA synthetase (TRS, EC 6.1.1.2) in cultivated bovine kidney cells MDBK was studied using purified monospecific polyclonal as well as monoclonal antibodies against cytoplasmic enzyme. Both light and electron microscopy was used to visualize the localization of antigen-antibody complexes within cells. The amount of TRS varied within a wide range in cytoplasm of various cells in the same culture. TRS was established to exist at free polyribosomes and as big aggregates in cytosol, at polysomes attached to membranes of rough endoplasmic reticulum as well as to external nuclear membrane. The product of cytochemical reaction was not revealed in nuclei, mitochondria, Golgi apparatus and in the region of microfilaments. Biochemical studies of isolated mitochondria from bovine tissues and from normal and malignant human tissues by means of immunoblotting and immunoprecipitation showed the presence of TRS in these organelles. Human and bovine cytoplasmic and mitochondrial TRS share common antigenic determinants.
|
| first_indexed | 2025-12-07T15:17:19Z |
| format | Article |
| fulltext |
Клеточная
биология
УДК 576.31:577.217.32
ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКОЕ И БИОХИМИЧЕСКОЕ
ИЗУЧЕНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ
ΤРИПТОФАНИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗЫ ВЫСШИХ ОРГАНИЗМОВ
К. Л. Палей, В. Н. Баранов, Η. Е. Зиновьев, Л. Л. Киселев
Введение. Особенностью эукариотических клеток по сравнению с про-
карнотическимн является их сложная внутриклеточная организация,
криводящая к разделению ряда биохимических циклов в пространстве,
что создает дополнительные возможности регуляции клеточных функ-
ций. Однако для ряда ключевых процессов, в том числе такого, как
белковый синтез, многое в отношении их пространственной организации
in vivo остается неясным.
Как известно, аминоацил-тРНК-синтетазы (КФ 6.1.1), катализи-
рующие синтез аминоацил-тРНК, выделяют в форме индивидуальных
молекул из цитоплазмы или органелл клеток, их обнаруживают также
в составе мультиферментных комплексов («кодосом»), полирибосом и
рибосом [1]. Вопрос о внутриклеточной локализации этих ферментов
остается актуальным, поскольку до сих пор применялись методы ис-
следования не целых, а разрушенных клеток и клеточных фракций, что,
естественно, могло приводить к перераспределению материала между
компонентами клеток.
При детальном иммунохимическом изучении одной из аминоацил-
тРНК-синтетаз эукариот — бычьей триптофанил-тРНК-синтетазы (ТРС)
(КФ 6.1.1.2) [2, 3] и последующем получении моноклональных анти-
тел к этому ферменту [4] стало возможным исследование внутрикле-
точной локализации этого представителя аминоацил-тРНК-синтетаз
высших организмов с использованием сочетания иммунологического,
электронно-микроскопического и биохимического подходов, что сделано
в этой работе впервые.
Материалы и методы. К л е τ к и. В работе использовали монослойную культуру
клеток почки быка (Madin Darby Bovine Kidney — MDBK), полученную в результате
спонтанной трасформации. Клетки культивировали в среде RPMI («Flow Laborato-
ries») с добавлением 10 %-ной телячьей сыворотки, 0,045 %-ного глютамина, 100 ед/мл
пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 мкг/мл канамицина.
В ы д е л е н и е б ы ч ь е й т р и п т о ф а н и л-т Ρ Η К-с и н τ е τ а з ы. Триптофа-
иил-тРНК-синтетазу из поджелудочной железы крупного рогатого скота выделяли по
ранее описанному методу [5] с небольшими модификациями. Гомогенность препарата
проверяли электрофорезом в 12,5%-ном полиакрила мидном геле в денатурирующих ус-
ловиях по методу Лэмли [6] с последующей окраской геля Кумасси или азотнокислым
серебром [7J. Активность ТРС определяли в реакции аминоацилирования т Р Н К с ис-
пользованием L-[ l 4C]-триптофана (56 мКи/ммоль, «Amersham», Англия) и в реакции
АТР-[32Р]-пирофосфатного обмена ([3 2Р]-пирофосфат ~ 2 0 0 мКи/ммоль).
П о л у ч е н и е а н т и т е л . Для получения иоликлональных антител гомогенный
препарат ТРС вводили кроликам породы Шиншилла четыре раза по 5 мг на животное
и полном адъюванте Фрейнда («Difco», США) с интервалами 21 день, 26 дней и 9 ме-
сяцев. Крові» отбирали из сонной артерии на восьмой день после последней инъекции
70 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. I. № 2 4 - 4-921 70
антигена. В радиальной иммунодиффузии [8] антисыворотки (АС) и ТРС наблюдали
одну полосу преципитации. Иммуноглобулиновую фракцию из кроличьей АС получали
осаждением сульфатом натрия с последующим фракционированием на ДЭАЭ-целлю-
лозе [3].
Специфические антитела получали связыванием иммуноглобулиновой фракции АС
кролика с гомогенной ТРС, иммобилизованной на диазотированной целлюлозе, приго-
товленной по методу Гурвича [9]. После отмывки сорбента 0,01 Μ Na-фосфатным буфе-
ром, рН 7,0 0,14 Μ NaCl (PBS) связавшиеся с ТРС антитела элюировали 0,2 Μ гли-
цин-НСІ, рН 2,5 и нейтрализовали.
Мышиные моноклональные антитела к ТРС из поджелудочной железы быка (ΑΜι)
получены С. Ф. Берестенем, как описано ранее [4]. Чистоту препарата проверяли элект-
рофоретически, иммунологическую активность выявляли в реакции иммунопреципитации.
Контрольный препарат истощенных антител получали инкубацией моноклональных
антител (1,14 мг/мл) с ТРС, иммобилизованной на диазоцеллюлозе. После истощения
оптическая плотность препарата составляла 0,025 ед. А280. Препарат истощенных анти-
тел проверяли методом ELISA, сорбируя ТРС на пластике («Flow Laboratories»).
Пробы обрабатывали антимышиными иммуноглобулинами, конъюгированными с перок-
сидазой хрена. Окраску препаратов проводили 0,01 %-ным раствором орто-фенилендиа-
мина в присутствии 0,03 %-ной Н 2 0 2 и 20 мМ Na-цитратного буфера, рН 4,7. В случае
контроля (истощенных антителу окраска, отражающая пероксидазную активность, визу-
ально не отличалась от фоновой.
Э к с т р а к т ы . Клеточные экстракты получали лизированием отмытых клеток
(MDBK) в буферном растворе (10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 50 мМ КС1, 1 мМ MgCl2, 0,1 мМ
дитиотреитол (ДТТ), 20% по объему глицерина, 1 %-ный Nonidet Р40 (NP40), 3 мМ
диизопропилфторфосфат (ДФФ)) . После инкубации 1 ч при 0 °С суспензию центрифуги-
ровали при 12000 об/мин 15 мин.
Экстракты из поджелудочной железы крупного рогатого скота получали гомогени-
зацией ткани в электрической мясорубке при 4 °С в буферном растворе (10 мМ трис-НСІ,
рН 7,5, 0,15 Μ КС1, 1 · Ю - 4 Μ триптофан, 5·10~4 Μ ДТТ, 1 · Ю - 4 Μ ЭДТА, 0,3 мМ Д Ф Ф ) .
Гомогенат центрифугировали 30 мин при 4000 об/мин и 4 °С. Осадок отбрасывали, а на-
досадочную жидкость центрифугировали 1 ч при 15000 об/мин. Супернатант использо-
вали для иммунопреципитации и иммуноблогинга, а осадок — для получения митохонд-
рий [10]. Для устранения цитоплазматических примесей митохондрии обрабатывали
раствором дигитонина— 1,5 мг/мл («Мегск», ФРГ) . После отмывки от детергента мито-
хондрии замораживали в жидком азоте, растирали в фарфоровой ступке до порошко-
образного состояния и суспендировали в гомогенизаторе стекло/стекло притертым пес-
тиком в буферном растворе для лизиса. Лизаты центрифугировали 15 мин при
12000 об/мин, осадки отбрасывали. Для определения активности в АТР-[3 2Р]-пирофос-
фатном обмене использовали препарат, предварительно диализованный для удаления
эндогенных аминокислот 24 ч против буферного раствора (50 мМ трис-НСі, рП 7,5, 2 мМ
меркаптоэтанол, 0,3 мМ Д Ф Ф ) . Контрольная проба не содержала в реакционной смеси
триптофан, активность в ней была близка к фоновой.
Ткани человека гомогенизировали в буферном растворе (50 мМ трис-HCl, рН 7,5,
50 мМ КС1, 1,5 мМ ЭДТА, 10 мМ MgCl2, 1 мМ ДТТ, 10 %-ный глицерин, 3 мМ Д Ф Ф ) .
В дальнейшем гомогенаты обрабатывали, как описано ранее.
Концентрацию белка в экстрактах определяли по окраске реактивом Кумасси
[11], бычий сывороточный альбумин (БСА) использовали как стандарт.
И м м у н о п р е ц и п и т а ц и я . ТРС и белки гомогенатов после взаимодействия с
антителами обрабатывали стафилококковой суспензией (St. aureus), предварительно от-
мытой буферным раствором (50 мМ трис-НСІ, ρ Η 7,6, 150 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА,
0,5 %-ный NP40, 5 мг/мл БСА). Иммунопреципигаты, абсорбированные на стафилокок-
ковой суспензии, отмывали трижды буфером RIPA [12], суспендировали в буферном
растворе для нанесения образцов, кипятили 5 мин и анализировали электрофорезом в
денатурирующих условиях.
И м м у н о б л о т и н г . После электрофореза по Лэмли препараты суммарных бел-
ков клеток, тканевых и митохондриальных экстрактов переносили под прессом на два
нитроцеллюлозных фильтра (диаметр пор 0,45 мкм, «Schleicher & Schull», ФРГ) . Один
фильтр окрашивали Кумасси бриллиантовым синим и отмывали 5 %-ной уксусной кис-
лотой, а второй фильтр после отмывки в буферном растворе (0,1 Μ Na-фосфат, рН 7,5,
0,15 Μ NaCl, 0,05 %-ный Twin20) инкубировали со специфическими анти-ТРС кроличьи-
ми антителами в разведении 1 : 15 в течение ночи при комнатной температуре. После
70 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. I. № 2 4 - 4-921 71
отмывки антител фильтры обрабатывали вторыми анти-кроличьими козьими Fab-фраг-
ментами, конъюгированными с пероксидазой хрена («Sigma», США). Конъюгаты любез-
но предоставлены Н. В. Энгельгардт (ВОНЦ АМН СССР). Инкубацию проводили 2 ч
при комнатной температуре. После отмывки фильтра буферным раствором (50 мМ трис-
НС1, рН 7,5, 0,15 Μ NaCl) окраску выявляли 0,05%-ным раствором 4-С1-1-нафтола в
50 мМ трис-HCl, рН 7,5 с добавлением 0,05 % Н202 .
Э л е к т р о н н а я м и к р о с к о п и я . Покровные стекла с культурой клеток MDBK
фиксировали 30 мин при 22 °С в 0,15 Μ какодилатном буферном растворе, рН 7,3, со-
держащем 6 % параформальдегид, 0,05 % глутаровый альдегид, 0,1 % сапонин. Пре-
параты промывали тем же буфером с добавлением 3,5 % сахарозы 12 ч при 4 °С, обра-
батывали раствором, включающим 0,5 мг/мл боргидрида, в 0,01 Μ Na-K-фосфатном
буфере, рН 7,2—10 мин. Отмывали 30 мин PBS, далее обработку вели по непрямому
иммунопероксидазному методу [3]. Клетки инкубировали 5 ч в растворе моноклональных
или специфических кроличьих поликлональных антител в разведении 1 : 10, после чего
обрабатывали раствором антимышиных кроличьих иммуноглобулинов, конъюгирован-
ных с пероксидазой хрена (Дако), в разведении 1 : І0 или антикроличьими козьими Fab-
фрагментами, конъюгированными с пероксидазой хрена. ГІероксидазную активность вы-
являли 0,05%-ным раствором 3,3'-диаминобензидина (ДАБ) в 0,05 Μ трис-HCl, рН 7,5,
содержащем 0,03 % Н202 . После отмывки проводили постфиксацию в 1,33%-ном раст-
воре OsOi. После дегидратации клеток возрастающими концентрациями ацетона препа-
раты заливали смесью эпон-аралдит и просматривали в световом микроскопе. Ультратон-
кие срезы, полученные на «Ультратоме Л КБ Ш», без дополнительного окрашивания
просматривали в электронном микроскопе JEM-100 С.
Контроли на специфичность иммунохимической реакции включали инкубацию
фиксированных клеток: 1) с истощенными на ТРС-сорбенте моноклональными антите-
лами; 2) с антимышиными кроличьими иммуноглобулинами, конъюгированными с пе-
роксидазой; 3) с ДАБ. Контрольные препараты клеток, не подвергавшихся обработке
антителами, окрашивали цитратом свинца.
Результаты и их обсуждение. Результаты, полученные при помощи
методов иммунной электронной микроскопии с использованием моно-
клональных и поликлональных антител, не отличались между собой.
Эти данные можно считать надежными ввиду высокой специфичности
препарата моноклональных антител (ΑΜι) [4] и выявления иммуно-
блотингом с помощью моноспецифических поликлональных антител в
лизате клеток линии MDBK основной полосы с молекулярной массой
60000 (рис. 1, а, см. вклейку), соответствующей субъединице ТРС [5].
Предварительный просмотр препаратов в световом микроскопе выя-
вил различия в степени окраски цитоплазмы в разных клетках (рис. 2,
см. вклейку). Наряду с интенсивно окрашенными округлыми мелкими
клетками (10—12 мкм) встречались слабоокрашенные распластанные
клетки размером —20 мкм. Одновременно с крайними формами видны
клетки с промежуточной степенью окраски, причем уровень окраски
варьировал в значительно более широких пределах, чем размеры кле-
ток. Поскольку в работе использовали несинхронную культуру, разный
светооптический уровень содержания фермента, по-видимому, связан с
тем, что клетки находятся в разных фазах клеточного цикла. Окраску
ядер можно предположить лишь в отдельных, интенсивно окрашенных
клетках (рис. 2).
При электронно-микроскопическом анализе расположение ТРС в
клетках соответствовало местам отложения темноокрашенного элект-
ронноплотного продукта иммуноцитохимической реакции. В соответст-
вии с данными световой микроскопии при малых увеличениях элект-
ронного микроскопа обнаружили различную степень окраски клеток
продуктом реакции (рис. 3, а, б, см. вклейку). Продукт реакции в виде
мелкогранулярных или аморфных преципитатов диффузно окрашивал
цитозоль. Клетки с преобладанием мелкогранулярных преципитатов
обычно имели менее интенсивную окраску. Преобладание аморфного
продукта реакции соответствует более интенсивной окраске цитоплазмы.
При иммунопероксидазном методе происходит отложение ко-
нечного продукта реакции в виде гранул с радиусом около 20 нм, что
70 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. I. № 2 4 - 4-921 72
ограничивает топографическое разрешение при электронной микроско-
пии [14]. Известно, что рибосомы имеют радиус ~ 1 0 нм, следователь-
но, гранулы продукта реакции могут маскировать рибосомы или поли-
рибосомы. Поэтому только на основании приведенных сведений преж-
девременно утверждать, связана ли мелкогранулярная структура про-
дукта реакции со специфической окраской свободных полирибосом или
рибосом, либо с локальным скоплением молекул фермента в цитозо-
ле. Окраска цитратом свинца клеток, не обработанных антителами, вы-
Рис. 4. Электронная микроскопия цитозоля клетки линии MDBK, не обработанной
антителами. Видны многочисленные свободные рибо- и полисомы (указаны стрел-
ками). ГЭР — цистерны гранулярного эндоплазматического ретикулума; Μ —
митохондрия. Препараты окрашены цитратом свинца. Х56000.
Fig. 4. Electron microscopy of cytosol of MDBK cells nontreated with antibodies.
явила большое число свободных рибо- и полирибосом в цитоплазме
(рис. 4) , количественно коррелирующее с содержанием мелкогрануляр-
ного продукта реакции в клетках, подвергавшихся обработке специфи-
ческими антителами. Этот факт свидетельствует в пользу локализации
Т Р С на свободных полирибосомах, хотя не исключает локализацию
фермента в цитозоле.
Можно предположить, что после синтеза на свободных полирибо-
сомах, где, как известно, синтезируется большинство растворимых бел-
ков цитоплазмы [15], зрелые молекулы ТРС переходят в цитозоль и
там обнаруживаются иммунохимически в виде интенсивно окрашенных
аморфных отложений. По-видимому, клетки с наиболее интенсивно ок-
рашенной цитоплазмой находятся в фазе клеточного цикла, характери-
зующейся максимальным содержанием вновь синтезированного зрелого
фермента. Выявление ТРС на большом количестве свободных полири-
босом можно объяснить тем, что моноклональное антитело ΑΜι специ-
фично к антигенной детерминанте, находящейся на N-конце полипеп-
тидной цепи Т Р С [4], а в поликлональном препарате шесть антител из
девяти специфичны к N-участку [3]. Иными словами, в обоих случаях
мы выявили, помимо зрелых молекул ТРС, и промежуточные продукты
ее синтеза. Кроме того, нельзя исключить, что присутствие ТРС на всех
полирибосомах объясняется тем, что при переносе аминоацильного ос-
татка с триптофанил-тРНК на полипептидную цепь ТРС связана с ри-
70 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. I. № 2 4 - 4-921 73
босомой. Известно, что некоторые эукариотические аминоацил-тРНК-
синтетазы образуют комплексы с рибосомной Р Н К и рибосомами [16]
и, может быть, ТРС катализирует реакцию аминоацилирования т Р Н К ,
будучи связанной с рибосомой.
При использовании антител, истощенных на сорбенте с иммобили-
зованным гомогенным препаратом ТРС, в части фиксированных клеток
можно обнаружить следовую мелкогранулярную окраску цитоплазмы
и мембранносвязанных полирибосом. В большинстве клеток эта ок-
раска слабо выделялась над общим фоном. Поскольку при обработке
клеток конъюгатами Fab с пероксидазой хрена специфической окрас-
ки внутриклеточных структур не обнаружили, можно предположить,
что эта следовая окраска является следствием неполного истощения
антител.
Кроме двух описанных вариантов цитоплазматической локализа-
ции ТРС, в цитоплазме единичных клеток обнаружили очаговые скоп-
ления продукта реакции неправильной или округлой формы размером
до 0,5 мкм, не ограниченные мембраной (иллюстрации не приводятся) .
Возможно, они являются морфологическим выражением мультифер-
ментиых комплексов (кодосом). В биохимических исследованиях трип-
тофанил-тРНК-синтетазу в таких комплексах в большинстве случаев
не выявили [17], что, по-видимому, связано с нестабильностью кодосом
и частичным разрушением их в процессе гомогенизации.
Наряду с локализацией фермента в цитозоле обнаружили окраши-
вание полирибосом, связанных с мембранами цистерн гранулярного
эндоплазматического ретикулума (ГЭР) , причем в самих цистернах
продукт реакции отсутствовал (рис. 5, а, см. вклейку). Степень окрас-
ки мембранносвязанных полирибосом варьировала от клетки к клетке
и д а ж е внутри индивидуальной клетки.
Поскольку на мембранносвязанных полисомах синтезируются обы-
чно секреторные или структурные белки [15], а аминоацил-тРНК-синте-
тазы, по имеющимся данным таковыми не являются, можно пред-
положить, что присутствие ТРС на мембранносвязанных, также как и
на свободных полирибосомах, необходимо для осуществления биосин-
теза других белков. Не исключено, что ТРС сама может синтезировать-
ся па полирибосомах, связанных с мембранами ГЭР и/или обладает
неизвестными еще функциональными свойствами, требующими ее мем-
бранной локализации. Разная степень окраски мембранносвязанных
полирибосом пока не может быть однозначно истолкована.
В местах тесного контакта полирнбосом, связанных с мембранами
ГЭР, и митохондрий видна слабая окраска наружной мембраны пос-
ледних (рис. 5, а ) , которую можно объяснить упомянутой ранее недо-
статочной разрешающей способностью иммунопероксидазного метода,
так как при отсутствии контакта ГЭР и митохондрий она не обнаруже-
на. Возможно, окрашенные полирибосомы маскируют просвет между
цистернами ГЭР и наружной митохондрпальной мембраной. Не исклю-
чено, однако, что тесный контакт полирибосом, связанных с ГЭР, и
мембран митохондрий обусловлен синтезом ТРС для этих оргапелл, а
очаговая окраска мембран митохондрий объясняется транспортом че-
рез них фермента [18, 19]. Отсутствие продукта реакции внутри мито-
хондрий, скорее всего, является следствием слабого проникновения ан-
тител в митохондрии фиксированных клеток.
Окраску элементов комплекса Гольджи не выявили. При просмот-
ре поперечных ультратонких срезов клеточного монослоя окраску ядер
продуктом реакции обнаруживали только на моно- и полирибосомах,
связанных с наружной ядерной мембраной (рис. 5, б) . Наблюдаемая
в световом микроскопе окраска ядер в отдельных интенсивно окрашен-
ных клетках, следовательно, связана со светооптическим эффектом на-
ложения окраски цитоплазмы на ядра в интактных клетках.
Обращает на себя внимание большое количество аутофагосом в
м е т к а х культуры. Отдельные аутофагосомы содержали различное ко-
личество продукта реакции (рис. 5, в), что связано с эндогенной перо-
70 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. I. № 2 4 - 4-921 74
ксидазной активностью этих органелл, так как при обработке фиксиро-
ванных клеток только Д А Б также выявили подобную активность. Не
исключено, однако, что указанная локализация продукта реакции объ-
ясняется протеолизом и/или процессингом ТРС в аутофагосомах [20].
Цитоплазма клеток часто содержала различное количество микро-
филаментов. В области их скопления продукт реакции обычно отсут-
ствовал (рис. 5, г).
Ввиду того, что вопрос о локализации ТРС в митохондриях решить
однозначно с помощью иммуноэлектронно-микроскопического метода
пока не удалось, мы использовали биохимический подход. Представля-
лось целесообразным исследовать митохондрии быка, а т акже челове-
Рис. 6. АТР- [λ2Ρ] -пирофосфатный обмен, катализируе-
мый диализированным митохондриальным белковым экст-
рактом в присутствии ( а ) и отсутствие (б) L-триптофа-
на. Инкубацию вели 12 мин при 37 °С.
Fig. 6. ATP-[3 2Р]-pyrophosphate exchange catalyzed by
dialyzed mitochondrial protein extract in the presence
(a) and absence (ό) о і tryptophan.
ка, поскольку известно, что в митохондриях клеток человека и быка
присутствуют специфичные т Р Н К Т г р [21] и, возможно, ТРС. Кроме то-
го, интересно проследить за присутствием ТРС в цитозоле и митохонд-
риях клеток с нарушенным биосинтезом белков и обменом аминокис-
лот, в частности триптофана, который наблюдали в опухолях челове-
ка [22].
Были выделены митохондрии из поджелудочной железы быка и
из ряда нормальных и опухолевых тканей человека. Метод, использо-
ванный для выделения митохондрий, обеспечивает очистку этих орга-
нелл от цптоплазматических примесей, что видно из электрофореграмм
митохондриальных и постмитохондриальных лизатов, представленных
па рис. 1, б.
В препаратах митохондриальных экстрактов из клеток поджелу-
дочной железы быка, диализованных для удаления эндогенных амино-
кислот, методом АТР-[3 2Р]-пирофосфатного обмена выявлена триито-
фапзависимая активность ТРС (рис. 6) . Д л я выяснения иммунологиче-
ской специфичности митохондриальной ТРС из бычьих клеток исполь-
зовали препараты моноклональных и поликлональных антител к ТРС,
выделенной из цитоплазмы клеток поджелудочной железы быка. Свя-
зывание моноклональных антител с митохондриальным ферментом в
описанных условиях экспериментов не наблюдали (рис. 7 и 8), что кос-
венно подтверждает высокую степень очистки митохондриальных бел-
ков от цптоплазматических и может свидетельствовать об отсутствии
взаимодействия моноклональных антител с митохондриальной ТРС.
В постмитохондриальных лизатах из поджелудочной железы (рис.
7) и из культуры клеток почки быка (рис. 7 и 8) в той же постановке
опыта выявили белки с молекулярными массами 60000 и 180000, свя-
зывающиеся с моноклональными антителами (рис. 8), последний, ве-
роятно, представляет собой тримерную форму фермента. Цепи с мо-
лекулярными массами ~ 4 0 0 0 0 и 50000, скорее всего, продукты огра-
ниченного протеолиза ТРС (рис. 7 и 8).
Обнаружили взаимодействие митохондриального фермента с АС к
цитоплазматической ТРС и со специфическими кроличьими поликло-
нальными антителами после абсорбции иммунопреципитатов на стафи-
лококковой суспензии и разделения продуктов взаимодействия элект-
рофорезом в денатурирующих условиях, а также иммуноблотингом
(рис. 1, а, 8) .
Оба метода позволили выявить полосы с молекулярными мас-
сами около 73000 и 60000, взаимодействующие в составе митохондри-
ального лизата из поджелудочной железы быка с поликлональными ан-
70 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. I. № 2 4 - 4-921 75
тителами к цитоплазматической ТРС. Количественное соотношение
этих белков в разных препаратах варьирует (рис. 1, а). Возможно, на-
блюдаемая картина является следствием протеолиза и/или процессин-
га белка 73000. Не исключена также возможность связывания с анти-
телами к ТРС митохондриального белка другой природы. В постмито-
хондриальном лизате клеток поджелудочной железы быка белок 73000
не выявили, иммуноблотингом обнаружили белки с молекулярными
массами ~ 6 0 0 0 0 и —-180000. Таким образом, можно с уверенностью
Рис. 7. Электрофорез в 12,5%-ном полиакриламид-
ном геле в денатурирующих условиях продуктов вза-
имодействия белков клеточных лизатов с мышиными
моноклональными (ΑΜι) антителами. В 1—3 пробах
инкубировали с антителами по 60 мкг исследуемых
белков, в 4—1 мкг. Каждая проба объемом 0,2 мл
содержала по 5 мкг моноклональных антител. Пробы
обрабатывали антимышиными кроличьими имму-
ноглобулинами. Гель окрашивали азотнокислым се-
ребром. Постмнтохондриальнын (1) и митохондри-
альный (2) лизаты клеток поджелудочной железы
быка; постмитохондриальпый лизат клеток линии
MDBK (3)\ ТРС из поджелудочной железы быка
(4); молекулярные массы белковых маркеров в кДа
(5). Стрелками указаны положения БСА, а также
мышиных и кроличьих иммуноглобулинов, присутст-
вующих во всех пробах.
Fig. 7. 12,5 % polyacrylamide gel electrophoresis of
complexes of cellular proteins with mouse monoclonal
antibodies under denaturing conditions.
сказать, что в изолированных митохондриях из клеток поджелудочной
железы быка обнаружили ТРС, обладающую ферментативной актив-
ностью. Отсутствие взаимодействия моноклональных антител AM ι с
этим митохондриальным белком свидетельствует скорее всего о том,
что выявляемая в митохондриях ТРС отличается от цитоплазматиче-
ской по меньшей мере по одной антигенной детерминанте. Связывание
этого фермента с моноспецифическими поликлональными антителами
к цитоплазматической ТРС свидетельствует об общих антигенных де-
терминантах у этих двух форм ТРС.
Известно, что 85—95 % митохондриальных белков синтезируются
на цитоплазматических рибосомах, в том числе в виде предшественни-
ков, транспорт которых через митохондриальную мембрану сопровож-
дается их ограниченным протеолизом [23, 24]. Топографию синтеза
этих белков связывают с полирибосомами ГЭР, находящегося в тесном
контакте с митохондриями [15, 18, 19]. Можно предположить, что ми-
тохондриальная ТРС синтезируется на полирибосомах цистерн ГЭР,
окружающих митохондрии. Электронно-микроскопически такую лока-
лизацию выявляли как моноклональными, так и поликлональными ан-
тителами. При транспорте через митохондриальную мембрану, который
морфологически может проявляться в виде очаговой окраски наруж-
ной мембраны митохондрий (рис. 5, а ) , антигенная детерминанта для
моноклонального антитела А М Ь локализованная на N-конце цитоплаз-
матической ТРС, вероятно, отщепляется, а это должно привести к на-
блюдаемому нами отсутствию связывания митохондриального фермен-
та с ΑΜι при сохранении связывания с поликлональными антителами.
По данным реакции иммунопреципитации и иммуноблотинга, содержа-
ние ТРС в постмитохондриальном лизате клеток поджелудочной желе-
зы быка составляет ~ 3 % от суммарного белка, а в митохондриях из
70 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. I. № 2 4 - 4-921 76
той же ткани и в лизате клеток MDBK —- ~ 0 , 2 5 %. Обнаруженное на-
ми высокое содержание ТРС в поджелудочной железе согласуется с
данными по выделению фермента [5] и отражает высокую белоксинте-
зирующую активность этой ткани. Возможно также, что ТРС, помимо
участия в синтезе триптофанил-тРНК, выполняет другие функции.
Во всех исследованных тканях человека иммуноблотингом обнару-
жен митохондриальный белок с молекулярной массой 60000, взаимо-
действующий со специфическими поликлональными антителами к ТРС
Рис. 8. Электрофорез в 12,5%-ном полиакри-
ламидном геле в денатурирующих условиях
продуктов реакции иммунопреципитации. Гель
окрашивали Кумасси. Митохондриальный ли-
зат поджелудочной железы быка: 250 мкг бел-
ка инкубировали с 5 мкг мышиных монокло-
нальных антител (1) или с 50 мкл кроличьей
АС (2)\ 20 мкг БСА инкубировали с 7 мкг AM]
(3) или 50 мкг БСА — с 0,1 мл кроличьей АС
(6); 208 мкг белка лизата клеток линии MDBK
инкубировали с 15 мкг ΑΜι (7); молекуляр-
ные массы белковых маркеров в кДа (8).
Стрелками указаны положения БСА (68 кДа)
тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов
мыши и кролика, присутствующих во всех про-
бах.
Fig. 8. 12.5 % polyacrylamide gel electrophore-
sis of products of immunoprecipitation reaction
under denaturing conditions.
быка (рис. 1, α) . Белок с такой молекулярной массой обнаружили и
при взаимодействии постмитохондриальных лизатов тканей человека
с антителами к цитоплазматическому ферменту быка, кроме одного
случая ткани миомы, в которой выявлены взаимодействующие белки
с молекулярными массами 120000 и 180000 и практически не найден
белок ~ 6 0 0 0 0 , в то время как митохондриальный белок 60000 из той
же ткани обнаружен иммуноблотингом. По-видимому, обнаруженные
особенности связаны только с цитоплазматической, а не митохондри-
альной формой ТРС клеток миомы. В связи с этим следует еще раз
упомянуть о наличии в цитоплазме клеток человека и быка димерных
и гримерных форм ТРС [5].
Перекрестная реакция антител к ТРС быка с ТРС человека под-
тверждается обнаруженным нами 50 %-ным ингибированием активно-
сти ТРС в постмитохондриальном лизате клеток плаценты человека
кроличьей антисывороткой к ТРС быка в реакции АТР-[32Р]-пирофос-
фатного обмена. По данным других исследователей [25, 26], ТРС из
тканей человека имеет молекулярную массу 116000—125000 и состоит
из двух идентичных субъединиц, что соответствует нашим результатам.
Выявление нами ТРС в митохондриях эукариотических тканей сог-
ласуется с данными литературы о выделении некоторых аминоацил-
тРНК-синтетаз из митохондрий [27] и хлоропластов высших организ-
мов [28].
Авторы благодарят С. Ф. Берестеня за предоставление препарата
моноклональных антител, А. С. Глейбермана за тестирование культу-
ры клеток почки быка методом иммунофлюоресценции, Е. С. Залман-
зон за предоставление культуры клеток MDBK, Η. В. Энгельгардт за
предоставленный препарат антикроличьих антител и Н. В. Теслер за
помощь при выполнении работы.
БИОПОЛИМЕРЫ II КЛЕТКА, 1985, т. I, № 2 77
IMMUNOMORPHOLOGICAL AND BIOCHEMICAL STUDIES
ON INTRACELLULAR DISTRIBUTION OF TRYPTOPHANYL-tRNA
SYNTHETASE FROM HIGHER EUKARYOTES
H. L. Pciley, V. N. Baranov, N. E. Zinoviev, L. L. Kisselev
Institute of Molecular Biology, Academy of Sciences of the USSR, Moscow
institute of Carcinogenesis, Ail-Union Cancer Research Centre, Academy of Medical
Sciences of the USSR, Moscow
S u m m а г у
Intracellular distribution of tryptophanyl-tRNA synthetase (TRS, EC 6.1.1.2) in cultivated
bovine kidney cells MDBK was studied using purified monospecific polyclonal as well as
monoclonal antibodies against cytoplasmic enzyme. Both light and electron microscopy
was used to visualize the localization of antigen-antibody complexes within cells. The
amount of TRS varied within a wide range in cytoplasm of various cells in the same cul-
ture. TRS was established to exist at free polyribosomes and as big aggregates in cyto-
soi, at polysomes attached to membranes of rough endoplasmic reticulum as well as
to external nuclear membrane. The product of cytochemical reaction was not revealed in
nuclei, mitochondria, Golgi apparatus and in the region of microfilaments.
Biochemical studies of isolated mitochondria from bovine tissues and from normal
and malignant human tissues by means of immunoblotting and immunoprecipitation
showed the presence of TRS in these organelles. Human and bovine cytoplasmic and mito-
chondrial TRS share common antigenic determinants.
1. Киселев Л. ЛФаворова О. О., Лаврик О. И. Биосинтез белков от аминокислот до
аминоацил-тРНК.— М. : Наука, 1984.—408 с.
2. Шейнкер В. Ш., Фаворова О. О., Рохлин О. В. Иммунохимическое сравнение трип-
тофанил-тРНК-синтетаз.— Молекуляр. биология, 1978, 12, № 3, с. 565—571.
3. Берестень С. Ф., Шейнкер В. Ш., Рохлин О. В. Иммунохимические свойства трипто-
фанил-тРНК синтетазы и ее фрагментов.— Молекуляр. биология, 1978, 12, № 6,
с. 1408—1419.
4. Моноклональные антитела к триптофанил-тРНК-синтетазе / С. Ф. Берестень, Т. А.
Заргарова, С. В. Костров, О. О. Фаворова.— Молекуляр. биология, 1984, 18, № 5,
с. 1407—1411.
5. Kisselev L. L·., Favor ova О. О., Kovaleva G. К. Tryptophanyl-tRNA synthetase from
beef pancreas.— In: Methods in Enzymology / Eds. K. Moldave, L. Grossman. N. Y.:
Acad, press, v. 59, p. 234—257.
6. Laetninli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage Т4,—Nature, 1970, 227, N 5259, p. 680—685.
7. Silver s taining of proteins in polvacrvlamide ge.is/ 'W. Wrav, T. Boulikes, V. P. Wray,
R. Hancock.—Anal. Biochem., 1981, 118, N 1, p. 197—203.
8. Остерман Л. Λ. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием,
иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами.— М. : Наука, 1983.— 303 с.
9. Fу рвач Α. Φ•, Кузовлева О. Б. Определение абсолютных количеств антител и их вы-
деление в чистом виде с помощью белково-целлюлозных комплексов.— В кн.: Имму-
нохимический анализ / П о д ред. Л. А. Зильбера. М. : Медицина, 1968.— 300 с.
10. Bustamante Ε., Soper Y. W., Pedersen P. L. A High-yield preparative method for
isolation of rat liver mitochondria.— Anal. Biochem., 1977, 80, N 2, p. 401—408.
I [. Bradford Μ. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.— Anal. Biochem.,
1976, 72, N 1, p. 248—254.
1,2. Parkoff /., Vertna I. M., Hunter T. Detection of t ransforming gene product in Molo-
ney murine sarcoma virus transformed cells.— Cell, 1982, 29, N 2, p. 417—426.
13. Ultrastructural localization of alpha-fetoprotein regenerat ing mouse liver / Ν. V.
Engelhardt, V. N. Baranov, M. N. Lazareva, A. I. Gusev.— Histochemistry, 1984, 80,
N 4, p. 401—407.
14. Ordronneau P., Lindstron P. P. M., Petrus Z. P. Four unlabelled antibody bridge tech-
niques: A comparison.— J. Histochem. and Cytochem., 1981, 29, N 4, p. 1397—1404.
15. Гайцхоки В. С. Информационные Р Н К клеток животных.— М. : Медицина, 1980.—
199 с.
16. Roberts W. К., Olsen Μ. L. Studies on the formation and stability of aminoacyl-tRNA
synthetase complexes from Ehrlich ascites cells.— Biochim. et biophys. acta, 1976, 454,
N 3, p. 480—492.
17. Dang С. V., Johnson D. LYang D. С. H. High molecular mass aminoacyl-tRNA syn-
thetase complexes in eukaryotes .—FEBS Lett., 3982, 142, N 1, p. 1—6.
18. Bhatnagar Μ. K·, Singh A. Ultrastucture of turkey hepatocytes.— Anat. Rec., 1982,
202, N 4, p. 473—482.
19. Association between mitochondria and rough endoplasmic reticulum in rat l i ve r /
I). F. Montizano. J. Casca rano . С. B. Pickett , W. J a m e s . - A n a t . Roc., 1982, 203, N 4,
p. 441--450.
70 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. I. № 2 4 - 4-921 78
20. Dean R. Т. Cellular degradative processes.— London: Chapman and Hall, 1978.—
120 p.
21. Sprinzl M., Gauss D. H. Compilation of tRNA sequences.— Nucl. Acids Res., 1984, 12,
Suppl., p. 1—57.
22. Майнолов С. Ε. Биохимические основы злокачественности.— Л. : Медицина, 1971.—
230 с.
23. Лузиков В. Н. Регуляция формирования митохондрий.— М. : Наука, 1980.— 317 с.
24. Hay RBohni P., Gasser S. How mitochondria import proteins.— Biochim. et biophys.
acta, 1984 779, N 1. p. 65—87.
25. Penneys N. 5., Muench К. H. Tryptophanyl-tRNA synthetase of human skin.— Clin.
Res., 1971, 19, N 2, p. 581—582.
26. Penneys N. S., Muench К. H. Human placental tryptophanyl transfer ribonucleic acid
synthetase. Purification and subunit structure.— Biochemistry, 1974, 13, N 3, p. 560—
565.
27. Gabius H.-J., Cramer F. Purification and subunit structure of phenylalanyl-tRNA syn-
thetase from hen liver mitochondria.— Biochem. and Biophys. Res. Communs., 1982,
106, N 2, p. 325—330.
28. Immunological evidence for structural differences between Euglena Gracilis chloro-
plastic valyl- and leucyl-tRNA synthetase and their cytoplasmic counterparts / B. Co-
las, P. Imbault, V. Sarantoglou, J. H. Weil .—FEBS Lett., 1982, 141, N 2, p. 213—
216.
Ин-т молекулярной биологии АН СССР, Москва Получено 13.08.84
Ин-т канцерогенеза ВOНЦ АМН СССР, Москва
Μ. К. Куханова, А. А. Краевский, Л. А. Терентьева, В. А. Рассказов
Введение. Мощными ингибиторами синтеза ДНК, катализируемого
ДНК -полимеразами (а — из тимуса теленка, β — из печени крыс и 1 —
из Е. coli) в системах in vitro, являются daNTP [1], которые после
связывания с комплексом Д Н К - п о л и м е р а з а + Д Н К реагируют с 3'-
концом растущей цепи. В результате этой реакции остатки 2',3'-диде-
зокси-3'-аминонуклеозид-5'-фосфатов включаются в З'-положение и
тем самым терминируют рост новосинтезированной цепи.
Известно также, что 2' ,3 '-дидезокси-3 /-аминонуклеозиды с теми же
основаниями, что и daNTP, подавляют синтез Д Н К в эмбрионах мор-
ского ежа в системе in vivo [2]. По предварительным данным механизм
их действия аналогичен действию daNTP, т. е. аминонуклеозиды фос-
форилируются и далее трифосфорилируются до daNTP и обрывают
синтез Д Н К по механизму терминации.
В этой работе представлены результаты исследований по дейст-
вию четырех daNTP на синтез Д Н К в изолированных ядрах, получен-
ных из эмбрионов морского ежа Strongylocentrotus intermidium на ста-
дии подвижной бластулы. Показано, что d a N T P являются ингибитора-
ми репликативного синтеза Д Н К и блокируют образование фрагмен-
тов Оказаки. Действие daNTP и агаТТР обратимо при добавлении
избытка природного субстрата dTTP.
Материалы и методы. daATP, daCTP, daGTP и daTTP синтезированы по [3] и
предоставлены В. Е. Зайцевой; dATP, dCTP, dGTP и dTTP производства НПО БАВ
(Новосибирск); ddTTP фирмы «PL», США; NEM («Serva», США); [ 3 H]dCTP фир-
Принятые сокращения: dNTP — 2'-дезоксинуклеозид-5'-трифосфаты с основаниями
аденин (dATP), цитозин (dCTP), гуанин (dGTP) и тимин (dTTP); daNTP — 2',3'-
дидезокси-3 '-аминонуклеозид-5'-трифосфаты с основаниями аденин (daATP), цитозин
(daCTP), гуанин (daGTP) и тимин (daTTP); а/ЛТР — 2'-дезокси-2'-азидориботимидин-
5'-трифосфат; ddTTP — 2'З'-дидезокситимидин-5'-трифосфат; агаТТР — 5'-трифосфат
1-ф-0-арабинофуранозил)тимина; NEM — N-этилмалеимид.
БИОПОЛИМЕРЫ II КЛЕТКА, 1985, т. I, № 2 79
УДК 577.123
ИНГИБИРОВАНИЕ РЕПЛИКАТИВНОГО СИНТЕЗА ДНК
В ЯДРАХ ЭМБРИОНОВ МОРСКОГО ЕЖА
STRONG YLCCENTROTUS INTERMIDIUM
2',3' -ДИДЕЗОКСИ-3'-АМИНОНУКЛЕОЗИД-5' ТРИФОСФАТАМИ
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-152201 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7657 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T15:17:19Z |
| publishDate | 1985 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Палей, Е.Л. Баранов, В.Н. Зиновьев, Н.Е. Киселев, Л.Л. 2019-06-08T16:30:20Z 2019-06-08T16:30:20Z 1985 Иммуноморфологическое и биохимическое изучение внутриклеточной локализации триптофанил-тРНК-синтетазы высших организмов / Е.Л. Палей, В.Н. Баранов, Н.Е. Зиновьев, Л.Л. Киселев // Биополимеры и клетка. — 1985. — Т. 1, № 2. — С. 70-79. — Бібліогр.: 28 назв. — рос. 0233-7657 http://dx.doi.org/10.7124/bc.000016 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152201 576.31:577.217.32 Исследовали внутриклеточное распределение триптофанил-тРНК-синтетазы (ТРС, КФ 6.1.1.2) в культивируемых клетках почки крупного рогатого скота с использованием очищенных моноспецифинеских поликлональных, а также моноклональных антител к цитоплазматическому ферменту, применяя световую и электронную микроскопию, Количественное содержание ТРС в цитоплазме клеток варьировало в широких пределах. Установлено присутствие ТРС на свободных полисомах и в виде крупных скоплений в цитозоле, на полисомах, связанных с мембранами гранулярного эндоплазматического ретикулума (ГЭР) и с наружной ядерной мембраной. Продукт иммуноцитохимической реакции не выявлен в ядрах, митохондриях, комплексе Гольджи и в области скопления микрофиламентов. При биохимическом исследовании изолированных митохондрий из тканей быка, а также нормальных и опухолевых тканей человека стало возможным выявление с помощью иммунопреципитации и иммуноблотинга ТРС в этих органеллах. Показано наличие общих антигенных детерминант у цитоплазматической и митохондриальной ТРС человека и быка, хотя моноклональные антитела выявляют между ними антигенное различие. Досліджували внутрішньоклітинний розподіл триптофаніл-тРНК-синтетази (ТРС, КФ 6.1.1.2) у культивованих клітинах нирки великої рогатої худоби з використанням очищених моноспецифічних поліклональних, а також моноклональних антитіл до цитоплазматичного ферменту, застосовуючи світлову та електронну мікроскопію. Кількісний вміст ТРС у цитоплазмі клітин варіював у широких межах. Встановлено присутність ТРС на вільних полісомах і у вигляді великих скупчень в цитозолі, на полісомах, зв’язаних з мембранами гранулярного ендоплазматичного ретикулуму (ГЕР) і з зовнішньою ядерною мембраною. Продукт імуноцитохімічної реакції не виявлено в ядрах, мітохондріях, комплексі Гольджі і в області скупчення мікрофіламентів. При біохімічному дослідженні ізольованих мітохондрій з тканин бика, а також нормальних і пухлинних тканин людини стало можливим виявлення за допомогою імунопреципітації і імуноблотингу ТРС у цих органелах. Показано наявність загальних антигенних детермінант у цитоплазматичній і мітохондріальній ТРС людини і бика, хоча моноклональні антитіла виявляють між ними антигенну відмінність. Intracellular distribution of tryptophanyl-tRNA synthetase (TRS, EC 6.1.1.2) in cultivated bovine kidney cells MDBK was studied using purified monospecific polyclonal as well as monoclonal antibodies against cytoplasmic enzyme. Both light and electron microscopy was used to visualize the localization of antigen-antibody complexes within cells. The amount of TRS varied within a wide range in cytoplasm of various cells in the same culture. TRS was established to exist at free polyribosomes and as big aggregates in cytosol, at polysomes attached to membranes of rough endoplasmic reticulum as well as to external nuclear membrane. The product of cytochemical reaction was not revealed in nuclei, mitochondria, Golgi apparatus and in the region of microfilaments. Biochemical studies of isolated mitochondria from bovine tissues and from normal and malignant human tissues by means of immunoblotting and immunoprecipitation showed the presence of TRS in these organelles. Human and bovine cytoplasmic and mitochondrial TRS share common antigenic determinants. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Клеточная биология Иммуноморфологическое и биохимическое изучение внутриклеточной локализации триптофанил-тРНК-синтетазы высших организмов Імуноморфологічне і біохімічне вивчення внутрішньоклітинної локалізації триптофаніл-тРНК-синтетази вищих організмів Immunomorphological and biochemical studies on intracellular distribution of tryptophanyl-tRNA synthetase from higher eukaryotes Article published earlier |
| spellingShingle | Иммуноморфологическое и биохимическое изучение внутриклеточной локализации триптофанил-тРНК-синтетазы высших организмов Палей, Е.Л. Баранов, В.Н. Зиновьев, Н.Е. Киселев, Л.Л. Клеточная биология |
| title | Иммуноморфологическое и биохимическое изучение внутриклеточной локализации триптофанил-тРНК-синтетазы высших организмов |
| title_alt | Імуноморфологічне і біохімічне вивчення внутрішньоклітинної локалізації триптофаніл-тРНК-синтетази вищих організмів Immunomorphological and biochemical studies on intracellular distribution of tryptophanyl-tRNA synthetase from higher eukaryotes |
| title_full | Иммуноморфологическое и биохимическое изучение внутриклеточной локализации триптофанил-тРНК-синтетазы высших организмов |
| title_fullStr | Иммуноморфологическое и биохимическое изучение внутриклеточной локализации триптофанил-тРНК-синтетазы высших организмов |
| title_full_unstemmed | Иммуноморфологическое и биохимическое изучение внутриклеточной локализации триптофанил-тРНК-синтетазы высших организмов |
| title_short | Иммуноморфологическое и биохимическое изучение внутриклеточной локализации триптофанил-тРНК-синтетазы высших организмов |
| title_sort | иммуноморфологическое и биохимическое изучение внутриклеточной локализации триптофанил-трнк-синтетазы высших организмов |
| topic | Клеточная биология |
| topic_facet | Клеточная биология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152201 |
| work_keys_str_mv | AT paleiel immunomorfologičeskoeibiohimičeskoeizučenievnutrikletočnoilokalizaciitriptofaniltrnksintetazyvysšihorganizmov AT baranovvn immunomorfologičeskoeibiohimičeskoeizučenievnutrikletočnoilokalizaciitriptofaniltrnksintetazyvysšihorganizmov AT zinovʹevne immunomorfologičeskoeibiohimičeskoeizučenievnutrikletočnoilokalizaciitriptofaniltrnksintetazyvysšihorganizmov AT kiselevll immunomorfologičeskoeibiohimičeskoeizučenievnutrikletočnoilokalizaciitriptofaniltrnksintetazyvysšihorganizmov AT paleiel ímunomorfologíčneíbíohímíčnevivčennâvnutríšnʹoklítinnoílokalízacíítriptofaníltrnksintetaziviŝihorganízmív AT baranovvn ímunomorfologíčneíbíohímíčnevivčennâvnutríšnʹoklítinnoílokalízacíítriptofaníltrnksintetaziviŝihorganízmív AT zinovʹevne ímunomorfologíčneíbíohímíčnevivčennâvnutríšnʹoklítinnoílokalízacíítriptofaníltrnksintetaziviŝihorganízmív AT kiselevll ímunomorfologíčneíbíohímíčnevivčennâvnutríšnʹoklítinnoílokalízacíítriptofaníltrnksintetaziviŝihorganízmív AT paleiel immunomorphologicalandbiochemicalstudiesonintracellulardistributionoftryptophanyltrnasynthetasefromhighereukaryotes AT baranovvn immunomorphologicalandbiochemicalstudiesonintracellulardistributionoftryptophanyltrnasynthetasefromhighereukaryotes AT zinovʹevne immunomorphologicalandbiochemicalstudiesonintracellulardistributionoftryptophanyltrnasynthetasefromhighereukaryotes AT kiselevll immunomorphologicalandbiochemicalstudiesonintracellulardistributionoftryptophanyltrnasynthetasefromhighereukaryotes |