Трансформация клеток дрожжей плазмидной ДНК с использованием хелатирующих агентов. О роли перекисного окисления липидов в индукции компетентности у дрожжей
Обнаружено, что предварительная обработка клеток дрожжей Sacсharomices cerevisiae (штаммы 746 и LL-20) хелатирующими агентами переходных металлов (8-оксихинолин, 1,10-фенантролин) приводит к появлению у них компетентности к трансформации плазмидной ДНК. Изучены факторы, влияющие на эффективность тра...
Збережено в:
| Дата: | 1985 |
|---|---|
| Автори: | , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1985
|
| Назва видання: | Биополимеры и клетка |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152256 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Трансформация клеток дрожжей плазмидной ДНК с использованием хелатирующих агентов. О роли перекисного окисления липидов в индукции компетентности у дрожжей / Ю.И. Горлов, В.С. Кириллова, Л.Г. Жарова, Л.И. Лихачева, В.А. Кордюм // Биополимеры и клетка. — 1985. — Т. 1, № 3. — С. 147-153. — Бібліогр.: 14 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-152256 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1522562025-02-23T18:18:22Z Трансформация клеток дрожжей плазмидной ДНК с использованием хелатирующих агентов. О роли перекисного окисления липидов в индукции компетентности у дрожжей Трансформація клітин дріжджів плазмідною ДНК з використанням хелатуючих агентів. Про роль перекисного окиснення ліпідів у індукції компетентності у дріжджів Plasmid DNA transformation of yeast cells treated with chelating agents. The role of lipid peroxidation in inducing competence in yeast Горлов, Ю.И. Кириллова, В.С. Жарова, Л.Г. Лихачева, Л.И. Корлюм, В.А. Генно-инженерная биотехнология Обнаружено, что предварительная обработка клеток дрожжей Sacсharomices cerevisiae (штаммы 746 и LL-20) хелатирующими агентами переходных металлов (8-оксихинолин, 1,10-фенантролин) приводит к появлению у них компетентности к трансформации плазмидной ДНК. Изучены факторы, влияющие на эффективность трансформации дрожжей с использованием 8-оксихинолина и двурепликонной плазмиды RВ4. Выход трансформантов при использовании данного метода, как правило, достигал 4·10<sup>3</sup>– 2·10<sup>4</sup> трансформантов на 10 мкг плазмидной ДНК. Показано, что хелаторы стимулируют перекисное окисление липидов у дрожжей. Присутствие ингибитора окисления липидов – синтетического антиоксиданта ионола в момент обработки клеток 8-оксихинолином – приводит к резкому снижению выхода трансформантов. Полученные данные свидетельствуют о том, что действие хелаторов на способность дрожжей к трансформации опосредовано их влиянием на перекисное окисление мембранных липидов. Виявлено, що попередня обробка клітин дріжджів Sacсharomices cerevisiae (штами 746 і LL-20) хелатуючими агентами перехідних металів (8-оксихінолін, 1,10-фенантролін) призводить до появи у них компетентності до трансформації плазмідної ДНК. Вивчено фактори, що впливають на ефективність трансформації дріжджів з використанням 8-оксихіноліну та дворепліконної плазміди RВ4. Вихід трансформантів при використанні даного методу, як правило, досягав 4 ·10<sup>3</sup>–2 ·10<sup>4</sup> трансформантів на 10 мкг плазмідної ДНК. Показано, що хелатори стимулюють перекисне окиснення ліпідів у дріжджів. Присутність інгібітора окиснення ліпідів ? синтетичного антиоксиданту іонолу в момент обробки клітин 8-оксихіноліном призводить до різкого зниження виходу трансформантів. Отримані дані свідчать про те, що дія хелатора на здатність дріжджів до трансформації опосередкована їхнім впливом на перекисне окиснення мембранних ліпідів. It is found that the pretreatment of yeast Saccharomyces cerevisiae (strains 746 and LL-20) cells with the chelating agents of transition metals (8-hydroxyquinoline, 1,10-phe-nanthroline) causes the appearance of competence for plasmid DNA transformation. The factors affecting the efficiency of yeast cell transformation are studied using 8-hydroxyquinoline and double-replicon plasmid RB4. Transformant yield under application of such a method reached 4×10<sup>3</sup>-2×10<sup>4</sup> transformations per 10 u.g of plasmid DNA. The chelating agents are shown to increase lipid peroxide formation in yeast. The addition of the lipid oxidation inhibitor (ionol, the synthetic antioxidant) during cell treatment with 8-hydroxyquinoline decreases the transformant yield. The data obtained indicate that the effect of chelators on the yeast competence for transformation may be due to their influence on the membrane lipid peroxidation. 1985 Article Трансформация клеток дрожжей плазмидной ДНК с использованием хелатирующих агентов. О роли перекисного окисления липидов в индукции компетентности у дрожжей / Ю.И. Горлов, В.С. Кириллова, Л.Г. Жарова, Л.И. Лихачева, В.А. Кордюм // Биополимеры и клетка. — 1985. — Т. 1, № 3. — С. 147-153. — Бібліогр.: 14 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.000022 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152256 575.24.577.352.42 ru Биополимеры и клетка application/pdf Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Генно-инженерная биотехнология Генно-инженерная биотехнология |
| spellingShingle |
Генно-инженерная биотехнология Генно-инженерная биотехнология Горлов, Ю.И. Кириллова, В.С. Жарова, Л.Г. Лихачева, Л.И. Корлюм, В.А. Трансформация клеток дрожжей плазмидной ДНК с использованием хелатирующих агентов. О роли перекисного окисления липидов в индукции компетентности у дрожжей Биополимеры и клетка |
| description |
Обнаружено, что предварительная обработка клеток дрожжей Sacсharomices cerevisiae (штаммы 746 и LL-20) хелатирующими агентами переходных металлов (8-оксихинолин, 1,10-фенантролин) приводит к появлению у них компетентности к трансформации плазмидной ДНК. Изучены факторы, влияющие на эффективность трансформации дрожжей с использованием 8-оксихинолина и двурепликонной плазмиды RВ4. Выход трансформантов при использовании данного метода, как правило, достигал 4·10<sup>3</sup>– 2·10<sup>4</sup> трансформантов на 10 мкг плазмидной ДНК. Показано, что хелаторы стимулируют перекисное окисление липидов у дрожжей. Присутствие ингибитора окисления липидов – синтетического антиоксиданта ионола в момент обработки клеток 8-оксихинолином – приводит к резкому снижению выхода трансформантов. Полученные данные свидетельствуют о том, что действие хелаторов на способность дрожжей к трансформации опосредовано их влиянием на перекисное окисление мембранных липидов. |
| format |
Article |
| author |
Горлов, Ю.И. Кириллова, В.С. Жарова, Л.Г. Лихачева, Л.И. Корлюм, В.А. |
| author_facet |
Горлов, Ю.И. Кириллова, В.С. Жарова, Л.Г. Лихачева, Л.И. Корлюм, В.А. |
| author_sort |
Горлов, Ю.И. |
| title |
Трансформация клеток дрожжей плазмидной ДНК с использованием хелатирующих агентов. О роли перекисного окисления липидов в индукции компетентности у дрожжей |
| title_short |
Трансформация клеток дрожжей плазмидной ДНК с использованием хелатирующих агентов. О роли перекисного окисления липидов в индукции компетентности у дрожжей |
| title_full |
Трансформация клеток дрожжей плазмидной ДНК с использованием хелатирующих агентов. О роли перекисного окисления липидов в индукции компетентности у дрожжей |
| title_fullStr |
Трансформация клеток дрожжей плазмидной ДНК с использованием хелатирующих агентов. О роли перекисного окисления липидов в индукции компетентности у дрожжей |
| title_full_unstemmed |
Трансформация клеток дрожжей плазмидной ДНК с использованием хелатирующих агентов. О роли перекисного окисления липидов в индукции компетентности у дрожжей |
| title_sort |
трансформация клеток дрожжей плазмидной днк с использованием хелатирующих агентов. о роли перекисного окисления липидов в индукции компетентности у дрожжей |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1985 |
| topic_facet |
Генно-инженерная биотехнология |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152256 |
| citation_txt |
Трансформация клеток дрожжей плазмидной ДНК с использованием хелатирующих агентов. О роли перекисного окисления липидов в индукции компетентности у дрожжей / Ю.И. Горлов, В.С. Кириллова, Л.Г. Жарова, Л.И. Лихачева, В.А. Кордюм // Биополимеры и клетка. — 1985. — Т. 1, № 3. — С. 147-153. — Бібліогр.: 14 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT gorlovûi transformaciâkletokdrožžejplazmidnojdnksispolʹzovaniemhelatiruûŝihagentovoroliperekisnogookisleniâlipidovvindukciikompetentnostiudrožžej AT kirillovavs transformaciâkletokdrožžejplazmidnojdnksispolʹzovaniemhelatiruûŝihagentovoroliperekisnogookisleniâlipidovvindukciikompetentnostiudrožžej AT žarovalg transformaciâkletokdrožžejplazmidnojdnksispolʹzovaniemhelatiruûŝihagentovoroliperekisnogookisleniâlipidovvindukciikompetentnostiudrožžej AT lihačevali transformaciâkletokdrožžejplazmidnojdnksispolʹzovaniemhelatiruûŝihagentovoroliperekisnogookisleniâlipidovvindukciikompetentnostiudrožžej AT korlûmva transformaciâkletokdrožžejplazmidnojdnksispolʹzovaniemhelatiruûŝihagentovoroliperekisnogookisleniâlipidovvindukciikompetentnostiudrožžej AT gorlovûi transformacíâklítindríždžívplazmídnoûdnkzvikoristannâmhelatuûčihagentívprorolʹperekisnogookisnennâlípídívuíndukcííkompetentnostíudríždžív AT kirillovavs transformacíâklítindríždžívplazmídnoûdnkzvikoristannâmhelatuûčihagentívprorolʹperekisnogookisnennâlípídívuíndukcííkompetentnostíudríždžív AT žarovalg transformacíâklítindríždžívplazmídnoûdnkzvikoristannâmhelatuûčihagentívprorolʹperekisnogookisnennâlípídívuíndukcííkompetentnostíudríždžív AT lihačevali transformacíâklítindríždžívplazmídnoûdnkzvikoristannâmhelatuûčihagentívprorolʹperekisnogookisnennâlípídívuíndukcííkompetentnostíudríždžív AT korlûmva transformacíâklítindríždžívplazmídnoûdnkzvikoristannâmhelatuûčihagentívprorolʹperekisnogookisnennâlípídívuíndukcííkompetentnostíudríždžív AT gorlovûi plasmiddnatransformationofyeastcellstreatedwithchelatingagentstheroleoflipidperoxidationininducingcompetenceinyeast AT kirillovavs plasmiddnatransformationofyeastcellstreatedwithchelatingagentstheroleoflipidperoxidationininducingcompetenceinyeast AT žarovalg plasmiddnatransformationofyeastcellstreatedwithchelatingagentstheroleoflipidperoxidationininducingcompetenceinyeast AT lihačevali plasmiddnatransformationofyeastcellstreatedwithchelatingagentstheroleoflipidperoxidationininducingcompetenceinyeast AT korlûmva plasmiddnatransformationofyeastcellstreatedwithchelatingagentstheroleoflipidperoxidationininducingcompetenceinyeast |
| first_indexed |
2025-11-24T06:33:01Z |
| last_indexed |
2025-11-24T06:33:01Z |
| _version_ |
1849652392809725952 |
| fulltext |
Генноинженерная
биотехнология
УДК 575.24.577.352.42
ТРАНСФОРМАЦИЯ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ХЕЛАТИРУЮЩИХ АГЕНТОВ.
О РОЛИ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ
В ИНДУКЦИИ КОМПЕТЕНТНОСТИ У ДРОЖЖЕЙ
Ю. И. Горлов, В. С. Кириллова, Л. Г. Жарова,
Л. И. Лихачева, В. А. Кордюм
Введение. Широкое использование дрожжей в качестве объекта для ген-
ноинженерных исследований стало возможным благодаря разработке
методов трансформации этих организмов плазмидной ДНК. С 1978 г.
для трансформации дрожжей широко применяют метод с ис-
пользованием сферопластов [1], обладающий рядом существенных не-
достатков, главным из которых является его большая трудоемкость. В
1983 г. разработан простой и удобный способ трансформации целых
клеток дрожжей, включающий обработку их солями щелочных метал-
лов [2]. В настоящее время данный метод внедряется в исследователь-
скую практику, однако известно, что он не во всех случаях обеспечивает
удовлетворительные результаты [2]. Отсюда следует, что разработка
новых эффективных приемов индукции компетентности к трансформа-
ции у дрожжей, исключающих получение сферопластов, остается ак-
туальной.
Систему трансформации микроорганизмов с помощью Д Н К при-
меняют не только в практике генноинженерных исследований в качест-
ве метода, но также используют как модель для изучения механизма
проникновения экзогенной Д Н К в клетку. Согласно общепринятой ги-
потезе Гринюса [3], объясняющей механизм транспорта Д Н К через
плазматическую мембрану бактерий, для протекания данного процесса
необходимы наличие на мембране электрохимического потенциала, обу-
словленного энергозависимой генерацией градиента Н+, и структурные
перестройки в ее липидном бислое. Установление природы физико-хи-
мических процессов, определяющих такие структурные изменения мем-
бран, в результате которых клетки микроорганизмов становятся компе-
тентными для проникновения Д Н К при трансформации, представляет
значительный интерес.
В результате многочисленных исследований на животных объектах
установлено, что одним из механизмов модификации структурно-функ-
ционального состояния мембран являются процессы перекисного окис-
ления липидов [4—7]. Роль перекисного окисления липидов в этом ас-
пекте у микроорганизмов совершенно не изучена. В нашей лаборатории
был разработан экспериментальный подход с использованием хелато-
ров металлов переменной валентности, который позволяет интенсифи-
цировать окислительные процессы в липидах дрожжей in vivo. При
этом исходили из следующих соображений. Известно, что ионы пере-
ходных металлов (Fe2+, Fe3+, Cu2+, Mn2+ , Co2+) способны выполнять
роль катализаторов перекисного окисления липидов [5]. Кроме того,
показано, что некоторые липофильные хелаторы (8-оксихинолин, 1,10-
фенантролин) в значительной степени усиливают каталитические свой-
147 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № С·
ства ионов железа и меди в системе окисления линоленовой кислоты
[8]. В связи с этим мы применили данные агенты для интенсификации
окислительных реакций липидов в целых клетках дрожжей.
Так как проникновение Д Н К в клетку, как отмечалось, зависит от
перестроек в липидной фазе мембран, нам представлялось интересным
выяснить следующее: приводит ли интенсификация перекисного окис-
ления липидов у дрожжей хелаторами к структурным изменениям мем-
бран (в частности плазматической мембраны); влияет ли обработка
дрожжей хелаторами на способность дрожжей к трансформации плаз-
мидной Д Н К и в какой мере это связано с интенсификацией перекисно-
го окисления липидов. Исследованию поставленных вопросов посвяще-
на данная работа.
Материалы и методы. В работе использовали следующие штаммы дрожжей: Sac-
charomyces cerevisiae LL-20 (leu 2-3 leu 2-112 his 3-11 his 3-15), получен из Ин-та
биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР; Saccharomyces cerevisiae 746
(IlOsA a his 3 ига 3-52 leu 2-3 leu 2-112 trp 1-289), штамм предоставлен д-ром Д. Ботс-
тейн, Кэмбридж. Д р о ж ж и S. cerevisiae выращивали на среде YNP, которая содержала
0,67% дрожжевой азотной основы YNB («Difco», США), 0,1 % пептона («Difco», США)
и 2 % глюкозы. Д л я выращивания S. cerevisiae 746 использовали полную питательную
среду YPD, содержащую 0,67% YNB («Difco», США), 2 % пептона («Difco», США),
1 % дрожжевого экстракта («Difco», США), 2 % глюкозы. Выращивание дрожжей про-
водили при 30 °С с аэрацией перемешиванием до плотности 1—2-Ю7 клеток в 1 мл (ло-
гарифмическая фаза роста). Д л я трансформации использовали химерные плазмиды
RB4 [9] и pYF92 [10], несущие соответственно хромосомальные дрожжевые гены LEV
и HIS, которые комплементировали соответствующие мутации у вышеуказанных штам-
мов дрожжей. Д л я выявления трансформантов у дрожжей 5. cerevisiae LL-20 исполь-
зовали селективную по лейцину или гистидину агаризованную среду, содержащую
0,67 % дрожжевой азотной основы без аминокислот (YNB w/oAAc, «Difco», США),
2 % глюкозы, 2 % агара (в случае использования плазмиды RB4 в данную среду добав-
ляли гистидин до конечной концентрации 20 мкг/мл, в случае плазмиды pYF92 — лей-
цин в той же концентрации). При трансформации дрожжей S. cerevisiae 746 плазмидой
RB4 использовали аналогичную дефицитную по лейцину среду, содержащую остальные
необходимые для роста этого штамма компоненты (гистидин — 20 мкг/мл, триптофан —
20 мкг/мл, урацил — 25 мкг/мл) .
Эффективность трансформации выражали числом выросших трансформантов в
расчете на 10 мкг плазмидной ДНК. Перекисное окисление липидов определяли по на-
коплению первичных продуктов этой реакции — диеновых конъюгатов, как описано в
работе [11].
Измерение флюоресценции исследуемых клеток дрожжей с 1-анилино-нафтален-8-
сульфонатом (АНС) проводили следующим образом. Обработанные хелаторами клетки
дрожжей ( М О 7 клеток) отмывали водой, ресуспендировали в 10 мМ трис-HCl буфер-
ном растворе (рН 7,0), содержащем 20 мкМ АНС («Serva», ФРГ) и через 5 мин осу-
ществляли запись спектра флюоресценции на спектрофлюориметре MPF-2M («Hitachi»,
Япония) при длине волны возбуждения 370 нм. Значение максимума флюоресценции
АНС выражали в относительных единицах ( h ) .
Результаты и обсуждение. Обработка исследуемых дрожжей таки-
ми хелаторами, как 8-оксихинолин и 1,10-фенантролин, приводит к
значительной стимуляции перекисного окисления липидов у этих орга-
низмов, о чем судили по накоплению первичных продуктов этой реак-
ции— диеновых конъюгатов. Влияние указанных хелаторов на содер-
жание диеновых конъюгатов у дрожжей 5. cerevisiae LL-20 (нМ/г су-
хого веса дрожжей) при различных условиях эксперимента представ-
лено следующими данными:
Длительность инкубации дрожжей с отмеченными агентами 1 ч. Инги-
Контроль
1,10-фенантролин, 250 мкг/мл .
8-оксихинолин, 250 мкг/мл
8-оксихинолин, 250 мкг/мл + ионол, 1 мкг/мл
8-оксихинолин, 250 мкг/мл + ионол, 10 мкг/мл
34
113
74
45
244
148 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № С·
битор окисления липидов — антиоксидант ионол — в низких дозах
(1 мкг/мл) предотвращает стимуляцию перекисного окисления 8-окси-
хинолином, тогда как в более высокой концентрации (10 мкг/мл) он,
наоборот, усиливает действие хелатора.
Использование техники флюоресцентных зондов позволяет отме-
тить изменения в дрожжевых мембранах после обработки хелаторами,
Рис. 1. Спектр флюоресценции АНС (20 мкМ) после окраски контрольных и обработан-
ных 8-оксихинолином клеток дрожжей S. cereuisiae LL-20 (возбуждение при 370 нм):
1 — контроль; 2 — 8-оксихинолин, 50 мкг/мл.
Fig. 1. Fluorescence spectrum ANS (20 μΜ) after s taining of control and 8-hydroxyqui-
noline-treated yeast S. cerevisiae LL-20 cells (excitation at 370 nm): 1 — control; 2 —
8-hydroxyquinoline (50 μ g / m l ) .
Рис. 2. Влияние 8-оксихинолина и ионола на жизнеспособность дрожжей 5. cerevisiae
LL-20 (за 100% принята выживаемость контрольных клеток): 1 — контроль; 2 — 8-ок-
сихинолин, 250 мкг/мл; 3 — 8-оксихинолин, 250 мкг/мл + ионол, 1 мкг/мл; 4 — 8-оксихи-
нолин, 250 мкг/мл + ионол, 3 мкг/мл. Условия эксперимента те же, что при проведении
трансформации, исключая инкубацию клеток с плазмидной ДНК. Клетки высевали на
среду, содержащую необходимые для роста лейцин (20 мкг/мл) и гистидин (20 мкг/мл)
— неселективная среда.
Fig. 2. Effect of 8-hydroxyquinoline and ionol on viability of yeast 5. cereuisiae LL-20
cells (100 % corresponds to viability of control cells): 1 — control; 2 — S-hydroxyquinoline
(250 μ g / m l ) ; 3 — 8-hydroxyquinoline (250 μ g / m l ) + i o n o l (1 μg/ml) ; 4 — 8-hydroxyqui-
noline (250 μ g / m l ) + i o n o l (3 μ g / m l ) .
Рис. 3. Влияние антиоксиданта (ионола) в момент обработки дрожжей S. cerevisiae
LL-20 8-оксихинолином на выход трансформантов (трансформация плазмидой RB4).
Эффективность трансформации в варианте без ионола принята за 100%: 1 — 8-оксихи-
нолин, 250 мкг/мл; 2 — 8-оксихинолин, 250 мкг/мл-Ь ионол, 1 мкг/мл; 3 — 8-оксихинолин,
250 мкг/мл + ионол, 3 мкг/мл; 4 — 8-оксихинолин, 250 мкг/мл + ионол, 5 мкг/мл.
Fig. 3. Effect of antioxidant (ionol) on frequency of t ransformat ion of 8-hydroxyquinoli-
ne-treated yeast S. cerevisiae LL-20 cells with plasmid RB4 (100% corresponds to trans-
formation frequency in a variant without ionol). 1—8-hydroxyquinol ine (250 μg /ml) ;
2 — S-hydroxyquinoline (250 μ g / m l ) + i o n o l (1 μ g / m l ) ; 3 — S-hydroxyquinoline
(250 μ g / m l ) + i o n o l (3 μg/ml) ; 4 — 8-hydroxyquinoline (250 μ g / m l ) + i o n o l (5 μ g / m l ) .
которые проявляются в возникновении дополнительных сайтов связы-
вания для отрицательно заряженного флюоресцентного зонда АНС
Исходя из этих данных и предположения о возможной роли пе-
рекисного окисления липидов в возникновении компетентности у дрож-
жей, в дальнейших экспериментах было исследовано влияние хелати-
рующих агентов на способность дрожжевых клеток трансформироваться
плазмидной ДНК. Клетки дрожжей 5. cerevisiae LL-20 и S. cerevisiae
746, в норме не способные к трансформации плазмидами, после обра-
ботки 8-оксихинолином и 1,10-фенантролином становятся компетент-
ными для трансформации (табл. 1). Об эффективности трансформации
дрожжей S. cerevisiae LL-20 плазмидой RB4 при использовании различ-
ных концентраций 8-оксихинолина (мкг/мл, обработка в течение 1 ч)
судили по количеству трансформантов на 10 мкг плазмидной ДНК:
(рис. 1)
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 3 149
Максимальный эффект данного хелатора проявляется в широком диа-
пазоне концентраций от 50 до 500 мкг/мл. Зависимость трансформации
дрожжей S. cerevisiae LL-20 плазмидой RB4 от длительности инкуба-
ции с 8-оксихинолином (концентрация 250 мкг/мл) представлена на ос-
новании различий в количестве трансформантов на 10 мкг плазмид-
ной ДНК:
Без ПЭГ, 42 °С, 5 мин 20
ПЭГ, без прогрева 1830
ПЭГ, 37 °С, 5 мин 1800
» 37 °С, 15 мин . . . 2130
» 42 °С, 5 мин 2800
» 42 °С, 15 мин 3220
» 47 °С, 5 мин 350
Прогрев суспензии клеток после обработки ПЭГом при 42 °С приводит
к заметному увеличению выхода трансформантов. Сведения, представ-
ленные выше, демонстрируют влияние различных условий на эф-
фективность трансформации дрожжей в случае индукции компетент-
ности 8-оксихинолином.
На основании результатов 26 независимых экспериментов предла-
гается следующая схема трансформации дрожжей плазмидной ДНК.
Осадок дрожжевых клеток (2-Ю7) после отмывки дистиллированной
водой суспендируют в 1 мл буферного раствора Τ(10 мМ трис-НСІ, рН
7,5) или в среде ΥΝΡ без Сахаров и добавляют 8-оксихинолин до конеч-
ной концентрации 100—250 мкг/мл. Суспензию инкубируют при 30 °С
в течение 1 ч, затем центрифугируют (3000 g, 5 мин), осадок клеток
ресуспендируют в ОД мл буфера Т. К полученной суспензии добавляют
8—10 мкг плазмидной Д Н К и инкубируют при осторожном перемеши-
вании в течение 30 мин при 30 °С. Затем к пробам прибавляют 1 мл
35—40 %-ного ПЭГ и продолжают инкубацию при тех же условиях в
течение 1 ч. По окончании инкубации пробы переносят на 5 мин в во-
дяную баню (42 °С), после чего клетки дважды отмывают дистиллиро-
ванной водой, суспендируют в 1 мл дистиллированной воды и высева-
ют по 0,2 мл в агаризованную селективную среду.
Т а б л и ц а 1
Индукция компетентности к трансформации у дрожжей S. cerevisiae (штаммы LL-20
и 746) после обработки хелаторами (время обработки 1 ч)
Induction of Competence for Transformation in Yeast S. cerevisiae (Strains 746 and
LL-20) after Treatment with Chelating Agents (Time of Treatment is 1 h)
Трансформируемые штаммы дрожжей
и типы используемых плазмид Хелатор, 250 мкг/мл
Выход транс-
формантов
на 10 мкг
плазмидной
ДНК
Saccharomyces cerevisiae LL-20 8-оксихинолин 3220
Плазмндa RB4 1,10-фенантролин 1340
Saccharomyces cerevisiae LL-20, плазмида
1,10-фенантролин
pYF92 8-оксихинолин 685
Saccharomyces cerevisiae 746, плазмида RB4 8-оксихинолин 7310
150 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № С·
Наибольший выход трансформантов наблюдали в случае инкубации
клеток с комплексоном в течение 1 ч.
Для эффективной трансформации исследуемых дрожжей плазми-
дами необходима инкубация клеток с полиэтиленгликолем (ПЭГ, моле-
кулярная масса 3000—4000) после обработки хелатирующими агента-
ми и инкубации с плазмидной ДНК. Результаты изучения влияния
полиэтиленгликоля и температурного прогрева на эффективность тран-
сформации дрожжей S. cerevisiae LL-20 (количество трансформантов
на 10 мкг плазмидной ДНК) плазмидой RB4 в различных условиях
эксперимента приведены ниже:
Для сопоставления разработанного нами метода с описанными в
литературе были проведены эксперименты по трансформации дрожжей
cerevisiae LL-20 плазмидой RB4 с использованием методов сферо-
пластов [1] и обработки клеток солями щелочных металлов [2]. Ре-
зультаты этих опытов, суммированные в табл. 2, позволяют заключить,
что предлагаемый метод обеспечивает трансформацию с эффективно-
стью, не уступающей таковой при использовании других методов. Од-
нако при трансформации той же плазмидой другого исследуемого штам-
ма дрожжей S. cerevisiae 746 оказалось, что метод с использованием
Т а б л и ц а 2
Трансформация дрожжей S. cerevisiae LL-20 плазмидой RB4
с использованием различных способов индукции компетентности
Plasmid Transformation of Yeast Cells of S. cerevisiae LL-20 with the
Use of Various Methods for Competence Induction
Распределение результатов по порядку ве-
личины выхода трансформантов на 10 мкг
ДНК*
Способ трансформации
104 103 Ю2
Сферопласты 21000 (2) 2772 ( 4)
Обработка LiCl 12247 (5) 5790 ( 6) —
Обработка 8-оксихинолином 17760 (4) 4500 ( И ) 594 (4)
* — Приведены средние значения выхода трансформантов в опытах,
количество которых указано в скобках.
хелаторов обеспечивает значительно более высокий выход трансфор-
мантов, чем метод обработки солями щелочных металлов (данные не
приведены). Таким образом, наличие нескольких методов получения
компетентных клеток дрожжей дает возможность исследователю в каж-
дом конкретном случае подбирать адекватные условия трансформации
этих организмов. Следует отметить, что компетентное состояние дрож-
жевых клеток достигается в результате использования относительно
низких концентраций хелаторов—0,25—1,75 мМ, тогда как соли щелоч-
ных металлов, например LiCl, эффективны для этой цели в значительно
более высокой концентрации—200—1000 мМ. Это позволяет говорить
о более высокой специфичности действия хелаторов на процессы, опре-
деляющие формирование компетентности у дрожжей по сравнению с
такими агентами, как соли щелочных металлов.
В связи с тем, что обработка хелаторами вызывает у дрожжей зна-
чительное повышение уровня перекисного окисления липидов и приво-
дит к изменению структуры поверхности дрожжевых клеток, представ-
лялось интересным установить степень взаимосвязи данных явлений с
компетентным для трансформации состоянием дрожжевых организмов.
С этой целью была предпринята попытка выяснить, как влияют антиок-
сиданты — ингибиторы перекисных реакций — на эффективность тран-
сформации дрожжей и их жизнеспособность в условиях индукции ком-
петентности хелатором. Использовали антиоксидант ионол, который в
различной концентрации добавляли в суспензию дрожжей в момент ин-
кубации их с 8-оксихинолииом. Результаты этих экспериментов пред-
ставлены на рис. 2, 3. Видно, что ионол в определенной концентрации
способен предотвращать угнетающее действие хелаторов на жизнеспо-
собность дрожжевых клеток, возвращая её к норме (рис. 2). Это согла-
суется с многочисленными данными, полученными на животных объек-
тах и свидетельствующими о нормализующем действии различных ан-
тиоксидантов на протекание разнообразных патологических процессов,
сопровождающихся интенсификацией перекисного окисления липидов
[6, 7]. Как видно из данных, представленных на рис. 3, присутствие ан-
тиоксиданта в момент обработки дрожжей хелаторами приводит к зна-
чительному снижению частоты трансформации плазмидной ДНК. При
151 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № С·
этом интересно отметить, что влияние ионола как на трансформацию,,
так и на жизнеспособность имеет четко выраженную концентрацион-
ную зависимость (рис. 2, 3). Данный антиоксидант эффективен только
при низкой концентрации (1 мкг/мл). По мере увеличения дозы наблю-
дали обратный эффект, что проявлялось в возникновении у ионола спо-
собности усиливать токсическое действие хелатора на жизнеспособ-
ность дрожжей и не снижать, а наоборот, несколько увеличивать часто-
ту трансформации. Эффект дозы для ионола и других антиоксидантов,
вплоть до обращения действия, также неоднократно отмечен в литера-
туре в отношении различных животных объектов [6, 7].
Таким образом, приведенные данные свидетельствуют в пользу
сделанного предположения о том, что компетентность дрожжевых кле-
ток к трансформации плазмидной Д Н К в результате обработки хела-
торами может прямо или опосредованно быть обусловлена процессами
перекисного окисления липидов. По нашему мнению, интенсификация
перекисных реакций хелатирующими агентами вызывает в плазмати-
ческой мембране дрожжей (возможно, и в других мембранных струк-
турах) такие конформационные изменения, которые делают возможным
поглощение полимерной Д Н К клетками. О наличии изменений поверх-
ности дрожжевых клеток после воздействия хелаторов свидетельствуют
данные, полученные при использовании флюоресцентной техники
(рис. 1). Говоря о механизме индукции конформационных изменений в
мембране путем интенсификации перекисного окисления липидов, сле-
дует отметить, что в литературе давно обсуждается вопрос о взаимо-
связи этих процессов. Считается, что свободнорадикальное окисление,
вызывающее появление полярных перекисных групп в полиеновых аци-
лах мембранных фосфолипидов, может приводить к существенным из-
менениям структуры мембраны вследствие «выталкивания» более гид-
рофильных ацилгидроперекисей из гидрофобного окружения в водную
фазу [7]. Возможно, что образование подобных структурных дефектов в
мембране и повышенная гидрофильность зоны дефектов может способ-
ствовать процессу адсорбции и поглощения экзогенной Д Н К . Нельзя
также исключить участие иных процессов в возникновении компетент-
ности у дрожжей при стимуляции окислительных реакций в липидах хе-
латорами. Перекисное окисление липидов, химически модифицируя
мембрану, приводит к изменению ее разнообразных свойств и физико-
химических характеристик. В частности, имеются свидетельства, что из-
менение скорости окислительных реакций приводит к изменению липид-
ного и фазового составов биомембран, липид-белковых взаимодействий,
вязкости липидного компонента и условий для структурных переходов
в мембранах; сдвигается температурный интервал жидкокристаллич-
ности мембранных липидов [4, 7]. Обнаружено, что изменение фазо-
вого состава липидов в результате действия продуктов перекисных ре-
акций обусловливает модификацию ионной проницаемости мембран. В
связи с этим обсуждается возможность участия линейных дефектов
(искажения липидных слоев), возникающих в липидах биологических
мембран при фазовых переходах в жидкокристаллическом состоянии
или переходах гель — жидкий кристалл, в протекании различных тран-
спортных процессов [12]. Имеются работы, в которых сделан вывод о
важной роли фазовых переходов мембранных липидов, индуцируемых
тепловым шоком в присутствии двухвалентных катионов в возникнове-
нии компетентности к поглощению Д Н К у бактерий [13, 14].
В связи с вышеизложенным, представляется вероятной следующая
схема взаимосвязанных процессов у дрожжей при индукции хелатора-
ми компетентности в отношении поглощения ДНК: обработка хелатора-
ми->интенсификация перекисного окисления липидов->химическая мо-
дификация мембран, изменение фазового состава липидного бислоя мем-
бран (сдвиг температурного интервала жидкокристалличности мемб-
ран)-жонформационные перестройки в мембранах (возникновение
структурных дефектов, образование гидрофильных зон, нарушение ли-
пид-белковых взаимодействий)-^компетентность к поглощению ДНК.
152 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № С·
Таким образом, разработанный в данной работе способ индукции
у дрожжей компетентности к трансформации плазмидной ДНК, осно-
ванный на применении липофильных хелаторов двухвалентных метал-
лов, может служить моделью для изучения роли перекисного окисления
липидов в структурной модификации мембран у дрожжевых орга-
низмов.
PLASMID DNA TRANSFORMATION OF YEAST CELLS TREATED
WITH CHELATING AGENTS. THE ROLE OF LIPID PEROXIDATION
IN INDUCING COMPETENCE IN YEAST
Yu. I. Gorlου, V. S. Kirillova, L. G. Zharova, L. I. Likhacheva, V. A. Kordyum
Institute of Molecular Biology and Genetics,
Academy of Sciences of the Ukrainian SSR, Kiev
S u m m a r y
It is found that the pretreatment of yeast Saccharomyces cerevisiae (strains 746 and
LL-20) cells with the chelating agents of transition metals (8-hydroxyquinoline, 1,10-phe-
nanthroline) causes the appearance of competence for plasmid DNA transformation.
The factors affect ing the efficiency of yeast cell t ransformation are studied using 8-hyd-
roxyquinoline and double-replicon plasmid RB4. Transformant yield under application of
such a method reached 4X103-2X104 t ransformations per 10 μg of plasmid DNA.
The chelating agents are shown to increase lipid peroxide formation in yeast. The
addition of the lipid oxidation inhibitor (ionol, the synthetic antioxidant) during cell tre-
atment with 8-hydroxyquinoline decreases the t ransformant yield. The data obtained indi-
cate that the effect of chelators on the yeast competence for t ransformation may be due
to their influence on the membrane lipid peroxidation.
1. Beggs J. D. Transformation of yeast by a replicating hybrid plasmid.— Nature, 1978,
275, N 5679, p. 104-109.
2. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations / H. Ito, Y. Fukuda,
K. Murata, A. Kimura.—J. BacterioL, 1983, 153, N 1, p. 163—168.
3. Исследование энергообеспечения передачи плазмиды R100-I при конъюгации клеток
Escherichia coli / Я. А. Бержинскене, Л. Ю. Зизайте, 3. А. Баропайте, Л. Л. Гри-
нюс.—Биохимия, 1980, 45, № 6, с. 1103—1113.
4. Владимиров Ю. Α., Арчаков А. И. Перекисное окисление липидов в биологических
мембранах.— М . : Наука, 1972.—252 с.
5. Свободнорадикальное окисление липидов в биологических мембранах / Ю. П. Коз-
лов, В. С. Данилов, В. Е. Каган, М. В. Ситковский.— М. : Изд-во Моск. ун-та,
1972.—88 с.
6. Бурлакова Е. Б., Алесенко А. В., Молочкина Ε. М. Биоантиоксиданты в лучевом по-
ражении и злокачественном росте.— М. : Наука, 1975.—214 с.
7. Биохимия липидов и их роль в обмене веществ / Под ред. С. Е. Северина.— М. :
Наука, 1981.—168 с.
8. Wills Ε. D. Mechanisms of lipid peroxide formation in tissues. Role of metals and
haematin proteins in the catalysis of the oxidation of unsaturated fa t ty acids.— Bio-
chim. et biophys. acta, 1965, 98, N 2, p. 238-251.
9. Sterile host yeasts (shy): a neukaryotic system of biological containment for recom-
binant DNA experiments / D. Botstein, S. C. Falco, S. E. Stewart et al —Gene , 1979,
8, N 1, p. 17-24.
10. Chimeric plasmids for cloning of deoxyribonucleic acids sequences in Saccharomyces
cerevisiae / R. K. Storms, J. B. McNeil, P. S. Khandekar et a l .—J. BacterioL, 1979,
140, N 1, p. 73-82.
11. Стальная И. Д. Метод определения диеновой конъюгации ненасыщенных высших
жирных кислот.— В кн.: Современные методы в биохимии / Под ред. В. Н. Орехо-
вича. М. : Медицина, 1977, с. 63—64.
12. Минц Ρ. И., Кононенко Е. В. Жидкие кристаллы в биологических системах.— М. :
ВИНИТИ, 1982.—150 с. (Итоги науки и техники. Биофизика, т. 13).
13. The influence of phase transition of membrane lipids on uptake of plasmid DNA in
Escherichia coli t ransformation / V a n I. M. Die, van A. Osterhout, Η. E. N. Bergmans,
W. P. M. Hoeks t ra .—FEMS Microbiol. Lett., 1983, 18, N 1-2, p. 127-130.
14. Van Die /. M., Bergmans Η. Ε. N., Hoekstra W. P. M. Studies on the role of the
heat shock in induction of competence.— J. Gen. Microbiol., 1983, 129, N 3, p. 663-
670.
Ин-т молекулярной биологии и генетики Получено 25.07.84
АН УССР, Киев
7 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № С·
|