Ингибирование репликативного синтеза ДНК в ядрах эмбрионов морского ежа Strongуlocentrotus intermidium 2',3'-дидезокси-3'-аминонуклеозид-5'- трифосфатами
2',3'-Дидезокси-3'-аминонуклеозид-5'-трифосфаты ингибируют репликативный синтез ДНК в изолированных ядрах из эмбрионов морских ежей Strongylocentrotus intermidium. Показано, что указанные соединения подавляют синтез фрагментов Оказаки. Действие 2',3'-дидезокси-3'-а...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Дата: | 1985 |
| Автори: | , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Російська |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1985
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152202 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Ингибирование репликативного синтеза ДНК в ядрах эмбрионов морского ежа Strongуlocentrotus intermidium 2',3'-дидезокси-3'-аминонуклеозид-5'- трифосфатами / М.К. Куханова, А.А. Краевский, Н.А. Терентьева, В.А. Рассказов // Биополимеры и клетка. — 1985. — Т. 1, № 2. — С. 79-86. — Бібліогр.: 11 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860012968505245696 |
|---|---|
| author | Куханова, М.К. Краевский, А.А. Терентьева, Н.А. Рассказов, В.А. |
| author_facet | Куханова, М.К. Краевский, А.А. Терентьева, Н.А. Рассказов, В.А. |
| citation_txt | Ингибирование репликативного синтеза ДНК в ядрах эмбрионов морского ежа Strongуlocentrotus intermidium 2',3'-дидезокси-3'-аминонуклеозид-5'- трифосфатами / М.К. Куханова, А.А. Краевский, Н.А. Терентьева, В.А. Рассказов // Биополимеры и клетка. — 1985. — Т. 1, № 2. — С. 79-86. — Бібліогр.: 11 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Биополимеры и клетка |
| description | 2',3'-Дидезокси-3'-аминонуклеозид-5'-трифосфаты ингибируют репликативный синтез ДНК в изолированных ядрах из эмбрионов морских ежей Strongylocentrotus intermidium. Показано, что указанные соединения подавляют синтез фрагментов Оказаки. Действие 2',3'-дидезокси-3'-аминотимидин-5'-трифосфата и арабинозилтимидин-5'-трифосфата обратимо при добавлении природного субстрата синтеза ДНК дезокситимидин-5'-трифосфата.
2 ', 3'-Дідезокси-3'-амінонуклеозид-5'-трифосфати інгібують реплікативний синтез ДНК в ізольованих ядрах з ембріонів морських їжаків Strongylocentrotus intermidium. Показано, що зазначені сполуки пригнічують синтез фрагментів Оказакі. Дія 2 ', 3'-дідезокси-3'-амінотимідин-5'-трифосфату і арабінозилтимідин-5'-трифосфату оборотно за додавання природного субстрату синтезу ДНК дезокситимідин-5'-трифосфату.
2', 3'-dideoxy-3'-aminonucleoside-5'-triphosphates are shown to be inhibitors of repllcative DNA synthesis in isolated nuclei of sea urchin embryo. These compounds inhibit the fragment Okazaki synthesis. The effect of 2', 3'-dideoxy-3'-aminothymidine 5'-triphosphate and arabinothymidine 5'-triphosphate is reversible when adding the corresponding substrate of DNA synthesis, 2'-deoxy-thymidine-5'-triphosphate.
|
| first_indexed | 2025-12-07T16:43:27Z |
| format | Article |
| fulltext |
20. Dean R. Т. Cel lu lar deg rada t ive processes.— London: C h a p m a n and Hal l , 1978.—
120 p.
21. Sprinzl M., Gauss D. H. Compi la t ion of t R N A sequences.— Nucl. Acids Res., 1984, 12,
Suppl. , p. 1—57.
22. Майнолов С. Ε. Биохимические основы злокачественности.— Л . : Медицина, 1971.—
230 с.
23. Лузиков В. Н. Регуляция формирования митохондрий.— М. : Наука , 1980.— 317 с.
24. Hay RBohni P., Gasser S. H o w mi tochondr ia impor t proteins .— Biochim. et biophys.
acta , 1984 779, N 1. p. 65—87.
25. Penneys N. S., Muench К. H. T ryp tophany l - tRNA syn the t a se of h u m a n skin.— Clin.
Res., 1971, 19, N 2, p. 581—582.
26. Penneys N. S., Muench К. H. H u m a n p lacenta l t ryp tophanyl t r a n s f e r r ibonucleic acid
syn the tase . Pu r i f i ca t ion and subuni t s t ruc ture .— Biochemistry , 1974, 13, N 3, p. 560—
565.
27. Gabius H.-J., Cramer F. Pu r i f i ca t ion and subuni t s t ruc tu re of pheny la l any l - tRNA syn-
the tase f rom hen liver mi tochondr ia .— Biochem. and Biophys. Res. Communs . , 1982,
106, N 2, p. 325—330.
28. Immunological evidence for s t ruc tu ra l d i f fe rences be tween E u g l e n a Graci l is chloro-
p las t ic va ly l - and leucyl - tRNA syn the t a se and their cy top lasmic coun te rpa r t s / B. Co-
las, P . Imbaul t , V. S a r a n t o g l o u , J . H. W e i l . — F E B S Lett., 1982, 141, N 2, p. 213—
216.
Ин-т молекулярной биологии АН СССР, Москва Получено 13.08.84
Ин-т канцерогенеза В О Н Ц А М Н СССР, Москва
УДК 577.123
ИНГИБИРОВАНИЕ РЕПЛИКАТИВНОГО СИНТЕЗА ДНК
В ЯДРАХ ЭМБРИОНОВ МОРСКОГО ЕЖА
STRONGYLCCENTROTUS INTERMIDIUM
2',3' -ДИДЕ30КСИ-3'-АМИНОНУКЛЕОЗИД-5'-ТРИФОСФАТАМИ
М. К. Куханова, А. А. Краевский, Л. А. Терентьева, В. А. Рассказов
Введение. Мощными ингибиторами синтеза ДНК, катализируемого
ДНК-полимеразами (а — из тимуса теленка, β — из печени крыс и 1 —
из Е. coli) в системах in vitro, являются daNTP [1], которые после
связывания с комплексом ДНК-полимераза+ДНК реагируют с 3'-
концом растущей цепи. В результате этой реакции остатки 2',3'-диде-
зокси-3'-аминонуклеозид-5'-фосфатов включаются в З'-положение и
тем самым терминируют рост новосинтезированной цепи.
Известно также, что 2',3'-дидезокси-3 /-аминонуклеозиды с теми же
основаниями, что и daNTP, подавляют синтез Д Н К в эмбрионах мор-
ского ежа в системе in vivo [2]. По предварительным данным механизм
их действия аналогичен действию daNTP, т. е. аминонуклеозиды фос-
форилируются и далее трифосфорилируются до daNTP и обрывают
синтез Д Н К по механизму терминации.
В этой работе представлены результаты исследований по дейст-
вию четырех daNTP на синтез Д Н К в изолированных ядрах, получен-
ных из эмбрионов морского ежа Strongylocentrotus intermidium на ста-
дии подвижной бластулы. Показано, что daNTP являются ингибитора-
ми репликативного синтеза Д Н К и блокируют образование фрагмен-
тов Оказаки. Действие daNTP и агаТТР обратимо при добавлении
избытка природного субстрата dTTP.
Материалы и методы. daATP, daCTP, d a G T P и d a T T P синтезированы по [3] и
предоставлены В. Е. Зайцевой; dATP, dCTP, d G T P и dTTP производства Н П О БАВ
(Новосибирск) ; d d T T P фирмы «PL», США; N E M («Serva», С Ш А ) ; [ 3 H ] d C T P фир-
Принятые сокращения: d N T P — 2 ' -дезоксинуклеозид-5 / -трифосфаты с основаниями
аденин (dATP) , цитозин (dCTP) , гуанин (dGTP) и тимин ( d T T P ) ; d a N T P — 2' ,3 /-
дидезокси-З ' -аминонуклеозид-5 ' -трифосфаты с основаниями аденин (daATP) , цитозин
( d a C T P ) , гуанин ( d a G T P ) и тимин ( d a T T P ) ; а / Л Т Р — 2 / -дезокси-2 / -азидориботимидин-
5 ' -трифосфат; d d T T P — ^З ' -дидезокситимидин-Б ' - трифосфат ; а гаТТР — 5 ' -трифосфат
1- (β -D-арабинофуранозил)тимина ; N E M — N-этилмалеимид.
79 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. I, Кя 2
мы «Изотоп», СССР, удельная активность 10 К и / м м о л ь ; а гаТТР синтезирован по [4] ;
azTTP предоставлен Л. А. Александровой.
В ы д е л е н и е я д е р и з э м б р и о н о в м о р с к о г о е ж а и о п р е д е -
л с н н е с и н т е з а Д Н К . Ядра из эмбрионов морского е ж а на стадии подвижной
бластулы выделяли по модифицированной методике [5]. Эмбрионы собирали центри-
фугированием (10 мин, 2000 g) , промывали три раза раствором 0,9 Μ глюкозы с добав-
лением 1 · Ю - 4 Μ ЭДТА. Осадок после центрифугирования суспендировали в буфере А
(20 мМ трис-HCl, рН 8,0, 5 мМ меркаптоэтанол, 5 мМ MgCl 2 ) , с о д е р ж а щ е м 0,32 Μ
сахарозу, и гомогенизировали, пропуская суспензию 2—3 раза через шприц с иглой № 8.
Разрушение эмбрионов и клеток наблюдали при микроскопировании. Гомогенат центри-
фугировали при 4000 g 15 мин, затем осадок, содержащий неочищенный ядерный ма-
териал, ресуспендировали в буфере А, содержащем 1,5 Μ сахарозу, и центри-
фугировали 30 мин при 14000 g. Полученный осадок суспендировали в буфере А, содер-
Рис. 1. Зависимость включения [ 3 Н ] С Т Р ядрами от времени. К а ж д а я проба содер-
ж а л а 4-Ю 6 ядер. Условия проведения опытов описаны в «Материалах и методах».
Fig. 1. Time dependence of incorpora t ion of [ 3 H ] C T P by nuclei. Each sample conta-
ined 4· 106 nuclei. Condi t ions are described in «Mater ia l s and Methods» .
Рис. 2. Зависимость включения [3H] С Т Р ядрами от количества ядер в пробе. Время
инкубации 15 мин.
Fig. 2. Dependence of incorpora t ion of [ 3 H ] C T P by nuclei ve r sus the a m o u n t of nuclei
per sample cell. Incubat ion t ime 15 min.
ж а щ е м 0,32 Μ сахарозу, до концентрации (2—3) ·10 8 ядер в 1 мл, что соответствовало
~ 125 ед. А2бо· Д л я измерения оптической плотности аликвоту ядерной суспензии раз-
бавляли 0,05 Η NaOH. Полученную суспензию использовали в опытах для изучения
синтеза Д Н К . Количество ядер определяли в камере Горяенова (под микроскопом) .
В ряде опытов проводили дополнительную очистку ядер. Д л я этого суспензию ядер
наслаивали на 1,5 Μ сахарозу, приготовленную на буфере А, и центрифугировали
40 мин при 14000 g. В опытах использовали только свежеприготовленные ядра .
Инкубационная смесь для определения синтеза Д Н К в я д р а х с о д е р ж а л а в
объеме 0,1 мл 50 мМ трис-HCl, рН 7,8, 3 мМ MgCl 2 , 2 мМ меркаптоэтанол, 2 мкКи
(или Ы О 6 имп/мин) [ 3 H]dCTP, смесь трех d N T P (где это указано) , дополнитель-
ных к радиоактивному субстрату, ингибиторы в концентрациях, указанных в подпи-
сях к рисункам и таблицам. После инкубации при 24 °С к пробам добавляли равный
объем 10%-ной ТХУ, содержащей 1 %-ный пирофосфат натрия и через 15 мин про-
пускали их сквозь стеклянные фильтры G F / C («Whatman» , Англия) . Фильтры про-
мывали 50 мл 5 %-пой ТХУ с 1 %-ным пирофосфатом натрия.
Ц е н т р и ф у г и р о в а н и е в щ е л о ч н о м с а х а р о з н о м г р а д и е н т е .
Д л я анализа размеров Д Н К , включающей радиоактивную метку, к пробам добавляли
мкл 0,2 Μ ЭДТА, 10 мкл 20 %-ного N-лаурилсаркозина и 10 мкл 3 Η N a O H . Через 1 ч
при 24 °С 0,1 мл суспензии наносили на сахарозный градиент (4,8 мл 5—20 %-ной саха-
розы), содержащей 0,15 Η NaOH, 0,3 мМ ЭДТА, 0,1 %-ный N-лаурилсаркозин. Центри-
фугирование проводили на «Spinco» в роторе SW-65 14 ч, 37000 об/мин.
Результаты исследования. Х а р а к т е р и с т и к а с и с т е м ы
с и н т е з а Д Н К в я д р а х и з э м б р и о н о в м о р с к о г о е ж а . На
рис. 1 представлены данные по включению (3H]dCTP в кислотонераст-
воримый материал в зависимости от времени инкубации. Видно, что
в течение 15—20 мин происходит увеличение уровня радиоактивности
80 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. I, Кя 2
в кислотонерастворимой фракции. На рис. 2 показана зависимость син-
теза Д Н К от количества ядер в пробе. Вплоть до 6-Ю6 ядер в пробе
наблюдалось увеличение включения радиоактивной метки в ДНК. Все
дальнейшие опыты проводили при концентрации ядер в пробе (2—
4) · 106 и времени инкубации 15 мин.
Характерной особенностью синтеза Д Н К ядрами из эмбрионов
морского ежа на изучаемой стадии их развития является почти полное
отсутствие зависимости синтеза Д Н К от добавленных экзогенных
dNTP (табл. 1). Как видно из этой таблицы, включение PHldCTP без
Рис. 3. Ингибирование синтеза Д Н К в я д р а х с помощью d a T T P (1, а) и а г а Т Т Р
(1,6), d d T T P (2) и a z T T P (3). Время реакции 15 мин, 24 °С. 1 0 0 % соответствуют
30000 имп/мин или 4,5 пмоля.
Fig . 3. Inhibi t ion of the DNA synthes i s in the nuclei by d a T T P (1, a ) , а гаТТР (1, 6 ) ,
d d T T P (2) and a z T T P ( 3 ) . Incuba t ion t ime 15 min a t 24 °С. 1 0 0 % of incorpora t ion cor-
respond to 30, 000 cpm or 4.5 pmoles .
Рис. 4. Ингибирование синтеза Д Н К в ядрах d a T T P (a), d a A T P (б), d a C T P (в) и
d a G T P (г). Время инкубации 15 мин. З а 100 % принято включение без ингибиторов.
F ig . 4. Inhibi t ion of DNA synthes i s in the nuclei by d a T T P ( a ) , d a A T P (6) , d a C T P
(в) and d a G T P (г). Incuba t ion t ime 15 min. Incorpora t ion wi thou t inhibi tors w a s t aken
as 100 %.
последующих опытах при изучении синтеза Д Н К в присутствии инги-
биторов экзогенные dNTP не добавляли (если специально не указы-
вается).
При удалении из системы АТР наблюдали лишь остаточный син-
тез, составляющий 15—25 % от синтеза в полной системе. В табл. 1
отражено действие некоторых известных ингибиторов ферментов син-
теза Д Н К (NEM, агаТТР и ddTTP). Добавление NEM, блокирующе-
го сульфгидрильные группы, приводило, к существенному уменьшению
включения [3H]dCTP. До концентрации 1 мМ ddTTP не оказывал за-
метного действия, а агаТТР в концентрации 0,5 мМ ингибировал си-
стему на 70 %.
Д е й с т в и е d а Ν Τ Ρ н а с и н т е з Д Н К я д р а м и . На рис. 3
представлены данные по ингибированию синтеза Д Н К в зависимости
от концентрации ингибиторов — аналогов dTTP : daTTP и агаТТР по-
давляют синтез Д Н К примерно одинаково, тогда как ddTTP и azTTP
мало влияют на этот процесс. На рис. 4 показано действие каждого
из четырех daNTP на репликацию и в табл. 2 приведены концентрации
daNTP, подавляющие синтез Д Н К на 50 %; все четыре daNTP ведут
себя как весьма эффективные ингибиторы синтеза.
81 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. I, Кя 2
добавления экзогенных dNTP
ниже всего лишь на 5—20 %
в разных опытах по сравне-
нию с системой, в которую до-
полнительно внесены dNTP по
20 мкМ каждого. Поэтому в
Рис. 5 иллюстрирует зависимость синтеза Д Н К в ядрах от време-
ни в присутствии 4 -Ю - 4 Μ daTTP. В качестве контроля приведен син-
тез Д Н К без ингибитора. Видно, что при данной концентрации daTTP
ингибирование составляет примерно 50 % независимо от времени, что
свидетельствует о равновероятном взаимодействии daTTP и соответст-
Рис. 5. Зависимость синтеза Д Н К в ядрах от времени: без ингибиторов ( 1 ) и в при-
сутствии 4 · ΙΟ"4 Μ d a T T P (2).
Fig. 5. Time dependence of the DNA synthes is in nuclei: w i thou t inhibi tors ( 1 i n t he
presence of 4 - Ю - 4 Μ d a T T P (2).
Рис. 6. Обратимость действия d a T T P при добавлении БО-кратного по отношению к
d a T T P субстрата синтеза dTTP. З а 100% принято включение [ 3 H ] d C T P в Д Н К без
ингибитора за данный промежуток времени (1)\ включение [ 3 H ] d C T P в пробы, со-
д е р ж а щ и е 4 - Ю - 4 Μ daTTP, в течение 10 мин с последующим добавлением 2 · Ю - 2 Μ
dTTP (2); в пробах присутствовал d a T T P ( 4 - Ю - 4 Μ) (3).
Fig. 6. The reversibi l i ty of act ion of d a T T P upon a d d i n g of a 50-fold excess of d T T P
with respect to daTTP. Incorpora t ion of [ 3 H ] C T P to DNA wi thou t inhibi tors wi th in a
given time was taken as 1 0 0 % 0 ) ; incorpora t ion of p H J d C T P in the sample tha t con-
ta ined 4 - Ю - 4 Μ d a T T P wi th in 10 min wi th a subsequen t addi t ion of 2 · 1 0 ~ 2 Μ d T T P
(2); d a T T P ( 4 - Ю - 4 Μ) w a s presen t in a sample cell (3).
вующего субстрата dTTP с ДНК-синтезирующим комплексом. Через
20 мин реакция практически заканчивается в обоих случаях.
О б р а т и м о с т ь д е й с т в и я d a T T P и а г а Т Т Р . На рис. 6 и
7 представлены данные по обратимости действия daTTP и агаТТР на
синтез Д Н К в ядрах. К пробам, содержащим 4 -Ю - 4 Μ daTTP или
Т а б л и ц а 1
Влияние экзогенных dNTP и других соединений
на включение в ДНК [*H]dCTP ядрами
эмбрионов в полной системе
The Effect of Exogenous dNTPs and Other
Compounds on the Incorporation of [3H]dCTP in
DNA of Embruo Nuclei in a Complete System
Т а б л и ц а 2
Концентрация ингибиторов, при
которой подавление синтеза ДНК
составляет 50 % от контроля
Concentration of Compounds which
Inhibits the DNA Synthesis by 50 %
Against the Control
П р и м е ч а н и е . П о л н а я система включала : солевую смесь, А Т Р и ядра , как это
указано в разделе «Материалы и методы». З а 100 % принято включение радиоактив-
ной метки, составляющее (25—35) · 103 имп/мин или 20 пмолей.
82 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. I, Кя 2
2 · 10—4 Μ агаТТР, через 10 мин добавляли субстрат синтеза Д Н К dTTP
в концентрации, превышающей концентрацию ингибитора в 50—100 раз,
и определяли зависимость синтеза Д Н К от времени. Видно, что через
2—3 мин после добавления dTTP включение [3H]dCTP в кислотонера-
створимую фракцию в обоих случаях начинает возрастать (кривая 2)
и через 25 мин инкубации радиоактивность в пробе составляет в слу-
чае daTTP 60—70 %, а в случае агаТТР — 75—90 % от радиоактивно-
Рис. 7. Обратимость действия агаТТР при добавлении 100-кратного по отношению
к а к а Т Т Р субстрата dTTP. Обозначения для кривой 1, как на рис. 6; 2 — включение
[ 3 H ] d C T P в пробы, содержащие 2 · 1 0 ~ 4 Μ агаТТР, в течение 10 мин с последующим
добавлением d T T P (1 ,6 ·10~ 2 М ) ; 3 — пробы, содержащие агаТТР ( 2 - Ю - 4 М ) .
Fig . 7. Reversibi l i ty of act ion of а гаТТР upon a d d i n g of a 100-fold excess of d T T P
wi th respect to агаТТР. Des igna t ion for curve (1) as in Fig. 6; incorpora t ion of [ 3 H ] d C T P
in the samples con ta in ing 2 - Ю - 4 Μ а гаТТР wi th in 10 min wi th a subsequen t
addi t ion of 1.6· ΙΟ"2 Μ dTTP (2)\ s amples wi th а гаТТР (2· ΙΟ"4 Μ ) f 3 ) .
Рис. 8. Анализ величины фрагментов ДІТК, включающих [ 3 H ] d C T P , в щелочном гра-
диенте плотности сахарозы. Условия описаны в разделе «Материалы и методы»: 1 —
распределение радиоактивности в градиенте после инкубации ядер с [ 3 H ] d C T P ; 2 —
то ж е в присутствии 4 · 1 0 ~ 4 Μ d a T T P ; 3 — положение маркера т Р Н К .
Fig . 8. Ana lys i s of sizes of DNA f r a g m e n t s con ta in ing rad ioac t iv i ty in a lka l ine g ra -
dient of sucrose densi ty . Condi t ions are described in «Mater ia l s and Methods» . Distr i-
but ion of rad ioac t iv i ty in g rad ien t a f t e r incubat ion of nuclei wi th [ 3 H ] d C T P (1) ; the
s ame in the presence of 4 · 10~4 Μ d a T T P (2); locat ion of tRNA marke r (3).
сти в контрольных опытах, куда ингибитор не вносился (кривая 1).
Включение в каждой пробе в процентах (кривая 2) рассчитывали от
соответствующей точки контроля. Кривая 3 отражает данные по вклю-
чению метки в пробы в присутствии ингибитора без добавления dTTP,
который добавляли также в каждую пробу (кривая / ) , не содержа-
щую ингибитор. Включение [3Н] dCTP практически не изменялось по
сравнению с пробами без добавления dTTP.
А н а л и з в е л и ч и н ы ф р а г м е н т о в Д Н К , в к л ю ч а ю щ и х
м е т к у . На рис. 8 представлены данные анализа размеров Д Н К ядер
после инкубации их с [3H]dCTP без ингибитора и в присутствии daTTP.
Видно, что [3H]dCTP включается в основном во фрагменты ДНК, име-
ющие коэффициент седиментации 4—5 S. В высокомолекулярной фрак-
ции радиоактивность составляет 4—6 % в расчете на весь радиоактив-
ный материал градиента. Инкубация ядер в присутствии 4 -Ю - 4 Μ
daTTP приводила к заметному уменьшению включения метки во фраг-
менты ДНК. Уменьшение счета составляет примерно 60%, что соот-
ветствует данным рис. 3 и 4.
Обсуждение результатов. Как видно из приведенных данных,
daNTP являются достаточно мощными ингибиторами синтеза Д Н К в
83 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. I, Кя 2
ядрах, полученных из эмбрионов морского ежа на стадии подвижной
бластулы. Из табл. 1 и рис. 3, отражающих действие известных инги-
биторов ДНК-полимераз (NEM, ddTTP и агаТТР) на синтез Д Н К в
ядрах, следует, что изучаемый процесс синтеза Д Н К является в основ-
ном репликативным и в нем участвует ДНК-полимераза а . Так, извест-
но, что NEM является ингибитором ДНК-полимеразы α в системе
in vitro с очищенной полимеразой α [6] и ингибирует в значительной
степени синтез Д Н К в ядрах из клеток мыши L929 [7] и печени крыс
[8]. В то же время ΝΕΜ в концентрации до 100 мкг/мл не влияет на
активность ДНК-полимеразы β из печени крыс [8], ведущей в основ-
ном репаративный синтез ДНК. В нашей системе ΝΕΜ в концентра-
ции 2-Ю- 3 Μ подавлял синтез на 70—75 %. В табл. 1 показано, что
агаТТР, второй известный тип ингибиторов ДНК-полимеразы а в
системах in vitro и в ядрах из клеток HeLa в S-фазе [9], в нашем слу-
чае ингибировал синтез Д Н К на 60—70 %. Ингибитор ДНК-полиме-
раз типа β ddTTP [10] подавлял включение [3H]dCTP только на 20—
25 %, причем практически полностью отсутствовала зависимость инги-
бирования от концентрации ddTTP в пределах 1 -10~ 5 —МО - 3 М. Из
этого следует, что выделенные ядра ведут по крайней мере на 75—
80 % репликативный синтез. Остальные 20—25 % включенной метки
могут отражать, по-видимому, как репаративный синтез, вызванный
повреждениями Д Н К при выделении ядер, так и более сложное влия-
ние ингибиторов на ДНК-полимеразу α в ядерной системе. Такое же
ингибирование ddTTP синтеза Д Н К наблюдалось в лизате клеток
HeLa [10].
Для синтеза Д Н К ядрами, выделенными из эмбрионов морского
ежа на стадии подвижной бластулы, не требуется добавления экзоген-
ных dNTP в отличие от систем с ядрами из L-клеток мыши [11], а так-
же из печени крыс [8], в которых синтез Д Н К резко снижается при
удалении даже одного из dNTP. Этот феномен можно объяснить нали-
чием в ядрах достаточно большого пула dNTP для синтеза ДНК. В
работе [12] отмечается, что неоплодотворенные яйца морского ежа со-
держат громадный пул dNTP, который вполне достаточен для репли-
кации Д Н К в течение двух делений. Поэтому при испытании действия
daNTP в системе с ядрами смесь экзогенных dNTP не добавляли.
Данные рис. 4 и табл. 2 свидетельствуют, что все четыре daNTP
являются эффективными ингибиторами синтеза Д Н К в ядрах, ведущих
на 70—75 % репликативный синтез и на 25—30 % репаративный. В
этой системе daNTP являются, по-видимому, ингибиторами процессов
обоих типов, так как в опытах in vitro [1] было показано, что они ин-
гибируют как полимеразу а, так и β. Их действие сопоставимо, а в
случае daCTP сильнее, чем эффект агаТТР. Различия в концентрациях
daNTP, дающих 50 %-ное подавление синтеза, может быть связано с
разной величиной пула dNTP в ядрах. В отличие от daNTP рибо-ана-
лог azTTP слабо ингибировал включение [3Н] dCTP во фрагменты
ДНК. Известно [13], что azATP подавлял репликацию Д Н К на ран-
них этапах элонгации, включающих синтез рибо-праймера, но не влиял
на синтез Д Н К в ядрах из асцитной карциномы Эрлиха. Следователь-
но, ядра, используемые нами, уже имели рибо-праймеры и продолжа-
ли синтез ДНК.
Графики рис. 6 и 7 показывают, что действие агаТТР и daTTP об-
ратимо при добавлении в систему большого избытка, по сравнению с
ингибиторами, субстрата dTTP. На основании полученных данных
можно полагать, что мононуклеотидные остатки из daTTP и агаТТР,
включенные в З'-конец синтезируемой цепи ДНК, подвергаются нукле-
азному выщеплению и замещаются на природные тимидиловые остат-
ки из dTTP, после чего ядра вновь могут продолжать синтез ДНК.
Медленное повышение уровня синтеза Д Н К свидетельствует в поль-
зу того, что daTTP и агаТТР ингибируют синтез Д Н К по терминацион-
ному механизму. Подобные эффекты обратимости действия ага-произ-
водных были описаны в работе [14], где показано, что выщепление
84 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. I, Кя 2
мононуклеотидных остатков ага-нуклеотидов производится репаратив-
ной системой ядер. Учитывая данные опытов с очищенными ДНК-по-
лимеразами in vitro [1], можно полагать, что daNTP действуют по то-
му же механизму.
Как видно из рис. 8, добавление daNTP в ДНК-синтезирующую
систему значительно понижает суммарный синтез ДНК, хотя фрагмен-
ты Оказаки образуются обычной длины. Поэтому мы полагаем, что
ингибирование полимеризации происходит главным образом на этапе
перехода от рибо-праймеров к элонгации синтеза ДНК. Возможны,
однако, и другие интерпретации замеченного явления. Одна из них
предполагает, что незрелые (недостроенные) фрагменты Оказаки под-
вергаются более быстрому гидролизу нуклеазами.
Авторы благодарят А. В. Иткеса за полезную критику и ценные
советы.
I N H I B I T I O N O F R E P L I C A T I V E DNA S Y N T H E S I S IN N U C L E I
O F SEA U R C H I N ( S T R O N G Y L O C E N T R O T U S INTERMIDIUM) EMBRYO
BY 2', 3 ' - D I D E O X Y - 3 ' - A M I N O N U C L E O S I D E 5 ' - T R I P H O S P H A T E S
M. K. Kukhanoua, A. A. Kraevsky
In s t i t u t e of Molecu la r Biology, Academy of Sciences of the U S S R , Moscow
N. A. Terentieva, V. A. Rasskazov
The Pac i f ic Ocean Ins t i tu te of Bioorgan ic Chemis t ry ,
Academy of Sciences of the U S S R , Vladivos tok
S u m m a r y
2', 3 ' -d ideoxy-3 ' -aminonucleos ide-5 ' - t r iphosphates are shown to be inhibi tors of repll-
cat ive DNA synthes is in isolated nuclei of sea urchin embryo. These compounds inhibit
the f r a g m e n t Okazaki synthes is . The ef fec t of 2' , 3 ' -d ideoxy-3 ' -aminothymidine 5 '- tr i-
phospha te and a rab ino thymid ine 5 ' - t r iphospha te is revers ible when a d d i n g the corre-
s p o n d i n g subs t r a t e of DNA synthes is , 2 ' -deoxy- thymidine-5 ' - t r iphosphate .
1. 2', 3'-Dideoxy-3'-aminonucleoside-5f-triphosphates a re the t e rmina to r s of DNA synthe-
sis ca ta lyzed by DNA po lymerases / Z. G. Ch idgeavadze , R. Sh. Beabealashvi l l i ,
A. M. At razhev et a l . — N u c l . Acids Res., 1984, 12, N 3 , p. 1671 — 1686.
2. Ингибирование биосинтеза Д Н К в эмбрионах морских ежей с помощью 2', З ' -диде-
зокси-З ' -аминонуклеозидов / М. К. Куханова , С. В. Кочеткова, А. А. Краевский и
д р . — Б и о х и м и я , 1983, 48, № 3 , с. 1747—1751.
3. Аминонуклеозиды и их производные. XI. Синтез 3 ' -амино-2' , З ' -дидезоксинуклео-
зид-5 ' -трифосфатов / В. Е. Зайцева , Н. Б. Д я т к и н а , А. А. Краевский и др.— Био-
оргапич. химия, 1984, 10, № 5 , с. 670—680.
4. Schinazi R. F., Chen Μ. S., Prusoff W. H. Ant iv i ra l and an t ineoplas t i c act ivi t ies of
pyr imidine a rab inosy l nucleosides and their 5 ' -amino der ivat ives .— J. Med. Chem.,
1979, 22, N 10, p. 1273—1277.
5. The mode of act ion of aphidicolin on DNA synthes is in isolated n u c l e i / М . Oguro ,
M. Shioka, M. N a g a n o , Y. Mano .— Biochem. and Biophys. Res. C o m m u n s , 1980, 92,
N 1, p. 13—16.
6. Cozzarelli N. R. The mechan i sm of act ion of inhibi tors of DNA s y n t h e s i s . — A n n .
Rev. Biochem., 1977, 46, p. 641—648.
7. Involvment of deoxyribonucleic acid po lymerase β in nuclear deoxyribonucleic syn-
thesis / T. R. But t , W. M. Wood, E. L. McKay, L. P . A d a m s . — B i o c h e m . J., 1978,
173, N 1, p. 309—314.
8. Zoncheddu Α., Aceomando R., Badaraceo G. Compar i son of the e f fec t s of d i f feren-
tial inhibi tors of eucaryot ic DNA polymerases on DNA synthes is in isolated ra t
liver nuclei.— Int . J. Biochem., 1983, 15, N 3, p. 337—342.
9. Wist E.t Krokan H., Prydz H. E f f ec t of Ι -β -D-a rab inofu ranos i l cy tos ine t r iphospha te
on DNA synthes i s in isolated HeLa cell nuc l e i . /—Biochemis t ry , 1976, 15, N 16,
p. 3647—3652.
10. Wager Μ. Α., Evans M. E.f Huberman K. S. E f fec t of 2', 3 ' -d ideoxythymidine 5 -
t r iphospha te on HeLa cells in vi t ro DNA synthes is : evidence tha t DNA po lymerase
a is the only po lymerase required for cel lular DNA repl icat ion — N u c l . Acids
Res., 1978, 5, N 5, p. 1933—1946. .
11. Berger N. AJohnson C. DNA synthes is in permeabi l ized mouse L cells — B i o c h i m .
et biophys. acta, 1976, 425, N 1, p. 1—17.
85 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. I, Кя 2
12. Mathews С. К. Giant pools of DNA precursors in sea urchin eggs .— Exp. Cell Res.,
1975, 92, N 1, p. 47—56.
13. Eliasson R. E., Pontis E., Reichard P. Replication of polyoma DNA in nuclei iso-
lated f rom azidocytidine inhibited f ib rob las t s .—J. Biol. Chem., 1981, 256, N 1 7 ,
p. 9044—9050.
14. Hiss Ε. Α., Preston R. J. The effect of cytosine arabinoside on the f requency of
s ingle-s t rand breaks in DNA of mammal i an cells following irradiation or chemical
t rea tment .— Biochim. et biophys. acta, 1977, 478, N 1, p. 1—8.
Ин-т молекулярной биологии АН СССР, Москва Получено 16.07.84
Тихоокеанский ин-т биоорганич. химии
Д В Н Ц АН СССР, Владивосток
УДК 575.127:633.71:576.851
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ Т-РАЙОНА
В ГИБРИДАХ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК,
ПОЛУЧЕННЫХ ПУТЕМ СЛИЯНИЯ
НОРМАЛЬНОЙ И ОПУХОЛЕВОЙ КЛЕТОК
И. Ф. Каневский, Η. Н. Череп, М. В. Скаржинская, Ю. Ю. Глеба
Введение. Клетки корончатых галлов растений, трансформированные
Agrobacterium tumafaciens и несущие в своем геноме Т-ДНК, способ-
ны к росту in vitro на питательных средах, лишенных фитогормонов
[1]. Они синтезируют необычные аминокислоты, так называемые опп-
кы [2—4], а некоторые опухолевые линии не способны зеленеть на све-
ту и/или регенерировать стебли. Эти свойства клеток корончатых
галлов впервые были использованы Вуллемсом с соавт. [5] для отбора
внутривидовых соматических гибридов между нормальной и трансфор-
мированной клетками Nicotiana tabacum. Нами ранее были получены
аналогичным образом межвидовые гибриды Nicotiana tabacum (транс-
формированный) + Nicotiana plumbaginifolia [6]. В обоих случаях
отбор гибридов оказался возможным, потому что у них сохранялся
признак гормопопезависимости и при этом восстанавливалась способ-
ность к позеленению/регенерации стеблей.
В данной работе изучали возможность селективного отбора гиб-
ридных линий в межтрибной комбинации видов Nicotiana tabacum
(трансформированный) и Atropa belladonna L а также экспрессию
признаков, прямо или опосредованно контролируемых генами Т-ДНК,
в гибридных клетках: активность лизопиндегидрогеназы; неспособность
к образованию побегов; неспособность к ризогенезу; устойчивость к 2-
аминоэтилцистеину, 5-бромдезоксиуридину и 5-метилтриптофану.
Материалы и методы. В качестве одного из родителей использовали клеточную
линию Nicotiana tabacum, сорт White Burley, полученную в результате трансформации
клеток табака октопиновым штаммом Agrobacterium tumefaciens B6S3, несущим плаз-
миду LBA2 (любезно предоставлена д-ром О. Шидером, Ин-т селекции растений Макса
Планка, Кёльн, Ф Р Г ) . Опухолевые клетки выращивали на среде Линсмейера и Скуга
[7], лишенной гормонов, в темноте, при 28 °С. Источником мезофильных протопластов
служили асептически выращиваемые диплоидные растения красавки Atropa belladonna
L. (2п = 72).
Д л я получения каллусных и мезофильных протопластов использовали ферментные
смеси и технику, описанные Глебой и Гоффманом [8].
Активность лизопиндегидрогеназы определяли по методике, разработанной Оттеном
и Шилпероортом [9]. Анализ множественных молекулярных форм амилазы проводили
согласно методике электрофореза в полиакриламидных гелях по Дэвису [10].
Слияние протопластов индуцировали по методу Менделя с соавт. [ И ] , при помощи
полиэтиленгликоля и буфера с высоким рН, высоким содержанием Са2+ и 1 0 % - н о г о
диметилсульфоксида (ДМСО) . После слияния протопласты культивировали три недели
86 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. I, Кя 2
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-152202 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7657 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T16:43:27Z |
| publishDate | 1985 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Куханова, М.К. Краевский, А.А. Терентьева, Н.А. Рассказов, В.А. 2019-06-08T16:32:13Z 2019-06-08T16:32:13Z 1985 Ингибирование репликативного синтеза ДНК в ядрах эмбрионов морского ежа Strongуlocentrotus intermidium 2',3'-дидезокси-3'-аминонуклеозид-5'- трифосфатами / М.К. Куханова, А.А. Краевский, Н.А. Терентьева, В.А. Рассказов // Биополимеры и клетка. — 1985. — Т. 1, № 2. — С. 79-86. — Бібліогр.: 11 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.000017 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152202 577.123 2',3'-Дидезокси-3'-аминонуклеозид-5'-трифосфаты ингибируют репликативный синтез ДНК в изолированных ядрах из эмбрионов морских ежей Strongylocentrotus intermidium. Показано, что указанные соединения подавляют синтез фрагментов Оказаки. Действие 2',3'-дидезокси-3'-аминотимидин-5'-трифосфата и арабинозилтимидин-5'-трифосфата обратимо при добавлении природного субстрата синтеза ДНК дезокситимидин-5'-трифосфата. 2 ', 3'-Дідезокси-3'-амінонуклеозид-5'-трифосфати інгібують реплікативний синтез ДНК в ізольованих ядрах з ембріонів морських їжаків Strongylocentrotus intermidium. Показано, що зазначені сполуки пригнічують синтез фрагментів Оказакі. Дія 2 ', 3'-дідезокси-3'-амінотимідин-5'-трифосфату і арабінозилтимідин-5'-трифосфату оборотно за додавання природного субстрату синтезу ДНК дезокситимідин-5'-трифосфату. 2', 3'-dideoxy-3'-aminonucleoside-5'-triphosphates are shown to be inhibitors of repllcative DNA synthesis in isolated nuclei of sea urchin embryo. These compounds inhibit the fragment Okazaki synthesis. The effect of 2', 3'-dideoxy-3'-aminothymidine 5'-triphosphate and arabinothymidine 5'-triphosphate is reversible when adding the corresponding substrate of DNA synthesis, 2'-deoxy-thymidine-5'-triphosphate. Авторы благодарят А. В. Иткеса за полезную критику и ценные советы. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Клеточная биология Ингибирование репликативного синтеза ДНК в ядрах эмбрионов морского ежа Strongуlocentrotus intermidium 2',3'-дидезокси-3'-аминонуклеозид-5'- трифосфатами Інгібування реплікативного синтезу ДНК у ядрах ембріонів морського їжака Strongуlocentrotus intermidium 2',3'-дидезокси-3'-амінонуклеозид-5'-трифосфатами Inhibition of replicative DNA synthesis in nuclei of sea urchin (Strongylocentrotus intermwium) embryo by 2', 3'-dideoxy-3'-aminonucleoside 5'-triphosphates Article published earlier |
| spellingShingle | Ингибирование репликативного синтеза ДНК в ядрах эмбрионов морского ежа Strongуlocentrotus intermidium 2',3'-дидезокси-3'-аминонуклеозид-5'- трифосфатами Куханова, М.К. Краевский, А.А. Терентьева, Н.А. Рассказов, В.А. Клеточная биология |
| title | Ингибирование репликативного синтеза ДНК в ядрах эмбрионов морского ежа Strongуlocentrotus intermidium 2',3'-дидезокси-3'-аминонуклеозид-5'- трифосфатами |
| title_alt | Інгібування реплікативного синтезу ДНК у ядрах ембріонів морського їжака Strongуlocentrotus intermidium 2',3'-дидезокси-3'-амінонуклеозид-5'-трифосфатами Inhibition of replicative DNA synthesis in nuclei of sea urchin (Strongylocentrotus intermwium) embryo by 2', 3'-dideoxy-3'-aminonucleoside 5'-triphosphates |
| title_full | Ингибирование репликативного синтеза ДНК в ядрах эмбрионов морского ежа Strongуlocentrotus intermidium 2',3'-дидезокси-3'-аминонуклеозид-5'- трифосфатами |
| title_fullStr | Ингибирование репликативного синтеза ДНК в ядрах эмбрионов морского ежа Strongуlocentrotus intermidium 2',3'-дидезокси-3'-аминонуклеозид-5'- трифосфатами |
| title_full_unstemmed | Ингибирование репликативного синтеза ДНК в ядрах эмбрионов морского ежа Strongуlocentrotus intermidium 2',3'-дидезокси-3'-аминонуклеозид-5'- трифосфатами |
| title_short | Ингибирование репликативного синтеза ДНК в ядрах эмбрионов морского ежа Strongуlocentrotus intermidium 2',3'-дидезокси-3'-аминонуклеозид-5'- трифосфатами |
| title_sort | ингибирование репликативного синтеза днк в ядрах эмбрионов морского ежа strongуlocentrotus intermidium 2',3'-дидезокси-3'-аминонуклеозид-5'- трифосфатами |
| topic | Клеточная биология |
| topic_facet | Клеточная биология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152202 |
| work_keys_str_mv | AT kuhanovamk ingibirovaniereplikativnogosintezadnkvâdrahémbrionovmorskogoežastrongulocentrotusintermidium23didezoksi3aminonukleozid5trifosfatami AT kraevskiiaa ingibirovaniereplikativnogosintezadnkvâdrahémbrionovmorskogoežastrongulocentrotusintermidium23didezoksi3aminonukleozid5trifosfatami AT terentʹevana ingibirovaniereplikativnogosintezadnkvâdrahémbrionovmorskogoežastrongulocentrotusintermidium23didezoksi3aminonukleozid5trifosfatami AT rasskazovva ingibirovaniereplikativnogosintezadnkvâdrahémbrionovmorskogoežastrongulocentrotusintermidium23didezoksi3aminonukleozid5trifosfatami AT kuhanovamk íngíbuvannâreplíkativnogosintezudnkuâdrahembríonívmorsʹkogoížakastrongulocentrotusintermidium23didezoksi3amínonukleozid5trifosfatami AT kraevskiiaa íngíbuvannâreplíkativnogosintezudnkuâdrahembríonívmorsʹkogoížakastrongulocentrotusintermidium23didezoksi3amínonukleozid5trifosfatami AT terentʹevana íngíbuvannâreplíkativnogosintezudnkuâdrahembríonívmorsʹkogoížakastrongulocentrotusintermidium23didezoksi3amínonukleozid5trifosfatami AT rasskazovva íngíbuvannâreplíkativnogosintezudnkuâdrahembríonívmorsʹkogoížakastrongulocentrotusintermidium23didezoksi3amínonukleozid5trifosfatami AT kuhanovamk inhibitionofreplicativednasynthesisinnucleiofseaurchinstrongylocentrotusintermwiumembryoby23dideoxy3aminonucleoside5triphosphates AT kraevskiiaa inhibitionofreplicativednasynthesisinnucleiofseaurchinstrongylocentrotusintermwiumembryoby23dideoxy3aminonucleoside5triphosphates AT terentʹevana inhibitionofreplicativednasynthesisinnucleiofseaurchinstrongylocentrotusintermwiumembryoby23dideoxy3aminonucleoside5triphosphates AT rasskazovva inhibitionofreplicativednasynthesisinnucleiofseaurchinstrongylocentrotusintermwiumembryoby23dideoxy3aminonucleoside5triphosphates |