Сравнительное исследование свойств ДНК-полимераз α и β из эмбрионов морского ежа
Из клеток эмбрионов морского ежа Strongylocentrotus intermedius выделены две ДНК-полимеразы, которые на основании своих физико-химических свойств классифицированы как а и р. Исследована их матричная специфичность. Показано, что ДНК-полимераза а может взаимодействовать как с одноцепочечным участком м...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Дата: | 1985 |
| Автори: | , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1985
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152406 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Сравнительное исследование свойств ДНК-полимераз α и β из эмбрионов морского ежа / Л.Л. Терентьев, Н.А. Терентьева, В.А. Рассказов // Биополимеры и клетка. — 1985. — Т. 1, № 5. — С.241-247. — Бібліогр.: 17 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-152406 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Терентьев, Л.Л. Терентьева, Н.А. Рассказов, В.А. 2019-06-11T10:42:47Z 2019-06-11T10:42:47Z 1985 Сравнительное исследование свойств ДНК-полимераз α и β из эмбрионов морского ежа / Л.Л. Терентьев, Н.А. Терентьева, В.А. Рассказов // Биополимеры и клетка. — 1985. — Т. 1, № 5. — С.241-247. — Бібліогр.: 17 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.000189 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152406 577.213.32 Из клеток эмбрионов морского ежа Strongylocentrotus intermedius выделены две ДНК-полимеразы, которые на основании своих физико-химических свойств классифицированы как а и р. Исследована их матричная специфичность. Показано, что ДНК-полимераза а может взаимодействовать как с одноцепочечным участком матрицы, так и с 3'-ОН-группой в составе матрицы-затравки. Взаимодействие ДНК-полимеразы а с одноцепочечным участком зависит от нуклеотидного состава матрицы. ДНК-полимераза β взаимодействует лишь с 3'-концевой группой праймера (гидроксильной или фосфатной). ДНК-полимераза а является умеренно процессивным ферментом и не способна заполнять одноцепочечный пробел в цепи ДНК до конца; ДНК-полимераза (3 – дистрибутивный фермент и застраивает брешь в цепи ДНК полностью З клітин ембріонів морського їжака Strongylocentrotus intermedius виділено дві ДНК-полімерази, які на підставі своїх фізико-хімічних властивостей класифіковані як а і р. Досліджено їхню матричну специфічність. Показано, що ДНК-полімераза а може взаємодіяти як з одноланцюговою ділянкою матриці, так і з 3'-ОН-групою у складі матриці-затравки. Взаємодія ДНК-полімерази а з одноланцюговою ділянкою залежить від нуклеотидного складу матриці. ДНК-полімераза (3 взаємодіє лише з 3'-кінцевою групою праймера (гідроксильною або фосфатною). ДНК-полімераза а є помірно процесивним ферментом і не здатна заповнювати одноланцюговий пробіл у ланцюзі ДНК до кінця; ДНК-полімераза β є дистрибутивним ферментом і забудовує пролом у ланцюзі ДНК повністю. Two DNA polymerases were isolated from embryonic cells of the sea urchin Strongylocentrotus mermedlus. In terms of physicochemical properties and primer-template specificity these enzymes are classified as DNA polymerases α and β. DNA polymerase a can interact both with single strand and 3'-hydroxyl termini in gapped DNA. The interaction of DNA polymerase α with single-stranded sites depends on the template base composition. DNA polymerase p recognizes only 3' primer termini (hydroxyl or phosphoryl). DNA polymerase a realizes DNA synthesis via a moderately processive mechanism and is unable to fill gaps in the DNA chain to completion. In contrast, DNA polymerase β is a distributive enzyme and fills gaps in the DNA chain completely. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Обзоры Сравнительное исследование свойств ДНК-полимераз α и β из эмбрионов морского ежа Порівняльне дослідження властивостей ДНК-полімераз α і β з ембріонів морського їжака Comparative study of DNA polymerases α and β from sea urchin embryos Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Сравнительное исследование свойств ДНК-полимераз α и β из эмбрионов морского ежа |
| spellingShingle |
Сравнительное исследование свойств ДНК-полимераз α и β из эмбрионов морского ежа Терентьев, Л.Л. Терентьева, Н.А. Рассказов, В.А. Обзоры |
| title_short |
Сравнительное исследование свойств ДНК-полимераз α и β из эмбрионов морского ежа |
| title_full |
Сравнительное исследование свойств ДНК-полимераз α и β из эмбрионов морского ежа |
| title_fullStr |
Сравнительное исследование свойств ДНК-полимераз α и β из эмбрионов морского ежа |
| title_full_unstemmed |
Сравнительное исследование свойств ДНК-полимераз α и β из эмбрионов морского ежа |
| title_sort |
сравнительное исследование свойств днк-полимераз α и β из эмбрионов морского ежа |
| author |
Терентьев, Л.Л. Терентьева, Н.А. Рассказов, В.А. |
| author_facet |
Терентьев, Л.Л. Терентьева, Н.А. Рассказов, В.А. |
| topic |
Обзоры |
| topic_facet |
Обзоры |
| publishDate |
1985 |
| language |
Russian |
| container_title |
Биополимеры и клетка |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Порівняльне дослідження властивостей ДНК-полімераз α і β з ембріонів морського їжака Comparative study of DNA polymerases α and β from sea urchin embryos |
| description |
Из клеток эмбрионов морского ежа Strongylocentrotus intermedius выделены две ДНК-полимеразы, которые на основании своих физико-химических свойств классифицированы как а и р. Исследована их матричная специфичность. Показано, что ДНК-полимераза а может взаимодействовать как с одноцепочечным участком матрицы, так и с 3'-ОН-группой в составе матрицы-затравки. Взаимодействие ДНК-полимеразы а с одноцепочечным участком зависит от нуклеотидного состава матрицы. ДНК-полимераза β взаимодействует лишь с 3'-концевой группой праймера (гидроксильной или фосфатной). ДНК-полимераза а является умеренно процессивным ферментом и не способна заполнять одноцепочечный пробел в цепи ДНК до конца; ДНК-полимераза (3 – дистрибутивный фермент и застраивает брешь в цепи ДНК полностью
З клітин ембріонів морського їжака Strongylocentrotus intermedius виділено дві ДНК-полімерази, які на підставі своїх фізико-хімічних властивостей класифіковані як а і р. Досліджено їхню матричну специфічність. Показано, що ДНК-полімераза а може взаємодіяти як з одноланцюговою ділянкою матриці, так і з 3'-ОН-групою у складі матриці-затравки. Взаємодія ДНК-полімерази а з одноланцюговою ділянкою залежить від нуклеотидного складу матриці. ДНК-полімераза (3 взаємодіє лише з 3'-кінцевою групою праймера (гідроксильною або фосфатною). ДНК-полімераза а є помірно процесивним ферментом і не здатна заповнювати одноланцюговий пробіл у ланцюзі ДНК до кінця; ДНК-полімераза β є дистрибутивним ферментом і забудовує пролом у ланцюзі ДНК повністю.
Two DNA polymerases were isolated from embryonic cells of the sea urchin Strongylocentrotus mermedlus. In terms of physicochemical properties and primer-template specificity these enzymes are classified as DNA polymerases α and β. DNA polymerase a can interact both with single strand and 3'-hydroxyl termini in gapped DNA. The interaction of DNA polymerase α with single-stranded sites depends on the template base composition. DNA polymerase p recognizes only 3' primer termini (hydroxyl or phosphoryl). DNA polymerase a realizes DNA synthesis via a moderately processive mechanism and is unable to fill gaps in the DNA chain to completion. In contrast, DNA polymerase β is a distributive enzyme and fills gaps in the DNA chain completely.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152406 |
| citation_txt |
Сравнительное исследование свойств ДНК-полимераз α и β из эмбрионов морского ежа / Л.Л. Терентьев, Н.А. Терентьева, В.А. Рассказов // Биополимеры и клетка. — 1985. — Т. 1, № 5. — С.241-247. — Бібліогр.: 17 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT terentʹevll sravnitelʹnoeissledovaniesvoistvdnkpolimerazαiβizémbrionovmorskogoeža AT terentʹevana sravnitelʹnoeissledovaniesvoistvdnkpolimerazαiβizémbrionovmorskogoeža AT rasskazovva sravnitelʹnoeissledovaniesvoistvdnkpolimerazαiβizémbrionovmorskogoeža AT terentʹevll porívnâlʹnedoslídžennâvlastivosteidnkpolímerazαíβzembríonívmorsʹkogoížaka AT terentʹevana porívnâlʹnedoslídžennâvlastivosteidnkpolímerazαíβzembríonívmorsʹkogoížaka AT rasskazovva porívnâlʹnedoslídžennâvlastivosteidnkpolímerazαíβzembríonívmorsʹkogoížaka AT terentʹevll comparativestudyofdnapolymerasesαandβfromseaurchinembryos AT terentʹevana comparativestudyofdnapolymerasesαandβfromseaurchinembryos AT rasskazovva comparativestudyofdnapolymerasesαandβfromseaurchinembryos |
| first_indexed |
2025-11-27T00:44:17Z |
| last_indexed |
2025-11-27T00:44:17Z |
| _version_ |
1850789237609201664 |
| fulltext |
6. Mikhailou V. S., Gulyamov D. B. Changes in DNA polymerase α, β, γ activities during
early development of the teleost fish Misgurnus fossilis (loach).— Eur. J. Biochem.,
1983, 135, N 2, p. 303—306.
7. Laemtnli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4.— Nature, 1970, 227, N 5259, p. 680—685.
8. Oakley B. R., Kirsch D. RMorris N. R. A simplified ultrasensitive silver stain for
detecting proteins in polyacrylamide gels.— Anal. Biochem., 1980, 105, N 2, p. 361—
363.
9. Михайлов В. С., Гулямов Д. Б. Выделение двух форм ДНК-пслимеразы α из икры
вьюна. Физико-химическая характеристика изоферментов.— Биохимия, 1983, 48,
№ 9, с. 1530—1537.
10. ДНК-полимеразная активность вируса ядерного полиэдроза большой вощинной мо-
ли /А . В. Рындич, Л. П. Сутугина, В. М. Кавсан и др.—Докл. АН УССР. Сер. Б,
1975, № 4, с. 347—349.
И. Выделение репликативного комплекса, содержащего ДНК-полимеразу α и ДНК-
праймазу, из грены тутового шелкопряда Bombyx mori/B. С. Михайлов, Д. О. Атае-
ва, К. А. Марлыев, ΓΙ. К- Куллыев.— Докл. АН СССР, 1984, 275, № 2, с. 502—505.
Ин-т зоологии ТССР, Ашхабад Получено 22.01.85
Ин-т биологии развития
им. Н. К. Кольцова АН СССР, Москва
УДК 577.213.32
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ
ДНК-ПОЛИМЕРАЗ α И β ИЗ ЭМБРИОНОВ МОРСКОГО ЕЖА
Л. Л. Терентьев, Н. А. Терентьева, В. А. Рассказов
Исследование биосинтеза Д Н К в клетках эукариот является одной из
центральных проблем молекулярной биологии. Согласно современным
представлениям синтез Д Н К осуществляется мультиферментным комп-
лексом, ключевую роль в котором играют ДНК-полимеразы. В клетках
эукариот обнаружены три типа ДНК-полимераз, которые в соответствии
со своими физико-химическими свойствами классифицированы как α, β
и у [1]. В яйцеклетках и эмбрионах морского ежа, как и в других эука-
риотических клетках, присутствует несколько отличающихся по свойст-
вам ДНК-полимераз [2, 3]. Впервые из клеток эмбрионов морского
ежа была выделена Лебом [4] высокомолекулярная ДНК-полимераза,
впоследствии классифицированная как ДНК-полимераза а . Сузуки-Хо-
ри и др. [5], а также Хобарт и Инфант [6] выделили ДНК-полимеразу,
напоминающую по своим свойствам ДНК-полимеразу β эукариот. Од-
нако сравнительный анализ свойств этих ферментов затруднен тем, что
эти ферменты выделяли из эмбрионов морских ежей разных видов и на
разных стадиях развития. К тому же основное внимание исследователи
уделяли характеристике лишь основных физико-химических свойств
ферментов, необходимых для отнесения ферментов к соответствующему
классу ДНК-полимераз. В то же время для выяснения функций этих
ферментов необходимо исследовать молекулярный механизм синтеза
ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразами, в частности, взаимодейст-
вие ДНК-полимераз с различными участками матрицы-затравки, ха-
рактер копирования матрицы и эффективность утилизации одноцепо-
чечного пробела.
В настоящей работе обобщены результаты исследования двух ДНК-
полимераз — α и β, выделенных из клеток эмбрионов морского ежа
Strongylocentrotus intermedins [7—10].
Для исследования спектра ДНК-полимераз суммарный белковый
препарат из эмбрионов морского ежа был подвергнут хроматографии
на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. Как видно из рис. 1, в результате
хроматографии обнаруживают три белковые фракции, обладающие
ДНК-полимеразной активностью. Анализ молекулярной массы ДНК-по-
лимераз, входящих в активные фракции, и исследование чувствительно-
Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 5 4 — 5-422 241
сти ферментов к действию сульфгидрильных реагентов дали основание
предположить, что ДНК-полимеразы, входящие в пики I и II, относятся
к классу ДНК-полимераз β, а ДНК-полимераза из пика III — к клас-
су ДНК-полимераз ос.
Для того чтобы более полно исследовать свойства ДНК-полиме-
раз морского ежа, были разработаны методы очистки ферментов. Для
выделения ДНК-полимеразы α белковый препарат из клеток эмбрионов
морского ежа фракционировали сернокислым аммонием, диализовали и
Рис. 1. Распределение ДНК-полимеразной активности при хроматографии суммарного
белкового препарата из эмбрионов морского ежа на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой: 1 —
белок, измеренный при Агво; 2 — ДНК-полимеразная активность.
Fig. 1. Distribution of the DNA polymerase activity after DEAE-cellulose chromatography
of unfractionated homogenate of sea urchin embryos: 1 — protein (A28o); 2 — DNA poly-
merase activity.
Рис. 2. Действие различных форм ДНК на реакцию полимеризации, осуществляемую
ДНК-полимеразой α (закрашенные символы) и ДНК-полимеразой β (незакрашенные
символы) с активированной ДНК (100 мкМ) в качестве затравки-матрицы: 1, 2 —
двухцепочечная кольцевая ДНК фага φХ174\ 3, 4 — одноцепочечная кольцевая ДНК
<$Х174; 5, 6 — линейная двухцепочечная ДНК без одноцепочечных пробелов с З'-ОН-
концевыми группами; 7, 8 — линейная двухцепочечная ДНК без одноцепочечных про-
белов с З'-фосфатными группами.
Fig. 2. Effect of various DNA forms on the polymerization reaction of DNA polymerase
α (filled symbols) and DNA polymerase β (open symbols) on activated DNA (100 μΜ).
1, 2 — supercoiled duplex circular yX174 DNA, 3, 4 — single-stranded circular φX174
DNA, (5, 6) — linear duplex fragments of DNA terminated with З'-hydroxyl, (7, 8) —
linear duplex fragments of DNA terminated with 3'-phosphate.
подвергали хроматографии на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой, гидроксил-
апатитом и ДНК-целлюлозой. В результате такой очистки была полу-
чена ДНК-полимераза а с удельной активностью 46 875 ед. на 1 мг
белка и выходом 39 %. Очистка в 2 757 раз.
Выделение ДНК-полимеразы β проводили по следующей схеме.
Экстракт белка из клеток эмбрионов морского ежа фракционировали
сульфатом аммония. Дальнейшая очистка включала хроматографию на
ДЭАЭ-целлюлозе, фосфоцеллюлозе, гидроксилапатите. Представленная
схема выделения дала возможность очистить ДНК-полимеразу β в
1 040 раз. Удельная активность фермента 2 600 ед./мг, выход 25 %.
Выделенные ДНК-полимеразы катализируют линейное включение
dNTP в течение 1 ч и более. Для проявления максимальной активности
ферменты требуют наличия в инкубационной смеси всех четырех dNTP,
ионов Mg2 + или Мп2+. В случае ДНК-полимеразы а оптимальная кон-
центрация Mg2+ составляет 20—30 мМ, Мп 2 + — 1 мМ; для ДНК-поли-
меразы β — 2 и 1 мМ соответственно. Оптимум величины рН для выде-
ленных ферментов: 8 — для ДНК-полимеразы а и 9,5 — для ДНК-поли-
меразы β.
В табл. 1 представлены результаты исследования основных фи-
зико-химических свойств выделенных ДНК-полимераз. Молекулярная
масса ДНК-полимеразы а, определенная относительно белков-марке-
ров с помощью хроматографии на колонке с биогелем А-1,5 т , состав-
ляет 150 000. Молекулярная масса ДНК-полимеразы β, определенная
на колонке с сефадексом G-100, равна 40 000. Коэффициент седимен-
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 5 4 — 5-422 242
Т а б л и ц а 1
Свойства ДНК-полимераз морского ежа Strongylocentrotus intermedins
Properties of DNA polymerases from sea urchin Strogylocentrotus intermedins
Свойства ДНК-полимераза α ДНК-полимераза β
Молекулярная масса 150 000 40 000
Полипептидный состав 2 субъединицы (65 ООО— и 70 000) 1 субъединица (40 000)
Коэффициент седиментации 7 , 3 S 3 ,2 S
Изоэлектрическая точка, рН 5 ,6 8 ,5
Влияние SH-реагентов Ингибируют Слабо ингибируют
Экзонуклеазная активность Нет Нет
Эндонуклеазная активность Нет Нет
Оптимум рН 8,0 9 ,5
Оптимум Μg 2 + , мМ 20—30 2
Оптимум Мп 2 + , мМ 1 1
Оптимум КС1 (NaCl), мМ 50 150
Влияние пирофосфата нат-
рия Ингибирует Ингибирует
Т а б л и ц а 2
Матричная специфичность ДНК-полимераз морского ежа Strongylocentrotus intermedins
Template specificity of DNA polymerases from sea urchin Strongylocentrotus intermedins
Матри ца-затра в ка
Активность ДНК-по-
лимеразы а, %
Активность ДНК-по-
лимеразы β, %
Матри ца-затра в ка
10 мМ
Mg2+
1 мМ
Мп2+
1 мМ
M g 2 +
1 мМ
Мп2+
Активированная Д Н К 100 21 100 30
Нативная Д Н К 20 1 — —
Денатурированная Д Н К 19 19 — —
ДНК, обработанная S1 нуклеазой 1 1 — —
ДНК, обработанная микрококковой нуклеазой 1 1 1 1
Д Н К фага 77 1 1 — —
Кольцевая одноцепочечная Д Н К фага φΧ174 1 1 1 1
Кольцевая двухцепочечная Д Н К фага φΧ174 1 1 1 1
Поли(сІА) · (dT) ю 31 144 320 220
Поли(сІАТ) ·поли (dAT) 14 15 — —
Поли (dA, dT) 1 6 — —
П о л и ^ А ) -поли^Т) 1 10 — —
Поли(гА) · (dT) ю 1 7 150 200
тации равен 7,3 S для ДНК-полимеразы α и 3,2 S — для ДНК-поли-
меразы β.
Выделенная из клеток эмбрионов морского ежа ДНК-полимераза а
имеет изоэлектрическую точку в кислой области рН. Изоэлектрическая
точка ДНК-полимеразы β находится в щелочной области рН и несколь-
ко ниже, чем у ДНК-полимераз β из клеток млекопитающих [11, 12].
Как и в случае других известных эукариотических ДНК-полиме-
раз α и β, сульфгидрильные реагенты действовали на активность вы-
деленных ДНК-полимераз по-разному. Полностью подавляя активность
ДНК-полимеразы ос, они в значительно меньшей степени влияли на
активность ДНК-полимеразы β.
Результаты изучения физико-химических свойств выделенных фер-
ментов соответствуют данным, полученным для ДНК-полимераз из
других эукариотических клеток [1].
Важную роль в классификации эукариотических ДНК-полимераз
играет способность ферментов использовать в качестве матрицы-затрав-
ки различные синтетические полинуклеотиды. Из табл. 2 видно, что
ДНК-полимераза ос, подобно аналогичным ферментам эукариот [1],
проявляет максимальную активность с ДНК, активированной панкреа-
тической ДНКазой. Фермент с низкой эффективностью использует син-
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 5 4 — 5-422 243
тетические полинуклеотиды в качестве матрицы-затравки в присутствии
ионов Mg2+. Замена ионов Mg2+ на Мп2 + изменяет специфичность
ДНК-полимеразы в отношении матрицы-затравки.
Максимальная активность ДНК-полимеразы β проявляется с по-
ли(сІА)-олиго(сІТ) в качестве матрицы-затравки. Кроме того, ДНК-по-
лимераза β морского ежа S. intermedins, подобно ДНК-полимеразе у
эукариот, способна копировать поли(гА) -олиго(сГГ)—матрицу-затрав-
Рис. 3. Влияние одноцепочечной кольцевой ДНК фага <$Х174 (А), двухцепочечной ли-
нейной ДНК без одноцепочечных пробелов с З'-ОН-концевыми группами (Б) на актив-
ность ДНК-полимеразы α и действие двухцепочечной линейной Д Н К без одноцепочеч-
ных пробелов с З'-ОН-концами (3, 2) или с З'-фосфатными группами (3\ 2') на ак-
тивность ДНК-полимеразы β (В): 1—0; 2—75; 3—150 мкМ ингибиторной ДНК.
Fig. 3. Effect of single-stranded circular X174 DNA (A), linear duplex DNA terminated
with З'-ОН groups (Б) on the DNA polymerase α activity. Effect of linear duplex DNA
terminated with 3'-OH (3, 2) or 3'-phosphate (3', 2') groups of the DNA polymerase β
activity (В): 1—0; 2—75; 5—150 μΜ of the inhibitor DNA.
Рис. 4. Влияние синтетических одноцепочечных полинуклеотидов (75 мкМ) на актив-
ность ДНК-полимераз α (А) и β (Б), определяемую с активированной Д Н К (75 мкМ):
1 — iKWHi(dG); 2 — поли(сіТ); 3 — поли^С) ; 4 — поли(dА); 5 — активированная ДНК.
Fig. 4. Effect of synthetic homopolymers (75 μΜ) on the reaction of DNA polymerase
α (A) and β (Б) on activated DNA (75 μΜ): 1 — poly(dG); 2 —poly(dT); 3 — poly(dC);
4 — poly(dA); 5 — activated DNA.
ку. Эффективное использование ДНК-полимеразой β из эмбрионов мор-
ского ежа Hemicentrotus pulcherrimus в качестве матрицы-затравки
поли(гА) -олиго(сІТ) отмечено в работе [5].
Результаты исследования физико-химических свойств и матрич-
ной специфичности ДНК-полимераз морского ежа 5. intermedius под-
твердили выдвинутое ранее предположение о принадлежности этих фер-
ментов к классу ДНК-полимераз α и β в соответствии с общепринятой
классификацией.
Поскольку оптимальной матрицей-затравкой в случае обоих фер-
ментов является Д Н К с одноцепочечными пробелами, ограниченными с
одной стороны З'-гидроксилом, а с другой — 5'-фосфатом, то можно
предположить, что взаимодействие ДНК-полимераз с матрицей может
включать узнавание некоторых комбинаций из одноцепочечного, двух-
цепочечного участков Д Н К и затравочной З'-гидроксильной группы.
Для того чтобы выяснить, с какими участками матрицы-затравки вза-
имодействуют ДНК-полимеразы, было исследовано влияние различных
форм ДНК, не поддерживающих синтез, на полимеризацию активиро-
ванной ДНК.
244 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 5
Отсутствие заметного ингибирования активности ДНК-полимераз
морского ежа двухцепочечными кольцевыми молекулами Д Н К фага
ΦХ174 свидетельствует о том, что двухцепочечные участки матрицы не
вовлечены в процесс взаимодействия ДНК-полимераз с матрицей-за-
травкой (рис. 2). Подобное отношение к двухцепочечным участкам
матрицы-затравки характерно для ДНК-полимеразы I Е. coli [13] и
ДНК-полимераз сс и β из клеток карциномы человека [14].
Добавление в инкубационную среду одноцепочечной кольцевой
Д Н К фага ц>Х174 сопровождается конкурентным ингибированием ак-
тивности ДНК-полимеразы ос (рис. 3, А) и не влияет на активность
ДНК-полимеразы β (рис. 2). Можно предположить, что существенным
моментом в реакции полимеризации, катализируемой ДНК-полимеразой
ос, является связывание фермента с одноцепочечным участком ДНК-
матрицы.
Линейная двухцепочечная Д Н К без одноцепочечных пробелов, со-
держащая З'-ОН-концевые группы, ингибирует активность ДНК-поли-
мераз α и β (рис. 2, 3). Аналогичная матрица, содержащая З'-фосфат-
ные концы, ингибирует активность только ДНК-полимеразы β (рис. 2,
3, В). Не исключено, что способность ДНК-полимеразы β взаимодей-
ствовать только с З'-концевой группой (гидроксильной или фосфатной)
одной из цепей Д Н К является природным свойством фермента и обу-
словлена функциональной ролью ДНК-полимеразы. Это предположе-
ние в определенной степени подтверждается экспериментами по влия-
нию одноцепочечных синтетических полинуклеотидов на активность
ДНК-полимеразы β морского ежа. Как видно из рис. 4, Б, добавление
в инкубационную смесь с ДНК-полимеразой β одноцепочечных синте-
тических дезоксирибополимеров практически не влияет на активность
выделенного фермента.
Показано [14], что ДНК-полимераза α клеток KB предпочтитель-
но взаимодействует с полинуклеотидными матрицами определенного
состава. Причем эффективность взаимодействия фермента с одноцепо-
чечным участком матрицы изменяется в ряду: поли (dT) ^ п о л и (dG) >
> п о л и (dC) > п о л и (dA). Добавление в инкубационную систему с ДНК-
полимеразой а морского ежа синтетических одноцепочечных гомополи-
меров ингибировало активность фермента в следующем порядке: по-
л н е в ) >поли(гіТ) > п о л и ( ё С ) > п о л и ( ё А ) (рис. 4, А).
Информации о характере копирования Д Н К ДНК-полимеразами в
настоящее время явно недостаточно. Дас и Фуджимура [15] показали, что
большинство ДНК-полимераз прокариот и эукариот включают в период
между связыванием с матрицей и диссоциацией из нее более одного
нуклеотида, т. е. являются процессивными ферментами. Для того, что-
бы определить значение процессивности ДНК-полимераз из эмбрионов
морского ежа, мы использовали кинетический метод, предложенный
Бамбара и соавт. [16]. Величину процессивности определяли на ак-
тивированной ДНК, сравнивая скорости реакций полимеризации в при-
сутствии полного и ограниченного наборов дезоксирибонуклеозидтри-
фосфатов. ДНК-полимераза ос морского ежа является умеренно про-
цессивным ферментом и катализирует включение ~ 1 0 нуклеотидов за
цикл полимеризации. ДНК-полимераза β — дистрибутивный фермент,
диссоциирующий из матрицы после каждого включенного нуклеотида.
Аналогичные результаты были получены для ДНК-полимераз ос [17] и
β [16] клеток КВ.
Несмотря на то, что обе ДНК-полимеразы из эмбрионов морского
ежа осуществляют процесс полимеризации с активированной Д Н К в
качестве матрицы-затравки, эффективность использования одноцепочеч-
ных пробелов в Д Н К у них различна. Так, ДНК-полимераза α не копи-
рует бреши размером менее 15 нуклеотидов. С увеличением длины од-
ноцепочечного пробела проявляется ограниченная способность запол-
нять брешь в цепи ДНК. При этом величина застраиваемого пробела
составляет 70—80 % общей длины матрицы, определенной с помощью
ДНК-полимеразы фага Т4. Неспособность фермента заполнять одноце-
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 5 4 — 5-422 245
почечный пробел до конца обусловлена, вероятно, очень высокой чув-
ствительностью ДНК-полимеразы а к особенностям вторичной струк-
туры матрицы-затравки. Ограниченный характер заполнения одноцепо-
чечного пробела в Д Н К ДНК-полимеразой а из клеток KB отмечали
в работе [17]. ДНК-полимераза β морского ежа полностью застраива-
ет брешь в цепи ДНК.
Сравнительный анализ свойств ДНК-полимераз α и β из клеток
эмбрионов морского ежа дает основание предположить, что существо-
вание различий в механизме полимеризации, осуществляемой этими
ферментами, вероятно, связано с различной функциональной ролью вы-
деленных ДНК-полимераз.
COMPARATIVE STUDY OF DNA POLYMERASES α AND β
FROM SEA URCHIN EMBRYOS
L. L. Terentiev, N. A. Terentieva, V. A. Rasskazov
Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far Eastern Research Centre,
Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok
S u m m a r y
Two DNA polymerases were isolated from embryonic cells of the sea urchin Strongylo-
centrotus ititermedius. In terms of physicochemical properties and primer-template spe-
cificity these enzymes are classified as DNA polymerases α and β. DNA polymerase α
can interact both with single strand and З'-hydroxyl termini in gapped DNA. The inte-
raction of DNA polymerase α with single-stranded sites depends on the template base
composition. DNA polymerase β recognizes only 3' primer termini (hydroxyl or phospho-
ryl). DNA polymerase α realizes DNA synthesis via a moderately processive mechanism
and is unable to fill gaps in the DNA chain to completion. In contrast, DNA polymerase
β is a distributive enzyme and fills gaps in the DNA chain completely.
1. Weissbach A. Eukaryotic DNA polymerases.— Ann. Rev. Biochem., 1977, 46, p. 25—47.
2. Separation and partial characterization of DNA polymerases in sea urchin Para-
centrotus lividus eggs /B . De Petrocellis, E. Parisi, S. Filosa, A. Capasso.— Bio-
chem. and Biophys. Res. Communs, 1976, 68, N 4, p. 954—960.
3. Racine F. M., Morris P. W. DNA polymerase α and β in the California urchin —
Nucl. Acids Res., 1978, 5, N 10, p. 3945—3957.
4. Loeb L. A. Purification and properties of deoxyribonucleic acid polymerase from
nuclei of sea urchin embryos — J . Biol. Chem., 1969, 244, N 7, p. 1672—1681.
5. Suzuki-Hori C., Nagano Η., Mano Y. DNA polymerase β from the nuclear fraction
of sea urchin embryos: characterization of the purified enzyme.— J. Biochem., 1977,
82, N 6, p. 1613—1621.
6. Hobart P. M., Infante A. A. A low molecular weight DNA polymerase in the sea
urchin Strongylocentrotus purpuratus. Partial purification properties, and changing
in development.—J. Biol. Chem., 1978, 253, N 17, p. 8229—8238.
7. Терентьев Л. Л., Терентьева Η. Α., Рассказов В. А. ДНК-полимераза из эмбрио-
нов морского ежа Strongylocentrotus intermedius. Очистка и некоторые свойства.—
Биохимия, 1980, 45, № 9, с. 1603—1608.
8. Терентьев Л. ЛТерентьева Η. Α., Рассказов В. А. Процессивность и некоторые
свойства ДНК-полимеразы α из эмбрионов морского ежа.— Там же, 1983, 48, № 2,
с. 224—229.
9. Терентьев Л. Л., Терентьева Η. Α., Рассказов В. А. Выделение и некоторые свойства
ДНК-полимеразы β из эмбрионов морского ежа 5. intermedius.— Там же, 1984, 49,
№ 7, с. 1103—1109.
10. Терентьев Л. ЛТерентьева Η. Α., Рассказов В. А. Сравнительные исследования
ДНК-полимераз α и β из эмбрионов морского ежа.— В кн.: Структура и функции
клеточного ядра: Тез. докл. Всесоюз. симпоз. Пущино, 1984, с. 278—279.
11. Wang Т. S.-F., Sedwick W. D., Korn D. Nuclear deoxyribonucleic acid polymerase.—
J. Biol. Chem., 1975, 250, N 14, p. 7040—7044.
12. Bollum F. J. Mammalian DNA polymerases —Progr . Nucl. Acids Res. and Мої. Biol.,
1975, 15, p. 109—144.
13. Romberg A. DNA replication / Ed. W. H. Freeman.—San Francisco : Stanford Univ.,
1980.—380 p.
14. Korn D., Fisher P. Α., Wang T. S.-F. Mechanisms of catalysis of human DNA poly-
merases α and β —Progr . Nucl. Acids Res. and Мої. Biol., 1981, 26, p. 63—81.
15. Das S. K., Fujimura R. К. Processiveness of DNA polymerases. A comparative study
using a simple procedure.—J. Biol. Chem., 1979, 254, N 4, p. 1227—1232.
246 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1. N° 5
16. Bambara R. Α., Uyemura D., Choi T. On the processive mechanism of E. coli DNA
polymerase I. Quantitative assesment of processivity.— Ibid., 1978, 253, N 1, p. 413—
423.
17. Fisher P. Α., Wang T. S.-FKorn D. Enzymological characterization of DNA poly-
merase a: Basic catalytic properties, processivity, and gap utilization of the homo-
geneous enzyme from human KB cells.—Ibid., 1979, 254, N 12, p. 6128—6137.
Тихоокеан. ин-т биоорган, химии Получено 22.01.85
ДВНЦ АН СССР, Владивосток
УДК 547.963.32.057:577.152.277.145
ДНК-ПОЛИМЕРАЗА I Ε. COLI:
ЗАВИСИМАЯ ОТ ПРАЙМЕР-МАТРИЧНОГО КОМПЛЕКСА
ИНАКТИВАЦИЯ ФЕРМЕНТА ИМИДАЗОЛИДАМИ
ДЕЗОКСИНУКЛЕОЗИД-5-ТРИФОСФАТОВ
Г. А. Невинский, С. В. Доронин, О. И. Лаврик
Метод аффинной модификации, как отмечается в монографии [1], лишь
начинают применять к ДНК-полимеразам (КФ 2.7.7.7). Можно пере-
числить несколько работ, в которых достигнуто ковалентное присое-
динение к полимеразам dNTP прямой фотосшивкой нуклеотидов с фер-
ментами [2, 3] или при использовании аналогов dNTP, содержащих
дополнительные алкилирующие группы, присоединенные по γ-фосфа-
ту нуклеотидов [4—6]. Эпоксипроизводное АТР [7] и окисленный по
рибозе перйодатом натрия 6-метил-тиопуринрибозид [8] также инакти-
вируют ДНК-полимеразу I.
Материалы и методы. В работе использовали препараты ДНК-полимеразы I из
Е. coli MRE-600 производства НИС НГУ и ИЦиГ СО АН СССР (Новосибирск) с удель-
ной активностью 3·103 ед. акт./мг [2]. Препараты фермента были свободными от при-
месных экзо- и эндонуклеаз и содержали по данным электрофореза в полиакриламид-
ном геле не более 3—5 % примесных белков [2].
В работе использовали HEPES («Ferak», ФРГ), бычий сывороточный альбумин
(БСА) («Koch-Light Laboratories», Англия), поли^А)-, поли^Т)- , поли^С)- ,
поли^С)- , поли (гА)-натриевые соли, dATP-, dCTP-, dGTP-: dTTP-натриевые соли
(НИКТИ БАВ, г. Бердск), [3Н] dTTP с удельной активностью 836 ТБк/моль и
[3H]dATP — 900 ТБк/моль («Изотоп», СССР), остальные реактивы квалификации х. ч.
и ос. ч.
ТСХ в препаративном варианте проводили на пластинках Kieselgel F6o 254
(«Мегк», ФРГ) в системе диоксан — вода — концентрированный аммиак (6:3:1), в ана-
литическом — на пластинках Silufol UV-254 («Kavalier», ЧССР) в системе диоксан —
вода — аммиак (6:4:1).
Синтез им-dNTP проводили, согласно [10], с некоторыми модификациями. Очистку
продуктов проводили с помощью ТСХ в указанных системах. Концентрацию им-dNTP
определяли спектрофотометрически, используя коэффициенты молярного поглощения для
нуклеотидов, приведенные в работе [12]. Для доказательства структуры продуктов
проводили их кислый гидролиз в 0,1 Μ Na-ацетатном буферном растворе, рН 4,0. Про-
дукты гидролиза идентифицировали с помощью ТСХ и микроколоночной хроматографии
на ионообменной смоле АСшЗОО производства НИС НГУ в градиенте концентраций
КН 2Р0 4 (рН 7,0), 7 Μ мочевина. Поглощение элюата регистрировали с помощью мик-
роспектрофотометра «Миллихром» отечественного производства. Величины Rf для
им-dATP, dCTP, dGTP и dTTP были равными 0,5; 0,41; 0,43; 0,45 соответственно. Пре-
параты им-dNTP использовали сразу после очистки с помощью ТСХ. В этом случае они
содержали не более 1—3 % примеси dNTP.
Принятые сокращения: им-dNTP — γ-имидазолид dNTP; HEPES — 2-^гидрокси-
этилпиперазин-№-2-этансульфокислота.
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 5 4 — 5-422 247
|