Синтез на однонитевой кольцевой ДНК фага М13, направляемый ДНК-полимеразой вируса ядерного полиэдроза тутового шелкопряда
Из куколок тутового шелкопряда Bombух mori, инфицированных вирусом ядерного полиэдроза (ВЯП), выделена вирусспецифичная ДНК-полимераза (ВЯП-полимераза), ВЯП-полимераза представляет собой полипептид с молекулярной массой 136 000 и коэффициентом седиментации 6,3 S. Фермент предпочитает в качестве матр...
Gespeichert in:
| Veröffentlicht in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Datum: | 1985 |
| Hauptverfasser: | , , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1985
|
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152405 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Синтез на однонитевой кольцевой ДНК фага М13, направляемый ДНК-полимеразой вируса ядерного полиэдроза тутового шелкопряда / Д.О. Атаева, К.А. Марлыев, П.К. Куллыев, В.С. Михайлов // Биополимеры и клетка. — 1985. — Т. 1, № 5. — С. 234-241. — Бібліогр.: 11 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-152405 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Атаева, Д.О. Марлыев, К.А. Куллыев, П.К. Михайлов, В.С. 2019-06-11T10:41:29Z 2019-06-11T10:41:29Z 1985 Синтез на однонитевой кольцевой ДНК фага М13, направляемый ДНК-полимеразой вируса ядерного полиэдроза тутового шелкопряда / Д.О. Атаева, К.А. Марлыев, П.К. Куллыев, В.С. Михайлов // Биополимеры и клетка. — 1985. — Т. 1, № 5. — С. 234-241. — Бібліогр.: 11 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.000188 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152405 577.159 Из куколок тутового шелкопряда Bombух mori, инфицированных вирусом ядерного полиэдроза (ВЯП), выделена вирусспецифичная ДНК-полимераза (ВЯП-полимераза), ВЯП-полимераза представляет собой полипептид с молекулярной массой 136 000 и коэффициентом седиментации 6,3 S. Фермент предпочитает в качестве матрицы poly(dA) с затравкой (dT)₁₀ и не активен при использовании poly (А). Частично очищенная ВЯП-полимераза активна на однонитевой кольцевой ДНК фага М13 в отсутствие затравки. Способность к синтезу на ДНК М13 обусловлена присутствием в препаратах ВЯП-полимеразы Mg²⁺-зависимой эндонуклеазы, специфичной в отношении двунитевых участков ДНК. Эндонуклеаза присутствует в препаратах ВЯП-полимеразы после фракционирования экстракта инфицированных куколок сульфатом аммония, хроматографии на фосфоцеллюлозе и оксиапатите, но может быть отделена от ВЯП-полимеразы при ультрацентрифугировании в градиенте глицерина в присутствии 200 мМ фосфата калия. При снижении концентрации соли ВЯП-полимераза и эндонуклеаза проявляют тенденцию к агрегации. З лялечок шовковичного шовкопряда Bombух mori, інфікованих вірусом ядерного поліедрозу (ВЯП), виділено вірусоспеціфічну ДНК-полімеразу (ВЯП-полімеразу), ВЯП-полімераза представляє собою поліпептид з молекулярною масою 136 000 і коефіцієнтом седиментації 6,3 S. Фермент надає перевагу як матриці poly (dA) із затравкою (dT)₁₀ і не активний при використанні poly (А). Частково очищена ВЯП-полімераза активна на однонитчастій кільцевій ДНК фага М13 за відсутності затравки. Здатність до синтезу на ДНК М13 обумовлена присутністю в препаратах ВЯП-полімерази Mg²⁺-залежної ендонуклеази, специфічної щодо двунитчастих ділянок ДНК. Ендонуклеаза присутня в препаратах ВЯП-полімерази після фракціонування екстракту інфікованих лялечок сульфатом амонію, хроматографії на фосфоцелюлозі і оксиапатиті, але може бути відокремлена від ВЯП-полімерази при ультрацентрифугуванні в градієнті концентрації гліцерину за присутності 200 мМ фосфату калію. При зниженні концентрації солі ВЯП-полімераза і ендонуклеаза виявляють тенденцію до агрегації. A virus-induced DNA polymerase (B. m. NPV polymerase) was purified from the silkworm Bombyx mori pupae infected with nuclear polyhedrosis virus (B. m. NPV). NPV polymerase is a polypeptide with a molecular weight of 136 kDa and a sedimentation coefficient of 6.3 S. As a template, B. m. NPV polymerase prefers polydeoxynucleotide poly(dA) with a primer (dT)₁₀ and is inactive when using poly(A). Partially purified B. m. NPV polymerase is active on the single-standed circular phage M13 DNA in the absence of a primer. The ability to utilize phage M13 DNA as a template is due to the presence of a Mg²⁺-dependent endonuclease specific to double-stranded DNA in the preparations of B. m. NPV polymerase. The endonuclease exists in the B. m. NPV polymerase preparations after ammonium sulphate fractionation, phosphocellulose and hydroxyapatite chromatography but may be separated from B. m. NPV polymerase by glycerol gradient ultracentrifugation in the presence of 200 rnM potassium phosphate. At the lower salt concentrations B. m. NPV polymerase and the endonuclease reveal a tendency to aggregation. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Обзоры Синтез на однонитевой кольцевой ДНК фага М13, направляемый ДНК-полимеразой вируса ядерного полиэдроза тутового шелкопряда Синтез на однонитковій кільцевій ДНК фага М13, який спрямовується ДНК-полімеразою вірусу ядерного поліедрозу тутового шовкопряда Synthesis on single-stranded circular phage M13 DNA by DNA polymerase of nuclear silkworm polyhedrosis virus Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Синтез на однонитевой кольцевой ДНК фага М13, направляемый ДНК-полимеразой вируса ядерного полиэдроза тутового шелкопряда |
| spellingShingle |
Синтез на однонитевой кольцевой ДНК фага М13, направляемый ДНК-полимеразой вируса ядерного полиэдроза тутового шелкопряда Атаева, Д.О. Марлыев, К.А. Куллыев, П.К. Михайлов, В.С. Обзоры |
| title_short |
Синтез на однонитевой кольцевой ДНК фага М13, направляемый ДНК-полимеразой вируса ядерного полиэдроза тутового шелкопряда |
| title_full |
Синтез на однонитевой кольцевой ДНК фага М13, направляемый ДНК-полимеразой вируса ядерного полиэдроза тутового шелкопряда |
| title_fullStr |
Синтез на однонитевой кольцевой ДНК фага М13, направляемый ДНК-полимеразой вируса ядерного полиэдроза тутового шелкопряда |
| title_full_unstemmed |
Синтез на однонитевой кольцевой ДНК фага М13, направляемый ДНК-полимеразой вируса ядерного полиэдроза тутового шелкопряда |
| title_sort |
синтез на однонитевой кольцевой днк фага м13, направляемый днк-полимеразой вируса ядерного полиэдроза тутового шелкопряда |
| author |
Атаева, Д.О. Марлыев, К.А. Куллыев, П.К. Михайлов, В.С. |
| author_facet |
Атаева, Д.О. Марлыев, К.А. Куллыев, П.К. Михайлов, В.С. |
| topic |
Обзоры |
| topic_facet |
Обзоры |
| publishDate |
1985 |
| language |
Russian |
| container_title |
Биополимеры и клетка |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Синтез на однонитковій кільцевій ДНК фага М13, який спрямовується ДНК-полімеразою вірусу ядерного поліедрозу тутового шовкопряда Synthesis on single-stranded circular phage M13 DNA by DNA polymerase of nuclear silkworm polyhedrosis virus |
| description |
Из куколок тутового шелкопряда Bombух mori, инфицированных вирусом ядерного полиэдроза (ВЯП), выделена вирусспецифичная ДНК-полимераза (ВЯП-полимераза), ВЯП-полимераза представляет собой полипептид с молекулярной массой 136 000 и коэффициентом седиментации 6,3 S. Фермент предпочитает в качестве матрицы poly(dA) с затравкой (dT)₁₀ и не активен при использовании poly (А). Частично очищенная ВЯП-полимераза активна на однонитевой кольцевой ДНК фага М13 в отсутствие затравки. Способность к синтезу на ДНК М13 обусловлена присутствием в препаратах ВЯП-полимеразы Mg²⁺-зависимой эндонуклеазы, специфичной в отношении двунитевых участков ДНК. Эндонуклеаза присутствует в препаратах ВЯП-полимеразы после фракционирования экстракта инфицированных куколок сульфатом аммония, хроматографии на фосфоцеллюлозе и оксиапатите, но может быть отделена от ВЯП-полимеразы при ультрацентрифугировании в градиенте глицерина в присутствии 200 мМ фосфата калия. При снижении концентрации соли ВЯП-полимераза и эндонуклеаза проявляют тенденцию к агрегации.
З лялечок шовковичного шовкопряда Bombух mori, інфікованих вірусом ядерного поліедрозу (ВЯП), виділено вірусоспеціфічну ДНК-полімеразу (ВЯП-полімеразу), ВЯП-полімераза представляє собою поліпептид з молекулярною масою 136 000 і коефіцієнтом седиментації 6,3 S. Фермент надає перевагу як матриці poly (dA) із затравкою (dT)₁₀ і не активний при використанні poly (А). Частково очищена ВЯП-полімераза активна на однонитчастій кільцевій ДНК фага М13 за відсутності затравки. Здатність до синтезу на ДНК М13 обумовлена присутністю в препаратах ВЯП-полімерази Mg²⁺-залежної ендонуклеази, специфічної щодо двунитчастих ділянок ДНК. Ендонуклеаза присутня в препаратах ВЯП-полімерази після фракціонування екстракту інфікованих лялечок сульфатом амонію, хроматографії на фосфоцелюлозі і оксиапатиті, але може бути відокремлена від ВЯП-полімерази при ультрацентрифугуванні в градієнті концентрації гліцерину за присутності 200 мМ фосфату калію. При зниженні концентрації солі ВЯП-полімераза і ендонуклеаза виявляють тенденцію до агрегації.
A virus-induced DNA polymerase (B. m. NPV polymerase) was purified from the silkworm Bombyx mori pupae infected with nuclear polyhedrosis virus (B. m. NPV). NPV polymerase is a polypeptide with a molecular weight of 136 kDa and a sedimentation coefficient of 6.3 S. As a template, B. m. NPV polymerase prefers polydeoxynucleotide poly(dA) with a primer (dT)₁₀ and is inactive when using poly(A). Partially purified B. m. NPV polymerase is active on the single-standed circular phage M13 DNA in the absence of a primer. The ability to utilize phage M13 DNA as a template is due to the presence of a Mg²⁺-dependent endonuclease specific to double-stranded DNA in the preparations of B. m. NPV polymerase. The endonuclease exists in the B. m. NPV polymerase preparations after ammonium sulphate fractionation, phosphocellulose and hydroxyapatite chromatography but may be separated from B. m. NPV polymerase by glycerol gradient ultracentrifugation in the presence of 200 rnM potassium phosphate. At the lower salt concentrations B. m. NPV polymerase and the endonuclease reveal a tendency to aggregation.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152405 |
| citation_txt |
Синтез на однонитевой кольцевой ДНК фага М13, направляемый ДНК-полимеразой вируса ядерного полиэдроза тутового шелкопряда / Д.О. Атаева, К.А. Марлыев, П.К. Куллыев, В.С. Михайлов // Биополимеры и клетка. — 1985. — Т. 1, № 5. — С. 234-241. — Бібліогр.: 11 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT ataevado sinteznaodnonitevoikolʹcevoidnkfagam13napravlâemyidnkpolimerazoivirusaâdernogopoliédrozatutovogošelkoprâda AT marlyevka sinteznaodnonitevoikolʹcevoidnkfagam13napravlâemyidnkpolimerazoivirusaâdernogopoliédrozatutovogošelkoprâda AT kullyevpk sinteznaodnonitevoikolʹcevoidnkfagam13napravlâemyidnkpolimerazoivirusaâdernogopoliédrozatutovogošelkoprâda AT mihailovvs sinteznaodnonitevoikolʹcevoidnkfagam13napravlâemyidnkpolimerazoivirusaâdernogopoliédrozatutovogošelkoprâda AT ataevado sinteznaodnonitkovíikílʹcevíidnkfagam13âkiisprâmovuêtʹsâdnkpolímerazoûvírusuâdernogopolíedrozututovogošovkoprâda AT marlyevka sinteznaodnonitkovíikílʹcevíidnkfagam13âkiisprâmovuêtʹsâdnkpolímerazoûvírusuâdernogopolíedrozututovogošovkoprâda AT kullyevpk sinteznaodnonitkovíikílʹcevíidnkfagam13âkiisprâmovuêtʹsâdnkpolímerazoûvírusuâdernogopolíedrozututovogošovkoprâda AT mihailovvs sinteznaodnonitkovíikílʹcevíidnkfagam13âkiisprâmovuêtʹsâdnkpolímerazoûvírusuâdernogopolíedrozututovogošovkoprâda AT ataevado synthesisonsinglestrandedcircularphagem13dnabydnapolymeraseofnuclearsilkwormpolyhedrosisvirus AT marlyevka synthesisonsinglestrandedcircularphagem13dnabydnapolymeraseofnuclearsilkwormpolyhedrosisvirus AT kullyevpk synthesisonsinglestrandedcircularphagem13dnabydnapolymeraseofnuclearsilkwormpolyhedrosisvirus AT mihailovvs synthesisonsinglestrandedcircularphagem13dnabydnapolymeraseofnuclearsilkwormpolyhedrosisvirus |
| first_indexed |
2025-11-25T21:08:29Z |
| last_indexed |
2025-11-25T21:08:29Z |
| _version_ |
1850551268925243392 |
| fulltext |
УДК 577.159
СИНТЕЗ НА ОДНОНИТЕВОЙ КОЛЬЦЕВОЙ ДНК ΦΑΓΑ Μ13,
НАПРАВЛЯЕМЫЙ ДНК-ПОЛИМЕРАЗОЙ ВИРУСА
ЯДЕРНОГО ПОЛИЭДРОЗА ТУТОВОГО ШЕЛКОПРЯДА
Д. О. Атаева, К. А. Марлыев, П. К. Куллыев, В. С. Михайлов
Введение. Инфекция клеток насекомых вирусом ядерного полиэдроза
(ВЯП) приводит к появлению в инфицированных клетках вирусспеци-
фичной ДНК-полимеразы [1, 2]. Этот фермент отличается от клеточных
ДНК-полимераз α, β, γ по физико-химическим и энзиматическим свойст-
вам и предположительно кодируется вирусным геномом. Используя
специфическое мечение белков вируса после ВЯП-инфекции клеток
Spodoptera frugiperda, Ванг и Келли [2] показали, что вирусная ДНК-
полимераза является полипептидом с молекулярной массой 126 000.
Получить в очищенном виде этот фермент и изучить его энзиматиче-
ские свойства авторам не удалось. Ранее нами было показано, что
после ВЯП-инфекции в куколках тутового шелкопряда возрастает ак-
тивность хозяйской α-полимеразы и появляется вирусспецифичная
ВЯП-полимераза. Необычным свойством ВЯП-полимеразы была высо-
кая активность на однонитевой ДНК фага М13 в отсутствие затравки.
В настоящей работе мы провели очистку ВЯП-полимеразы из инфици-
рованных куколок тутового шелкопряда, описали матричные свойства
фермента и механизм утилизации ВЯП-полимеразой Д Н К фага М13.
Материалы и методы. Однонитевую Д Н К фага М13 и Д Н К плазмиды pBR322
получали по описанным методам [3, 4]. Вирус ядерного полиэдроза получали и кукол-
ки тутового шелкопряда инфицировали, как описано ранее [5]. Суспензию ВЯП инъе-
цировали в куколки на 3-й день метаморфоза. Инфицированные куколки инкубировали
при 25 °С в течение 72 ч и собирали на жидком азоте. Процедура очистки ВЯП-поли-
меразы включала получение гомогената, супернатанта, фракционирование сульфатом
аммония, хроматографию на фосфоцеллюлозе, оксиапатите и ультрацентрифугирование
в градиенте глицерина (табл. 1). Экспериментальные детали выделения фермента будут
описаны в отдельном сообщении. Препарат ВЯП-полимеразы хранили при —20 °С в
буферном растворе А: 10 мМ фосфат калия, рН 7,5, 50 %-ный глицерин, 0,1 мМ ЭДТА,
5 мМ 2-меркаптоэтанол.
Т а б л и ц а I
Выделение ВЯП-полимеразы из куколок тутового шелкопряда, инфицированных ВЯП
Purification of В. т. NPV-polymerase from silkworm pupae infected with NPV
№ стадии Стадия Белок, мг
ДНК-полиме-
разная актив-
ность, ед.**
Удельная
активность,
ед./мг
Коэффициент
очистки
1 Гомогенат* 20900 4670 0,223
2 Супернатант 7780 5390 0 ,693 3 ,1
3 (Ш 4 ) 2 80 4 -фракция 911 2520 2,76 12,4
4 Фосфоцеллюлоза 14,5 510 35,3 158
5 Оксиапатит 3,4 390 116 522
6 Градиент глицерина 0 ,2 91 471 2110
* Количество исходного материала составляло 46 куколок. ** Единицу активности оп-
ределяли как включение 1 нмоля dNMP в ДНК за 30 мин.
Активность ВЯП-полимеразы определяли в реакционной смеси следующего со-
става: 100 мМ фосфат калия, рН 7,5, 10 мМ MgCU, 200 мкг/мл бычьего сывороточного
альбумина (БСА), 2 мМ дитиотрейтол, dATP, dCTP, dGTP — 25 мкМ каждый, 10 мкМ
[3Н] TTP с удельной активностью 20 мкКи/мл. В качестве матрицы использовали Д Н К
тимуса теленка, активированную ДНКазой I (125 мкг/мл), или Д Н К фага М13
(10 мкг/мл). Препарат ВЯП-полимеразы в буфере А добавляли до 1/5 конечного объе-
ма реакции 50 мкл. После инкубации при 37 °С в течение 30 мин реакцию останавливали
и кислотонерастворимую радиоактивность определяли, как описано ранее [6]. Единицу
234 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 5 3-5-422 234
активности определяли как включение 1 нмоля dNMP в Д Н К за 30 мин инкубации.
Для седиментадионного или электрофоретического анализа новообразованной Д Н К
реакцию останавливали добавлением ЭДТА до концентрации 20 мМ и DS-Na — до 1 %.
ДНК собирали после гель-фильтрации на биогеле А-1,5 т и осаждали этанолом.
Щелочные градиенты сахарозы (5—20 %) готовили на буфере: 0,3 н. NaOH,
0,7 Μ NaCl, 5 мМ ЭДТА. Препараты центрифугировали в роторе SW 50.1 в течение 6 ч
при 47 000 об/мин и 10 °С. Горизонтальный электрофорез Д Н К проводили в геле
1 %-ной агарозы размером 12X8X0,5 см в буфере: 40 мМ трис-ацетат, рН 8,0, 20 мМ
ацетат натрия, 1 мМ ЭДТА. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присут-
ствии DS-Na проводили по методу Лэммли [7] в плоском геле размером 14Х12Х
Х0,14 см. Концентрирующий гель содержал 4 % акриламида, разделяющий — градиент
5—20% или 5—15% акриламида. Гель окрашивали серебром [8]. Ультрацентрифуги-
рование ВЯП-полимеразы в градиенте глицерина (10—30 %) проводили, как описано
ранее для ДНК-полимеразы α из икры вьюна [9].
Результаты и обсуждение. Способность ВЯП-полимеразы к синте-
зу на Д Н К фага М13 позволила отделить активность вирусной ДНК-
полимеразы от активности клеточных ДНК-полимераз в неочищенных
экстрактах инфицированных куколок и разработать эффективный метод
очистки вирусного фермента. В табл. 1 представлен способ получения
частично очищенной ВЯП-полимеразы из инфицированных куколок ту-
тового шелкопряда. Фракционирование экстракта куколок сульфатом
аммония позволило получить две фракции, одна из которых обогащена
клеточной α-полимеразой, а другая — ВЯП-полимеразой. Полное раз-
деление этих ферментов было достигнуто при хроматографии на фосфо-
целлюлозе. ДНК-полимераза а элюируется с ионообменника при кон-
центрации КС1 0,3 М, тогда как ВЯП-полимераза — при 0,44 М. После
хроматографии на оксиапатите и ультрацентрифугирования в градиен-
те глицерина был получен препарат ВЯП-полимеразы, очищенный
примерно в 2 000 раз. Электрофорез в полиакриламидном геле выявил
наличие в препарате ряда балластных белков. Идентификация ВЯП-по-
лимеразы как полипептида с молекулярной массой 136 000 была сдела-
на после дополнительной хроматографии препарата на гепарин-сефа-
розе, в результате которой может быть получен близкий к гомогенности
препарат фермента. После гепарин-сефарозы ВЯП-полимераза была
нестабильна и теряла 50% активности за 5 ч при 4 °С. Добавление
БСА до 100 мкг/мл предотвращало инактивацию фермента. В работе
анализировали частично очищенные препараты ВЯП-полимеразы после
стадии ультрацентрифугирования в градиенте глицерина (стадия 6,
табл. 1), которые были очищены в 2 100—4 800 раз и не теряли ак-
тивности в течение нескольких месяцев хранения при —20 °С.
Т а б л и ц а 2
Матричная специфичность ВЯП-полимеразы
Template specificity of В. m. NPV-polymerase
Матрица Концентрация,
мкг/мл
ДНК-полимераз-
ная активность,
пмоль dNMP
Нативная Д Н К 100 15,0
Денатурированная Д Н К 100 16,1
Активированная Д Н К 100 37,8
poly(A) 50 0,42
poly(A) -oligo(dT) 50-10 0 ,38
poly (dA) 50 1,0
poly(dA) -oligo(dT) 50-10 276
Д Н К фага M13 50 46,0
Д Н К плазмиды pBR322 20 20,3
В табл. 2 представлены матричные свойства ВЯП-полимеразы.
Фермент не использует в качестве матрицы poly (А), но обнаруживает
высокую активность при использовании poly(dA). В этом отношении
он напоминает ДНК-полимеразу, обнаруженную ранее в препаратах
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 5 3-5-422 2 3 5
ВЯП большой вощинной моли [10]. Активность на poly (dA) абсолютно
зависит от присутствия затравочного фрагмента oligo(dT). Синтез на
природных Д Н К является матричным процессом, поскольку удаление
из реакционной смеси любого из dNTP приводит к полному подавлению
синтеза. Константа Михаэлиса для dTTP при синтезе на активирован-
ной Д Н К равна 0,38 мкМ. К т для активированной Д Н К равна 8,2 мкМ
(2,7 мкг/мл). Обращает на себя внимание высокая активность ВЯП-по-
лимеразы на кольцевых Д Н К фага М13 и плазмиды pBR322, лишенных
Рис. 1. Кинетика синтеза Д И К ВЯП-полимеразой на активированной Д Н К (1) и на
Д Н К фага М13 (2).
Fig. 1. Kinetics of DNA synthesis by NPV polymerase on the activated DNA (1 ) and
phage M13 DNA (2) .
Рис. 2. Электрофорез в 1 %-ной агарозе Д Н К фага М13: 1 — без инкубации в реакци-
онной смеси; 2 — после инкубации в реакционной смеси с ВЯП-полимеразой в присут-
ствии 10 мкМ, 150 мкКи/мл [a- 3 2 P]dTTP; 3 — как 2, но после тепловой денатурации
(100°С, 5 мин); 4 — как 1, но после тепловой денатурации (100 °С, 5 мин); 1—4 —
окраска бромистым этидием; 2\ 3' — авторадиография дорожек 2, 3.
Fig. 2. Gel electrophoresis of phage M13 DNA in 1 % agarose 1-4 — ethidium bromide
staining: 1 — without incubation; 2 — after incubation in the reaction mixture with B. m.
NPV polymerase in the presence of [a- 3 2 P]dTTP; 3 — the same as 2 but after thermal
denaturation (100 °С, 5 min); 4 — the same as 1 but after thermal denaturation (100 °С,
5 min). 2\ 3' — autoradiographs of tracks 2, 3.
затравочных З'-ОН-концов. Km фермента для Д Н К М13 оказывается
ниже, чем для активированной ДНК, и составляет 2,3 мкМ (0,78 мкг /мл).
Способность к синтезу на Д Н К фага М13 может быть обусловлена
присутствием в препарате ВЯП-полимеразы ДНК-праймазной активно-
сти. Ранее комплекс ДНК-полимеразы α и ДНК-праймазы был выде-
лен нами из грены тутового шелкопряда [11]. Активность этого комплек-
са на Д Н К М13 абсолютно зависит от присутствия rNTP в реакцион-
ной смеси. Однако активность ВЯП-полимеразы на Д Н К М13 наблю-
дается в отсутствие rNTP и не стимулируется при добавлении rNTP в
реакционную смесь. Обработка смеси dNTP перед реакцией периода-
том натрия для удаления возможной примеси rNTP не снимает способ-
ности ВЯП-полимеразы инициировать синтез Д Н К фага М13. Эти дан-
ные свидетельствуют против инициирования синтеза на Д Н К М13 с
участием ДНК-праймазы.
На рис. 1 представлена кинетика включения метки ВЯП-полиме-
разой в активированную Д Н К и Д Н К фага М13. В отличие от синтеза
на активированной ДНК, протекающего с высокой скоростью с начала
инкубации при 37 °С, синтез на Д Н К М13 протекает с низкой скоростью
в течение первых 3—5 мин инкубации. Это свидетельствует о наличии
в полимеризующей реакции на Д Н К М13 lag-периода, в течение ко-
торого происходит активация системы.
2 3 6 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 5
Электрофоретический анализ в агарозе продукта синтеза на Д Н К
М13 (рис. 2) позволяет сделать следующие заключения: 1) в ходе
синтеза происходит увеличение молекулярной массы матричных моле-
кул; 2) после тепловой денатурации новосинтезированная Д Н К высво-
бождается из комплекса с матрицей и представлена гетерогенными по-
линуклеотидами; 3) в ходе синтеза не наблюдается существенной де-
градации Д Н К М13. Однако в условиях электрофореза не могут быть
разделены интактные молекулы Д Н К фага и молекулы, несущие один
разрыв.
Рис. 3. Ультрацентрифугирование новообразо-
ванной ВЯП-полимеразой Д Н К фага М13 в
щелочном 5—20%-ном градиенте сахарозы:
1 — 5 мин синтеза в присутствии 10 мкМ
[а- 3 2 Р]dTTP; 2 — как У+25 мин синтеза после,
добавления 1 мМ dTTP; 3 — 30 мин синтеза
в присутствии 10 мкМ [a- 3 2P]dTTP. Включе-
ние, равное 5984 (1), 4539 (2) и 121 409 (3)
имп/мин, принято за 100 %. Стрелкой указано
положение Д Н К фага М13 в градиенте.
Fig. 3. Alkaline sucrose gradient (5-20 %) ul-
t racentr i fugat ion of phage MJ3 DNA labelled
by B. m. NPV polymerase: / — 5 min of the
synthesis in the presence of 10 μΜ [a- 3 2P]dTTP,
2 — 5 min of the synthesis in the presence of
10 μΜ [a- 3 2P] dTTP followed by 25 min of
the synthesis after the addition of 1 mM dTTP,
3 — 30 min of the synthesis in the presence of 10 μΜ [a- 3 2 P]dTTP. Incorporations of
[a-3 2P] dTTP into DNA equal to 5984 (1), 4539 (2) and 121 409 (3) cpm are taken as
100 %· The arrow shows the position of phage M13 DNA.
При ультрацентрифугировании в щелочных градиентах сахарозы
новообразованная за 5 мин инкубации Д Н К представлена молекулами
длиной, примерно равной размеру Д Н К М13, и гетерогенными по раз-
меру фрагментами (рис. 3). Дополнительные 25 мин синтеза в условиях
100-кратного разбавления меченого предшественника ([a-32P]dTTP) не-
меченым аналогом (dTTP) приводят к увеличению фракции гетероген-
ных фрагментов. Эти данные указывают на присутствие в препарате
нуклеазной активности.
Наличие эндонуклеазной активности в препарате ВЯП-полимеразы
было выявлено после инкубации Д Н К плазмиды pBR322 и фага М13 в
реакционной смеси в присутствии фермента (рис. 4). Характерным
свойством эндонуклеазы является специфичность в отношении двуните-
вой ДНК- Переход ковалентно замкнутой Д Н К плазмиды pBR322 в ре-
лаксированную форму происходит со скоростью, примерно на порядок
большей, чем деградация Д Н К фага М13. Соответствующий расчет,
учитывающий размер молекул Д Н К фага и плазмиды, а также одно-
ударный механизм перехода из формы I в форму II для Д Н К pBR322
и двуударный механизм распада зоны интактных молекул Д Н К М13
показали, что однонитевые разрывы в двунитевой Д Н К возникают под
действием эндонуклеазы в 5,6 раза чаще, чем на той же длине (в нук-
леотидах) однонитевой ДНК. Полученную оценку специфичности эндо-
нуклеазы в отношении двунитевой Д Н К можно рассматривать как ми-
нимальную, поскольку природные однонитевые ДНК, в том числе Д Н К
М13, обладают несовершенной вторичной структурой и не являются
полностью однонитевыми. Эндонуклеаза является Мg2+-зависимым фер-
ментом и не активна при замене Mg2 + на Са2+ (рис. 5). При низкой
концентрации фосфата калия фермент вызывает появление двунитевых
разрывов в ДНК, а при концентрации фосфата выше 100 мМ в Д Н К
образуются однонитевые разрывы. Фосфат калия в концентрации вы-
ше 100 мМ ингибирует нуклеазу.
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 5 3 - 5 - 4 2 2 2 3 7
Эндонуклеаза может быть отделена от полимеразы при ультрацен-
трифугировании в градиенте глицерина (рис. 6). В присутствии 200 мМ
фосфата калия нуклеаза имеет седиментационный коэффициент око-
ло 3 S. Помимо ДНК-полимеразной активности на активированной
Д Н К во фракциях градиента обнаруживается активность на Д Н К М13.
Рис. 4. Электрофорез в 1 %-ной агарозе с 1 мкг/мл бромистого этидия Д Н К плазмиды
pBR322 и фага М13 после инкубации в реакционной смеси с ВЯП-полимеразой в тече-
ние 0 (1, 1'); 5 (2, 2')\ 15 (3, 3')\ 30 (4, 4') и 60 мин (5, 5'); Г—5' — после тепловой
денатурации (100°С, 5 мин); I, II, III— формы Д Н К плазмиды pBR322; Μ — положе-
ние Д Н К фага М13 в геле.
Fig. 4. Gel electrophoresis of plasmid pBR322 DNA and phage M13 DNA in 1 % agarose
with 1 μg/ml ethidium bromide after incubation in the reaction mixture with B. m. NPV
polymerase for 0 min (1, Ґ ) , 5 min (2, 2r), 15 min (3, 3'), 30 min (4, 4') and 60 min
(5, 5'). Iі-5і- the same as 1-5 but af ter thermal denaturation (100°С, 5 min). I, II, III—
forms of plasmid pBR322 DNA; Μ — the position of phage M13 DNA in gel.
Рис. 5. Электрофорез в 1 %-ной агарозе с 1 мкг/мл бромистого этидия Д Н К плазмиды
pBR322 после инкубации в реакционной смеси без фермента (1) и в присутствии ВЯП-
полимеразы (2—12) в условиях: концентрация MgCl2 равна 0 (2); 2 (3); 5 (4); 10 мМ
(5)\ без MgCl2 в присутствии СаС12 в концентрации 2 (6)\ 5 мМ (7); в присутствии
10 мМ MgCl2 при концентрации фосфата калия (рН 7,5), равной 0 (8); 50 (9)\ 100
(10)\ 150 (11); 200 мМ (12). I, II, / / / — ф о р м ы Д Н К pBR322.
Fig. 5. Gel electrophoresis of plasmid pBR322 DNA in 1 % agarose with 1 μg/ml ethi-
dium bromide af ter incubation in the reaction mixture without enzyme (1) and with
B. m. NPV polymerase (2-12) under the following conditions: MgCl2 concentration of
0 mM (2 ) , 2 mM (3) , 5 mM (4), 10 т М (5); without MgCl2 at CaCl2 concentration of
2 mM (6), 5 mM (7); with 10 mM MgCl2 at potassium phosphate (pH 7.5) concentration
of 0 mM (8), 50 mM (9), 100 mM (10), 150 mM (11), 200 mM (12). I, II, III — forms
of plasmid pBR322 DNA.
Распределение активности на Д Н К М13 по фракциям градиента сдви-
нуто относительно распределения полимеразной активности на активи-
рованной Д Н К в низкомолекулярную область градиента, т. е. в зону,
где седиментирует эндонуклеаза. Добавление материала из фракций,
содержащих нуклеазу, к фракциям, содержащим ВЯП-полимеразу,
приводит к увеличению полимеразной активности на Д Н К М13. Так,
в одном из опытов ДНК-полимеразные активности на Д Н К М13 в
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 5 3-5-422 238
Рис. 6. Повторное ультрацентрифугирование препарата ВЯП-полимеразы в 10—
30 % -ном градиенте глицерина в присутствии 200 (а) и 50 мМ (б) фосфата ка-
лия (рН 7,5). Представлены ДНК-полимеразные активности на Д Н К фага М13 (1),
активированной Д Н К (2), а также отношение указанных активностей (3). Электрофо-
реграммы представляют эндонуклеазную активность фракций, определенную на Д Н К
плазмиды pBR322. Стандарты: каталаза (11,3 S), альдолаза (8,3 S), БСА (4,3 S) .
Fig. 6. Second glycerol gradient (10-30%) ultracentrifugation of B. m. NPV po-
lymerase in the presence of 200 mM (a) and 50 mM (6) potassium phosphate (pH 7.5).
DNA polymerase activities on phage Μ13 DNA (1), activated DNA (2) and a ratio of
the activities (3) are shown. Electrophoregrams show the endonuclease activity in
the gradient fractions determined by means of plasmid pBR322 DNA. Standards: cata-
lase (11.3 S), aldolase (8.3 S), BSA (4.3 S) .
аликвотах no 5 мкл из фракций градиента, соответствующих ВЯП-по-
лимеразе в эндонуклеазе, а также их смеси были равны соответственно
10 800, 1 080 и 38 980 имп/мин. Снижение концентрации соли в градиен-
те с 200 до 50 мМ фосфата калия приводит к агрегации ДНК-полиме-
разной и эндонуклеазной активностей. Об этом свидетельствуют гете-
рогенные распределения ферментативных активностей в градиенте и
увеличение седиментационных коэффициентов.
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 5 3-5-422 2 3 9
Полученные данные позволяют предложить следующую схему син-
теза на Д Н К фага М13, осуществляемого частично очищенным препа-
ратом ВЯП-полимеразы. Активация системы обеспечивается актив-
ностью эндонуклеазы. Эндонуклеаза генерирует затравочные З'-ОН-кон-
цы в Д Н К М13, преимущественно в двунитевых участках, которые
могут являться матрицей для ВЯП-полимеразы. В ходе синтеза про-
исходит удлинение двунитевой области ДНК, что делает вовлеченные в
синтез молекулы Д Н К М13 избирательной мишенью для нуклеазы.
Последним обстоятельством объясняется появление гетерогенных по
размеру меченых фрагментов в условиях, когда основная масса моле-
кул Д Н К Μ13 в реакционной смеси не деградировала (рис. 2). Атаку-
емый нуклеазой двунитевый участок Д Н К М13 может являться «шпиль-
кой» или быть образованным двумя отстоящими друг от друга участ-
ками молекулы.
Природные однонитевые кольцевые Д Н К являются матрицей для
репликативных комплексов, содержащих ДНК-полимеразу и ДНК-пра-
ймазу. Подобный комплекс был выделен нами ранее из грены тутового
шелкопряда [11]. Его активность на Д Н К М13 инициируется образова-
нием короткой РНК-затравки. В настоящей работе описан другой ме-
ханизм инициации синтеза на Д Н К М13, который состоит в образова-
нии затравки специфической эндонуклеазной атакой двунитевого участ-
ка ДНК.
Авторы выражают признательность проф. И. Б. Збарскому за цен-
ные советы при выполнении настоящей работы.
SYNTHESIS ON SINGLE-STRANDED CIRCULAR PHAGE M13 DNA BY DNA
POLYMERASE OF NUCLEAR SILKWORM POLYHEDROSIS VIRUS
D. O. Ataeva, K. A. Marlyev, P. K. Kullyev, V. S. Mikhailov
Institute of Zoology, Academy of Sciences of the Turkmen SSR, Ashkhabad;
N. K. Koltzov Institute of Developmental Biology,
Academy of Sciences of the USSR, Moscow
S u m m a r y
A virus-induced DNA polymerase (B. m. NPV polymerase) was purified from the silk-
worm Botnbyx rnori pupae infected with nuclear polyhedrosis virus (B. m. NPV) . NPV
polymerase is a polypeptide with a molecular weight of 136 kDa and a sedimentation
coefficient of 6.3 S. As a template, B. m. NPV polymerase prefers polydeoxynucleotide
poly (d A) with a primer (dT)io and is inactive when using poly (A). Part ial ly purified
B. m. NPV polymerase is active on the single-standed circular phage M13 DNA in
the absence of a primer. The ability to utilize phage M13 DNA as a template is due to
the presence of a Mg2+-dependent endonuclease specific to double-stranded DNA in
the preparations of B. m. NPV polymerase. The endonuclease exists in the B. m. NPV
polymerase preparations after ammonium sulphate fractionation, phosphocellulose and
hydroxyapatite chromatography but may be separated from B. m. NPV polymerase by
glycerol gradient ul tracentr ifugation in the presence of 200 mM potassium phosphate.
At the lower salt concentrations B. m. NPV polymerase and the endonuclease reveal
a tendency to aggregation.
1 Miller L K., Jewell J. E., Browne D. Baculovirus induction of a DNA polymerase.—
' J. Virol., 1981, 40, N 1, p. 305—308.
2. Wang X., Kelly D. C. Baculovirus replication: purification and identification of
the Trich'oplusia ni nuclear polyhedrosis virus-induced DNA polymerase — J . Gen.
Virol., 1983, 64, N 10, p. 2229-2236.
3 Under N. D., Boeke J. D. The filamentous phage (Ff) as vectors for recombinant
' DNA — a review.—Gene, 1982, 19, N 1, p. 1 — 10.
4 Zasloff M. Ginder G., Felsenfeld G. A new method for the purification and identi-
fication of covalently-closed circular DNA molecules.—Nucl. Acids Res., 1978, 5,
5 The* писШс acid^of nuclear-polyhedrosis virus of the silkworm / K. Onodera, T. Ko-
' mano, M. Himeno, F. Sakai .—J. Мої. Biol., 1965, 13, N 2, p. 532—539.
2 4 0
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 5
6. Mikhailou V. S., Gulyamov D. B. Changes in DNA polymerase α, β, γ activities during
early development of the teleost fish Misgurnus fossilis (loach).— Eur. J. Biochem.,
1983, 135, N 2, p. 303—306.
7. Laemtnli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4.— Nature, 1970, 227, N 5259, p. 680—685.
8. Oakley B. R., Kirsch D. RMorris N. R. A simplified ultrasensitive silver stain for
detecting proteins in polyacrylamide gels.— Anal. Biochem., 1980, 105, N 2, p. 361—
363.
9. Михайлов В. С., Гулямов Д. Б. Выделение двух форм ДНК-пслимеразы α из икры
вьюна. Физико-химическая характеристика изоферментов.— Биохимия, 1983, 48,
№ 9, с. 1530—1537.
10. ДНК-полимеразная активность вируса ядерного полиэдроза большой вощинной мо-
л и / А . В. Рындич, Л. П. Сутугина, В. М. Кавсан и др.—Докл. АН УССР. Сер. Б,
1975, № 4, с. 347—349.
И . Выделение репликативного комплекса, содержащего ДНК-полимеразу α и ДНК-
праймазу, из грены тутового шелкопряда Bombyx mori/B. С. Михайлов, Д. О. Атае-
ва, К. А. Марлыев, ΓΙ. К- Куллыев.— Докл. АН СССР, 1984, 275, № 2, с. 502—505.
Ин-т зоологии ТССР, Ашхабад Получено 22.01.85
Ин-т биологии развития
им. Н. К. Кольцова АН СССР, Москва
УДК 577.213.32
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ
ДНК-ПОЛИМЕРАЗ α И β ИЗ ЭМБРИОНОВ МОРСКОГО ЕЖА
Л. Л. Терентьев, Н. А. Терентьева, В. А. Рассказов
Исследование биосинтеза Д Н К в клетках эукариот является одной из
центральных проблем молекулярной биологии. Согласно современным
представлениям синтез Д Н К осуществляется мультиферментным комп-
лексом, ключевую роль в котором играют ДНК-полимеразы. В клетках
эукариот обнаружены три типа ДНК-полимераз, которые в соответствии
со своими физико-химическими свойствами классифицированы как α, β
и у [1]. В яйцеклетках и эмбрионах морского ежа, как и в других эука-
риотических клетках, присутствует несколько отличающихся по свойст-
вам ДНК-полимераз [2, 3]. Впервые из клеток эмбрионов морского
ежа была выделена Лебом [4] высокомолекулярная ДНК-полимераза,
впоследствии классифицированная как ДНК-полимераза а . Сузуки-Хо-
ри и др. [5], а также Хобарт и Инфант [6] выделили ДНК-полимеразу,
напоминающую по своим свойствам ДНК-полимеразу β эукариот. Од-
нако сравнительный анализ свойств этих ферментов затруднен тем, что
эти ферменты выделяли из эмбрионов морских ежей разных видов и на
разных стадиях развития. К тому же основное внимание исследователи
уделяли характеристике лишь основных физико-химических свойств
ферментов, необходимых для отнесения ферментов к соответствующему
классу ДНК-полимераз. В то же время для выяснения функций этих
ферментов необходимо исследовать молекулярный механизм синтеза
ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразами, в частности, взаимодейст-
вие ДНК-полимераз с различными участками матрицы-затравки, ха-
рактер копирования матрицы и эффективность утилизации одноцепо-
чечного пробела.
В настоящей работе обобщены результаты исследования двух ДНК-
полимераз — α и β, выделенных из клеток эмбрионов морского ежа
Strongylocentrotus intermedins [7—10].
Для исследования спектра ДНК-полимераз суммарный белковый
препарат из эмбрионов морского ежа был подвергнут хроматографии
на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. Как видно из рис. 1, в результате
хроматографии обнаруживают три белковые фракции, обладающие
ДНК-полимеразной активностью. Анализ молекулярной массы ДНК-по-
лимераз, входящих в активные фракции, и исследование чувствительно-
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 5 3-5-422 241
|