Количественное изучение взаимодействия деацилированной тРНК с Р-, А- и Е-сайтами 70 S рибосом Escherichia coli
В работе определены зависимости констант ассоциации деацилированной тРНК^Phe с Р-сайтом рибосом от концентрации ионов Mg²⁺ и температуры; измерена константа ассоциации тРНК^Phe с А-сайтом; показано, что с изменением концентрации Mg²⁺ и температуры взаимодействие тPHK^Phe с Е-сайтом остается кодоннез...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Дата: | 1985 |
| Автори: | , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1985
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152284 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Количественное изучение взаимодействия деацилированной тРНК с Р-, А- и Е-сайтами 70 S рибосом Escherichia coli / Ю.П. Семенков, Е.М. Макаров, С.В. Кириллов // Биополимеры и клетка. — 1985. — Т. 1, № 4. — С. 183-193. — Бібліогр.: 38 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-152284 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Семенков, Ю.П. Макаров, Е.М. Кириллов, С.В. 2019-06-09T15:24:56Z 2019-06-09T15:24:56Z 1985 Количественное изучение взаимодействия деацилированной тРНК с Р-, А- и Е-сайтами 70 S рибосом Escherichia coli / Ю.П. Семенков, Е.М. Макаров, С.В. Кириллов // Биополимеры и клетка. — 1985. — Т. 1, № 4. — С. 183-193. — Бібліогр.: 38 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.000180 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152284 577.217 В работе определены зависимости констант ассоциации деацилированной тРНК^Phe с Р-сайтом рибосом от концентрации ионов Mg²⁺ и температуры; измерена константа ассоциации тРНК^Phe с А-сайтом; показано, что с изменением концентрации Mg²⁺ и температуры взаимодействие тPHK^Phe с Е-сайтом остается кодоннезависимым. На основе полученных и ранее нами опубликованных данных построены ряды относительного сродства аминоацил-тРНК, пептидил-тРНК и деацилированной тРНК к Р-, А- и Е-сайтам 70S рибосомы, а также предлагается термодинамически обоснованная модель транслокации с использованием Е-сайта как выходного. Визначено залежності констант асоціації деацильованої тРНК^Phe з Р-сайтом рибосом від концентрації іонів Mg²⁺ і температури; виміряно константу асоціації тРНК^Phe з А-сайтом; показано, що із зміною концентрації Mg²⁺ і температури взаємодія тPHK^Phe з Е-сайтом залишається кодоннезалежною. На основі отриманих та опублікованих нами раніше даних побудовано ряди відносної спорідненості аміноацил-тРНК, пептидил-тРНК і деацильованої тРНК до Р-, А- та Е-сайтів 70S рибосоми, а також запропоновано термодинамічно обгрунтовану модель транслокації з використанням Е-сайта як вихідного. The association constants of deacylated tRNA^Phe for the P site of 70S ribosomes were measured in the presence and absence of poly(U), and at different Mg²⁺ concentrations and temperatures. The numbers of Mg²⁺ ions involved in this interaction were determined: 4.4±0.3 (+poly(U) and 2.7±0.3 (–poly(U). The association constant of tRNA^Phe for the A site was found to be 5•10⁵M⁻¹, much lower than that for the P site (2•10⁹M⁻¹), at 15 mM Mg²⁺, 200 mM NH₄⁺ and 25 °C. The independence of the E-site binding of tRNA^Phe on the messenger RNA was confirmed under these medium conditions. Based on the data obtained the affinity orders of aminoacyl-, peptidyl-tRNA and deacylated tRNA for the P, A and E sites are determined, and a possible mechanism of involvement of the E site in the translocation process is discussed. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Структура и функции биополимеров Количественное изучение взаимодействия деацилированной тРНК с Р-, А- и Е-сайтами 70 S рибосом Escherichia coli Кількісне вивчення взаємодії деацильованої тРНК з Р-, А- і Е-сайтами 70S рибосом Escherichia coli Quantitative study of interaction of deacylated tRNA with the P, A and E sites of Escherichia coli ribosomes Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Количественное изучение взаимодействия деацилированной тРНК с Р-, А- и Е-сайтами 70 S рибосом Escherichia coli |
| spellingShingle |
Количественное изучение взаимодействия деацилированной тРНК с Р-, А- и Е-сайтами 70 S рибосом Escherichia coli Семенков, Ю.П. Макаров, Е.М. Кириллов, С.В. Структура и функции биополимеров |
| title_short |
Количественное изучение взаимодействия деацилированной тРНК с Р-, А- и Е-сайтами 70 S рибосом Escherichia coli |
| title_full |
Количественное изучение взаимодействия деацилированной тРНК с Р-, А- и Е-сайтами 70 S рибосом Escherichia coli |
| title_fullStr |
Количественное изучение взаимодействия деацилированной тРНК с Р-, А- и Е-сайтами 70 S рибосом Escherichia coli |
| title_full_unstemmed |
Количественное изучение взаимодействия деацилированной тРНК с Р-, А- и Е-сайтами 70 S рибосом Escherichia coli |
| title_sort |
количественное изучение взаимодействия деацилированной трнк с р-, а- и е-сайтами 70 s рибосом escherichia coli |
| author |
Семенков, Ю.П. Макаров, Е.М. Кириллов, С.В. |
| author_facet |
Семенков, Ю.П. Макаров, Е.М. Кириллов, С.В. |
| topic |
Структура и функции биополимеров |
| topic_facet |
Структура и функции биополимеров |
| publishDate |
1985 |
| language |
Russian |
| container_title |
Биополимеры и клетка |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Кількісне вивчення взаємодії деацильованої тРНК з Р-, А- і Е-сайтами 70S рибосом Escherichia coli Quantitative study of interaction of deacylated tRNA with the P, A and E sites of Escherichia coli ribosomes |
| description |
В работе определены зависимости констант ассоциации деацилированной тРНК^Phe с Р-сайтом рибосом от концентрации ионов Mg²⁺ и температуры; измерена константа ассоциации тРНК^Phe с А-сайтом; показано, что с изменением концентрации Mg²⁺ и температуры взаимодействие тPHK^Phe с Е-сайтом остается кодоннезависимым. На основе полученных и ранее нами опубликованных данных построены ряды относительного сродства аминоацил-тРНК, пептидил-тРНК и деацилированной тРНК к Р-, А- и Е-сайтам 70S рибосомы, а также предлагается термодинамически обоснованная модель транслокации с использованием Е-сайта как выходного.
Визначено залежності констант асоціації деацильованої тРНК^Phe з Р-сайтом рибосом від концентрації іонів Mg²⁺ і температури; виміряно константу асоціації тРНК^Phe з А-сайтом; показано, що із зміною концентрації Mg²⁺ і температури взаємодія тPHK^Phe з Е-сайтом залишається кодоннезалежною. На основі отриманих та опублікованих нами раніше даних побудовано ряди відносної спорідненості аміноацил-тРНК, пептидил-тРНК і деацильованої тРНК до Р-, А- та Е-сайтів 70S рибосоми, а також запропоновано термодинамічно обгрунтовану модель транслокації з використанням Е-сайта як вихідного.
The association constants of deacylated tRNA^Phe for the P site of 70S ribosomes were measured in the presence and absence of poly(U), and at different Mg²⁺ concentrations and temperatures. The numbers of Mg²⁺ ions involved in this interaction were determined: 4.4±0.3 (+poly(U) and 2.7±0.3 (–poly(U). The association constant of tRNA^Phe for the A site was found to be 5•10⁵M⁻¹, much lower than that for the P site (2•10⁹M⁻¹), at 15 mM Mg²⁺, 200 mM NH₄⁺ and 25 °C. The independence of the E-site binding of tRNA^Phe on the messenger RNA was confirmed under these medium conditions. Based on the data obtained the affinity orders of aminoacyl-, peptidyl-tRNA and deacylated tRNA for the P, A and E sites are determined, and a possible mechanism of involvement of the E site in the translocation process is discussed.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152284 |
| citation_txt |
Количественное изучение взаимодействия деацилированной тРНК с Р-, А- и Е-сайтами 70 S рибосом Escherichia coli / Ю.П. Семенков, Е.М. Макаров, С.В. Кириллов // Биополимеры и клетка. — 1985. — Т. 1, № 4. — С. 183-193. — Бібліогр.: 38 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT semenkovûp količestvennoeizučenievzaimodeistviâdeacilirovannoitrnksraiesaitami70sribosomescherichiacoli AT makarovem količestvennoeizučenievzaimodeistviâdeacilirovannoitrnksraiesaitami70sribosomescherichiacoli AT kirillovsv količestvennoeizučenievzaimodeistviâdeacilirovannoitrnksraiesaitami70sribosomescherichiacoli AT semenkovûp kílʹkísnevivčennâvzaêmodíídeacilʹovanoítrnkzraíesaitami70sribosomescherichiacoli AT makarovem kílʹkísnevivčennâvzaêmodíídeacilʹovanoítrnkzraíesaitami70sribosomescherichiacoli AT kirillovsv kílʹkísnevivčennâvzaêmodíídeacilʹovanoítrnkzraíesaitami70sribosomescherichiacoli AT semenkovûp quantitativestudyofinteractionofdeacylatedtrnawiththepaandesitesofescherichiacoliribosomes AT makarovem quantitativestudyofinteractionofdeacylatedtrnawiththepaandesitesofescherichiacoliribosomes AT kirillovsv quantitativestudyofinteractionofdeacylatedtrnawiththepaandesitesofescherichiacoliribosomes |
| first_indexed |
2025-11-26T21:35:47Z |
| last_indexed |
2025-11-26T21:35:47Z |
| _version_ |
1850773485302841344 |
| fulltext |
УДК 577.217
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
ДЕАЦИЛИРОВАННОЙ тРНК С Р-, А- И Е-САЙТАМИ
70 S РИБОСОМ ESCHERICHIA COLI
Ю. П. Семенков, Ε. М. Макаров, С. В. Кириллов
Введение. Деадилированная тРНК, образующаяся на Р-сайте рибосом
в результате транспептидации, является одной из трех функциональных
форм тРНК, удаление которой в акте транслокации является одним из
ключевых и в то же время малоизученных событий этого процесса.
Ясно, что знание сродства деацилированной тРНК к активным сайтам
рибосомы необходимо как для понимания энергетики транслокации, так
и для изучения функций третьего, Ε-сайта, недавно обнаруженного в
рибосомах из прокариот и специфичного к деацилированной тРНК [1].
На основе качественных данных Шраером и Нолем [2] был пред-
ложен следующий порядок относительного сродства функциональных
форм тРНК к рибосомным сайтам: в ряду деацилированная т Р Н К —
иептидил-тРНК—аминоацил-тРНК сродство растет слева направо к
Α-сайту и уменьшается к Р-сайту. В соответствии же с транслокацион-
ной гипотезой Ледера [3] сродство деацилированной тРНК, в проти-
воположность этому порядку, к Р-сайту должно быть ниже (как про-
дукта Р-сайта пептидилтрансферазы), чем у пептидил-тРНК, являю-
щейся субстратом Р-сайта пептидилтрансферазы.
Имеющиеся экспериментальные данные по этому вопросу также
противоречивы, малочисленны и получены в разных экспериментальных
системах и условиях (концентрации двух- и одновалентных катионов,
температуры и т. д.). Так, данные Хольшуха и соавт. [4] о том, что
сродство деацилированной тРНК ниже к Р-сайту, чем у аналога пеп-
тидил-тРНК — Ас-РЬе-тРНКр}1е — находятся в соответствии с гипотезой
Ледера. По данным же Питере и Яруса [5] и Райнбергера и соавт.
[6], наоборот, аналоги пептидил-тРНК имеют меньшее сродство к Р-
сайту, чем деацилированная тРНК. Зависимости же сродства обсужда-
емых форм тРНК от этих условий неизвестны, что еще больше затруд-
няет сравнение результатов разных исследователей (например, кон-
станты ассоциации деацилированной тРНК с Р-сайтом колеблются от
106 М - 1 у Хольшуха и соавт. [4] до 10 9М - 1 — у Кантора и соавт. [7]) .
В настоящей работе измерены константы ассоциации деацилиро-
ванной тРНК Р Ь е с Р-, А- и Е-сайтами 70S рибосом, а также определе-
ны зависимости этих констант на Р-сайте от концентрации ионов Mg2J~
и температуры; определено относительное сродство аминоацил-, пепти-
дил- -и деацилированной тРНК к Р-, А- и Ε-сайтам; предлагается тер-
модинамически обоснованная модель диссоциации деацилированной
тРНК из рибосомы в процессе транслокации с использованием Е-сайта
как выходного.
Материалы и методы. Активные 30S- и 505-субчастицы, а также фракциониро-
ванную поли(и) (Мг = 30 ООО) получали, как в [8, 9]. Высокообогащенные препараты
т Р Н К Р Ь е выделяли по следующей модифицированной процедуре. Тотальную тРНК, по-
лученную по методу Зубея [10], пропускали через колонку с бензоилированной ДЭАЭ-
целлюлозой (БД-целлюлоза), используя последовательно два линейных градиента:
NaCl (0,4—1,0 Μ) и этанола (0—50 %) (рис. 1, А). Эта предварительная стадия необ-
ходима, так как если не освободить тотальную тРНК от спиртовой фракции (рис. 1, А,
пик / / ) , она будет в дальнейшем неизбежно загрязнять Phe-TPHKP h e , поскольку обе
выходят из колонки при одних и тех же концентрациях спирта (рис. 1, А, Б). Фракции,
вымытые солевым градиентом и содержащие всю т Р Н К Р Ь е [11], объединяли и заря-
жали [14С] фенилаланином (800 расп. / мин-пмоль). Для зарядки использовали фер-
ментную фракцию S-100, свободную от РНК и имеющую отношение А28о/А2бо= 1,5 [12].
[17,С] Phe-TPHKP h e снова наносили на колонку с БД-целлюлозой и промывали ее гради-
ентами NaCl и спирта так же, как на рис. 1, А. Обогащенная [14С] РЬе-тРНК Р Ь е выхо-
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 4 4 — 5-250 183
дила в трех основных фракциях: I — с обогащением 1500 пмоль/ед. Α2βο, II и III — с
обогащением 1100 пмоль/ед. Азво (рис. 1, Б, кривая 2). Последние фракции объединя-
ли и наносили на колонку с сефарозой-4В, которую затем промывали обратным гра-
диентом сульфата аммония в основном по методу Холмса и соавт. [13]. Эта последняя
стадия позволяет значительно «дообогатить» [14С] РИе-тРНКРЬе — фракции 18—21
(рис. 1, В) содержали аминоацил-тРНК с обогащением 1920 пмоль/ед. А2ео. Деацили-
рованную немеченую тРНК получали деацилированием этой [14С] Phe-TPHKPh<i (60 мин
при 37 °С в 0,5 Μ трис-HCl, рН 9,0). Ac-[1 4C]Phe-TPHKP h e получали из этого же пре-
Номер фракции
Рис. 1. Обогащение Phe-τΡΗΚ. А. 32000 ед. А2ео тотальной тРНК нанесли на колонку
с БД-целлюлозой (4,4X50 см) в буферном растворе А (0,05 Μ NaAc, рН 5,0, 0,01 Μ
MgCU), содержащем NaCl в концентрации 0,4 Μ. Затем колонку элюировали после-
довательно четырьмя объемами линейного градиента концентрации NaCl 0,4—1,0 Μ в
буферном растворе А (фракции 1—21) и тремя объемами линейного градиента этано-
ла в концентрации 0—50 % (в буфере А, содержащем 1,0 Μ NaCl, фракции 21—35).
Фракции 5—20 объединили для зарядки [14С] фенилаланином. Б. Заряженные 14С-фе-
нилаланином фракции 5—20 (см. А) хроматографировали на БД-целлюлозе, как в А. В.
300 ед. А2бо обогащенной [14С] РЬе-тРНКР Ь е (·—1100 пмоль/ед. А26о, из фракций / / + / / / ,
Б) перевели в 6 мл буферного раствора Б (0,01 Μ NaAc, рН 4,5, 10 мМ MgCla,
0,01 Μ ЭДТА, 6 мМ 2-меркаптоэтанол), содержащего 1,3 Μ (NH4)2S04, и нанесли на
колонку с сефарозой-4В (1,1X27 см), уравновешенную в этих же условиях. Колонку
элюировали шестью объемами обратного линейного градиента сульфата аммония в
концентрации 1,3—0,05 Μ в буфере Б. Все процедуры проводили при 4 °С. 1 — А26о;
2 — [14С] радиоактивность.
Fig. 1. Enrichment of Phe-tRNA
парата аминоацил-тРНК по методу Лапидота и Раппапорта [14]. Равномерно мечен-
ную [14С]-урацилом деацилированную [ 1 4 С]тРНК Р Ь е выделяли из клеток Е. coli
АТ2473, дефектных по синтезу урацила, как описано в [15]. Ее обогащали до
1270 пмоль/ед. А2бо так же, как и немеченую тРНК Р Ь е (см. выше) с промежуточным
деацилированием [3Н] фенилаланином; была опущена только последняя ступень очист-
ки на сефарозе-4В.
Все эксперименты (исключая показанные на рис. 4 и 5) были выполнены в бу-
ферном растворе ТАМ (0,02 Μ трис-HCl, рН 7,4, 0,015 Μ MgCl2, 0,2 Μ NH4C1,
0,001 Μ ЭДТА) при 25 °С. Измерение констант ассоциации тРНК с рибосомами прово-
дили с помощью метода фильтрования Ниренберга и Ледера [38], модифицированного
для равновесных измерений, как описано в [20]. Остальные условия экспериментов да-
ны в подписях к рисункам. БД-целлюлозу синтезировали, как описано в [16]. В ра-
боте использовали сефарозу-4В фирмы «Pharmacia» (Швеция), тетрациклин и пуроми-
цин—фирмы «Serva» (ФРГ) и эдеин — фирмы «Calbiochem» (США).
К к , К р и КЕ — константы ассоциации тРНК с А-, Р- и Ε-сайтами соответственно.
Нижние индексы, использованные в тексте, обозначают: t — деацилированную тРНК Р Ь е ,
ρ — пептидил-тРНК (т. е. Ac-Phe-TPHKPhe) и а — аминоацил-тРНК (т. е. РИе-тРНКР Ь е).
Результаты и обсуждение. О т с у т с т в и е к о д о н - а н т и к о -
д о н о в о г о в з а и м о д е й с т в и я д л я т Р Н Kp h e н а Ε - с а й -
те . Ранее мы показали, что при высокой концентрации Mg2 + (20 мМ)
184 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 4 4 — 5-250 184
и О °С 70S рибосомы связывают три молекулы деацилированной
тРНКР11е в присутствии поли(и) (с Р-, А- и Е-сайтами) и две молекулы
без поли(и) (с Р- и Е-сайтами) [17]. Взаимодействие TPHKP h e с Е-
сайтом оказалось практически кодоннезависимым, так как величины
KtB равны 5-Ю7 М-1 ( + п о л и ( и ) ) и 3-Ю7 М"1 (—поли(и)) . Анало-
гичную ситуацию мы наблюдаем и при понижении концентрации Mg24"
до 15 мМ и повышении температуры до 25 или 37 °С (рис. 1, Л, £ ) ,
т. е. и в так называемых «физиологических» условиях, как это опре-
Рис. 2. Титрование 70S рибосом деацилированной тРНК Р Ь е в присутствии (А) и в
отсутствие (Б) поли(и) при различных внешних условиях: 1 — 20 мМ Mg 2 + , 0 °С [17];
2 — 1 5 мМ Mg 2 + , 25 °С; 3 — 1 5 мМ Mg2+, 37 °С. Инкубационные смеси содержали в
100 мкл буферного раствора ТАМ: 10 пмоль 30S субчастиц, И пмоль 50S субчастиц,
10 мкг поли(ІІ) и указанные количества [14С] тРНК Р Ь е . Время инкубации 3 ч.
Fig. 2. Titration of 70S ribosomes with deacylated tRNAP h e in the presence (A) and
absence (B) of poly(U) under different environmental conditions.
Рис. 3. Зависимость Ι/β от 1 /г для Ac-Phe-TPHKPhe (1) и тРНК Р Ь е (2). Инкубацион-
ные смеси содержали в 0,2—5,0 мл буферного раствора ТАМ: 10 пмоль 30S субчастиц,
11 пмоль 50S субчастиц, 10 мкг поли(11) и 8,2 пмоль [14С] тРНК Р Ь е или 6,3 пмоль
Ac- [1 4C]Phe-TPHKp h e . Время инкубации 3 ч.
Fig. 3. The plots of Ι /β vs. I / r for Ac-Phe-tRNAPhe (1) and tRNAP h e (2).
делено Райнбергером и соавт. [18], Ε-сайт реализуется количественно
без участия соответствующего кодона. Этот результат противоречит
данным вышеупомянутых авторов [18].
В з а и м о д е й с т в и е д е а ц и л и р о в а н н о й τ Ρ Η Kp h e с Ρ -
с а й т о м п р и в а к а н т н ы х А- и Ε - с а й т а х . Из трех сайтов,
Р, А и Е, TPHKPhe имеет наибольшее сродство к Р-сайту. Это следует,
в частности, из того, что наблюдается количественная корреляция меж-
ду добавлением небольшого количества (30 %) тРНК Р Ь е и уменьшением
связывания Ac-Phe-TPHKPhe с пуромицинчувствительным, т. е. Р-сай-
том [19]. Следовательно, измерение термодинамических параметров
взаимодействия тРНКР11е с Р-сайтом необходимо проводить при избытке
рибосом над тРНК.
Измерения проводили методом переменного объема, когда во всех
пробах содержатся одинаковые количества компонентов, причем от-
ношение 70S,/TPHK>1, концентрация поли(И) поддерживается насы-
щающей, а изменение концентраций компонентов достигается измене-
нием объема смесей. Этот способ дает возможность даже при больших
величинах К р иметь надежно измеримые концентрации тРНК в рас-
творе и, кроме того, определять долю активной тРНК. Изотерма ад-
сорбции описывается в этом случае уравнением 1 / β = 1 / γ + 1 / γ Крг,
где β — доля связанной тРНК, у — ее активная доля и г — концентра-
ция свободных рибосом [20]. Поправку на долю активных рибосом мы
здесь не вводим, так как все они активны в связывании тРНК (рис. 2).
На рис. 3 показаны результаты опытов, сделанных с тРНКР11е и
Ас-РЬе-тРНКр11е в идентичных условиях. По наклону полученных пря-
мых определяем константы ассоциации на Р-сайте: Κ ί - = 2 · 109М_1 для деа-
цилированной тРНКР Ь е и 5-КРАГ 1 для Ac-Phe-TPHKPhe (Kph τ · е · сродст-
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 4 4 — 5-250 185
во тРНКР Ь е к Р-сайту в четыре раза выше, чем у аналога пептидил-тРНК.
По пересечению с осью ординат определяем и доли активных т Р Н К :
ур ~ 90 % для Ас-РЬе-тРНКРІ1е и γ* ~ 55 % для тРНКРЬе . Нужно отметить,
что при использовании равномерно меченных урацилом препаратов тРНК,
полученных при выращивании дефектных по синтезу урацила штаммов на
минеральных средах, доля активной тРНК редко превышает 60 %. Вероятно,
это связано с частичной недомодификацией минорных оснований в тРНК
[ 2 1 ] , важных для взаимодействия тРНК с рибосомой.
Из этого опыта ясно, что определение констант ассоциации по мно-
гим точкам с учетом величин у обязательны. Если бы мы определяли
Рис. 4. Зависимости log/G p от logMg 2 + . А — в присутствии поли(и) при 10 (1 ) ; 20 (2);
25 (3); 30 °С (4). Б — в отсутствие поли(ІІ) при: 0 (1); 10 (2); 20 (3); 30 °С (4).
Fig. 4. The plots of log/Cip vs. l og [Mg 2 + ] at different temperatures in the presence (A)
and absence (5) of poly(U) .
Рис. 5. Зависимости Вант-Гоффа для деацилированной т Р Н К Р Ь е на Р-сайте. А — в при-
сутствии поли(и) при концентрациях Μ g 2 + : 12,5 (1); 10 (2)\ 7,5 (3); 5 мМ (4). Б —
в отсутствие поли(ІІ) при 20 (1); 15 (2) и 10 мМ Mg2+ (3).
Fig. 5. Van't Hoff plots for the binding of deacylated tRNA P h c at the P-site at different
[Mg2+] concentrations in the presence (A) and absence (Б) of poly(U).
величины K p по одной точке, предполагая у* = у р = 1 0 0 %, что обычно
и делается, то при больших концентрациях компонентов получили бы
KtvIKv
v<\, а при малых концентрациях (большие объемы смесей) —
противоположный результат.
В табл. 1 приведены результаты измерения величин Ktv для деаци-
лированной тРНКР11е способом, описанным выше, при различных кон-
центрациях Mg2+ и температурах, в присутствии и отсутствие п о л и ( и ) .
Графики рис. 4 показывают зависимости величин Ktv от концентрации
Mg2+. В логарифмических координатах они линейны и подчиняются
закону Alog Ktv = n&\og [Mg2+]. При условиях, что сайты связывания
ионов магния идентичны и взаимонезависимы на взаимодействующих
макромолекулах и компоненты комплекса связывают одно и то же
число ионов магния как в растворе, так и в составе комплекса, вели-
чина η может быть интерпретирована как количество ионов Mg2 + , при-
нимающих участие во взаимодействии этих макромолекул [22]. Легко
подсчитать, что п=4,4+0,3 в присутствии поли(и) и / 2 = 2 , 7 + 0 , 3 — без
поли(и ) , причем эти величины не зависят от температуры. Зависимо-
сти Вант-Гоффа, построенные по данным табл. 1, также линейны
(рис. 5, А, Б), что позволяет подсчитать величины Δ Я0, AG0 и Δ50
взаимодействия деацилированной тРНКР11е с Р-сайтом 70S рибосом
(табл. 2).
И з м е р е н и е к о н с т а н т ы а с с о ц и а ц и и д е а ц и л и р о -
в а н н о й TPHKP h e с Α - с а й т о м п р и з а н я т ы х Р- и Ε -
с а й т а х . Определение величин KtA затруднительно из суммарной кри-
вой на рис. 2, А, так как три сайта вовлечены в связывание тРНК Р Ь е ,
и Α-сайт по термодинамическим причинам заполняется последним [6,
186 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 4 4 — 5-250 186
17]. Поэтому в данной работе для измерения KtA мы выбрали способ
конкуренции немеченой TPHKPhe с меченой Ac-[1 4C]Phe-TPHKp h e . Мы
показали ранее, что этим аналогом пептидил-тРНК можно одновре-
менно заполнить Р- и А-сайты 70S рибосом, и параметры этого связы-
вания хорошо известны [19]. При малых концентрациях тРНКр і 1 е кон-
курирует с Ac-Phe-TPHKphe исключительно за Р-сайт [19, 23, 24] и
только при достаточно больших — за Α-сайт также [24]. Опыт ставили
следующим образом: к 10 пмоль комплекса 70S поли(ІІ) добавляли
смесь TPHKp h e и Ac-[14C]Phe-TPHKphe . Пептидил-тРНК использовали
в таких количествах (40 пмоль), чтобы в отсутствие TPHKp h e величина
Vp ->2, т. е. выполнялись условия Кр \р] > 1 и К ρ [/?]»1; количество тРНКР Ь е
варьировали от 0 до 800 пмоль. В этих условиях количество молекул
Ас-РЬе-тРНКРЬе, связанных с одной рибосомой (ν^), зависит от концентрации
Rnfiniтнпй т Р Н К р Ь е следующим обоязом:
+ПОЛИ (U) —поли (U)
Mg 2 +, мМ Τ °С /Ср .10-8 , М-1 M g 2 + , мМ Τ °С κ ρ . ι ο - 8 , Λ1-1
5 0 3,22±0,85 10 0 0,95+0,20
5 10 2,02±0,48 10 10 0,58+0,13
5 17,5 0,23+0,05 і 0 15 0,49+0,07
5 25 0,10+0,01 І0 20 0,23+0,01
7,5 10,5 21,5+3,5 І0 30 0,17+0,04
7,5 13,5 15,0+5,3 15 0 2,62±0,32
7,5 20 3,71+0,27 15 10 1,69+0,27
7,5 30 0,52+0,05 15 15 1,05+0,19
10 11 58,0+8,5 15 20 0,61 ± 0 , 0 6
10 20 14,1+4,9 15 30 0,43+0,12
10 30 2,02+0,24 20 0 6,98+0,59
10 25 4,37+0,32 20 10 3,45+0,50
12,5 11 125+85 20 15 3,02+0,58
12,5 20 30,8+2,1 20 20 1,95±0,61
12.5 30 5,02+0,39 20 30 0,86+0,09
12,5 37 1,2+0,4 — ,— —
15 25 22,3+5,4 — .—
20 25 37,2+8,3 — — —
Т а б л и ц а 2
Термодинамические параметры взаимодействия деацилированной TPHKPhe с Р-сайтом
70S рибосом
Thet modynamical Quantities of tRNAPh* Binding at the Ρ Site of 70S Ribosomes
поли (U) Δ60 , кДж/моль АН°, кДж/моль Δ5°, Дж/моль-град.
+ — (53,1+4,2) — (139,7+16,3) — (285,1+20,9)
— — (43,3+3,8) — (44,4+4,2) — (2,6+1,4)
П р и м е ч а н и е . Δ G° и AS0 измерены при 15 мМ Mg 2 + и 25 °С.
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 4 187
где [р] и [t\ — концентрации свободных пептидил-тРНК и тРНК . Если
мы обозначим то нетрудно показать,
Т а б л и ц а 1
Константы асоциации десцилированной TPHKPhe с Р-сайтом 70S рибосом
при различных концентрациях M g 2 + и температурах (NH"|" = .200 мМ)
Association Constants of Deacylated tRNAPhe for the Ρ Site of 70S Ribosomes at
Different Concentrations of M g 2 + and Temperatures ( N H f = 2 0 0 mM)
что выражение (1) преобразуется в
При ζ ->оо (большие избытки тРНК ) выражение (2) упрощается до
что является уравнением прямой — касательной к дальней области кривой
(2) и пересекающейся с осью ординат
Рис. 6. Ингибирование связывания Ac-Phe-TPHKP h e деацилированной TPHK P h e ( Л ) я
то же в виде зависимости 1/v ^от 2 (Б). Инкубационные смеси содержали в 150 мкл
буферного раствора ТАМ: 7,4 пмоль 30S субчастиц, 8,0 пмоль 60S субчастиц, 10 мкг
поли(и) , 40 пмоль Ас-[14С] Phe-TPHKP h e и 0—880 пмоль немеченой деацилированной
TPHKP h e . Время инкубации 3 ч.
Fig. 6. Inhibition of the Ac-Phe-tRNAP h e binding at the P-and Α-sites of the 70S poly(U)
complex with deacylated tRNA P h e .
Рис. 7. Титрование Α-сайтов 70S поли(и) комплексов с Р-сайтами, предварительно за-
нятыми деацилированной т Р Н К Р Ь е (Л) и то же в двойных обратных координатах (Б).
Смеси содержали в 50 мкл буферного раствора ТАМ: 10 пмоль 30S субчастиц, 11 пмоль
50S субчастиц, 5 мкг поли(О) и 30 пмоль деацилированной тРНК Р Ь е . После 60 мин
инкубации к смесям добавляли 0—38 пмоль Ас-[14С] Phe-TPHKP h e в 100 мкл буферного
раствора ТАМ и инкубацию продолжали еще 90 мин.
Fig. 7. Titration of the Α-sites of the 70S·poly(UJ complexes with Ac-Phe-tRNAP h e when
the P-sites are preoccupied with tRNA P h e .
вен xy
X + у
. На рис. 6 показан результат такого эксперимента в прямых (Л)
и обратных (Б) координатах. Касательная, обозначенная на рис. 6, Б сплош-
= 1/30. Зная величину χ =4 из данных ной линиеи, имеет наклон
Т е р м о д и н а м и ч е с к о е о б о с н о в а н и е о б р а з о в а н и я
м о д е л ь н ы х п р е - и п о с т т р а н с л о к а ц и о н н ы х к о м п -
л е к с о в . В 1972 г. Ватанабе показал, что добавление деацилирован-
ной тРНК вызывает «сдвиг» связывания A c - P h e - τ Ρ Η Κ (при избытке
70S рибосом) из Р- в А-сайт [23]. С тех пор это явление неизменно
используют для изучения процесса транслокации в рибосомах и отме-
чают высокую специфичность образования посттранслокационного
( — τ Ρ Η Κ ρ ί 1 θ ) и претранслокационного ( + т Р Н К Р Ь е ) комплексов [24].
Эта специфичность легко может быть объяснена с использованием ве-
личин констант ассоциации, измеренных выше. Если 10 пмоль комплек-
188 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 4
ее наклон ра-при значении
рис. 3, мы определяем и величину т. е. константа ассоци-
ации деацилированной тРНК с Α-сайтом, Kt, приблизительно в 30 раз
меньше, чем у Ас-Рhе-тРНКРЬе (Кр).
са 70S поли(и) в объеме 150 мкл преинкубировать с 3—1,5-кратным
избытком деацилированной тРНКр*1е, то на основании приведенных
выше данных нетрудно подсчитать, что будут заняты 99,5 (98) % Р-
сайтов и только 4,5 (8) % Α-сайтов. И действительно, если такой пре-
формированный комплекс титровать Ac-Phe-TPHKPhe, то практически
одна молекула пептидил-тРНК связывается с рибосомой, причем в А-
сайт, что подтверждает отсутствие реакции с пуромицином (рис. 7, А).
Построив полученную зависимость в обратных координатах (рис. 7, Б ) ,
мы определяем в этом случае величину / (р А =2,6-10 7 М - 1 , очень близ-
кую к той, которая была измерена, когда оба сайта были доступны
для пептидил-тРНК (2-ю 7 М"1 [19]).
В случае, когда при образовании претранслокационного комплекса
необходимо связать всю данную пептидил-тРНК с Α-сайтом, т. е. когда
Рис. 8. Кинетика связывания Ac-Phe-'rPHKPhe с Α-сайтом комплекса 70S поли(и) . Ин-
кубационные смеси содержали 25 пмоль 30S субчастиц, 30 пмоль 50S субчастиц, 10 мкг
поли(и) и 60 пмоль тРНКР1ге . После 60 мин преинкубации к ним добавляли по
10,9 пмоль Ас-[14С] РЬе-тРЫКР Ь е и измеряли кинетику ее связывания при конечных
объемах смесей 50 (1) и 400 мкл (2). В контрольных смесях, не содержавших деаци-
лированную тРНК Р Ь е , связывание Ас [14С] РЬе-тРНКР Ь е с Р-сайтом определяли после
30 мин инкубации при объемах смесей 50 (3) и 400 мкл (4).
Fig. 8. Kinetics of Ac-Phe-tRNAP h e binding at the Α-site of the 70S-poly(U) complex.
Рис. 9. Относительное сродство Phe-TPHKP h c (1), 1^-ацетил-Р1іе-тРНКР11е (2) и деаци-
лированной тРНК Р Ь е (3) к Α-, Р-, Ε-сайтам комплекса [ 7 0 5 + п о л и ( и ) ] . Константы ас-
социации КА, Кр , К Е различных функциональных форм тРНК с Α-, Р-, Е-сайтами ри-
босом соответственно измерены при 15 мМ Mg2+ и 25 °С. Оценки величины К Р
Е и К а
в
взяты из [15].
Fig. 9. Relative affinity of Phe-tRNAP h e (1), Ac-Phe-tRNAP h e (2) and tRNA P h e (3) for
the A-, P- and Ε-sites of the 70S·poly(U) complex. The upper limits for the K P
E and
Ka
K values are taken from [15].
присутствие ее в растворе нежелательно, нужно, очевидно, работать
при избытке рибосом над Ас-Рhе-тРНКРhе . Если мы возьмем фикси-
рованное количество активной Ac-Phe-TPHKphe, то, принимая во вни-
мание, что Кр =[АР]/[А] [p], где [Ар] и [А] — концентрации занятых и сво-
бодных Α-сайтов, условие ее полного связывания будет выглядеть как [Ар]/
/[ρ] >>1 или Кр [А] >> 1. Отсюда рассчитываем, что, например, для 10 пмоль
Ас-Рhе-тРНКРhе при обьеме смеси 50 мкл необходимо взять не менее
25 пмоль рибосом. На рис. 8 , 1 показано, что в этих условиях действитель-
но ~ 95 % Ac-Phe-TPHKPhe связано. Если же условие Kp[А]>> 1 не соблю-
дается и это соотношение равно, например, единице, что соответствует объе-
му смеси 400 мкл, то в равновесии должно связаться только 50 %
Ac-Phe-TPHKPhe. Как видно из рис. 8, 2, наблюдается хорошее совпадение
эксперимента с расчетом. В отсутствие тРНКРЬе, т .е. когда Р-сайт свободен,
при объемах и 50, и 400 мкл вся Ас-Рhе-тРНКРЬе свявается с Р-сайтами
рибосом (рис. 8 , 3 , 4 ) вследствие достаточно высокого значения величины
КР
Р (5· 108М -1 , рис. 3 и [19]). Причиной образования только посттранслока-
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 4 4 — 5-250 189
ционных комплексов в этом случае является тот факт, что отношение /Ср/
/КА
Р в условиях данного эксперимента равно 25 [19].
К о л и ч е с т в о и о н о в м а г н и я , п р и н и м а ю щ и х у ч а -
с т и е п р и в з а и м о д е й с т в и и тРНК с р и б о с о м о й ; ф и -
з и о л о г и ч е с к и е и « н е ф и з и о л о г и ч е с к и е » к о н ц е н т р а -
ц и и и о н о в м а г н и я . Как показано в настоящей работе, зависи-
мость величины константы ассоциации деацилированной TPHKp h e с Р-
сайтом 70S рибосом от концентрации Mg2+ имеет вид Mog Ktv =
= nAlog [Mg2 +] . Линейность этой зависимости позволяет, во-первых,
оценивать величины Кр при тех концентрациях Mg2+, где прямые из-
мерения невозможны из-за слишком слабого или сильного взаимодей-
ствия тРНК с рибосомой и, во-вторых, определять количество ионов
магния, принимающих участие в этом взаимодействии. Аналогичные
результаты были получены нами ранее для РЬе-тРНКР Ь е и Ac-Phe-
тРНК Р Ь е [12, 19, 25]. Различие заключается только в величинах η для
всех трех форм тРНК, как это видно из табл. 3.
Т а б л и ц а 3
Количество ионов магния, принимающих участие во взаимодействии РЬе-тРНКР1и\
ацетил-РНе-тРНКPhe, тРНКРІІе с Р- и А-сайтами 70S рибосом
The Numbers of Mg 2 + Ions Involved in the Interactions of Phe-tRNAAc-Phe-tRNAрье
and tRNAVhc with the Ρ and A Sites of 70S Ribosomes
Сайт поли (U) Phe-TPHKP h e Ас-РЬе-тРНКР Ь е T P H K P h e
Ρ + 5 , 6 + 0 , 4 5 , 8 + 0 , 4 4 , 4 + 0 , 3
Ρ 6 , 4 4 - 0 , 9 8 , 7 4 - 1 , 1 2 , 7 + 0 , 3
А + 1 , 2 + 0 , 1 5 , 4 + 0 , 4 ?
А
Далее анализ стехиометрии насыщающего связывания различных
форм тРНК с рибосомами дает Следующие результаты! V шах — ̂
для Phe-TPHKPhe
И 30S субчастиц при 5, 10 и 20 мМ Mg2+ [8]; v 2 m a x =
= 2 для Phe-TPHKp h e и 70S рибосом при 5, 10 и 20 мМ Mg2+ [26, 27];
v 2 m a x = 2 для Ac-Phe-TPHKphe и 70S рибосом в пределах концентрации
Mg2+, по крайней мере, 10—20 мМ [19]; v 2
m a x — 3 для деацилированной
TPHKp h e и 70S рибосом при 10 мМ [6], 15 мМ (рис. 2, Л и [6]) и
20 мМ Mg 2 + [17]. Сопоставляя эти данные с отсутствием каких-либо
особенностей в зависимостях между Alog К и Alog [Mg2+], о чем гово-
рилось выше, приходим к следующим выводам: в модельных системах,
где изучается взаимодействие тРНК с рибосомами в отсутствие факто-
ров элонгации, нет объективных причин делить концентрации Mg2+ на
физиологические и «нефизиологические». Концентрация ионов магния
имеет только количественное значение, т. е. с ее вариациями в преде-
лах, обычно используемых в экспериментах, меняются (и в сильной
степени) константы ассоциации любой из трех биологических форм
тРНК с рибосомными сайтами без появления или исчезновения послед-
них. Утверждения Райнбергера и соавт. [18], что 18 мМ является
границей между физиологическими и «нефизиологическими» концен-
трациями Μg2+, основаны на результатах Хольшуха и соавт. [28].
Последние действительно наблюдали, работая с фиксированной кон-
центрацией Ac-Phe-TPHKPhe, резкое уменьшение связывания пептидил-
тРНК с двух до единицы при понижении концентрации Mg2+ с 20 до
10 мМ. Однако они не привели никаких доказательств того, что кон-
центрация пептидил-тРНК при всех концентрациях Mg2+ была насы-
щающей, и наблюдаемый ими эффект легко объясняется тем, что кон-
станта ассоциации Ac-Phe-TPHKphe с Р-сайтом падает в 20 раз, с А-
сайтом — в 40 раз в диапазоне концентраций Mg2+ 20—10 мМ [19].
О т н о с и т е л ь н о е с р о д с т в о р а з л и ч н ы х ф о р м тРНК
190 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 4 4 — 5-250 190
к р и б о с о м ы ы м с а й т а м и г и п о т е з а т р а н с л о к а ц и и
Л е д е р а . Как видно из данных эксперимента на рис. 3, сродство де-
ацилированной TPHKp h e к Р-сайту в четыре раза выше, чем у аналога
пептидил-тРНК, что качественно согласуется с результатами в [5, 6]
и находится в противоречии с данными группы Гассена [4, 28]. При-
влекая наши более ранние данные для аминоацил-тРНК [25, 26], мы
можем теперь построить ряды относительного сродства всех трех форм
тРНК к рибосомным сайтам при одних и тех же внешних условиях
(15 мМ Μg2+, 20 мМ NH4+ и 25 °С). Мы видим из данных рис. 9, что
к Α-сайту сродство уменьшается в ряду: аминоацил-тРНК>пептидил-
тРНК>деацилированная тРНК. Это хорошо согласуется с предполо-
жениями Шрайера и Ноля [2] и Ледера [3]. Однако на Р-сайте на-
блюдается необычный порядок: сродство к Р-сайту увеличивается в
ряду: пептидил-тРНК<аминоацил-тРНК<деацилированная тРНК. Ами-
ноацил-тРНК имеет большее сродство к Р-сайту, чем пептидил-тРНК,
которая, по Ледеру, является субстратом Р-сайта, а деацилированная
тРНК со свободным З'-концом, являющаяся продуктом Р-сайта, имеет
к нему самое высокое сродство. Эти результаты находятся в резком
противоречии с продукт-субстратными отношениями Ледера в его ги-
потезе.
Реальными субстратами пептидилтрансферазного центра являются
только З'-концевые части молекулы тРНК, и для минимальных донор-
ного и акцепторного фрагментов соотношения, предсказанные Ледером,
выполняются [29—32]. Однако уже при пентануклеотидных субстратах
аминоацильный фрагмент CACCA-Phe имеет одинаковое сродство с
пептидильным фрагментом CACCA-Phe-<-Ac к Р-сайту пептидилтранс-
феразного центра [33]. Сравнивая же абсолютные величины констант
ассоциации З'-концевых фрагментов тРНК [30, 32] с измеренными на-
ми величинами для интактных молекул тРНК (рис. 9), приходим к
следующим выводам: 1) З'-концевые остатки вносят незначительный
вклад в свободную энергию взаимодействия тРНК — рибосома, и обу-
словлено это, очевидно, тем, что основной вклад в это взаимодействие
вносит не 50S субчастица, несущая пептидилтрансферазный центр, а
30S субчастица [34]; 2) взаимодействующая система тРНК — рибосо-
ма устроена так, что все три биологические формы тРНК имеют более
высокое сродство к Р-, чем к Α-сайту, и это, вероятно, термодинами-
чески обеспечивает однонаправленность процесса транслокации. Не-
обычный порядок сродства различных форм тРНК к Р-сайту (см. вы-
ше) обусловлен, возможно, различием в конформациях этих тРНК. По
крайней мере, различные количества ионов магния, принимающих уча-
стие во взаимодействии пептидил-, аминоацил- и деацилированной
тРНК с Р- и Α-сайтами, являются значительным аргументом в пользу
этого предположения.
Т р а н с л о к а ц и я и Ε - с а й т . Чрезвычайно низкий уровень
свободной энергии деацилированной тРНК на Р-сайте (рис. 3—5) мо-
жет явиться препятствием для диффузионного механизма транслока-
ции. Действительно, экстраполируя данные на рис. 4 в область низких
значений Mg2+, находим, что даже при концентрации Mg2 + 2—3 мМ,
200 мМ NH4+ И 25 °С (т. е. при условиях, достаточно близких in vivo),
величина /(*p~106 М - 1 . Сопоставляя эту величину с концентрацией
рибосом (Ю - 5 М) и стационарной концентрацией деацилированной
тРНК (Ю~4 М) in vivo [35], приходим к выводу, что деацилированная
тРНК не может спонтанно диссоциировать из Р-сайта, и необходим
какой-то дополнительный механизм для ее выхода в раствор.
Такой механизм, заключающийся в том, что выходным является
не Р-, а Ε-сайт, был впервые предложен Нолем для рибосом из эука-
риот [36] и затем детализирован и в определенной мере эксперимен-
тально подтвержден для рибосом из Е. coli в работе группы Нирхауса
[37]. Действительно, если соотношение Ю3 ([17] и эта ра-
бота) верно и для условий in vivo, то константа ассоциации деацили-
рованной тРНК с Ε-сайтом в этих условиях равна ~ 103—104 М - 1 .
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 4 4 — 5-250 191
В сочетании с высокими скоростями ассоциации — диссоциации деаци-
лированной тРНК в Е-сайте [15] это значит, что спонтанная диссо-
циация тРНК из Ε-сайта термодинамически и кинетически разрешена.
Поскольку кодон-антикодоновое взаимодействие тРНК на Е-сайте,
по данным Граевской с соавт. [15] и нашим [17], отсутствует, а от-
ношение K р /Kt Е ~10 3 , мы предлагаем следующий механизм перехода
деацилированной тРНК из Р- в Ε-сайт. Этот переход сопровождается
повышением свободной энергии тРНК на Р-сайте на 4—5 ккал/моль
и разрывом кодон-антикодонового взаимодействия, энергия которого
примерно и составляет на Р-сайте такую величину [34]. Роль сопря-
женной реакции, необходимой для такого повышения свободной энер-
гии, могут играть реакция транспептіидации и/иліи связывания EF-
G-GTP и EF-G-зависимый гидролиз GTP.
QUANTITATIVE STUDY OF INTERACTION OF DEACYLATED tRNA
WITH THE P, A AND Ε SITES OF ESCHERICHIA COLI RIBOSOMES
Yu. P. Semenkov, Ε. M. Makarov, S. V. Kirillov
Β. Ρ Konstantinov Nuclear Physics Institute,
the Academy of Sciences of the USSR, Gatchina, Leningrad District
S u m m a r y
The association constants of deacylated tRNA P h e for the Ρ site of 70S ribosomes were
measured in the presence and absence of poly(U), and at different Μ g 2 + concentrations
and temperatures. The numbers of Mg2+ ions involved in this interaction were determi-
ned: 4.4+0.3 ( + p o l y ( U ) and 2.7±0.3 (—poly(U). The association constant of tRNA P h e
for the A site was found to be δ-ΙΟ-'Μ-1, much lower than that for the Ρ site (2 ·10 9 Μ _ 1 ) ,
at 15 mM Mg2+, 200 mM NH4+ and 25 °С. The independence of the Ε-site binding of
tRNA P h e on the messenger RNA was confirmed under these medium conditions. Based
on the data obtained the affinity orders of aminoacyl-, peptidyl-tRNA and deacylated
tRNA for the P, A and Ε sites are determined, and a possible mechanism of involvement
of the Ε site in the translocation process is discussed.
1. Rheinberger H. J., Nierhaus К. H. Simultaneous binding of three tRNA molecules by
the ribosome of Escherichia coli.— Biochem. Int., 1980, 1, N 4, p. 297—303.
2. Schrier Μ. N., Noll H. Conformational changes in ribosomes during protein synthe-
sis .—Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1971, 68, N 2, p. 805—809.
3. Leder P. The elongation reaction in protein synthesis.— Adv. Protein Chem., 1973,
27, p. 213—242.
4. The /K7?/idi//-substituent within peptidyl-tRNA increases the stability of tRNA—mRNA
association / K. Hohlshuh, D. Schnerwitzki, M. Schmitt, H. G. Gassen.— FEBS Lett.,
1982, 142, N 1, p. 125—128.
5. Peters M., Yarus M. Transfer RNA selection at the ribosomal A- and P-sites.— J. Мої.
Biol., 1979, 134, N 3, p. 471—491.
6. Rheinberger H. /., Sternbach Я., Nierhaus К. H. Three tRNA binding sites on Esche-
richia coli r ibosomes.—Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1981, 78, N 9, p. 5310—5314.
7. Cantor C. R., Fairclough К• Η. Fluorescence studies of the binding of yeast tRNAP h ( !
derivative to Escherichia coli ribosomes.— J. Мої. Biol., 1979, 132, N 4, p. 557—573.
8. Kirillov S. V., Makhno V. /., Semenkov Yu. P. Mechanism of codon-anticodon interac-
tion in ribosomes. Direct functional evidence that isolated 30S subunits contain two
codon-specific binding sites for transfer RNA.— Nucl. Acids Res., 1980, 8, N 1,
p. 183 — 196.
9. Кириллов С. В., Махно В. Я., Семенков 10. Я. Влияние молекулярного веса по-
лижи) и присутствия рибосомного белка SI на стабильность комплекса тРНК с
малой субчастицей рибосом.—Докл. АН СССР, 1976, 229, № 2, с. 488—491.
10. Zubay Q. The isolation and fractionation of soluble ribonucleic acid.— J. Мої. Biol.,
1962, 4, N 3, p. 347—356.
11. Семенков Ю. П., Махно В. Я., Кириллов С. В. Выделение и изучение некоторых
свойств высокоактивных 30S и 50S субчастиц рибосом Escherichia coli.— Молеку-
ляр. биология, 1976, 10, № 4, с. 754—763.
.12. Quantitative study of the interaction of aminoacyl-tRNA with the A site of Escheri-
chia coli ribosomes. Equilibrium and kinetic parameters of binding in the absence of
EF-Tu and GTP / K. Sh. Kemkhadze, V. B. Odintsov, Yu. P. Semenkov, S. V. Kiril-
lov .—FEBS Lett., 1981, 125, N 1, p. 10—14.
13. Separation of t ransfer ribonucleic acid by sepharose chromatography using reverse
salt g r a d i e n t s / W . M. Holmes, R. E. Hurd, B. R. Reid et a l .—Proc. Nat. Acad. Sci.
USA, 1975, 72, N 4, p. 1068 -1071 .
192 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 4 4 — 5-250 192
14. Rappaport S., Lapidot Y. The chemical preparation of acetylaminoacyl-tRNA.— Meth.
Enzymol., 1974, 24, part E, p. 685—693.
15. Grajevskaja R. Α., Ivanov Yu. V., Saminsky Ε. Μ. 70S ribosomes of Escherichia coli
have an additional site for deacylated tRNA binding.—Eur. J. Biochem., 1982, 128,
N 1, p. 47—52.
16. Gillam I. C., Tener G. M. The use of BD-cellulose in separating transfer RNA's.—
Meth. Enzymol., 1971, 20, part C, p. 55—70.
17. Kirillov S. V., Makarov Ε. M., Semenkov Yu. P. Quantitative study of interaction
of deacylated tRNA with Escherichia coli ribosomes. Role of 50S subunits in forma-
tion of the Ε s i te .—FEBS Lett., 1983, 157, N 1, p. 91—94.
18. Rheinberger H. /., Schilling S., Nierhaus К. H. The ribosomal elongation cycle: tRNA
binding, translocation and tRNA release.—Eur. J. Biochem., 1983, 134, N 4, p. 421 —
428.
19. Kirillov S. V., Semenkov Yu. P. Non-exclusion principle of Ac-Phe-tRNAP h e interac-
tion with the donor and acceptor sites of Escherichia coli ribosomes.— FEBS Lett.,
1982, 148, N 2, p. 235—238.
20. The mechanism of codon-anticodon interaction in ribosomes. Heterogeneity of tRNA
complexes with 70S ribosomes of Escherichia coli / S. V. Kirillov, V. I. Makhno,
V. B. Odinzov, Yu. P. Semenkov.—Eur. J. Biochem., 1978, 89, N 3, p. 305—313.
21. Gefter M. L., Russel R. L. Role of modification in tyrosine transfer RNA: a modified
base affecting ribosome binding.— J. Мої. Biol., 1969, 39, N 1, p. 145—157.
22. Noll M., Noll H. Structural dynamics of bacterial ribosomes. V. Magnesium-depen-
dent dissociation of tight couples into subunits: measurements of dissociation con-
stants and exchange rates.—Ibid., 1976, 105, N 1, p. 111 — 130.
23. Watanabe S. Interaction of siomycin with the acceptor site of Escherichia coli ribo-
somes.— Ibid., 1972, 67, N 3, p. 443—457.
24. Wurmbach P., Nierhaus К. Η. Codon-anticodon interaction at the ribosomal Ρ (pepti-
dyl-tRNA) si te.—Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1979, 76, N 5, p. 2143—2147.
25. Механизм кодон-антикодонового взаимодействия в рибосомах. Взаимодействие
аминоацил-тРНК с 70S рибосомами Escherichia coli в отсутствие фактора элонга-
ции EF-Tu и GTP / К. Ш. Кемхадзе, В. Б. Одинцов, В. И. Махно и др.— Молеку-
ляр. биология, 1981, 15, № 4, с. 779—789.
26. Mechanism of codon-anticodon interaction in ribosomes. Codon-anticodon interaction
of aminoacyl-tRNA at the ribosomal donor s i t e / S . V. Kirillov, K. Sh. Kemkhadze,
Ε. M. Makarov et a l .—FEBS Lett., 1980, 120, N 2, p. 221—224.
27. Kinetic aspects of tetracycline action on the acceptor (A) site of Escherichia coli
ribosomes / Yu. P. Semenkov, Ε. M. Makarov, V. I. Makhno, S. V. Kirillov.— Ibid.,
1982, 144, N 1, p. 125—129.
28. Holschuh K., Riesner D., Gassen H. G. Steps of mRNA translocation in protein bio-
synthesis .—Nature, 1981, 293, N 5834, p. 675—677.
29. Harris R., Pestka S. Studies on the formation of transfer ribonucleic acid—ribosome
complexes. XXIV. Effect of antibiotics on binding of aminoacyl-oligonucleotides to
ribosomes — J . Biol. Chem., 1973, 248, N 4, p. 1168—1174.
30. Effect of puromycin analogs and other agents on peptidyl-puromycin synthesis on
polyribosomes / S. Pestka, R. Vince, S. Daluge, R. Harris.— Antimicrob. Agents and
Chemother., 1973, 4, p. 37—43.
31. The donor site of the peptidyltransferase center of ribosomes. Equilibrium association
constants of model substrates and inhibitors / M. Kukhanova, S. Streltsov, L. Victo-
rova et al — F E B S Lett., 1979, 102, N 1, p. 198—203.
32. Krayevsky Α. Α., Kukhanova Μ. K. The peptidyltransferase center of ribosomes.—
Progr. Nucl. Acids Res. and Мої. Biol., 1979, 23, p. 1—51.
33. Bourd S., Victorova L. S., Kukhanova Μ. K. On substrate specificity of the donor
site of the Escherichia coli ribosomal peptidyltransferase center.— FEBS Lett., 1982,
142, N 1, p. 96—100.
34. Кириллов С. В. Механизм кодон-антикодонового взаимодействия в рибосомах.—
В кн.: Итоги науки и техники. М. : ВИНИТИ, 1983, с. 5—98. (Сер. Биол. химия;
Т. 18).
35. Gouy ΜGrantham R. Polypeptide elongation and tRNA cycling in Escherichia coli:
a dynamic approach.—FEBS Lett., 1980, 115, N 1, p. 151 — 155.
36. Noll H. Chain initiation and control of protein synthesis.— Science, 1966, 151,
N 3715, p. 1241 — 1245.
37. Rheinberger H. /., Nierhaus Κ Η. Testing an alternative model for the ribosomal
peptide elongation cycle.—Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1983, 80, N 14, p. 4213—4217.
38. Nirenberg M., Leder P. RNA codewords and protein synthesis. The effect of trinu-
cleotides upon the binding of sRNA to ribosomes —Science, 1964, 145, N 3639,
p. 1399—1407.
Ленинград, ин-т ядерной физики Получено 15.01.85
им. Б. П. Константинова АН СССР, Гатчина
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 4 4 — 5-250 193
|