Новые ингибиторы биосинтеза ДНК и РНК in vitro и in vivo
Обзор собственных данных авторов о способах синтеза и свойствах большого количества новых ингибиторов биосинтеза ДНК и РНК in vitro и in vivo. На индивидуальных матрицах с участием очищенных ДНК- и РНК-полимераз определен молекулярный механизм действия этих ингибиторов в реакциях полимеризации, пиро...
Gespeichert in:
| Veröffentlicht in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Datum: | 1985 |
| Hauptverfasser: | , , , , , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russisch |
| Veröffentlicht: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1985
|
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152413 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Новые ингибиторы биосинтеза ДНК и РНК in vitro и in vivo / Р.Ш. Бибилашвили, З.Г. Чиджавадзе, А.А. Краевский, М.К. Куханова, А.М. Атражев, А.В. Ажаев, Т.В.Кутателадзе // Биополимеры и клетка. — 1985. — Т. 1, № 6. — С. 293-307. — Бібліогр.: 31 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859470665538600960 |
|---|---|
| author | Бибилиашвили, Р.Ш. Чиджавадзе, З.Г. Краевский, А.А. Куханова, М.К. Атражев, А.М. Ажаев, А.В. Кутателадзе, Т.В. |
| author_facet | Бибилиашвили, Р.Ш. Чиджавадзе, З.Г. Краевский, А.А. Куханова, М.К. Атражев, А.М. Ажаев, А.В. Кутателадзе, Т.В. |
| citation_txt | Новые ингибиторы биосинтеза ДНК и РНК in vitro и in vivo / Р.Ш. Бибилашвили, З.Г. Чиджавадзе, А.А. Краевский, М.К. Куханова, А.М. Атражев, А.В. Ажаев, Т.В.Кутателадзе // Биополимеры и клетка. — 1985. — Т. 1, № 6. — С. 293-307. — Бібліогр.: 31 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Биополимеры и клетка |
| description | Обзор собственных данных авторов о способах синтеза и свойствах большого количества новых ингибиторов биосинтеза ДНК и РНК in vitro и in vivo. На индивидуальных матрицах с участием очищенных ДНК- и РНК-полимераз определен молекулярный механизм действия этих ингибиторов в реакциях полимеризации, пирофосфоролиза и гидролиза. Показана применимость некоторых ингибиторов для изучения репликации в культуре клеток эукариот, в эмбрионах и ядрах клеток, а также репарации ДНК в хроматине.
Огляд власних даних авторів щодо способів синтезу і властивостей великої кількості нових інгібіторів біосинтезу ДНК і РНК in vitro і in vivo. На індивідуальних матрицях за участі очищених ДНК- і РНК-полімераз визначено молекулярний механізм дії цих інгібіторів у реакціях полімеризації, пірофосфоролізу і гідролізу. Показано застосовність деяких інгібіторів для вивчення реплікації в культурі клітин еукаріотів, в ембріонах і ядрах клітин, а також репарації ДНК у хроматині.
This review summarizes the authors' data on the pathways of the synthesis and properties of a great number of new inhibitors of DNA and RNA biosynthesis in vitro and in vivo. The molecular mechanism of the action of these inhibitors in the reactions of polymerization, pyrophosphorolysis and hydrolysis is determined using individual templatfts with involvement of purified DNA and RNA polymerases. Some of these inhibitors are shown to be applicable fo studying of replication in the culture of eukaryotic cells, in embryos and cell nuclei, as well as for repairing DNA in chromatin.
|
| first_indexed | 2025-11-24T09:18:21Z |
| format | Article |
| fulltext |
У Д К 577.123
НОВЫЕ ИНГИБИТОРЫ БИОСИНТЕЗА ДНК И РНК
IN VITRO И IN VIVO
Р. Ш. Бибилашвили, 3. Г. Чиджавадзе, А. А. Краевский,
М. К. Куханова, А. М. Атражев, А. В. Ажаев, Т. В. Кутателадзе
Механизм функционирования ферментов и мультиферментных комплек-
сов, осуществляющих процессы транскрипции, репликации, обратной
транскрипции, генетической рекомбинации, репарации Д Н К и др., изу-
чен совершенно недостаточно, особенно у эукариот. Среди основных
подходов, применяемых в настоящее время для решения этих проблем,
следует упомянуть следующие.
1. Изучение свойств и состава мультибелковых комплексов, выде-
ленных из клетки. Среди лучше изученных в настоящее время можно
назвать репликативные комплексы вирусов, фагов, прокариот, а также
транскрипционные комплексы различного происхождения. Гораздо
меньше известно о репарации, рекомбинации и др. процессах.
2. Ступенчатая сборка синтезирующих Д Н К мультибелковых ком-
плексов из очищенных компонентов и изучение их функционирования
на каждой ступени сборки.
3. Ингибиторный анализ процессов биосинтеза Д Н К и РНК. Этот
подход дает наибольшие возможности для сравнения комплексов, син-
тезирующих Д Н К и Р Н К in vitro и in vivo, что обеспечивает надеж-
ность выводов, полученных in vitro. Кроме того, ингибиторный анализ
является постоянным и незаменимым компонентом двух первых под-
ходов и имеет, таким образом, самостоятельное значение при работе
in vitro.
Здесь будут сообщены данные о новых субстратоподобных инги-
биторах биосинтеза Д Н К и РНК, полученных и изученных в лаборато-
риях генетической инженерии ВКНЦ АМН СССР и химии белкового
синтеза ИМБ АН СССР, частично — в сотрудничестве с другими лабо-
раториями.
Субстратоподобные ингибиторы широко используют в ингибитор-
ном анализе биосинтеза Д Н К и РНК. Это вызвано в первую очередь
тем, что планирование свойств при их создании в определенной сте-
пени базируется на известных теоретических предпосылках. Почти все
они по своей природе являются аналогами природных субстратов, в ко-
торых модифицируются основание, углеводная часть или трифосфатная
группа. Поэтому, планируя синтез какого-либо нового типа аналогов,
можно в определенных пределах предугадать их свойства в полиме-
разных системах in vitro и in vivo. Например, вызывая определенные
изменения в основаниях, можно предсказать, как это повлияет на уз-
навание таких аналогов субстратов комплексом [праймер-матрица+
+белки] как с точки зрения непосредственно узнавания, так и обра-
зования продуктивного ферментативного комплекса [праймер-матри-
ц а + б е л к и + а н а л о г субстрата]. Здесь мы не будем касаться аналогов
субстратов с модифицированными основаниями, так как такие соеди-
нения наиболее широко применяют для изучения механизмов мутаге-
неза. Наше внимание было сосредоточено на аналогах субстратов, мо-
дифицированных по углеводному остатку.
Наиболее мощными субстратоподобными ингибиторами, как пра-
вило, являются так называемые терминаторы синтеза Д Н К и РНК.
Для синтеза РНК, катализируемого РНК-полимеразой из Е. coli, были
ранее известны два типа таких соединений, а именно rNTP(3 'H) [1]
и r N T P ( 3 O C H 3 ) [2, 3]. Эти соединения проявляли высокую специфич-
ность к синтезирующему Р Н К комплексу [ Д Н К + Р Н К - п р а й м е р + Р Н К -
полимераза]. Далее, эффективно включившись в З'-конец РНК-прай-
мера, они прерывали дальнейшую полимеризацию, так как в их З'-по-
ложении отсутствовала группа, способная к ковалентному взаимодейст-
Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 6 3 - 5-575 2 9 3
вию с α-фосфатом следующего субстрата. Поэтому такие соединения, в
частности rNTP(3OCH3), оказались удобными для терминации цепей
Р Н К при определении первичной структуры Д Н К по нуклеотидной
последовательности транскрипта [3]. Основной недостаток ΓΝΤΡ(3Ή)
и rNTP(3OCH 3 ) состоял в том, что в их З'-положении содержалась
группировка, химически инертная, модификация которой совершенно
исключалась. По этой причине в З'-конец транскрипта не представля-
лось возможным включить какой-либо остаток, обладающий репор-
терными, лигандными или другими свойствами.
Чтобы преодолеть эти недостатки, мы разработали общую схему
синтеза и провели изучение в РНК-синтезирующей системе in vitro
ряда аналогов rNTP, содержащих в З'-положении аминогруппу и ее
производные. Аминогруппа в З'-положении представлялась нам пер-
спективным заместителем по следующим причинам: эта группа по объ-
ему и электроноакцепторным свойствам не слишком отличается от гидро-
ксила; замена гидроксила в З'-положении на аминогруппу не сильно
изменяла общую конформацию молекулы, что было известно из иссле-
дования ПМР-спектров соответствующих нуклеозидов [4, 5]. В то же
время в литературе отсутствовали данные, которые характеризовали
бы свойства аминогруппы в З'-положении субстрата в полимеризую-
щих нуклеотиды системах; другими словами, не было известно, ката-
лизируют ли ферменты полимеризации образование фосфоамидных
связей. Поэтому для введения аминопроизводных нуклеотидов в прак-
тику молекулярнобиологических исследований было необходимо выяс-
нить некоторые вопросы.
На первом этапе в результате экспериментального рассмотрения
ряда вариантов нами разработана общая схема синтеза rNTP(3 'N 3 ) ,
rNTP(3 'NH 2 ) и их З'-производных [6—8], позволяющая синтезировать
все названные соединения с каждым из природных нуклеиновых ос-
нований—аденином, гуанином, цитозином и урацилом. Д л я этого най-
дена простая, короткая и эффективная схема синтеза исходного заме-
щенного сахара (I) , который конденсацией с защищенными основа-
ниями (В—X) дает соответствующие нуклеозиды (II) с азидогруппой
в З'-положении — схема (1). Эта азидогруппа на любой последующей
стадии может быть превращена в аминогруппу.
294 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 6
Азидонуклеозиды превращали далее в соответствующие 5'-трифос-
фаты rNTP(3 'N 3 ) и восстанавливали в rNTP(3 'NH 3 ) [8]. Аминогруп-
па в ΓΝΤΡ(3'ΝΗ2) проявляла ярко выраженные нуклеофильные свойст-
ва и легко реагировала с N-биотинилимидазолом, прокрашивалась
флуорескамином; в результате этих реакций получены rNTP (3'NHbio)
и rNTP(3 'Nf luo ) . Одна из групп этих соединений — rNTP (3'Nfluo) —
несет флюоресцентную метку, другая — rNTP (3'NHbio) —лигандную
группу. Строение всех исследуемых соединений представлено на схе-
ме (2).
Все полученные соединения испытаны в бесклеточной системе син-
теза Р Н К на Д Н К фага DIIIT7, инициируемого с промотора А1; син-
тез катализировался РНК-полимеразой из Е. coli. Эффективными тер-
минаторами синтеза Р Н К оказались r N T P ( 3 ' N H 2 ) : включаясь в З'-ко-
нец растущей цепи РНК, они прекращали ее дальнейшую элонгацию,
что видно из фотографий электрофореза в полиакриламидном геле
(ПААГ). Эффективность rNTP(3 'NH 2 ) как терминаторов была срав-
нима с эффективностью rNTP (3 ' 0СН 3 ) . Из этих данных следовало, что
r N T P ( 3 ' N H 2 ) , включившись в цепь РНК, прерывает последующее уд-
линение цепи РНК. Отсутствие образования фосфоамидных связей
при катализе синтеза Р Н К РНК-полимеразой из Е. coli показано так-
же в экспериментах, в которых реплику РН К подвергали кислотной
обработке [8]. При таком воздействии фосфамидные связи гидролизу-
ются и, таким образом, можно было бы наблюдать уменьшение длины
реплики после соответствующей обработки по сравнению с контролем.
Однако никакого изменения не было. Из этих данных становится оче-
видно, что во время эксперимента rNTP(3 'NH 2 ) включается исключи-
тельно в З'-конец транскрипта и РНК-полимераза из Е. coli не спо-
собна катализировать синтез фосфамидных связей.
Обычно реакцию синтеза РН К проводили при рН 8,0; в этом слу-
чае З'-аминогруппа находится в протонированном состоянии на 70—
80 %, так как ее р/Са = 8,5 [8]. В то же время известно, что протониро-
ванная NH3+-rpynna обладает лишь слабыми нуклеофильными свойст-
вами. Поэтому были поставлены опыты при рН 7; 8,5; 9 и 9,5. При рН
9 и 9,5 rNTP(3 /NH 2 ) практически полностью депротонирована. Однако
и при рН выше рКа rNTP (3'ΝΗ2) СТОЛЬ же эффективно терминирова-
ли синтез РНК.
Терминаторными свойствами обладали rNTP(3 'N 3 ) , rNTP(3 / NH 2 ) ,
rNTP (3'NHbio) и rNTP (З'Nfluo), хотя некоторые из них было необ-
ходимо использовать в более высокой концентрации. Терминирование
синтеза РНК некоторыми соединениями показано на рис. 1 (см.
вклейку), а также в табл. 1, где в условной относительной шкале при-
водятся свойства названных и некоторых других изученных нами сое-
динений.
Основные наши усилия были, однако, посвящены ингибиторам био-
синтеза ДНК. Был выбран тот же подход — синтез субстратоподобных
ингибиторов, модифицированных по дезоксирибозидному остатку.
Ранее был известен только один тип терминаторов синтеза Д Н К
[9—11]. Это связано с более строгим отбором ДНК-полимеразами
своих субстратов за счет наличия у бактериальных полимераз 3'->5'-
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 6 295
экзонуклеазной активности, а также достаточно высокой пирофосфо-
рилазной активности у ДНК-полимераз по сравнению с РНК-полиме-
разами. В качестве примера более высокой специфичности ДНК-поли-
мераз по сравнению с РНК-полимеразами можно привести свойства
dNTP(3 ; OCH 3 ) ; эти соединения совершенно не обладают терминатор-
ными качествами при синтезе ДНК, тогда как r N T P ( 3 O C H 3 ) , как упо-
миналось выше, эффективно терминируют синтез РНК.
Т а б л и ц а 1
Субстратные свойства ряда соединений в синтезе РНК,
катализируемом РНК-полимеразой Е. coli
Substrate pr perties of some compounds in RNA synthesis
catalyzed by E. coin RNA polymerase
Соединение Включение в З'-конец
цепи РНК*
Возможность
элонгации цепи
после включения
rNTP (3'NH2) + + +
rNTP (3'NHbio) + + + —
rNTP (3'Nfluo) + + —
rNTP (3'N3) + —
rNTP (2'N\) ++ +
rNTP (2'NH2) + - ++
rNTP (З 'ОСНз) + + + — .
rNTP (2 'ОСНз)
dNTP (3'NH2) —
araNTP (3'NH2) —
* Величина терминирующего эффекта пропорциональна коли-
честву знаков « + » ; знак «—» показывает отсутствие терми-
нации.
Т а б л и ц а 2
Этапы выделения ДНК-полимеразы а из тимуса теленка (1 кг)
Stages of isolation of DNA polymerase a from calf thymus (1 kg)
Этапы выделения Белок, мг Удельная актив-
ность, ед,/мг*
Общая
активность, ед. Выход, %
Гомогенат 100000 2,5 250000 100
Фосфоцеллюлоза 800 250 200000 80
Гидроксиапатит 125 800 100000 40
Сефароза 6В 53 1500 80000 32
ДЭАЭ- целлюлоз а 20 2500 50000 20
Bio Rex 70 4 5000 20000 8
* 1 ед. активности соответствует 1 нмолю субстрата, включенного в цепь Д Н К за 1 ч,
37 °С.
Из литературы известно, что среди испытанных ранее соединений
терминаторными свойствами в синтезах, катализируемых ДНК-поли-
меразами, обладали только ddNTP [9, 10]. Эти соединения сыграли
и сейчас играют огромную роль при определении структуры Д Н К по-
лимеризационным методом [10, 11]. Однако ddNTP обладают сравни-
тельно высоким субстратным сродством только к некоторым ДНК-по-
лимеразам (ДНК-полимеразе I из Е. coli, ДНК-полимеразе фага 7Y,
ДНК-полимеразам типа β из млекопитающих, ревертазе, концевой де-
зоксинуклеотидилтрансферазе), но основные реплицирующие ДНК-по-
лимеразы млекопитающих (типа а) практически не используют ddNTP
в качестве субстрата.
Нами разработана общая схема синтеза 3 /-азидо-2 /,3 /-дидезокси-
нуклеозидов — III, схема (3) [12, 13], которые далее превращаются в
dNTP(3 /NH 2 ) [14] (в этой части работы принимали участие также
Н. Б. Дяткина и В. Е. Зайцева). Схема пригодна для синтеза нуклео-
зидов с неприродными основаниями, полезными для изучения физико-
296 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 6 3 - 5-575 296
Далее нуклеозиды IV, схема (3), либо восстанавливают в З'-ами-
но^^З ' -дидезоксинуклеозиды V, либо фосфорилируют и затем восста-
навливают в dNTP(3 'NH 2 ) . Последние в соответствии со схемой (4)
переводятся в производные по З'-аминогруппе.
Для обеспечения ферментативной части исследования нами осу-
ществлено выделение ДНК-полимераз α (из тимуса теленка) и β (из
печени крыс), причем методики выделения существенно модифициро-
ваны по сравнению с литературными. Схемы выделения ферментов
суммированы в табл. 2 и 3, чистота проиллюстрирована электрофоре-
зом в ПААГ (рис. 2, см. вклейку). При седиментации ДНК-полимера-
зы α в градиенте сахарозы найдено, что фермент содержит две фрак-
ции: одна — 8 0 % общей активности, коэффициент седиментации 5,7 S,
вторая — 2 0 % и 9,0 S соответственно. Из литературы известно, что
фракция 5,7 S является продуктом протеолиза нативного фермента,
9,0 S, но обладает ферментативной активностью [15]. Фермент свобо-
ден от экзо- и эндонуклеазной активностей и от фосфатазной активно-
сти. Ингибирование фермента N-этилмалеимидом, быстрая темпера-
турная инактивация, а также ингибирование araNTP позволяют отне-
сти его к ДНК-полимеразам типа а.
Для ДНК-полимеразы β предложена эффективная и воспроизводи-
мая методика выделения и очистки, основанная на учете свойств этого
Т а б л и ц а 3
Этапы выделения ДНК-полимеразы β из печени крыс
Stages of isolation of DNA polymerase β from rat liver
Этапы выделения
Очистка и экстракция хроматина
Белок, мг
3300+нуклеиновая кис-
Удельная
актив-
ность,
ед./мг*
Общая
актив-
ность, ед.
Выход, %
лота 27 89000 100
ДЭАЭ-целлюлоза+фосфоцеллю-
лоза 25,8 1000 25800 29
Affigel Blue А 2,0 9500 19000 2 1 , 2
ДНК-сефароза 0,24 31000 7400 8 , 4
* 1 ед. активности соответствует 1 нмолю субстрата, включенного в цепь Д Н К за 1 ч,
37 °С.
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 6 297
типа ферментов. Путь очистки изложен в табл. 3. Полученный фер-
мент имел удельную активность, соответствующую литературным дан-
ным для ДНК-полимераз из других источников [16—18]. Фермент
имел молекулярную массу 38000—40000 (по подвижности в ПААГ в
денатурирующих условиях), pi 8,6—8,9, стабилен при действии N-этил-
малеимида; синтез, катализируемый полученной полимеразой, инги-
бируется ddNTP, но довольно резистентен к araNTP. Все это позво-
ляет отнести фермент к группе ДНК-полимераз β. Фермент не содер-
жит экзо- и эндонуклеазных активностей и при электрофорезе в ПААГ
дает одну полосу при прокраске серебром (рис. 2).
Терминаторные свойства аналогов нуклеозид-5'-трифосфатов изу-
чали в системе полимеризации, содержащей фрагмент плазмиды
Рис. 3. Схема эксперимента по элонгации (этапы а также гидролизу или пиро-
фосфоролизу (1->3->4а->6) с участием Д Н К плазмиды pBRS2950: bp — пары основа-
ний; — —радиоактивно меченные фрагменты ДНК; ... — фрагменты ДНК, син-
тезированные в присутствии ингибиторов. Стрелками показаны места расщепления
Д Н К рестриктазами.
Fig. 3. A scheme of elongation (stages / - > 5 ) , hydrolysis of pyrophosphorolysis (1-+3-*
-+4a-+6) with pBRS2950 plasmid DNA: bp — base pairs; radioactive labeled
DNA fragments; ... •— DNA fragments synthesized in the presence of inhibitors. Arrows
show the restriction sites on the DNA molecule after the action of endonucleases Hind III
and EcoRl.
pBRS2950, содержащей видоизмененный (удлиненный по сравнению с
диким штаммом pBR322) фрагмент между участками рестрикции
EcoRI и HindiII, на котором удобно проводить эксперименты по поли-
меризации [19].
Схема проведения опытов показана на рис. 3. Д Н К плазмиды
pBRS2950t несущей по одному участку расщепления для рестриктаз
EcoRI и HindiII, с длиной малого фрагмента между этими участками
130 пар оснований (структура фрагмента представлена на схеме (5))>
расщепляемая EcoRI (этап 1), и линейная Д Н К обрабатываются экзо-
нуклеазой III из Е. coli 8—15 мин (этап 2), в течение которых участки
Д Н К длиной 70—120 нуклеотидных остатков подвергаются гидролизу.
После этой стадии Д Н К метят, проводя частичное достраивание гид-
ролизованных цепей в присутствии трех немеченых dNTP и одного
[a-32P]dNTP в присутствии ДНК-полимеразы I (этап 3). На очищен-
ной от избытка субстратов Д Н К проводят дальнейший ресинтез в при-
сутствии субстратов и ингибитора, катализируемый той ДНК-полиме-
разой, которая изучается в этом эксперименте (этап 4). По заверше-
нии синтеза Д Н К расщепляется рестриктазой Hindlll (этап 5 ) и ее
фрагменты подвергаются электрофорезу в геле (этап 6). Условия элек-
трофореза выбирают так, чтобы малые фрагменты Д Н К находились
на рабочем участке геля, а большие — оставались вне его. По карти-
нам электрофореза удается проанализировать эффект ингибиторов на
каждом конкретном шаге полимеризации (пирофосфоролиза, гидроли-
298 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 6 3 - 5-575 298
за) . Радиоактивно меченную (после этапа 3) Д Н К можно также под-
вергать пирофосфоролизу или гидролизу, катализируемым ДНК-поли-
меразой (этап 4'), последующей рестрикции (этап 5') и электрофорезу.
1 GAAT TCGGGG CGCACAC TGG СТ С TAGGTGA СТ ТАА GCGCA CCACGCACAT
. CTTAAGCCCC &CGTGTGA.CG GAGATCCACT GAA TTC&CGT GGTGCGTGTA
51 AAGGTGAAAC AAAACGG TTG AC А AC A TGAA GTAAACACGG TACGATGTAC
TTCCACTTTG ТТТТ&ССААС TGTTGTACTT CATTTGT GCC AT G СТА С A TG
101 CACATGAAAG GACA&TGAGT СААА TTCGAT AAGCT
GTGTACTTTG CTGTCA СТСА GTTTAAGCTA TTCGA
В некоторых случаях использовали стандартную систему реплика-
ции М13 ршДНК с химически синтезированным олигонуклеотидным
праймером [20].
Реакции полимеризации на индивидуальных матрицах имеют ряд
важных преимуществ перед опытами с суммарной ДНК. При прове-
дении полимеризации на индивидуальной матрице видны взаимоотно-
шения полимеризующий комплекс — субстрат — ингибитор в каждом
шаге полимеризации. На фотографиях электрофоретических гелей вид-
ны эти взаимоотношения на каждом нуклеотидном звене, что дает воз-
можность связать каждый этап реакции полимеризации со структурой
матрицы и праймера на этом участке, структурой субстрата или инги-
битора. Из данных электрофореза удается увидеть, процессивно ли ра-
ботает фермент, взаимоотношения скоростей элонгации и обратных
реакций — пирофосфоролиза и гидролиза.
На первом этапе исследований нами показано, что dNTP(3 /NH 2 )
оказались эффективными терминаторами всех тестированных ДНК-по-
лимераз. Тестированы были следующие ферменты: ДНК-полимераза
I из Е. coli, ДНК-полимераза а из тимуса теленка, ДНК-полимераза β
из печени крыс [19], обратная транскриптаза, кодируемая вирусом
птичьего миелобластоза, а также концевая дезоксинуклеотидилтранс-
фераза из тимуса теленка. Контролем служили ddNTP. Способность
аналогов NTP терминировать синтез Д Н К (включение в З'-конец цепи
Д Н К ) , катализируемый обратной транскриптазой, представлена сле-
дующими данными:
ddNTP +
dNTP(3 'NH 2 ) +
dNTP (3'NHacet) +
dNTP(3'NHbio) +
dNTP (3'Nfluo) +
dNTP(3'F) +
araNTP (3'NH 2 ) +
araNTP (3'N 8) +
araNTP +
rNTP —
Примерно одинаковую эффективность dNTP(3 'NH 2) и ddNTP по-
казали для ДНК-полимеразы β и обратной транскриптазы (часть опы-
тов с обратной транскрипцией выполнена А. М. Мазо). Синтез,
катализируемый обратной транскриптазой, терминировался также
araNTP (3'NH2), araNTP (З'N3) и dNTP(3 'F) . В случае ДНК-полиме-
разы I, применяемой обычно для определения первичной структуры
методом Сенгера, dNTP(3 /NH 2) были в 2—5 раз эффективнее, чем
ddNTP (эти опыты выполнены А. С. Краевым, Б. К. Черновым и
К. Г. Скрябиным); для ДНК-полимеразы α ddNTP практически вооб-
ще не обладали терминаторными свойствами, тогда как dNTP(3 'NH 2 )
были высокоэффективны. И только для концевой дезоксинуклеотидил-
Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 6 3 - 5-575 299
трансферазы ddNTP были более эффективны, чем dNTP(3 'NH 2 ) , хотя
последние также оказались хорошими терминаторами. В качестве при-
меров приведены рис. 4 (см. вклейку) и рис. 5.
Термипаторные свойства dNTP(3'NH2) означают следующее. 1 —
dNTP(3 'NH2) узнаются комплексом [ п р а й м е р - м а т р и ц а + Д Н ^ - п о л и м е -
раза] как субстраты, после чего 5 /-мононуклеотидный остаток
dNTP(3'NH 2) включается в З'-конец праймера. Это включение непо-
средственно видно на картине гель-электрофореза, так как полосы
Рис. 5. Включение NTP в З'-консц [ 3 2 Р] -
d (pGTAATCCCATGTT), рН 6,5, 37 °С,
20 мин: dTTP (1 ); rUTP (2); 500 мкМ
rUTP (2'N 3) (3); dTTP(3'NH 2 ) (4);
dTTP (3'NHbio) (5); dTTP (3'Nfluo) (6);
dTTP (3'NHacet) (7); исходный олигонук-
леотид без инкубации (8); ddCTP (9);
»'. dCTP (3'NH 2 ) (10); агаСТР (11); rCTP
< , * Γ * " * V <> " " ( 1 2 ) ; a r a A T P ( 3 , N H ^ ) o n dATP(3'F) (14);
' -J 0 ' *·•' ?\ '* олигонуклеотид, инкубированный без rNTP
: (15).
Fig. 5. Incorporation of NTP into 3'-termini of [ 3 2 P ] -d (pGTAATCCCATGTT), pH 6.5,
37 UC, 20 min: dTTP (1): rUTP (2); 500 μΜ. rUTP(2 'N 3 ) (3); dTTP(3'NH 2 ) (4);
dTTP (3'NHbio) (5); dTTP (3'Nfluo) (6); dTTP (3'NHacet) (7); control oligonucleotide
without incubation (8); ddCTP (9); dCTP(3'NH 2 ) (10); araCTP (11); rCTP (12);
araATP(3'NH 2 ) (13); dATP(3'F) (14); ol igonucleotide incubated without rNTP (15).
олигонуклеотидов оканчиваются теми нуклеотидными остатками, кото-
рые по природе основания соответствуют терминатору [19] и ни на
каких других. 2 — После включения нуклеотидного остатка в З'-конец
праймера дальнейшее продолжение цепи Д Н К становится невозмож-
ным. В случае ddNTP это совершенно очевидно, так как в З'-положе-
нии ddNTP не содержится способной к реакции химической группы.
Однако у dNTP(3 /NH 2) в З'-положении имеется NH2-rpynna, которая
в принципе может участвовать в последующей реакции, образуя фосфо-
амидную связь — NH—Ρ (О) (ОН)—О—. Вопрос в нашем случае состо-
ял лишь в том, способны ли ДНК-полимеразы катализировать образо-
вание такой фосфамидной связи.
Для выяснения этого были сделаны следующие контроли. После
завершения опытов с терминацией к реакционной смеси добавляли из-
быток субстратов и инкубировали ее дополнительно. Никакого изме-
нения распределения полос на гелях по сравнению с контролем не за-
фиксировано. В другой серии опытов после терминации полимеризации
смесь инкубировали при рН 2—3 (добавляя уксусную кислоту) раз-
личное время, после чего проводили электрофорез. И также никакого
изменения полос на электрофореграммах замечено не было. Эти дан-
ные иллюстрируют отсутствие образования фосфамидных связей, ибо
в первом случае полосы должны были бы сдвинуться в более поли-
мерную область, а во втором — напротив, в менее полимерную [19].
Однако при нейтральных рН NH2-rpynna в dNTP(3'NH2) находит-
ся в протонированном состоянии NH3+, как для rNTP(3 / NH 2 ) .
В dNTP рК a NH2-rpynnbi составляет 9,1—9,2 [21]. Поэтому следу-
ющие опыты по терминации были проведены при рН 8 и 8,5. При рН
8,5 по крайней мере 20 % терминатора и также затерминированного
праймера находятся в депротонированной форме. Однако и при этой
величине рН картина полос не изменялась. Таким образом, очевидно,
что РНК- и ДНК-полимеразы не способны катализировать образова-
ние фосфамидных связей [8, 19].
Затем в качестве ингибиторов элонгации Д Н К были испытаны за-
мещенные по З'-аминогруппе соединения, а именно dNTP (3'NHacet),
dNTP(3 /NHbio) и dNTP (3'Nfluo). Эти исследования проведены для
трех ферментов — ДНК-полимеразы I из Е. coli, а из тимуса теленка
и концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы из тимуса теленка [22].
300 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 6 3 - 5-575 298
Все три соединения показали эффективные терминаторные свойства
при катализе ДНК-полимеразой I; dNTP(3'NHacet) и в более слабой
степени dNTP (3'NHbio) — для ДНК-полимеразы α и, наконец,
dNTP (3'NHacet) и dNTP (3'NHbio) для дезоксинуклеотиднлтрансфера-
зы. Эти данные отражены на рис. 5 и 6 (см. вклейку) и в табл. 4.
Т а б л и ц а 4
Субстратные свойства аналогов NTP для концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы
Substrate properties of NTP analogs for terminal deoxynucleotidyltransferase
Нуклеотид
Максимальное количество ну-
клеотидиых остатков, вклю-
ченных в олигонуклеотид
Отношение скоростей включе-
ния аналога (V.,) и (V(]j-pp)
dTTP оо 1,0
(JCTP оо 2,0
dGTP и dATP оо 1,2
ddCTP 1 0,5
ddATP 1 0,3
dTTP(3'NH 2 ) 1 0,1
d C T P ^ ' N H , )
dTTP (3'NHacet)
d T T P ^ ' N H b i o )
1 0,2 d C T P ^ ' N H , )
dTTP (3'NHacet)
d T T P ^ ' N H b i o )
1 0,2
d C T P ^ ' N H , )
dTTP (3'NHacet)
d T T P ^ ' N H b i o ) 1 0,15
dTTP(3'Nfluo) 0
d A T P ( 3 T )
d T T P ( 3 T )
1 0,4 d A T P ( 3 T )
d T T P ( 3 T ) 1 0,3
dNTP (З'ОСНз) 0 0
r N T P ^ N H s ) 0 0
rNTP (3OCH3) 0 0
r N T P ( 2 / N 3 ) 1—2 0,05
araNTP 3 0,2—0,3
araNTP(3 / NH 2 ) 1 0,15—0,2
rNTP 2 0,1—0,2
П р и м е ч а н и е . Соединения r N T P ( 2 / N 3 ) и r N T P ( 2 / N H 2 ) синтезированы Л. А. Алек-
сандровой; rNTP(З'ОСНз) и d N T P ( 3 O C H 3 ) — В. Л. Флорентьевым и А. М. Крициным;
araNTP(3 'NH 2 ) — А . М. Папчихиным; dNTP(3'F) — в лаборатории И. А. Михайлопуло.
Суммируя данные по терминаторным свойствам dNTP(3 'NH 2 ) ,
можно сделать следующие выводы.
1. Замещение З'-гидроксила в природных субстратах ДНК-поли-
мераз dNTP на аминогруппу не приводит к значительному ухудшению
субстратных свойств dNTP(3'NH2) на стадии включения в З'-конец
цепи ДНК. Из испытанных нами ферментов (табл. 5, 6) все типы об-
ладали высоким сродством к dNTP(3 'NH 2 ) ; единственным ферментом,
для которого dNTP(3 /NH2) уступали по сродству ddNTP, была конце-
вая дезоксинуклеотидилтрансфераза, но и в этом случае сродство
dNTP(3 /NH 2) было достаточно велико. В литературе не сообщалось
ни об одном аналогичном ингибиторе со столь широким спектром ак-
тивности. Из сказанного можно сделать заключение, что замена гид-
роксила на аминогруппу в З'-положении не сильно искажает конфор-
мационные и электронные свойства молекул нуклеозидтрифосфатов.
2. Будучи присоединенными к З'-концу праймера З'-аминонуклео-
тиды полностью прерывают дальнейшую элонгацию цепи.
3. Даже введение достаточно объемных заместителей по З'-амино-
группе сохраняет терминаторные свойства З'-замещенных нуклеозид-
трифосфатов, по крайней мере для некоторых ДНК-полимераз.
Будучи присоединенными к З'-концу праймера, З'-аминонуклеоти-
ды со свободной или замещенной аминогруппой ингибируют также
реакцию пирофосфоролиза, а для ДНК-полимеразы I также и 3'—>5'-
экзонуклеазного гидролиза. Эти данные отчетливо видны на фотогра-
фиях электрофорезов в ПААГ. В качестве примера приведен гидролиз
Д Н К (рис. 7, см. вклейку), катализируемый ДНК-полимеразой I.
Свойство терминаторов ингибировать гидролиз, ломимо сведений о
процессе синтеза ДНК, имеет еще одно существенное значение для
изучения первичной структуры Д Н К методом Сенгера. Качество тер-
Е И О О О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА, 1985*, т. 1, '№' 6 301
минирующего субстрата для определения первичной структуры, ката-
лизируемого бактериальными ДНК-полимеразами, прямо пропорцио-
нально скорости включения терминатора в З'-конец Д Н К и обратно
пропорционально скорости его З'-^-б'-экзонуклеазного гидролиза. Толь-
ко в случае достаточно большого различия в скоростях включения/
/гидролиза соединения будут служить терминаторами. Причина боль-
шого различия в скоростях прямой и обратной реакции для термина-
торов по сравнению с природными субстратами заключается, видимо,
в различии скоростей ассоциации фермента с комплексом [матрица+
+праймер] .
Т а б л и ц а 5
Свойства аналогов NTP в реакциях терминации, элонгации, гидролиза
или пирофосфоролиза, катализируемых ДНК-полимеразами I и а
Properties of NTP analogs in the course of elongation, hydrolysis
or pyrophosphorolysis reactions catalyzed by DNA polymerases I and a
Ингибитор
ДНК-поли-
мераза
Терминация
элонгации
Специфическое
ингибирование
гидролиза
Специфическое
ингибирование
пирофосфоролиза
d N T P ( 3 ' N H 2 ) I + + + d N T P ( 3 ' N H 2 )
a + +
dNTP (3'NHacet) I + + +
α +
dNTP (3'NHbio) I + +
a —
dNTP (3'Nfluo) I + +
a + -
dNTP (3'F) I + +
a —
ddNTP I + +
a —
rNTP I — +
a —
rNTP(2 'NH 2 ) и I — + -
rNTP(2 'N 3 ) a —
rNTP(3 'NH 2 ) I — —
α
П р и м е ч а н и е . « + » — сильное специфическое к основанию ингибирование; «~\—:
специфическое, но не сильное ингибирование; « — » — н е т ингибирования.
Т а б л и ц а 6
Ингибирование репаративного синтеза ДНК
в хроматине с помощью dNTP(3'NH2)
Inhibition of repair synthesis in chromatin
by dNTP(3'NH2)
Концентрация инги- Молярное соотноше-
Ингибитор
битора, при которой ние ингибитор:суб-
Ингибитор достигается 50 %-ное страт при 50 %-ном
ингибировиние син- ингибировании
теза, мкМ д н к
dTTP(3'NH 2 ) 0,65 1 : 1
dATP(3 'NH 2 ) 0,65 1 : 1
dCTP(3 'NH 2 ) 0,65 1 : 1
dGTP(3 'NH 2 ) 1,5 2 : 1
ddTTP 0,65 1 : 1
araTTP 2,4 4 : 1
Чтобы оценить возможность использования новых ингибиторов в
клеточных системах, на следующем этапе мы изучили действие
dNTP(3 / NH 2 ) на репликацию Д Н К в ядрах эмбрионов морского ежа.
Эта работа выполнена в сотрудничестве с Н. А. Терентьевой и В. А. Рас-
302 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 6
сказовым [23]. В выделенных ядрах эукарнот происходит синтез фраг-
ментов Оказаки, которые, как правило, не лигируются в полимерные
цепи ДНК. Синтез фрагментов Оказаки катализируется ДНК-полиме-
разой типа а [24, 25]. Однако, в отличие от бесклеточной системы с
чистыми ферментами, в ядрах в синтезе фрагментов Д Н К участвует
более сложный комплекс белков. Вследствие этих причин синтез Д Н К
в ядрах более приближен к репликации in vivo.
Концентрации dNTP(3'NH2) (Μ), при которых синтез Д Н К в яд-
рах эмбрионов ингибируется на 50 % [23], приведены ниже:
dTTP(3'NH 2 ) 2 - Ю - 4
dATP(3 / NH 2 ) 6 - Ю - 5
dCTP (3'NH 2 ) 2 - Ю - 5
агаТТР 1 . 10~ 4
Из этих данных видно, что все соединения эффективно ингибировали
синтез ДНК, причем их действие было близким к эффекту агаТТР —
наиболее мощного ингибитора, катализируемого ДНК-полимеразами а
Рис. 8. Обратимость действия dTTP(3 / NH 2 ) при добавлении 50-кратного избытка dTTP
по отношению к ингибитору (2). Включение [ 3 Н] dCTP без ингибитора принято за 100 %
(1) ; включение [ 3 H ] d C T P в присутствии 4 · 10~4 Μ dTTP (3'NH 2 ) (3) .
Fig. 8. The reversibility of action of dTTP(3'NH 2 ) on addition of a 50-fold excess of
dTTP with respect to the inhibitor (2). Incorporation of [ 3 H ] dCTP to DNA without
the inhibitor within a given time is taken as 100% (1) ; incorporation of [ 3 H]dCTP in
the samples in the presence of 4 · 1 0 ~ 4 Μ dTTP(3'NH 2 ) (3).
Рис. 9. Ингибирование включения [ 3 H] dCyd в Д Н К : 1 — d G u o ( 3 / N H 2 ) ; 2 —
dThd(3'NH 2 ) ; 3 — dAdo(3 'NH 2 ) ; 4 — dCyd(3 'NH 2 ) ; 5 — araCyd.
Fig. 9. Inhibition of [ 3 H]dCyd incorporation into DNA of the embryo by: dGuo(3 'NH 2 )
(1); dThd(3 / NH 2 ) (2); dAdo(3 'NH 2 ) (3); dCyd(3 'NH 2 ) (4); araCyd (5).
синтеза ДНК. По профилю новосинтезированной Д Н К в щелочном
градиенте сахарозы можно увидеть, что основная радиоактивность на-
ходится во фрагментах Д Н К с константой седиментации около 3,5 S
[23]. Из этого очевидно, что в присутствии dNTP(3 /NH 2 ) образуется
меньшее количество фрагментов, но синтезируемые фрагменты имеют
такую же величину, как и в отсутствие dNTP(3 / NH 2 ) . Эти данные по-
казывают, что либо dNTP(3 /NH 2 ) ингибируют инициацию элонгации
фрагментов Оказаки, либо недостроенные фрагменты Оказаки гидро-
лизуются какими-либо экзонуклеазами.
Ингибирование образования фрагментов Оказаки при участии
dNTP(3 /NH 2) происходит, по-видимому, по механизму терминации. В
пользу этого свидетельствуют результаты, представленные на рис. 8.
После внесения dTTP(3 /NH2) синтез Д Н К ингибировался пропорцио-
нально концентрации внесенного dTTP(3'NH2) (рис. 8). После добав-
ления в реакционную массу избытка природного субстрата dTTP по
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 6 3 - 5-575 3 0 3
отношению к ингибитору (соотношение субстрат : ингибитор 50:1) син-
тез Д Н К постепенно восстанавливался в течение 30—40 мин. Если бы
dTTP(3 /NH2) ингибировал синтез Д Н К не по механизму терминирова-
ния, а, например, по механизму конкурентного ингибирования, синтез
ДНК восстанавливался бы сразу же после внесения dTTP. Временная
задержка, наблюдаемая в эксперименте, вызывается необходимостью
репаративного выщепления звеньев терминаторных групп и восстанов-
ления нормального синтеза.
В качестве примера системы с репаративным синтезом Д Н К выб-
ран γ-облученный хроматин печени крыс. Эти опыты выполнены сов-
местно с Н. В. Беляковой и
В. М. Крутиковым [26]. Из-
вестно, что в этом случае в
γ-облученном хроматине при
добавлении субстратов прохо-
дит только репаративный син-
тез, катализируемый ДНК-по-
Рис. 10. Зависимость включения
[ 3 Н] dTHd ( З 'МШ) в Д Н К от времени
в клетках миеломы pz8Ag653 (1) и
контрольное включение [ 3H]dThd (2).
Fig. 10. Time dependence of
[ 3 H ] d T h d ( 3 / N H 2 ) incorporation into
DNA of p38Ag653 myelome cells (1) \
control incorporation of [ 3 H]dThd (2).
лпмеразой β. Однако помимо ДНК-полимеразы β в хроматине содер-
жится большой комплекс других белков, вклад которых в репарацию
Д Н К не известен [27—29].
В табл. 6 показаны концентрации dNTP(3 / NH 2 ) , при которых дос-
тигается 50 %-ное ингибирование репаративного синтеза Д Н К [26].
Как видно из таблицы, ингибирование синтеза Д Н К на 50 % достига-
ется при соотношении ингибитор : субстрат 1:1. Эти данные иллюстри-
руют высокую ингибирующую способность dNTP(3 'NH 2 ) , подобную
действию ddNTP — наиболее мощных ингибиторов репаративного син-
теза ДНК.
Проведенные две серии опытов с ядрами эмбрионов и хроматином
печени крыс показали, что dNTP(3 /NH 2) проявляли мощные ингиби-
рующие свойства на полимолекулярном уровне организации. Однако
при переходе к системе in vivo на клетках возникает ряд дополнитель-
ных проблем, связанных с проницаемостью клеточных стенок для ин-
гибиторов, возможностью фосфорилирования, вероятностью дополни-
тельных метаболических превращений, которые уничтожили бы инги-
биторные свойства изучаемых молекул.
Была проведена серия опытов на клетках миеломы мышей p38Ag653
[30], а также эмбрионах морского ежа Strongylocentrotus intermedius
[31]. Так как известно, что фосфаты нуклеозидов не проникают через
клеточную стенку или проникают в незначительной степени, мы ис-
пользовали для этих целей 3 /-амино-2 /,3 /-дидезоксинуклеозиды, а имен-
но Cyd(3 'NH 2) , Ado(3 /NH2) , Thd(3 /NH2) и Guo(3 'NH 2) .
При проведении опытов с эмбрионами морских ежей найдено, что
все четыре экзогенных природных [3Н]2 /-дезоксинуклеозида (Cyd, Guo,
Ado, Thd) способны включаться в Д Н К эмбрионов или, другими сло-
вами, кинироваться в эмбрионах в соответствующие dNTP (все опыты
с эмбрионами морских ежей выполнены совместно с JI. Л. Терентье-
вым, Н. А. Терентьевой и В. А. Рассказовым).
Далее были проверены все четыре 3 /-амино-2 /,3 /-дидезоксинуклео-
зида в качестве ингибиторов репликации в эмбрионах морских ежей.
Графики рис. 9 демонстрируют ингибирование включения [3H]dCyd в
304 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 6
ДНК. Для сравнения показано ингибирование включения [3H]dCyd
арабинозилцитидином. Такая же картина была обнаружена и для
включения в Д Н К [3H]dThd в эмбрионы морских ежей и клетки мие-
ломы мыши (эксперименты с клетками мыши проведены С. В. Кочет-
ковой).
Анализ этих данных показывает, что, во-первых, все аминонуклео-
зиды ингибируют включение меченых дезоксинуклеозидов В Д Н К при
репликации и, во-вторых, это включение не специфично к основанию,
т. е. каждый аминонуклеозид ингибирует включение любого природно-
го нуклеозида, например, dAdo(3 /NH2) препятствует включению в Д Н К
dCyd или же dThd. Эта неспецифичность включения косвенно подтвер-
ждает ингибирование на уровне образования цепей ДНК.
Для выяснения справедливости этих предположений был приготов-
лен [3Н] dThd (3'ΝΗ2) И в клетках миеломы показаны его превраще-
ния. Препарат проникает в клетки, фосфорилируется, трифосфорилиру-
ется и превращается в [3Н] dTTP (3'NIT2). После этого радиоактивная
метка включается в Д Н К и одновременно с этим ингибируется синтез
Д Н К (рис. 10). Эти данные убеждают в том, что в клетках эукариот
ингибиторы на основе З'-аминонуклеозидов можно успешно использо-
вать для изучения биосинтеза ДНК.
Представленный в настоящей публикации цикл исследований пока-
зывает, что аналоги природных рибо- и 2 /-дезоксирибонуклеотидов,
в которых гидроксил при С3 замещен на аминогруппу, служат мощны-
ми ингибиторами биосинтеза РНК и Д Н К (транскрипции, реплика-
ции, репарации, обратной транскрипции, дополнительного синтеза, ка-
тализируемого концевой дезоксинуклеотидилтрансферазой) в бескле-
точных, а также клеточных системах. Молекулярный механизм ингиби-
рования rNTP(3 'NH 2) И dNTP(3 /NH 2) состоит в терминации цепей
РНК и ДНК. Новый тип ингибиторов представляется нам полезным
для изучения биосинтеза Д Н К в клетках.
В настоящее время для изучения биосинтеза Д Н К in vivo и in vit-
ro в наших лабораториях используют разнообразные аналоги нуклео-
зидов и их фосфатов, содержащие амино- или азидогруппы.
NEW INHIBITORS OF DNA AND RNA BIOSYNTHESIS
IN VITRO AND IN VIVO
R. Sh. Bcabcalashvilli, Z. G. Chidgeavadze, A. A. Krayevsky, Μ. K. Kukhanova,
A. M. Atrazhev, Α. V. Azhaev, Т. V. Kutateladze
Research Institute of Experimental Cardiology.
National Cardiological Scientific Centre, Academy of Medical Sciences of the USSR,
Moscow;
Institute of Molecular Biology, Academy of Sciences of the USSR, Moscow;
Institute of Physiology, Academy of Sciences of the Georgian SSR, Tbilisi
S u m m a r y
This review summarizes the authors' data on the pathways of the synthesis and proper-
ties of a great number of new inhibitors of DNA and RNA biosynthesis in vitro and
in vivo. The molecular mechanism of the action of these inhibitors in the reactions of
polymerization, pyrophosphorolysis and hydrolysis is determined using individual tem-
plates with involvement of purified DNA and RNA polymerases. Some of these inhibi-
tors are shown to be applicable fo studying of replication in the culture of eukaryotic
cells, in embryos and cell nuclei, as well as for repairing DNA in chromatin
1. Suchadonik R. / . Naturally occuring nucleoside and nucleotide antibiotics.— Progr.
Nucl. Acids Res. Мої. Biol., 1979, 22, p. 193—292.
2. Айвазаиівили Β. Α., Бибилашвили P. III., Флорентьев В. А. Аналоги ATP в РНК-
полимеразной реакции.— Молекуляр. биология, 1977, И , № 4, с. 854—863.
3. Specific termination of RNA polymerase synthesis as a method of RNA and DNA se-
quencing / V. D. Axelrod, R. M. Vartikyan, V. A. Aivazashvili , R. Sh. Beabealashvil-
i i .—Nucl . Acids Res, 1978, 5, N 10, p. 3549—3563.
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 6 3 - 5-575 3 0 5
4. Solution conformational analysis of 2 /-amino-2 /-deoxyadenosine, З'-атіпо-З'-сІеохуасІе-
nosine and puromycin by pulsed NMR m e t h o d / Н . Plach, E. Westhof, H. D. Lude-
mann, R. Mengel — Eur. J. Biochem., 1977, 80, N 1, p. 295—304.
5. Proton magnetic resonance studies of 2'-, 3'- and 5'-deoxyadenosine conformations
in solution / E. Westhof, H. Plach, I. Cuno, H. D. Liidemann.— Nucl. Acids Res.,
1977, 4, N 4 , p. 939—953.
6. Aminonucleosides and their derivatives. IV. Synthesis of S'-amino-S'-deoxynucleoside
5'-phosphates / Α. V. Azhayev, A. M. Ozols, A. S. Bushnev et al.— Ibid., 1979, 6,
N 2, p. 625—643.
7. Aminonucleosides and their derivatives. VI. A new synthesis of l ,2,5-tri-0-acyl-3-azi-
do-3-deoxy-p-D-ribofuranose / A. M. Ozols, Α. V. Azhayev, N. B. Dyatkina, A. A. Kray-
evsky.— Synthesis, 1980, N 7, p. 557—559.
8. 3'-Deoxy-3'-aminonucleoside S'-triphosphates — terminators of RNA synthesis, cata-
lyzed by DNA-dependent RNA polymerase from E. coli/T. Kutateladze, R. Beabea-
lashvilli, A. Azhayev, A. Krayevsky.— FEBS Lett., 1983, 153, N 2 , p. 420—426.
9. Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid. XXXIV. Termination of chain growth
by a 2 / ,3 /-dideoxyribonucleotide / M. R. Atkinson, M. P. Deutcher, A. Kornberg et al.—
Biochemistry, 1969, 8, N 12, p. 4897—4904.
10. Sanger F., Nicklen S., Coulson A. R. DNA sequencing with chain terminating inhi-
bitors .—Proc. Nat. Acad. Sci USA. 1977, 74, N 1 2 , p. 5463—5467.
11. Smith A. J. H. DNA sequence analysis by primed synthesis.— Meth. Enzymol., 1980,
65, p. 560—580.
12. Dyatkina N. В., Azhayev Α. V. Aminonucleosides and their derivatives. XII. A new
synthesis of l -O-methyl-3 azido-2,3-dideoxy-D-ribofuranose.— Synthesis, 1984, N 1 1 ,
p. 961—963.
13. Aminonucleosides and their derivatives. XIII. Synthesis of benzimidasole azidonucleo-
s i d e s . / N . B. Dyatkina, A. A. Kpayevsky et al .—Ibid., 1985, N 4 , p. 410—411.
14. Аминонуклеозиды и их производные. XI. Синтез З'-амино-З'-дезоксинуклеозид-б'-
трифосфатов / В. Е. Зайцева, Н. Б. Дяткина, А. А. Краевский и др.— Биоорган,
химия, 1984, 10, № 5, с. 670—680.
15. Grosse F., Krauss G. Purification of a 9S DNA polymerase species from calf thy-
mus.—Biochemistry, 1981, 20, N 19, p. 5470—5475.
16. Chang L. M. S. Low molecular weight DNA polymerase from calf thymus chroma-
tin.—J. Biol. Chem., 1975, 248, N 11, p. 3789—3795.
17. Wang T. S. F., Sedwick W. В., Кот D. Nuclear DNA polymerase, purification and
properties of the homogeneous enzyme from human KB cells. — Ibid., 1974, 249, N 3,
p. 841—847.
18. DNA polymerase from brain neurons is a repair e n z y m e / J . Wager, U, Htibsher,
C. Kuenzle, S. Spodar.— Eur. J. Biochem., 1979, 942, N 3 , p. 361—368.
19. 2/,3/-Dideoxy-3/-aminonucleoside 5'-triphosphates are the terminators of DNA syn-
thesis catalyzed by DNA polymerases / Z. G. Chidgeavadze, R. Sh. Beabealashvill i ,
A. M. Atrazhev et a l .—Nucl . Acids Res., 1984, 12, N 3 , p. 1671—1684.
20. Filamentous coliphage Μ13 as a cloning vehicle: insertion of Hind II fragment of
lac regulatory region in M13 replicative form in vitro / J. Messing, B. Gronenborn,
B. Mueller-Hill, P. Y. Hofschneider .—PNAS USA, 1977, 74, N 7 , p. 3642—3646.
21 Аминонуклеозиды и их производные. X. 2 /-Дезоксидинуклеозиды и 2 /-дезоксидинук-
леодиты с фосфамидными связями / В. Ε Зайцева, Н. В. Скапцова, А. В. Ажаев,
А. А. Краевский.— Биоорган, химия, 1984, 10, № 3, с. 401—407.
22. 2'-3'-Dideoxy-3'-aminonucleoside 5'-phosphates are the terminators of DNA synthesis
catalyzed by DNA polymerases / A. Krayevsky, M. Kukhanova, A. Atrazhev et al.—
Nucl. Acids Res., Symp. Ser., 1984, N 14, p. 283—284.
23. Inhibition of replicative DNA synthesis in nuclei of sea urchin embryo Strongylocent-
rotus intermidium by 2' ,3 /-Dideoxy-3 /-aminonucleoside 5'-triphosphates / M. Kukhano-
va, A. Krayevsky, N. Terentveva, V. Rasskazov.— Biochim. et biophys. acta, 1984,
783, N 2, p. 221—226.
24. Zoncheddu Α., Accomando R., Badaraceo G. Comparison of the effects of differential
inhibitors of eucaryotic DNA polymerases on DNA synthesis in isolated rat liver
nuclei.— Int. J. Biochem., 1983, 15, N 3 , p. 337—342.
25. Wagar Μ. Α., Evans Μ J., Huberman / . A. Effect of 2 / ,3'-dideoxythymidine 5'-tri-
phosphate on HeLa cell in vitro DNA synthesis: evidence that DNA polymerase a is
the only polymerase required for cellular DNA replication.— Nucl. Acids Res., 1978,
5, N 6, p. 1933—1946.
26. 2 / ,3 /-Dideoxy-3 /-aminonucleoside 5'-triphosphates inhibit the repair of DNA in rat
liver chromatin / A. Krayevsky, M. Kukhanova, L. Alexandrova et al.— Biochim. et
biophys. acta, 1984, 783, N° 2, p. 216—220.
27. Белякова Η. В., Нарыжный С. Η., Крутяков В. М. Механизм активирующего дей-
ствия АТР на репаративный синтез Д Н К в хроматине.— Молекуляр. биология, 1980,
14, № 3, с. 586—594.
28. Miller Μ. R., Lui L. Η. Participation of different DNA polymerases in mammalian
DNA repair synthesis is not related to «patch size».— Biochem. and Biophys. Res.
Communs, 1982, 108, N 4 , p. 1676—1682.
29. Крутяков В. Μ., Кравецкая Т. П. Экзогенный синтез Д Н К в выделенном хромати-
не — Молекуляр. биология, 1978, 12, № 3, с. 654—662.
30. Кочеткова С. В., Куханова М. К, Краевский А. А. Фосфорилирование З'-дезокси-
З'-аминотимидина и его включение в клетки миеломы мыши p38Ag653.— Биополи-
меры и клетка, 1985, 1, N° 3, с. 131—134.
306 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 6
31. Ингибирование биосинтеза Д Н К в эмбрионах морских ежей с помощью 2',3'-дидез-
окси-З'-аминонуклеозидов / М . К. Куханова, С. В. Кочеткова, А. А. Краевский
и др.—Биохимия, 1983, 48, № 10, с. 1747—1751.
НИИ эксперим. кардиологии В К Н Ц АМН СССР, Получено 22.01.85
Москва
Ин-т молекуляр. биологии АН СССР, Москва
Ин-т физиологии АН ГССР, Тбилиси
УДК 577.214.625+577.214.42
ТРАНСКРИПЦИЯ СИНТЕТИЧЕСКИХ
ДВУТЯЖЕВЫХ ПОЛИДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДОВ
С ПОВТОРЯЮЩИМИСЯ ФРАГМЕНТАМИ ПРОМОТОРОВ
О. Н. Королева, В. Л. Друца, 3. А. Шабарова
В нашей лаборатории уже в течение нескольких лет ведутся всесто-
ронние исследования свойств синтетических двутяжевых полидезокси-
рибонуклеотидов, содержащих 8-М2-звенные повторы. В рамках этих
исследований нами были получены полинуклеотиды с регулярно пов-
торяющимися элементами промоторов: «идеальной» последовательно-
стью Прибноу (дуплекс I) и областью «—10»-го нуклеотида trp-upouo-
торов (дуплекс II) :
(5'- 3') . Λ TGCA'iTArAATGCATTATAATGCATTATAATGCATTATAA .. .
(З'-5') . . , ACGTAA ΤΑ τ TACGJAA ΤΑ Τ TACGTAATATTACGT ААТАТТ. . . Л^ТІЛЄКС /
( δ з ' ) . . . aactagttaactagttaactagttaactagttaactagtt. . .
(3'-5') . . . ttgatcaattgatcaattgatcaattgatcaattgatcaa
Дуплекс /7
Ранее нами показано, что оба дуплекса способны образовывать
устойчивые к гепарину долгоживущие комплексы с РНК-полимеразой
Е. coli (периоды полураспада 200 и 30 мин соответственно) [1]. В на-
стоящем сообщении речь пойдет о результатах исследования транс-
крипционной активности in vitro и in vivo указанных синтетических
полимеров.
Исследование транскрипции in vitro в присутствии высокой кон-
центрации (0,1 мМ) рибонуклеозидтрифосфатов и избытка РНК-поли-
меразы Е. coli показало, что полимер II является в 2,5 раза более эф-
фективной матрицей, чем полимер I. При этом наблюдается воспроиз-
водимая неравномерность распределения интенсивности полос транс-
криптов: для полимера I характерна периодичность, соответствующая
10 нуклеотидным звеньям, а для полимера II — 4 звеньям. Эти дан-
ные весьма трудно интерпретируемы, поскольку в условиях проведе-
ния реакции инициация транскрипции может происходить не только с
определенных мест внутри ДНК-дуплексов (как это можно было ожи-
дать, учитывая наличие фрагментов промоторов), но также с концов
и нерепарированных разрывов [2]. Кроме того, при транскрипции мат-
риц, содержащих элементы поворотной симметрии, может происходить
преждевременная терминация транскрипции, чему способствует обра-
зование «шпилек» в синтезируемой РНК.
С целью исключить или по крайней мере резко понизить инициа-
цию транскрипции с концов или одноцепочечных разрывов в полиме-
рах I и II была проведена транскрипция в присутствии гепарина. При
этом общее количество транскриптов после 15-минутной инкубации с
ферментом снижалось для дуплекса I на 12%, а для дуплекса II —
на 30 % и обнаруживалась заметная периодичность (совпадающая с
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 6 3 - 5-575 3 0 7
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-152413 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7657 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-11-24T09:18:21Z |
| publishDate | 1985 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Бибилиашвили, Р.Ш. Чиджавадзе, З.Г. Краевский, А.А. Куханова, М.К. Атражев, А.М. Ажаев, А.В. Кутателадзе, Т.В. 2019-06-11T10:59:32Z 2019-06-11T10:59:32Z 1985 Новые ингибиторы биосинтеза ДНК и РНК in vitro и in vivo / Р.Ш. Бибилашвили, З.Г. Чиджавадзе, А.А. Краевский, М.К. Куханова, А.М. Атражев, А.В. Ажаев, Т.В.Кутателадзе // Биополимеры и клетка. — 1985. — Т. 1, № 6. — С. 293-307. — Бібліогр.: 31 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.000191 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152413 577.123 Обзор собственных данных авторов о способах синтеза и свойствах большого количества новых ингибиторов биосинтеза ДНК и РНК in vitro и in vivo. На индивидуальных матрицах с участием очищенных ДНК- и РНК-полимераз определен молекулярный механизм действия этих ингибиторов в реакциях полимеризации, пирофосфоролиза и гидролиза. Показана применимость некоторых ингибиторов для изучения репликации в культуре клеток эукариот, в эмбрионах и ядрах клеток, а также репарации ДНК в хроматине. Огляд власних даних авторів щодо способів синтезу і властивостей великої кількості нових інгібіторів біосинтезу ДНК і РНК in vitro і in vivo. На індивідуальних матрицях за участі очищених ДНК- і РНК-полімераз визначено молекулярний механізм дії цих інгібіторів у реакціях полімеризації, пірофосфоролізу і гідролізу. Показано застосовність деяких інгібіторів для вивчення реплікації в культурі клітин еукаріотів, в ембріонах і ядрах клітин, а також репарації ДНК у хроматині. This review summarizes the authors' data on the pathways of the synthesis and properties of a great number of new inhibitors of DNA and RNA biosynthesis in vitro and in vivo. The molecular mechanism of the action of these inhibitors in the reactions of polymerization, pyrophosphorolysis and hydrolysis is determined using individual templatfts with involvement of purified DNA and RNA polymerases. Some of these inhibitors are shown to be applicable fo studying of replication in the culture of eukaryotic cells, in embryos and cell nuclei, as well as for repairing DNA in chromatin. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Обзоры Новые ингибиторы биосинтеза ДНК и РНК in vitro и in vivo Нові інгібітори біосинтезу ДНК і РНК in vitro і in vivo New inhibitors of DNA and RNA biosynthesis in vitro and in vivo Article published earlier |
| spellingShingle | Новые ингибиторы биосинтеза ДНК и РНК in vitro и in vivo Бибилиашвили, Р.Ш. Чиджавадзе, З.Г. Краевский, А.А. Куханова, М.К. Атражев, А.М. Ажаев, А.В. Кутателадзе, Т.В. Обзоры |
| title | Новые ингибиторы биосинтеза ДНК и РНК in vitro и in vivo |
| title_alt | Нові інгібітори біосинтезу ДНК і РНК in vitro і in vivo New inhibitors of DNA and RNA biosynthesis in vitro and in vivo |
| title_full | Новые ингибиторы биосинтеза ДНК и РНК in vitro и in vivo |
| title_fullStr | Новые ингибиторы биосинтеза ДНК и РНК in vitro и in vivo |
| title_full_unstemmed | Новые ингибиторы биосинтеза ДНК и РНК in vitro и in vivo |
| title_short | Новые ингибиторы биосинтеза ДНК и РНК in vitro и in vivo |
| title_sort | новые ингибиторы биосинтеза днк и рнк in vitro и in vivo |
| topic | Обзоры |
| topic_facet | Обзоры |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152413 |
| work_keys_str_mv | AT bibiliašvilirš novyeingibitorybiosintezadnkirnkinvitroiinvivo AT čidžavadzezg novyeingibitorybiosintezadnkirnkinvitroiinvivo AT kraevskiiaa novyeingibitorybiosintezadnkirnkinvitroiinvivo AT kuhanovamk novyeingibitorybiosintezadnkirnkinvitroiinvivo AT atraževam novyeingibitorybiosintezadnkirnkinvitroiinvivo AT ažaevav novyeingibitorybiosintezadnkirnkinvitroiinvivo AT kutateladzetv novyeingibitorybiosintezadnkirnkinvitroiinvivo AT bibiliašvilirš novííngíbítoribíosintezudnkírnkinvitroíinvivo AT čidžavadzezg novííngíbítoribíosintezudnkírnkinvitroíinvivo AT kraevskiiaa novííngíbítoribíosintezudnkírnkinvitroíinvivo AT kuhanovamk novííngíbítoribíosintezudnkírnkinvitroíinvivo AT atraževam novííngíbítoribíosintezudnkírnkinvitroíinvivo AT ažaevav novííngíbítoribíosintezudnkírnkinvitroíinvivo AT kutateladzetv novííngíbítoribíosintezudnkírnkinvitroíinvivo AT bibiliašvilirš newinhibitorsofdnaandrnabiosynthesisinvitroandinvivo AT čidžavadzezg newinhibitorsofdnaandrnabiosynthesisinvitroandinvivo AT kraevskiiaa newinhibitorsofdnaandrnabiosynthesisinvitroandinvivo AT kuhanovamk newinhibitorsofdnaandrnabiosynthesisinvitroandinvivo AT atraževam newinhibitorsofdnaandrnabiosynthesisinvitroandinvivo AT ažaevav newinhibitorsofdnaandrnabiosynthesisinvitroandinvivo AT kutateladzetv newinhibitorsofdnaandrnabiosynthesisinvitroandinvivo |