Maintenance of mesenchymal stem cells culture due to the cells with reduced attachment rate
Aim. The classic detachment techniques lead to changes in cells properties. We offer a simple method of cultivating the population of cells that avoided an influence on the surface structures. Methods. Mesenchymal stem cells (MSC) from human umbilical cord matrix were obtained and cultivated in stan...
Saved in:
| Published in: | Вiopolymers and Cell |
|---|---|
| Date: | 2013 |
| Main Authors: | , , , , |
| Format: | Article |
| Language: | English |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
2013
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152491 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Maintenance of mesenchymal stem cells culture due to the cells with reduced attachment rate / N.S. Shuvalova, O.A. Maslova, O.M. Sukhorada, O.G. Deryabina, V.A. Kordium // Вiopolymers and Cell. — 2013. — Т. 29, №. 1. — С. 75-78. — Бібліогр.: 15 назв. — англ, рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-152491 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Shuvalova, N.S. Maslova, O.A. Sukhorada, O.M. Deryabina, O.G. Kordium, V.A. 2019-06-11T19:22:04Z 2019-06-11T19:22:04Z 2013 Maintenance of mesenchymal stem cells culture due to the cells with reduced attachment rate / N.S. Shuvalova, O.A. Maslova, O.M. Sukhorada, O.G. Deryabina, V.A. Kordium // Вiopolymers and Cell. — 2013. — Т. 29, №. 1. — С. 75-78. — Бібліогр.: 15 назв. — англ, рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000809 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152491 57.086.833.6 Aim. The classic detachment techniques lead to changes in cells properties. We offer a simple method of cultivating the population of cells that avoided an influence on the surface structures. Methods. Mesenchymal stem cells (MSC) from human umbilical cord matrix were obtained and cultivated in standard conditions. While substituting the culture media by a fresh portion, the conditioned culture medium, where the cells were maintained for three days, was transferred to other culture flacks with addition of serum and growth factors. Results. In the flacks, one day after medium transfer, we observed attached cells with typical MSC morphology. The cultures originated from these cells had the same rate of surface markers expression and clonogenic potential as those replated by standard methods. Conclusions. MSC culture, derived by preserving the cells with reduced attachment ability, actually has the properties of «parent» passage. Using this method with accepted techniques of cells reseeding would allow maintaining the cells that avoided an impact on the cell surface proteins. Мета. Застосування класичних методик для відкріплення мезенхімальних стовбурових клітин (МСК) від субстрату призводить до змін їхніх властивостей. У даному повідомленні запропоновано простий і доступний спосіб збереження популяції клітин, що уникли впливів на поверхневий апарат. Методи. МСК з матриксу пупкового канатика людини отримували і культивували за стандартною методикою. При заміні культурального середовища на свіжу порцію кондиціоноване середовище, у якому культури знаходилися впродовж трьох днів і яке потенційно містило спонтанно відкріплені клітини, переносили в інший культуральний посуд, додаючи сироватку та ростові фактори. Результати. Через добу після перенесення середовища на дні культурального посуду можна було спостерігати прикріплені клітини типової для МСК морфології, які мали ступінь експресії поверхневих маркерів та клоногенний потенціал, аналогічні таким у культур, пасованих за стандартною методикою. Висновки. Дочірня культура, отримана внаслідок збереження клітин, які спонтанно відкріпились у процесі заміни культурального середовища, фактично, зберігає властивості клітин вихідного пасажу. Запропонований метод доцільно застосовувати додатково до стандартної методики пасування. Це дозволить постійно мати пул клітин, які уникли пошкоджуючих впливів на білки і глікопротеїни поверхні клітини. Цель. Использование классических методик для открепления мезенхимальных стволовых клеток (МСК) от субстрата приводит к изменению их свойств. В данном сообщении предложен простой и доступный способ сохранения популяции клеток, избежавших влияния на поверхностный аппарат. Методы. МСК из матрикса пупочного канатика человека получали и культивировали по стандартной методике. При замене культуральной среды на свежую порцию кондиционированную среду, в которой культура находилась в течение трех дней, предположительно содержащую спонтанно открепившиеся клетки, переносили в другой культуральный сосуд, добавляя сыворотку и ростовые факторы. Результаты. Через сутки после переноса кондиционированной среды на дне сосуда можно было обнаружить прикрепленные клетки типичной для МСК морфологии, имеющие степень экспрессии поверхностных маркеров и клоногенный потенциал, аналогичные таким культур, пересеянных по стандартной методике. Выводы. Дочерняя культура, полученная в результате сохранения клеток, спонтанно открепившихся в процессе замены культуральной среды, фактически, сохраняет свойства клеток исходного пассажа. Метод целесообразно применять дополнительно к стандартной методике пассирования. Это позволит постоянно иметь пул клеток, избежавших влияния классической процедуры пассирования на белки и гликопротеины поверхности клетки. en Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Вiopolymers and Cell Methods Maintenance of mesenchymal stem cells culture due to the cells with reduced attachment rate Можливість підтримання культури мезенхімальних стовбурових клітин за рахунок клітин зі зниженим ступенем адгезії Возможность поддержания культуры мезенхимальных стволовых клеток за счет клеток со сниженной степенью адгезии Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Maintenance of mesenchymal stem cells culture due to the cells with reduced attachment rate |
| spellingShingle |
Maintenance of mesenchymal stem cells culture due to the cells with reduced attachment rate Shuvalova, N.S. Maslova, O.A. Sukhorada, O.M. Deryabina, O.G. Kordium, V.A. Methods |
| title_short |
Maintenance of mesenchymal stem cells culture due to the cells with reduced attachment rate |
| title_full |
Maintenance of mesenchymal stem cells culture due to the cells with reduced attachment rate |
| title_fullStr |
Maintenance of mesenchymal stem cells culture due to the cells with reduced attachment rate |
| title_full_unstemmed |
Maintenance of mesenchymal stem cells culture due to the cells with reduced attachment rate |
| title_sort |
maintenance of mesenchymal stem cells culture due to the cells with reduced attachment rate |
| author |
Shuvalova, N.S. Maslova, O.A. Sukhorada, O.M. Deryabina, O.G. Kordium, V.A. |
| author_facet |
Shuvalova, N.S. Maslova, O.A. Sukhorada, O.M. Deryabina, O.G. Kordium, V.A. |
| topic |
Methods |
| topic_facet |
Methods |
| publishDate |
2013 |
| language |
English |
| container_title |
Вiopolymers and Cell |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Можливість підтримання культури мезенхімальних стовбурових клітин за рахунок клітин зі зниженим ступенем адгезії Возможность поддержания культуры мезенхимальных стволовых клеток за счет клеток со сниженной степенью адгезии |
| description |
Aim. The classic detachment techniques lead to changes in cells properties. We offer a simple method of cultivating the population of cells that avoided an influence on the surface structures. Methods. Mesenchymal stem cells (MSC) from human umbilical cord matrix were obtained and cultivated in standard conditions. While substituting the culture media by a fresh portion, the conditioned culture medium, where the cells were maintained for three days, was transferred to other culture flacks with addition of serum and growth factors. Results. In the flacks, one day after medium transfer, we observed attached cells with typical MSC morphology. The cultures originated from these cells had the same rate of surface markers expression and clonogenic potential as those replated by standard methods. Conclusions. MSC culture, derived by preserving the cells with reduced attachment ability, actually has the properties of «parent» passage. Using this method with accepted techniques of cells reseeding would allow maintaining the cells that avoided an impact on the cell surface proteins.
Мета. Застосування класичних методик для відкріплення мезенхімальних стовбурових клітин (МСК) від субстрату призводить до змін їхніх властивостей. У даному повідомленні запропоновано простий і доступний спосіб збереження популяції клітин, що уникли впливів на поверхневий апарат. Методи. МСК з матриксу пупкового канатика людини отримували і культивували за стандартною методикою. При заміні культурального середовища на свіжу порцію кондиціоноване середовище, у якому культури знаходилися впродовж трьох днів і яке потенційно містило спонтанно відкріплені клітини, переносили в інший культуральний посуд, додаючи сироватку та ростові фактори. Результати. Через добу після перенесення середовища на дні культурального посуду можна було спостерігати прикріплені клітини типової для МСК морфології, які мали ступінь експресії поверхневих маркерів та клоногенний потенціал, аналогічні таким у культур, пасованих за стандартною методикою. Висновки. Дочірня культура, отримана внаслідок збереження клітин, які спонтанно відкріпились у процесі заміни культурального середовища, фактично, зберігає властивості клітин вихідного пасажу. Запропонований метод доцільно застосовувати додатково до стандартної методики пасування. Це дозволить постійно мати пул клітин, які уникли пошкоджуючих впливів на білки і глікопротеїни поверхні клітини.
Цель. Использование классических методик для открепления мезенхимальных стволовых клеток (МСК) от субстрата приводит к изменению их свойств. В данном сообщении предложен простой и доступный способ сохранения популяции клеток, избежавших влияния на поверхностный аппарат. Методы. МСК из матрикса пупочного канатика человека получали и культивировали по стандартной методике. При замене культуральной среды на свежую порцию кондиционированную среду, в которой культура находилась в течение трех дней, предположительно содержащую спонтанно открепившиеся клетки, переносили в другой культуральный сосуд, добавляя сыворотку и ростовые факторы. Результаты. Через сутки после переноса кондиционированной среды на дне сосуда можно было обнаружить прикрепленные клетки типичной для МСК морфологии, имеющие степень экспрессии поверхностных маркеров и клоногенный потенциал, аналогичные таким культур, пересеянных по стандартной методике. Выводы. Дочерняя культура, полученная в результате сохранения клеток, спонтанно открепившихся в процессе замены культуральной среды, фактически, сохраняет свойства клеток исходного пассажа. Метод целесообразно применять дополнительно к стандартной методике пассирования. Это позволит постоянно иметь пул клеток, избежавших влияния классической процедуры пассирования на белки и гликопротеины поверхности клетки.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152491 |
| citation_txt |
Maintenance of mesenchymal stem cells culture due to the cells with reduced attachment rate / N.S. Shuvalova, O.A. Maslova, O.M. Sukhorada, O.G. Deryabina, V.A. Kordium // Вiopolymers and Cell. — 2013. — Т. 29, №. 1. — С. 75-78. — Бібліогр.: 15 назв. — англ, рос. |
| work_keys_str_mv |
AT shuvalovans maintenanceofmesenchymalstemcellscultureduetothecellswithreducedattachmentrate AT maslovaoa maintenanceofmesenchymalstemcellscultureduetothecellswithreducedattachmentrate AT sukhoradaom maintenanceofmesenchymalstemcellscultureduetothecellswithreducedattachmentrate AT deryabinaog maintenanceofmesenchymalstemcellscultureduetothecellswithreducedattachmentrate AT kordiumva maintenanceofmesenchymalstemcellscultureduetothecellswithreducedattachmentrate AT shuvalovans možlivístʹpídtrimannâkulʹturimezenhímalʹnihstovburovihklítinzarahunokklítinzízniženimstupenemadgezíí AT maslovaoa možlivístʹpídtrimannâkulʹturimezenhímalʹnihstovburovihklítinzarahunokklítinzízniženimstupenemadgezíí AT sukhoradaom možlivístʹpídtrimannâkulʹturimezenhímalʹnihstovburovihklítinzarahunokklítinzízniženimstupenemadgezíí AT deryabinaog možlivístʹpídtrimannâkulʹturimezenhímalʹnihstovburovihklítinzarahunokklítinzízniženimstupenemadgezíí AT kordiumva možlivístʹpídtrimannâkulʹturimezenhímalʹnihstovburovihklítinzarahunokklítinzízniženimstupenemadgezíí AT shuvalovans vozmožnostʹpodderžaniâkulʹturymezenhimalʹnyhstvolovyhkletokzasčetkletoksosnižennoistepenʹûadgezii AT maslovaoa vozmožnostʹpodderžaniâkulʹturymezenhimalʹnyhstvolovyhkletokzasčetkletoksosnižennoistepenʹûadgezii AT sukhoradaom vozmožnostʹpodderžaniâkulʹturymezenhimalʹnyhstvolovyhkletokzasčetkletoksosnižennoistepenʹûadgezii AT deryabinaog vozmožnostʹpodderžaniâkulʹturymezenhimalʹnyhstvolovyhkletokzasčetkletoksosnižennoistepenʹûadgezii AT kordiumva vozmožnostʹpodderžaniâkulʹturymezenhimalʹnyhstvolovyhkletokzasčetkletoksosnižennoistepenʹûadgezii |
| first_indexed |
2025-11-25T20:56:20Z |
| last_indexed |
2025-11-25T20:56:20Z |
| _version_ |
1850543580589850624 |
| fulltext |
METHODS
UDC 57.086.833.6
Âîçìîæíîñòü ïîääåðæàíèÿ êóëüòóðû
ìåçåíõèìàëüíûõ ñòâîëîâûõ êëåòîê çà ñ÷åò
êëåòîê ñî ñíèæåííîé ñòåïåíüþ àäãåçèè
Í. Ñ. Øóâàëîâà, Î. À. Ìàñëîâà, Å. Ì. Ñóõîðàäà, Î. Ã. Äåðÿáèíà, Â. À. Êîðäþì
Èíñòèòóò ìîëåêóëÿðíîé áèîëîãèè è ãåíåòèêè ÍÀÍ Óêðàèíû
Óë. Àêàäåìèêà Çàáîëîòíîãî, 150, Êèåâ, Óêðàèíà, 03680
riyena@yandex.ru
Öåëü. Èñïîëüçîâàíèå êëàññè÷åñêèõ ìåòîäèê äëÿ îòêðåïëåíèÿ ìåçåíõèìàëüíûõ ñòâîëîâûõ êëåòîê (ÌÑÊ)
îò ñóáñòðàòà ïðèâîäèò ê èçìåíåíèþ èõ ñâîéñòâ. Â äàííîì ñîîáùåíèè ïðåäëîæåí ïðîñòîé è äîñòóïíûé
ñïîñîá ñîõðàíåíèÿ ïîïóëÿöèè êëåòîê, èçáåæàâøèõ âëèÿíèÿ íà ïîâåðõíîñòíûé àïïàðàò. Ìàòåðèàëû è
ìåòîäû. ÌÑÊ èç ìàòðèêñà ïóïî÷íîãî êàíàòèêà ÷åëîâåêà ïîëó÷àëè è êóëüòèâèðîâàëè ïî ñòàíäàðòíîé
ìåòîäèêå. Ïðè çàìåíå êóëüòóðàëüíîé ñðåäû íà ñâåæóþ ïîðöèþ êîíäèöèîíèðîâàííóþ ñðåäó, â êîòîðîé
êóëüòóðà íàõîäèëàñü â òå÷åíèå òðåõ äíåé, ïðåäïîëîæèòåëüíî ñîäåðæàùóþ ñïîíòàííî îòêðåïèâøèåñÿ
êëåòêè, ïåðåíîñèëè â äðóãîé êóëüòóðàëüíûé ñîñóä, äîáàâëÿÿ ñûâîðîòêó è ðîñòîâûå ôàêòîðû. Ðåçóëü-
òàòû. ×åðåç ñóòêè ïîñëå ïåðåíîñà êîíäèöèîíèðîâàííîé ñðåäû íà äíå ñîñóäà ìîæíî áûëî îáíàðóæèòü
ïðèêðåïëåííûå êëåòêè òèïè÷íîé äëÿ ÌÑÊ ìîðôîëîãèè, èìåþùèå ñòåïåíü ýêñïðåññèè ïîâåðõíîñòíûõ
ìàðêåðîâ è êëîíîãåííûé ïîòåíöèàë, àíàëîãè÷íûå òàêèì êóëüòóð, ïåðåñåÿííûõ ïî ñòàíäàðòíîé ìåòî-
äèêå. Âûâîäû. Äî÷åðíÿÿ êóëüòóðà, ïîëó÷åííàÿ â ðåçóëüòàòå ñîõðàíåíèÿ êëåòîê, ñïîíòàííî îòêðåïèâ-
øèõñÿ â ïðîöåññå çàìåíû êóëüòóðàëüíîé ñðåäû, ôàêòè÷åñêè, ñîõðàíÿåò ñâîéñòâà êëåòîê èñõîäíîãî ïàñ-
ñàæà. Ìåòîä öåëåñîîáðàçíî ïðèìåíÿòü äîïîëíèòåëüíî ê ñòàíäàðòíîé ìåòîäèêå ïàññèðîâàíèÿ. Ýòî
ïîçâîëèò ïîñòîÿííî èìåòü ïóë êëåòîê, èçáåæàâøèõ âëèÿíèÿ êëàññè÷åñêîé ïðîöåäóðû ïàññèðîâàíèÿ íà
áåëêè è ãëèêîïðîòåèíû ïîâåðõíîñòè êëåòêè.
Êëþ÷åâûå ñëîâà: ÌÑÊ, êóëüòèâèðîâàíèå, êëåòêè ñî ñíèæåííîé ñòåïåíüþ àäãåçèè.
Ââåäåíèå. Ìåçåíõèìàëüíûå ñòâîëîâûå êëåòêè (ÌÑÊ)
ñ÷èòàþò îäíèì èç ñàìûõ ïåðñïåêòèâíûõ èíñòðó-
ìåíòîâ äëÿ êëåòî÷íîé òåðàïèè. Îäíàêî èõ êóëüòè-
âèðîâàíèå ñâÿçàíî ñ åùå íå äî êîíöà ïðåîäîëåííû-
ìè òðóäíîñòÿìè. Ïîýòîìó àêòèâíî ðàçðàáàòûâàþò-
ñÿ è ñîâåðøåíñòâóþòñÿ ñïîñîáû èõ âûäåëåíèÿ èç
òêàíåé, êóëüòèâèðîâàíèÿ è ïàññèðîâàíèÿ, ñïîñîáñò-
âóþùèå ñîõðàíåíèþ ìóëüòèïîòåíòíîñòè [1–3].
 òêàíÿõ îðãàíèçìà ÌÑÊ íàõîäÿòñÿ â ñëîæíîé
òðåõìåðíîé ñèñòåìå, ãäå èõ ïîâåðõíîñòíûé àïïà-
ðàò ïðèñïîñîáëåí äëÿ ïîëó÷åíèÿ è îáðàáîòêè ñèã-
íàëîâ èçâíå. Âíåêëåòî÷íûé ìàòðèêñ è îêðóæàþ-
ùèå êëåòêè ñîçäàþò óíèêàëüíûå ôèçèêî-õèìè÷åñ-
êèå óñëîâèÿ, îïðåäåëÿþùèå ïîâåäåíèå ÌÑÊ [4, 5].
Ïðè êóëüòèâèðîâàíèè â ìîíîñëîå êëåòêè àäàïòèðó-
þòñÿ ê ñïåöèôè÷åñêèì óñëîâèÿì, èçáàâëÿþòñÿ îò
öåíòðàëèçîâàííîé ðåãóëÿöèè ñî ñòîðîíû íåéðî-èì-
ìóíî-ãóìîðàëüíûõ ôàêòîðîâ [6]. Ïðè ïàññèðîâà-
íèè êóëüòóðû êëåòêè ïðèíóäèòåëüíî îòêðåïëÿþò
îò ïîâåðõíîñòè ñóáñòðàòà, íà êîòîðîì îíè ðîñëè.
Äëÿ ýòîãî ïðèìåíÿþò ðàñòâîðû, ñîäåðæàùèå ïðî-
òåîëèòè÷åñêèå ôåðìåíòû, áåñôåðìåíòíûå ðàñòâîðû
è ñïåöèàëüíûå ìåõàíè÷åñêèå ïðèåìû [2]. Ñðåäè
ôåðìåíòàòèâíûõ ñðåäñòâ îòêðåïëåíèÿ êëåòîê îò
ñóáñòðàòà íàèáîëåå ðàñïðîñòðàíåííûìè è äîñòà-
òî÷íî ýôôåêòèâíûìè ñ÷èòàþòñÿ ðàñòâîðû òðèïñè-
íà (0,25 %) è âåðñåíà (0,02 %) [2]. Íî âî âðåìÿ òàêîé
ïðîöåäóðû áåëêè è ãëèêîïðîòåèíû ïîâåðõíîñòè
êëåòîê íåèçáåæíî ïîâðåæäàþòñÿ. Èñïîëüçîâàíèå
æå ïðîòåîëèòè÷åñêèõ ôåðìåíòîâ è âëèÿíèå ìåõà-
ISSN 0233–7657. Biopolymers and Cell. 2013. Vol. 29. N 1. P. 75–78 doi: 10.7124/bc.000809
75
� Institute of Molecular Biology and Genetics, NAS of Ukraine, 2013
íè÷åñêèõ ìàíèïóëÿöèé ïðè ïàññèðîâàíèè ïðèâî-
äèò ê ïîòåðå êëåòêàìè âàæíûõ ðåöåïòîðîâ õîóìèí-
ãà è ìîëåêóë àäãåçèè. Ýòî, êàê èçâåñòíî, íåãàòèâíî
ñêàçûâàåòñÿ íà ñòâîëîâîì ïîòåíöèàëå ÌÑÊ [3–8].
Ñ êàæäûì ïàññàæåì êëåòêè èçìåíÿþò ñâîè ñâîéñò-
âà, ñíèæàåò ñòåïåíü ìóëüòèïîòåíòíîñòè è ñïîñîá-
íîñòü ê ýôôåêòèâíîìó õîóìèíãó [9]. Ïîýòîìó ïðåä-
ëàãàþò ðàçëè÷íûå âàðèàíòû âûðàùèâàíèÿ ÌÑÊ
áåç ïðèíóäèòåëüíîãî îòêðåïëåíèÿ, äëÿ ÷åãî ïðèìå-
íÿþò êóëüòóðàëüíûå ñîñóäû ñïåöèàëüíîé ôîðìû,
êîòîðûå ìîãóò ðàñòÿãèâàòüñÿ è óâåëè÷èâàòü ïëî-
ùàäü ïîâåðõíîñòè ïðè ðàçðàñòàíèè êëåòî÷íîé ìàñ-
ñû [10, 11], à òàêæå êóëüòèâèðîâàíèå â òðåõìåðíûõ
óñëîâèÿõ íà ðàçëè÷íûõ íîñèòåëÿõ [12]. Òàêèå ñïî-
ñîáû ýôôåêòèâíû, íî òðåáóþò ïðèâëå÷åíèÿ äîïîë-
íèòåëüíûõ òåõíè÷åñêèõ âîçìîæíîñòåé, óñëîæíÿþ-
ùèõ ðàáîòó è ÿâëÿþùèõñÿ äîñòàòî÷íî äîðîãèìè.
Öåëü äàííîé ðàáîòû ñîñòîÿëà â îïòèìèçàöèè
óñëîâèé êóëüòèâèðîâàíèÿ ÌÑÊ äëÿ ñîõðàíåíèÿ êëå-
òîê, èìåþùèõ íåïîâðåæäåííûé ïîâåðõíîñòíûé àï-
ïàðàò è, ñîîòâåòñòâåííî, áîëåå áëèçêèõ ïî ñâîéñò-
âàì ê êëåòêàì ïåðâûõ ïàññàæåé, ÷åì êëåòêè, ìíî-
ãîêðàòíî ïðîøåäøèå ïðîöåäóðó ïàññèðîâàíèÿ.
Ìàòåðèàëû è ìåòîäû. Âûäåëåíèå êëåòîê. Ïó-
ïîâèíû, ïîëó÷åííûå ïðè íîðìàëüíûõ ðîäàõ, ïðåäî-
ñòàâëåíû ðîääîìîì ¹ 5 ã. Êèåâà. Êëåòêè èçîëèðî-
âàëè ïî êîìáèíèðîâàííîé ìåòîäèêå [13]. Ïóïîâè-
íó âûäåðæèâàëè â ðàñòâîðå àíòèáèîòèêîâ (ñìåñü ïå-
íèöèëëèíà («Àðòåðèóì», Óêðàèíà) è ñòðåïòîìèöè-
íà («Àðòåðèóì») ïî 1 ìã/ìë) â òå÷åíèå 20 ìèí è
ïðîìûâàëè â PBS. Çàòåì åå ðåçàëè íà ôðàãìåíòû, èç
êîòîðûõ óäàëÿëè ñîñóäû äëÿ èçáåæàíèÿ ïîòåíöè-
àëüíîé êîíòàìèíàöèè ïîïóëÿöèè ÌÑÊ êëåòêàìè ýí-
äîòåëèÿ. Ïîëó÷åííûå ôðàãìåíòû ïðîìûâàëè, ìåõà-
íè÷åñêè èçìåëü÷àëè è ïîãðóæàëè â ðàñòâîð ôåðìåí-
òîâ (êîëëàãåíàçà I òèïà («Sigma», ÑØÀ), 200 åä/ìë,
ãèàëóðîíèäàçà IV òèïà («Sigma»), 400 åä/ìë) íà 20–
60 ìèí ïðè òåìïåðàòóðå 37° Ñ â çàâèñèìîñòè îò
ïëîòíîñòè ìàòðèêñà. Ïîñëå èíêóáàöèè ôðàãìåíòû
òêàíè ïåðåíîñèëè âî ôëàêîíû ñ êóëüòóðàëüíîé ñðå-
äîé (DMEM ñ íèçêèì ñîäåðæàíèåì ãëþêîçû («ÐÀÀ»,
Àâñòðèÿ) è ñ äîáàâëåíèåì ïåíèöèëëèíà («Àðòåðè-
óì») è ñòðåïòîìèöèíà («Àðòåðèóì») ïî 100 ìêã/ìë,
2 ìÌ L-ãëþòàìèí («Sigma»), 10 íM FGF2 (Ðåôèáðîë,
«ÔàðìÁèîòåê», ÑØÀ) è 10 %-é ðàñòâîð ýìáðèîíàëü-
íîé òåëÿ÷üåé ñûâîðîòêè («ÐÀÀ»)).
Ðàñòâîð ôåðìåíòîâ ñîáèðàëè è öåíòðèôóãè-
ðîâàëè â òå÷åíèå 7 ìèí ïðè 1000 îá/ìèí. Ê ïîëó-
÷åííîìó îñàäêó äîáàâëÿëè PBS è ñíîâà öåíòðèôó-
ãèðîâàëè â òîì æå ðåæèìå. Ïîëó÷åííûé îñàäîê âíî-
ñèëè âî ôëàêîíû ñ êóëüòóðàëüíîé ñðåäîé, îïèñàí-
íîé âûøå.
×åðåç 1–3 ñóò íà äíå êóëüòóðàëüíîãî ñîñóäà
ìîæíî áûëî íàáëþäàòü ïðèêðåïëåííûå ôèáðîáëà-
ñòîïîäîáíûå êëåòêè – åäèíè÷íûå è êëîíû èç 2–6
êëåòîê. ×åðåç 2 äíÿ ïîñëå îáíàðóæåíèÿ êëåòîê ñðå-
äó çàìåíÿëè íà ñâåæóþ.
Êóëüòèâèðîâàíèå. Êóëüòèâèðîâàíèå ïðîâîäèëè
â ÑÎ2-èíêóáàòîðå (37° Ñ, 5 % ÑÎ2). ÌÑÊ êóëüòèâè-
ðîâàëè â ñðåäå, îïèñàííîé âûøå, â ïëàñòèêîâûõ
ôëàêîíàõ ïëîùàäüþ 25 è 75 ñì2 («ÐÀÀ»). Íà âñåõ ïàñ-
ñàæàõ êóëüòèâèðîâàíèÿ çàìåíó êóëüòóðàëüíîé ñðå-
äû íà ñâåæóþ ïîðöèþ ïðîèçâîäèëè êàæäûå 3 äíÿ.
Êëåòêè ïàññèðîâàëè â ïðèñóòñòâèè ñìåñè òðèï-
ñèíà (0, 25 %) («PAA») è âåðñåíà (0,02 %) â ñîîòíî-
øåíèè 1:1 äî äîñòèæåíèÿ êóëüòóðîé ìîíîñëîÿ 70 %
êîíôëþåíòíîñòè.
Îïòèìèçàöèÿ êóëüòèâèðîâàíèÿ. Ïðè çàìåíå êóëü-
òóðàëüíîé ñðåäû íà ñâåæóþ ïîðöèþ êîíäèöèîíèðî-
âàííóþ ñðåäó ñîáèðàëè, ïåðåíîñèëè â äðóãîé ôëà-
êîí è äîáàâëÿëè ýìáðèîíàëüíóþ òåëÿ÷üþ ñûâîðîò-
êó (1 ìë íà 10 ìë ïîëó÷åííîé ñðåäû) è FGF2 (èç
ðàñ÷åòà 0,0025 ìêã/ìë).
Îöåíêà ñîñòîÿíèÿ êóëüòóðû. Ìîðôîëîãèþ êëå-
òîê îöåíèâàëè ñ èñïîëüçîâàíèåì èíâåðòèðîâàííî-
ãî ìèêðîñêîïà Leica DMIL. Ñíèìêè ïîëó÷åíû ñ ïî-
ìîùüþ ôîòîàïïàðàòà Cannon PowerShot 640À.
Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå. Èçâåñòíî, ÷òî â îï-
ðåäåëåííóþ ôàçó êëåòî÷íîãî öèêëà, íàïðèìåð, ïå-
ðåä äåëåíèåì ñíèæàåòñÿ ñòåïåíü àäãåçèè êëåòêè ê
ñóáñòðàòó [14].
Êóëüòóðà ÌÑÊ (ïðè îáû÷íîì êóëüòèâèðîâàíèè)
ÿâëÿåòñÿ íåñèíõðîíèçèðîâàííîé. Ñîîòâåòñòâåííî
ôàçû êëåòî÷íîãî öèêëà ïðîõîäÿò íåîäíîâðåìåííî,
÷òî ïðèâîäèò ê ðèñêó ïîòåðè ÷àñòè êëåòîê ïðè ñòàí-
äàðòíîì ïàññèðîâàíèè, êîãäà ñðåäó, â êîòîðîé êëåò-
êè êóëüòèâèðîâàëè, óäàëÿþò èç êóëüòóðàëüíîãî ñî-
ñóäà. Ñîãëàñíî ïðåäëîæåííîé ìåòîäèêå, ïðè ïðî-
öåäóðå ñìåíû ñðåäû êîíäèöèîíèðîâàííóþ ñðåäó, â
êîòîðîé êëåòêè íàõîäèëèñü ðàíåå, ïåðåíîñÿò â äðó-
ãîé êóëüòóðàëüíûé ñîñóä. Ê òàêîé ñðåäå äîáàâëÿþò
ïîðöèþ ñûâîðîòêè è ðîñòîâûõ ôàêòîðîâ.
ØÓÂÀËÎÂÀ Í. Ñ. È ÄÐ.
76
Íà ñëåäóþùèå ñóòêè íàáëþäàþò ïðèêðåïëåíèå
êëåòîê, íàõîäèâøèõñÿ, î÷åâèäíî, íà ìîìåíò ïàññè-
ðîâàíèÿ â ìåíåå àäãåçèðîâàííîì ñîñòîÿíèè. Äëÿ èõ
êîíöåíòðàöèè ïîëó÷åííóþ ñðåäó òàêæå ìîæíî öåíò-
ðèôóãèðîâàòü, îñàæäàÿ, òàêèì îáðàçîì, êëåòêè è ñðà-
çó ïîìåùàÿ ïîëó÷åííûé îñàäîê âî ôëàêîí ñî ñðå-
äîé, íà êîòîðîé â îïûòå âåäóò êóëüòóðó.
Ó÷èòûâàÿ èíäèâèäóàëüíûå îñîáåííîñòè êóëü-
òóð, ïîëó÷åííûõ îò ðàçíûõ äîíîðîâ, âàæíî îòìå-
òèòü, ÷òî íà äíå êóëüòóðàëüíîãî ôëàêîíà â ñðåäíåì
îáíàðóæèâàþòñÿ 10–20 «òî÷åê ïðèêðåïëåíèÿ». Îíè
ìîãóò ñîäåðæàòü îò 1 äî 10 êëåòîê. Òàêèå êëîíû ÿâ-
ëÿþòñÿ æèçíåñïîñîáíûìè è àêòèâíî ïðîëèôåðèðó-
þò. ×åðåç 7–10 äíåé êîëè÷åñòâî êëåòîê âîçðàñòàåò â
ñðåäíåì â 3 ðàçà. ×åðåç 2 íåäåëè ïîñëå ïîÿâëåíèÿ
ïåðâûõ êëåòîê êëîíû äîñòèãàþò òàêîé ÷èñëåííîñ-
òè è ïëîòíîñòè ðàñïîëîæåíèÿ êëåòîê, ÷òî èõ ìîæíî
ïàññèðîâàòü ñ ïîìîùüþ ñòàíäàðòíûõ ïîäõîäîâ.
Êëåòêè, ïîëó÷åííûå ìåòîäîì ñîõðàíåíèÿ êîí-
äèöèîíèðîâàííîé ñðåäû, èìåþò òèïè÷íóþ äëÿ ÌÑÊ
ìîðôîëîãèþ. Ñ ó÷åòîì ðàçëè÷èé â êîëè÷åñòâå êëå-
òîê, ïîëó÷åííûõ ïî ìåòîäèêå, îïèñàííîé âûøå, è
êëåòîê, ïàññèðîâàííûõ ïî ñòàíäàðòíûì ìåòîäèêàì
ñ ïðèìåíåíèåì ðàñòâîðîâ òðèïñèíà (0, 25 %) è âåð-
ñåíà (0,02 %), ìîæíî êîíñòàòèðîâàòü, ÷òî â öåëîì
êëåòêè äî÷åðíåé êóëüòóðû ñîõðàíÿþò ìîðôîëîãèþ,
õàðàêòåðíóþ äëÿ êëåòîê èñõîäíîé êóëüòóðû (ðèñó-
íîê, ñì. âêëåéêó). Îíè òàêæå èìåþò ñòåïåíü ýêñïðåñ-
ñèè ïîâåðõíîñòíûõ ìàðêåðîâ, àíàëîãè÷íóþ êóëü-
òóðàì, ïåðåñåÿííûì ïî ñòàíäàðòíîé ìåòîäèêå (áî-
ëåå 75 % ïîïóëÿöèè ÿâëÿþòñÿ ïîëîæèòåëüíûìè ïî
ìàðêåðàì CD105, CD73, CD90).
Ýêñïðåññèþ ïîâåðõíîñòíûõ ìàðêåðíûõ áåëêîâ
îïðåäåëÿëè ñ ïîìîùüþ îêðàñêè àíòèòåëàìè ñ ôëóî-
ðåñöåíòíûìè ìåòêàìè («United States Biological»,
ÑØÀ) íà ïðîòî÷íîì öèòîôëóîðèìåòðå-ñîðòåðå BD
FACSAria (Èíñòèòóò ãåíåòè÷åñêîé è ðåãåíåðàòèâ-
íîé ìåäèöèíû ÍÀÌÍÓ) (äàííûå íå ïðèâåäåíû).
Âðåä ìíîãîêðàòíîãî ïðèíóäèòåëüíîãî îòêðåïëå-
íèÿ êëåòîê îò ñóáñòðàòà ïðè âåäåíèè êóëüòóðû ïî
ïàññàæàì õîðîøî îïèñàí â ðàáîòàõ [7–9, 15].
Ïðåäëîæåííàÿ íàìè ìåòîäèêà èñïîëüçîâàíèÿ
êîíäèöèîíèðîâàííîé ñðåäû äàåò âîçìîæíîñòü äî-
ïîëíèòåëüíî ñîõðàíèòü îïðåäåëåííîå êîëè÷åñòâî
êëåòîê è ñíèçèòü ñòåïåíü íåãàòèâíîãî âëèÿíèÿ íà
ÌÑÊ.
Âûâîäû. Ãëàâíûì ïðåèìóùåñòâîì ïðåäëîæåí-
íîãî ïîäõîäà ÿâëÿåòñÿ òî, ÷òî êóëüòóðà, ïîëó÷åííàÿ
ïîñðåäñòâîì ñîõðàíåíèÿ êëåòîê, ñïîíòàííî îòêðå-
ïèâøèõñÿ ïðè çàìåíå êóëüòóðàëüíîé ñðåäû, ôàêòè-
÷åñêè ñîõðàíÿåò ñâîéñòâà êëåòîê èñõîäíîãî ïàñ-
ñàæà. Ïîñêîëüêó â ñîñòîÿíèè ñî ñíèæåííîé ñòåïåíüþ
àäãåçèè íàõîäèòñÿ ëèøü ÷àñòü ïîïóëÿöèè, îïèñàí-
íûé ìåòîä öåëåñîîáðàçíî ïðèìåíÿòü äîïîëíèòåëü-
77
ÏÎÄÄÅÐÆÀÍÈÅ ÊÓËÜÒÓÐÛ ÑÒÂÎËÎÂÛÕ ÊËÅÒÎÊ ÇÀ Ñ×ÅÒ ÊËÅÒÎÊ ÑÎ ÑÍÈÆÅÍÍÎÉ ÑÒÅÏÅÍÜÞ ÀÄÃÅÇÈÈ
à á
Ñðàâíåíèå ìîðôîëîãèè êóëüòóð êëåòîê (÷åðåç 48 ÷): à – êëåòêè, ïðîøåäøèå ñòàíäàðòíóþ ïðîöåäóðó ïàññèðîâàíèÿ, 2-é ïàññàæ; á – êëåò-
êè, ïîëó÷åííûå â ðåçóëüòàòå ïåðåíîñà ñðåäû, ãäå èõ êóëüòèâèðîâàëè â òå÷åíèå 3 äíåé, â äðóãîé êóëüòóðàëüíûé ôëàêîí, 1-é ïàññàæ.
ÌÑÊ æèâûå, íåîêðàøåííûå; � 100
íî ê ñòàíäàðòíîé ìåòîäèêå. Ýòî ïîçâîëèò ïîñòîÿííî
ïîääåðæèâàòü ïîïóëÿöèþ êëåòîê, èçáåæàâøèõ âëè-
ÿíèÿ ñòàíäàðòíîé ïðîöåäóðû ïàññèðîâàíèÿ íà áåëêè
è ãëèêîïðîòåèíû ïîâåðõíîñòíîãî àïïàðàòà.
N. S. Shuvalova, O. A. Maslova, O. M. Sukhorada, O. G. Deryabina,
V. A. Kordium
Maintenance of mesenchymal stem cells culture due to the cells
with reduced attachment rate
Institute of Molecular Biology and Genetics, NAS of Ukraine
150, Akademika Zabolotnoho Str., Kyiv, Ukraine, 03680
Aim. The classic detachment techniques lead to changes in cells pro-
perties. We offer a simple method of cultivating the population of cells
that avoided an influence on the surface structures. Methods. Mesen-
chymal stem cells (MSC) from human umbilical cord matrix were ob-
tained and cultivated in standard conditions. While substituting the cul-
ture media by a fresh portion, the conditioned culture medium, where the
cells were maintained for three days, was transferred to other culture
flacks with addition of serum and growth factors. Results. In the flacks,
one day after medium transfer, we observed attached cells with typical
MSC morphology. The cultures originated from these cells had the same
rate of surface markers expression and clonogenic potential as those
replated by standard methods. Conclusions. MSC culture, derived by
preserving the cells with reduced attachment ability, actually has the
properties of «parent» passage. Using this method with accepted tech-
niques of cells reseeding would allow maintaining the cells that avoided
an impact on the cell surface proteins.
Keywords: MSC, cultivation, cells with reduced attachment ability.
Í. Ñ. Øóâàëîâà, Î. Î. Ìàñëîâà, Î. Ì. Ñóõîðàäà, Î. Ã. Äåðÿá³íà,
Â. À. Êîðäþì
Ìîæëèâ³ñòü ï³äòðèìàííÿ êóëüòóðè ìåçåíõ³ìàëüíèõ ñòîâáóðîâèõ
êë³òèí çà ðàõóíîê êë³òèí ç³ çíèæåíèì ñòóïåíåì àäãå糿
Ìåòà. Çàñòîñóâàííÿ êëàñè÷íèõ ìåòîäèê äëÿ â³äêð³ïëåííÿ ìå-
çåíõ³ìàëüíèõ ñòîâáóðîâèõ êë³òèí (ÌÑÊ) â³ä ñóáñòðàòó ïðèçâî-
äèòü äî çì³í ¿õí³õ âëàñòèâîñòåé. Ó äàíîìó ïîâ³äîìëåíí³ çàïðîïî-
íîâàíî ïðîñòèé ³ äîñòóïíèé ñïîñ³á çáåðåæåííÿ ïîïóëÿö³¿ êë³òèí,
ùî óíèêëè âïëèâ³â íà ïîâåðõíåâèé àïàðàò. Ìàòåð³àëè ³ ìåòîäè.
ÌÑÊ ç ìàòðèêñó ïóïêîâîãî êàíàòèêà ëþäèíè îòðèìóâàëè ³ êóëü-
òèâóâàëè çà ñòàíäàðòíîþ ìåòîäèêîþ. Ïðè çàì³í³ êóëüòóðàëüíî-
ãî ñåðåäîâèùà íà ñâ³æó ïîðö³þ êîíäèö³îíîâàíå ñåðåäîâèùå, ó ÿêî-
ìó êóëüòóðè çíàõîäèëèñÿ âïðîäîâæ òðüîõ äí³â ³ ÿêå ïîòåíö³éíî
ì³ñòèëî ñïîíòàííî â³äêð³ïëåí³ êë³òèíè, ïåðåíîñèëè â ³íøèé êóëü-
òóðàëüíèé ïîñóä, äîäàþ÷è ñèðîâàòêó òà ðîñòîâ³ ôàêòîðè. Ðå-
çóëüòàòè. ×åðåç äîáó ï³ñëÿ ïåðåíåñåííÿ ñåðåäîâèùà íà äí³ êóëü-
òóðàëüíîãî ïîñóäó ìîæíà áóëî ñïîñòåð³ãàòè ïðèêð³ïëåí³ êë³òè-
íè òèïîâî¿ äëÿ ÌÑÊ ìîðôîëî㳿, ÿê³ ìàëè ñòóï³íü åêñïðåñ³¿ ïîâåðõ-
íåâèõ ìàðêåð³â òà êëîíîãåííèé ïîòåíö³àë, àíàëîã³÷í³ òàêèì ó
êóëüòóð, ïàñîâàíèõ çà ñòàíäàðòíîþ ìåòîäèêîþ. Âèñíîâêè. Äî-
÷³ðíÿ êóëüòóðà, îòðèìàíà âíàñë³äîê çáåðåæåííÿ êë³òèí, ÿê³ ñïîí-
òàííî â³äêð³ïèëèñü ó ïðîöåñ³ çàì³íè êóëüòóðàëüíîãî ñåðåäîâèùà,
ôàêòè÷íî, çáåð³ãຠâëàñòèâîñò³ êë³òèí âèõ³äíîãî ïàñàæó. Çàïðî-
ïîíîâàíèé ìåòîä äîö³ëüíî çàñòîñîâóâàòè äîäàòêîâî äî ñòàí-
äàðòíî¿ ìåòîäèêè ïàñóâàííÿ. Öå äîçâîëèòü ïîñò³éíî ìàòè ïóë
êë³òèí, ÿê³ óíèêëè ïîøêîäæóþ÷èõ âïëèâ³â íà á³ëêè ³ ãë³êîïðîòå¿íè
ïîâåðõí³ êë³òèíè.
Êëþ÷îâ³ ñëîâà: ÌÑÊ, êóëüòèâóâàííÿ, êë³òèíè ç³ çíèæåíèì ñòó-
ïåíåì àäãå糿.
REFERENCES
1. Nombela-Arrieta C., Ritz J., Silberstein L. The elusive nature
and function of mesenchymal stem cells // Nat. Rev. Mol. Cell
Biol.–2011.–12, N 2.–P. 126–131.
2. Heng B. C., Cowan Ñ. M., Basu S. Comparison of enzymatic and
non-enzymatic means of dissociating adherent monolayers of
mesenchymal stem cells // Biol. Proced. Online.–2009.–11.–
Ð. 161–169.
3. Rombouts W. J., Ploemacher R. E. Primary murine MSC show
highly efficient homing to the bone marrow but lose homing abi-
lity following culture // Leukemia.–2003.–17, N 1.–Ð. 160–170.
4. Augello A., Kurth T. B., De Bari C. Mesenchymal stem cells: a
perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches
// Eur. Cell Mater.–2010.–20.–P. 121–133.
5. Reilly G. C., Engler A. J. Intrinsic extracellular matrix properties
regulate stem cell differentiation // J. Biomech.–2010.–43, N 1.–
P. 55–62.
6. Toyoda M., Takahashi H., Umezawa A. Ways for a mesenchy-
mal stem cell to live on its own: maintaining an undifferentiated
state ex vivo // Int. J. Hematol.–2007.–86, N 1.–Ð. 1–4.
7. Wagner W., Horn P., Castoldi M., Diehlmann A., Bork S., Saf-
frich R., Benes V., Blake J., Pfister S., Eckstein V., Ho A. D. Re-
plicative senescence of mesenchymal stem cells: a continuous
and organized process // PLoS One.–2008.–3, N 5.–e2213.
8. Angelucci S., Marchisio M., Di Giuseppe F., Pierdomenico L.,
Sulpizio M., Eleuterio E., Lanuti P., Sabatino G., Miscia S., Di
Ilio C. Proteome analysis of human Wharton’s jelly cells during
in vitro expansion // Proteome Sci.–2010.–8.–P. 18.
9. Sarkar D., Spencer J. A., Phillips J. A., Zhao W., Schafer S., Spel-
ke D. P., Mortensen L. J., Ruiz J. P., Vemula P. K., Sridharan R.,
Kumar S., Karnik R., Lin C. P., Karp J. M. Engineered cell ho-
ming // Blood.–2011.–118, N 25.–e184–191.
10. Majd H., Wipff P. J., Buscemi L., Bueno M., Vonwil D., Quinn T.
M., Hinz B. A novel method of dynamic culture surface expan-
sion improves mesenchymal stem cell proliferation and pheno-
type // Stem Cells.–2009.–27, N 1.–Ð. 200–209.
11. Majd H., Quinn T. M., Wipff P. J., Hinz B. Dynamic expansion
culture for mesenchymal stem cells // Methods Mol. Biol.–2011.–
698.–Ð. 175–188.
12. Witte H., Stubenrauch M., Frober U., Fischer R., Voges D., Hoff-
mann M. Integration of 3-D cell cultures in fluidic microsystems
for biological screenings // Eng. Life Sci.–2011.–11, N 2.–
Ð. 140–147.
13. Tong C. K., Vellasamy S., Tan B. C., Abdullah M., Vidyadaran
S., Seow H. F., Ramasamy R. Generation of mesenchymal stem
cell from human umbilical cord tissue using a combination enzy-
matic and mechanical disassociation method // Cell Biol. Int.–
2011.–35, N 3.–P. 221–226.
14. Thery M., Bornens M. Cell shape and division // Curr. Opin. Cell.
Biol.–2006.–18, N 6.–P. 648–657.
15. Bruder S. P., Jaiswal N., Haynesworth S. E. Growth kinetics,
self-renewal, and the osteogenic potential of purified human
mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and fol-
lowing cryopreservation // J. Cell. Biochem.–1997.–64, N 2.–
Ð. 278–294.
Received 05.11.12
78
ØÓÂÀËÎÂÀ Í. Ñ. È ÄÐ.
|