Сайт-направленный мутагенез остатков лизина, локализованных в соединительном пептиде нуклеотидсвязывающего домена (свертки Россмана) тирозил-тРНК синтетазы из печени быка

Сайт-направленный мутагенез остатков лизина, локализованных в соединительном пептиде нуклеотидсвязывающего домена (свертки Россмана) тирозил-тРНК синтетазы из печени быка

Методом сайт-направленного мутагенеза изучена функциональная роль аминокислотных остат­ ков лизина 146 и 147, локализованных в соединительном пептиде нуклеотидсвязывающего домена эукариотической тирозил-тРНК синтетазы. Обнаружено, что замена как обоих положительно заряженных остатков лизина на аспар...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
Bibliographische Detailangaben
Veröffentlicht in:Биополимеры и клетка
Datum:2000
Hauptverfasser: Найденов, В.Г., Вудмаска, М.И., Корнелюк, А.И., Мацука, Г.Х.
Format: Artikel
Sprache:Russian
Veröffentlicht: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2000
Schlagworte:
Структура и функции биополимеров
Online Zugang:https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152597
Tags: Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:Сайт-направленный мутагенез остатков лизина, локализованных в соединительном пептиде нуклеотидсвязывающего домена (свертки Россмана) тирозил-тРНК синтетазы из печени быка / В.Г. Найденов, М.И. Вудмаска, А.И. Корнелюк, Г.Х. Мацука // Биополимеры и клетка. — 2000. — Т. 16, № 4. — С. 275-280. — Бібліогр.: 17 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-152597
record_format dspace
spelling Найденов, В.Г.
Вудмаска, М.И.
Корнелюк, А.И.
Мацука, Г.Х.
2019-06-12T13:02:31Z
2019-06-12T13:02:31Z
2000
Сайт-направленный мутагенез остатков лизина, локализованных в соединительном пептиде нуклеотидсвязывающего домена (свертки Россмана) тирозил-тРНК синтетазы из печени быка / В.Г. Найденов, М.И. Вудмаска, А.И. Корнелюк, Г.Х. Мацука // Биополимеры и клетка. — 2000. — Т. 16, № 4. — С. 275-280. — Бібліогр.: 17 назв. — рос.
0233-7657
DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.000571
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152597
577.152.611:576.31
Методом сайт-направленного мутагенеза изучена функциональная роль аминокислотных остат­ ков лизина 146 и 147, локализованных в соединительном пептиде нуклеотидсвязывающего домена эукариотической тирозил-тРНК синтетазы. Обнаружено, что замена как обоих положительно заряженных остатков лизина на аспарагин и тирозин соответственно, так и одного остатка лизина-147 приводит к полной инактивации фермента в реакции аминоацилирования гомологичной тРНКТуг быка. Сделано предположение о возможной роли данного остатка лизина в стабилизации переходного состояния при взаимодействии синтетазы с акцепторным стеблем гомологичной тРНКTyr .
Методом сайт-спрямованого мутагенезу вивчено функціо­нальну роль амінокислотних залишків лізину-146 та 147, локалізованих у з'єднувальному пептиді нуклеотидзв'язуючого домену (згортки Россмана) еукаріотичної тирозил-тРНК син­тетази. Встановлено, що заміна як обох позитивно зарядже­них залишків лізину на аспарагін та тирозин відповідно, так і одного залишку лізину-147 призводить до повної інактиваиії синтетази в реакції аміноацилювання гомологічної тРНК. Зроблено висновок щодо можливої ролі даного залишку лізину в стабілізації перехідного стану при взаємодії синтетази з акцепторним стеблом гомологічної тРНКTyr
The functional role of lysine 146 and 147 residues located in the connection peptide of the nucleotide-binding domain (Rossman fold) of eukaryotic tyrosyl-tRNA synthetase has been studied by means of site-directed mutagenesis. Replacement of both positively charged residues with asparagine and tyrosine correspondingly as well as substitution of lysine 147 alone cause inactivating of tyrosyl-tRNA synthetase in the reaction of aminoacylation of homologous tRNA. The significance of lysine 147 in stabilization of complex between synthetase and tRNA acceptor stem has been suggested.
ru
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
Биополимеры и клетка
Структура и функции биополимеров
Сайт-направленный мутагенез остатков лизина, локализованных в соединительном пептиде нуклеотидсвязывающего домена (свертки Россмана) тирозил-тРНК синтетазы из печени быка
Сайт-спрямований мутагенез залишків лізину, локалізованих у з'єднувальному пептиді нуклеотидзв'язуючого домену (згортки Россмана) тирозил-тРНК синтетази з печінки бика
Site-directed mutagenesis of lysine residues located in the connection peptide of the nucleotide-binding domain (Rossman fold) of tyrosyl-tRNA synthetase from bovine liver
Article
published earlier
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
title Сайт-направленный мутагенез остатков лизина, локализованных в соединительном пептиде нуклеотидсвязывающего домена (свертки Россмана) тирозил-тРНК синтетазы из печени быка
spellingShingle Сайт-направленный мутагенез остатков лизина, локализованных в соединительном пептиде нуклеотидсвязывающего домена (свертки Россмана) тирозил-тРНК синтетазы из печени быка
Найденов, В.Г.
Вудмаска, М.И.
Корнелюк, А.И.
Мацука, Г.Х.
Структура и функции биополимеров
title_short Сайт-направленный мутагенез остатков лизина, локализованных в соединительном пептиде нуклеотидсвязывающего домена (свертки Россмана) тирозил-тРНК синтетазы из печени быка
title_full Сайт-направленный мутагенез остатков лизина, локализованных в соединительном пептиде нуклеотидсвязывающего домена (свертки Россмана) тирозил-тРНК синтетазы из печени быка
title_fullStr Сайт-направленный мутагенез остатков лизина, локализованных в соединительном пептиде нуклеотидсвязывающего домена (свертки Россмана) тирозил-тРНК синтетазы из печени быка
title_full_unstemmed Сайт-направленный мутагенез остатков лизина, локализованных в соединительном пептиде нуклеотидсвязывающего домена (свертки Россмана) тирозил-тРНК синтетазы из печени быка
title_sort сайт-направленный мутагенез остатков лизина, локализованных в соединительном пептиде нуклеотидсвязывающего домена (свертки россмана) тирозил-трнк синтетазы из печени быка
author Найденов, В.Г.
Вудмаска, М.И.
Корнелюк, А.И.
Мацука, Г.Х.
author_facet Найденов, В.Г.
Вудмаска, М.И.
Корнелюк, А.И.
Мацука, Г.Х.
topic Структура и функции биополимеров
topic_facet Структура и функции биополимеров
publishDate 2000
language Russian
container_title Биополимеры и клетка
publisher Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
format Article
title_alt Сайт-спрямований мутагенез залишків лізину, локалізованих у з'єднувальному пептиді нуклеотидзв'язуючого домену (згортки Россмана) тирозил-тРНК синтетази з печінки бика
Site-directed mutagenesis of lysine residues located in the connection peptide of the nucleotide-binding domain (Rossman fold) of tyrosyl-tRNA synthetase from bovine liver
description Методом сайт-направленного мутагенеза изучена функциональная роль аминокислотных остат­ ков лизина 146 и 147, локализованных в соединительном пептиде нуклеотидсвязывающего домена эукариотической тирозил-тРНК синтетазы. Обнаружено, что замена как обоих положительно заряженных остатков лизина на аспарагин и тирозин соответственно, так и одного остатка лизина-147 приводит к полной инактивации фермента в реакции аминоацилирования гомологичной тРНКТуг быка. Сделано предположение о возможной роли данного остатка лизина в стабилизации переходного состояния при взаимодействии синтетазы с акцепторным стеблем гомологичной тРНКTyr . Методом сайт-спрямованого мутагенезу вивчено функціо­нальну роль амінокислотних залишків лізину-146 та 147, локалізованих у з'єднувальному пептиді нуклеотидзв'язуючого домену (згортки Россмана) еукаріотичної тирозил-тРНК син­тетази. Встановлено, що заміна як обох позитивно зарядже­них залишків лізину на аспарагін та тирозин відповідно, так і одного залишку лізину-147 призводить до повної інактиваиії синтетази в реакції аміноацилювання гомологічної тРНК. Зроблено висновок щодо можливої ролі даного залишку лізину в стабілізації перехідного стану при взаємодії синтетази з акцепторним стеблом гомологічної тРНКTyr The functional role of lysine 146 and 147 residues located in the connection peptide of the nucleotide-binding domain (Rossman fold) of eukaryotic tyrosyl-tRNA synthetase has been studied by means of site-directed mutagenesis. Replacement of both positively charged residues with asparagine and tyrosine correspondingly as well as substitution of lysine 147 alone cause inactivating of tyrosyl-tRNA synthetase in the reaction of aminoacylation of homologous tRNA. The significance of lysine 147 in stabilization of complex between synthetase and tRNA acceptor stem has been suggested.
issn 0233-7657
url https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152597
citation_txt Сайт-направленный мутагенез остатков лизина, локализованных в соединительном пептиде нуклеотидсвязывающего домена (свертки Россмана) тирозил-тРНК синтетазы из печени быка / В.Г. Найденов, М.И. Вудмаска, А.И. Корнелюк, Г.Х. Мацука // Биополимеры и клетка. — 2000. — Т. 16, № 4. — С. 275-280. — Бібліогр.: 17 назв. — рос.
work_keys_str_mv AT naidenovvg saitnapravlennyimutagenezostatkovlizinalokalizovannyhvsoedinitelʹnompeptidenukleotidsvâzyvaûŝegodomenasvertkirossmanatiroziltrnksintetazyizpečenibyka
AT vudmaskami saitnapravlennyimutagenezostatkovlizinalokalizovannyhvsoedinitelʹnompeptidenukleotidsvâzyvaûŝegodomenasvertkirossmanatiroziltrnksintetazyizpečenibyka
AT kornelûkai saitnapravlennyimutagenezostatkovlizinalokalizovannyhvsoedinitelʹnompeptidenukleotidsvâzyvaûŝegodomenasvertkirossmanatiroziltrnksintetazyizpečenibyka
AT macukagh saitnapravlennyimutagenezostatkovlizinalokalizovannyhvsoedinitelʹnompeptidenukleotidsvâzyvaûŝegodomenasvertkirossmanatiroziltrnksintetazyizpečenibyka
AT naidenovvg saitsprâmovaniimutagenezzališkívlízinulokalízovanihuzêdnuvalʹnomupeptidínukleotidzvâzuûčogodomenuzgortkirossmanatiroziltrnksintetazizpečínkibika
AT vudmaskami saitsprâmovaniimutagenezzališkívlízinulokalízovanihuzêdnuvalʹnomupeptidínukleotidzvâzuûčogodomenuzgortkirossmanatiroziltrnksintetazizpečínkibika
AT kornelûkai saitsprâmovaniimutagenezzališkívlízinulokalízovanihuzêdnuvalʹnomupeptidínukleotidzvâzuûčogodomenuzgortkirossmanatiroziltrnksintetazizpečínkibika
AT macukagh saitsprâmovaniimutagenezzališkívlízinulokalízovanihuzêdnuvalʹnomupeptidínukleotidzvâzuûčogodomenuzgortkirossmanatiroziltrnksintetazizpečínkibika
AT naidenovvg sitedirectedmutagenesisoflysineresidueslocatedintheconnectionpeptideofthenucleotidebindingdomainrossmanfoldoftyrosyltrnasynthetasefrombovineliver
AT vudmaskami sitedirectedmutagenesisoflysineresidueslocatedintheconnectionpeptideofthenucleotidebindingdomainrossmanfoldoftyrosyltrnasynthetasefrombovineliver
AT kornelûkai sitedirectedmutagenesisoflysineresidueslocatedintheconnectionpeptideofthenucleotidebindingdomainrossmanfoldoftyrosyltrnasynthetasefrombovineliver
AT macukagh sitedirectedmutagenesisoflysineresidueslocatedintheconnectionpeptideofthenucleotidebindingdomainrossmanfoldoftyrosyltrnasynthetasefrombovineliver
first_indexed 2025-11-26T02:08:21Z
last_indexed 2025-11-26T02:08:21Z
_version_ 1850608127323406336
fulltext ISSN 0233-7657. Биополимеры и клетка. 2000. Т. 16. № 4 Сайт-направленный мутагенез остатков лизина, локализованных в соединительном пептиде нуклеотидсвязывающего домена (свертки Россмана) тирозил-тРНК синтетазы из печени быка В. Г. Найденов, М. И. Вудмаска, А. И. Корнелюк, Г. X. Мацука Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины Ул. Академика Заболотного, 150, Киев, 03143, Украина Методом сайт-направленного мутагенеза изучена функциональная роль аминокислотных остат­ ков лизина 146 и 147, локализованных в соединительном пептиде нуклеотидсвязывающего домена эукариотической тирозил-тРНК синтетазы. Обнаружено, что замена как обоих положительно заряженных остатков лизина на аспарагин и тирозин соответственно, так и одного остатка лизина-147 приводит к полной инактивации фермента в реакции аминоацилирования гомологичной тРНКТуг быка. Сделано предположение о возможной роли данного остатка лизина в стабилизации переходного состояния при взаимодействии синтетазы с акцепторным стеблем гомологичной тРНКТуг. Введение. В процессе биосинтеза белка аминоацил- тРНК синтетазы (АРСазы, КФ 6.1.1) осуществля­ ют активацию аминокислот за счет энергии АТР и их перенос на тРНК. При этом реализуется узна­ вание тРНК гомологичными АРСазами, являющее­ ся примером высокоспецифического белково-нук- леинового взаимодействия [1 ]. Основным методом, позволяющим детально описать молекулярный ме­ ханизм узнавания тРНК синтетазами и роль от­ дельных аминокислотных остатков как в узнавании субстратов, в том числе тРНК, так и в катализе реакции аминоацилирования, является рентгено- структурный анализ кристаллов [2, 3] . В то же время следует отметить отсутствие рентгенострук- турных данных для АРСаз высших организмов, в первую очередь млекопитающих, включая челове­ ка. Альтернативным подходом для изучения стру­ ктурно-функциональных взаимодействий в АРСа- зах являются методы селективных химических мо- © В. Г. НАЙДЕНОВ, М. И. ВУДМАСКА, А. И. КОРНЕЛЮК, Г. X. МАЦУКА, 2000. дификаций и сайт-направленного мутагенеза, по­ зволяющие изучить функциональную роль опреде­ ленных аминокислотных остатков в белках. Тирозил-тРНК синтетаза (ТирРС) из печени быка (КФ 6.1.1.1, димер 2 x 5 9 кДа) состоит из двух функциональных модулей: N-концевого ката­ литического ядра (39 кДа), содержащего нуклео- тидсвязывающий домен, свертку Россмана, и нека­ талитического С-домена [4—6]. Проблема строения активного центра и меха­ низма узнавания эукариотической тРНК Т у г тиро- зил-тРНК синтетазой является весьма важной, по­ скольку первая содержит короткую дополнитель­ ную петлю в отличие от длиннопетлевых про- кариотических тРНК Т у г и не аминоацилируется бактериальным ферментом, т. е. отсутствует пере­ крестное аминоацилирование [7]. Ранее с помо­ щью методов селективных химических модифика­ ций нами изучена структура активного центра эукариотической ТирРС. На основании получен­ ных данных сделан вывод о существенной роли остатков гистидина [8], цистеина и лизина [9— т. 275 НАЙДЕНОВ В. Г. И ДР. Изучение химической модификации остатков лизина ТирРС из печени быка пиридоксаль-5'-фос- фатом [10, 11 ] показало, что модификации подвер­ гаются два остатка лизина на субъединицу фермен­ та, причем тРНК эффективно защищает фермент от модификации. В то же время критическим для активности является только один остаток лизина, модификация которого приводит к 80 %-й инакти­ вации фермента в реакции аминоацилирования гомологичной тРНК Т у г . С другой стороны, недавно было показано [12], что для активности ТирРС человека сущест­ венным элементом структуры является соедини­ тельный пептид нуклеотидсвязывающего домена, называемого сверткой Россмана. Так как первич­ ные структуры ТирРС быка [5, 6] и человека [13] высокогомологичны (на 96 % ) , мы предположили идентичность механизмов узнавания гомологичных тРНК этими ферментами. Анализ первичной стру­ ктуры ТирРС быка (AF087021) в области соедини­ тельного пептида свертки Россмана (аминокислот­ ные остатки 127—162) показал наличие кластера остатков лизина К146К147, который является наи­ более вероятным кандидатом для функционально важного остатка лизина. Для проверки этой гипо­ тезы в данной работе нами были проведены замены аминокислотных остатков лизина-146 и 147 на остатки аспарагина и тирозина соответственно. Материалы и методы. Сайт-направленный мутагенез ТирРС по остаткам лизина-146 и 147 осуществляли с использованием полимеразной цеп­ ной реакции (ПЦР) методом «мегапраймера» [14]. Фрагмент клона pY40J8 (плазмида pGEX-2T, экс- прессирующая 39-кДа форму ТирРС из печени быка, слитую с глутатион-Б-трансферазой; конст­ руирование pY4018 будет подробно описано допол­ нительно) от сайта Xbal (267) до сайта Sad (669) был клонирован в плазмиду pBluescript SK(+) по тем же сайтам. Реакционная смесь для первого раунда ПЦР содержала в объеме 100 мкл: 20 мМ трис-HCl (рН 8,5), 10 мМ (NH 4 ) 2 S0 4 , 2 мМ MgCl2, четыре де- зоксинуклеозидтрифосфата в концентрации 0,2 мМ каждый, 0,1 %-й тритон Х-100, 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 100 нг плазмиды, му- тантный праймер и праймер ml3 reverse в концен­ трации 0,5 мкМ каждый, а также 5 ед. акт. Pfu- полимеразы. По завершении 30 циклов ПЦР в режиме: 94 °С — 1 мин; 55 °С — 1 мин; 72 °С — 2 мин продукт ПЦР длиной 310 нуклеотидных пар был очищен препаративным электрофорезом в 1,5 %-м агарозном геле и использован в качестве мегапраймера во втором раунде ПЦР в паре с праймером ml3 forward. Реакционная смесь для второго раунда ПЦР имела такой же состав, что и в первом раунде, за исключением того, что количество плазмиды было увеличено до 1 мкг. Продукт второго раунда ПЦР длиной 597 нуклеотидных пар после очистки пре­ паративным электрофорезом был обработан ре- стриктазами SacI и Xbal и лигирован в плазмиду pY4018. Наличие ожидаемых нуклеотидных замен подтверждено секвенированием обеих цепей му- тантной плазмиды. Бактериальная экспрессия и очистка мутан­ тних белков и белка дикого типа. Для экспрессии ТирРС дикого типа и мутантных белков были использованы клетки Escherichia coli штамма BL21 (Е. coli В F dcm ompT hsdS (rb" mb~) gal). Индукцию, культивирование клеток, а также очи­ стку экспрессированных белков осуществляли в соответствии с методиками, описанными в [15]. Аминоацилирование тРНК белком дикого ти­ па и мутантними белками. Стандартная реакци- 276 САЙТ-НАПРАВЛЕННЫЙ МУТАГЕНЕЗ ОСТАТКОВ ЛИЗИНА Рис. 2. Общая схема сайт-направленного мутагенеза и клонирования мутантной тирозил-тРНК синтетазы 277 НАЙДЕНОВ В. Г. И ДР. 1 2 3 4 Рис. 3. Электрофоретический анализ в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия бактериальной экспрессии нормаль­ ной и мутантной тирозил-тРНК синтетазы быка: / , 2 — лизат клеток, несущих плазмиду с геном синтетазы дикого типа; 5, 4 — лизаты клеток, несущих плазмиды с генами синтетазы K147Y и K146N, K147Y соответственно (/ — в отсутствие ИПТГ; 2—4 — после индукции ИПТГ) ТирРС в области Gin 142-Val 153 (за исключением указанных на рис. 1 замен). Использовали синте­ тический мутантный праймер, содержащий четыре нуклеотидные замены в позициях 13, 14, 16 и 22. Замены в позициях праймера 14 и 16 (А-Т и А-С соответственно) приводят к замене в белке остатка лизина-147 на тирозин. Нуклеотидная замена в позиции 13 праймера (А-С) приводит к замене лизина-146 на аспарагин. Следует отметить, что мутантный праймер вырожден в положении нукле- отида 13, что позволило получить в конечном итоге два варианта мутаций в ТирРС: одинарную — K147Y и двойную — K146N, K147Y. Нуклеотидная замена А-С в позиции 22 мутан­ тного праймера является «молчащей», т. е. не приводит к аминокислотной замене в последова­ тельности кодируемого белка. Ее ввели, чтобы получить сайт рестрикции для рестриктазы НаеІІ, наличие которого позволило проводить скрининг и отбор мутантных клонов. Схема получения методом ПЦР мутантных фрагментов ДНК и клонирования мутантной ТирРС в бактериальном экспрессирующем векторе pGEX представлена на рис 2. Фрагмент клона pY401S от сайта Xbal (267) до сайта SacI (669) был клонирован в плазмиду pBluescript SK(+) по тем же сайтам. С использованием мутантного праймера и праймера ml3 reverse (место посадки которого имеется в плазмиде pBluescript SK(+) выше сайта Xbal) методом ПЦР была получена З'-концевая часть XbaI-SacI-фрагмета гена ТирРС, несущая заданные мутации. Этот ПЦР-фрагмент использо- онная смесь для аминоацилирования содержала в объеме 20—50 мкл: 30 мМ HEPES-KOH (рН 7,6), 20 мМ КС1, 10 мМ MgCl2, 2 мМ АТР (рН 7,0), 2 мМ DTT, 10—20 мкМ [ 1 4С]тирозин (удельная активность 1332 ПБк/моль; 0,1—1 мкМ дрожжевая тРНК Т у г . Последним в реакционную смесь вносили препарат ТирРС до конечной концентрации 0,1— 0,5 мкМ и проводили инкубацию при 25 °С. Реак­ цию останавливали добавлением 10 объемов ох­ лажденного 7 %-го раствора трихлоруксусной кис­ лоты, фильтровали через стекловолокнистые фильтры GF-C и измеряли радиоактивность в толу- ольном сцинтилляторе на счетчике «RACK-ВЕТА». Результаты и обсуждение. Аминокислотные замены в соединительном пептиде ТирРС вводили с использованием ПЦР и мутантного праймера (рис 1), комплементарного (-)-цепи ДНК гена С, имп/мин 3500 п Рис 4 Кинетика аминоацилирования дрожжевой тРНК очи­ щенными нормальной <wt) и мутантной (K147Y; K146N, K147Y) тирозил-тРНК синтетазой 278 САЙТ-НАПРАВЛЕННЫЙ МУТАГЕНЕЗ ОСТАТКОВ ЛИЗИНА ван в качестве «мегапраймера» в паре с праймером ml3 forward для получения 5'-концевой части ^йа/-£ас/-фрагмента. Следует отметить, что для ПЦР использовали Р/и-полимеразу, отличающую­ ся повышенной точностью синтеза ДНК, чтобы свести к минимуму возможные нежелательные и случайные мутации. Мутантный Хйа/-5ас/-фрагмент был клониро­ ван в плазмиду pBluescript SK(+). Затем проводили секвенирование для подтверждения наличия задан­ ных мутаций, после чего мутантный Xbal-Sacl- фрагмент возвращали в плазмиду pY4018. Бактериальную экспрессию исходного и мутан- тных белков осуществляли в клетках Е. coli штам­ ма BL-21 (рис. 3). После разрушения клеток ультразвуком нор­ мальный и мутантные белки очищали аффинной хроматографией на колонке с глутатион-сефарозой и тестировали в системе in vitro по способности аминоацилировать дрожжевую тРНК (рис. 4). Обнаружено, что замена двух остатков лизи­ на — 146 и 147 и даже одного 147 приводит к практически полной потере ферментативной актив­ ности синтетазы в реакции аминоацилирования эукариотической тирозин-специфичной тРНК. Таким образом, методами белковой инженерии впервые показано, что критическим остатком лизи­ на в реакции аминоацилирования тРНК эукарио­ тической ТирРС является остаток Lysl47, локали­ зованный в соединительном пептиде нуклеотидсвя- зывающего домена синтетази. Данный соедините­ льный пептид (127—162) является вставочным и соединяет две половины свертки Россмана — нук- леотидсвязывающего домена, присутствующего во всех АРСазах 1-го структурного класса. Данный остаток лизина 147 является одним из наиболее интересных структурных элементов тРНК-связывающего центра бычьей ТирРС, так как, очевидно, он соответствует функционально важному остатку лизина, обнаруженному нами ра­ нее [10, 11] в экспериментах по модификации синтетазы селективным реагентом пиридоксаль-5'- фосфатом. При модификации этого единственного остатка лизина, с одной стороны, почти полностью ингибировалась активность фермента, а с другой — проявлялась антикооперативность взаимодействия двух субъединиц синтетазы [10, 11 ]. Этот остаток, вероятно, соответствует остатку лизина в ТирРС из Bacillus stearothermophilus, участвующему в фор­ мировании дополнительного контакта с тРНК Т у г (аденином-73) в переходном состоянии и являюще­ муся критическим для узнавания тРНК Т у г среди других тРНК В. stearothermophilus [16, 17]. В. Г. Найдьонов, М. I Вудмаска, О. I. Корнелюк, Г. X. Мацука Сайт-спрямований мутагенез залишків лізину, локалізованих у з'єднувальному пептиді нуклеотидзв'язуючого домену (згортки Россмана) тирозил-тРНК синтетази з печінки бика Резюме Методом сайт-спрямованого мутагенезу вивчено функціо­ нальну роль амінокислотних залишків лізину-146 та 147, локалізованих у з* єднувальному пептиді нуклеотидзв'язуючого домену (згортки Россмана) еукаріотичної тирозил-тРНК син­ тетази. Встановлено, що заміна як обох позитивно зарядже­ них залишків лізину на аспарагін та тирозин відповідно, так і одного залишку лізину-147 призводить до повної інактиваиії синтетази в реакції аміноацилювання гомологічної тРНК. Зроблено висновок щодо можливої ролі даного залишку лізину в стабілізації перехідного стану при взаємодії синтетази з акцепторним стеблом гомологічної тРНк^. V. G. Naidenov, М. I. Vudmmkxi, А. I. Kornelyuk, G. Юі Matsuka Site-directed mutagenesis of lysine residues located in the connection peptide of the nucleotide-binding domain (Rossman fold) of tyrosyl- tRNA synthetase from bovine liver Summary The functional role of lysine 146 and 147 residues located in the connection peptide of the nucleotide-binding domain (Rossman fold) of eukaryotic tyrosyl-tRNA synthetase has been studied by means of site-directed mutagenesis. Replacement of both positively charged residues with asparagine and tyrosine correspondingly as well as substitution of lysine 147 alone cause inactivating of tyrosyl-tRNA synthetase in the reaction of aminoacylation of homologous tRNA. The significance of lysine 147 in stabilization of complex between synthetase and tRNA acceptor stem has been suggested. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Schimmel P. Aminoacyl-tRNA synthetase: general features and recognition of transfer RNAs / / Ann. Rev. Biochem.—1987.— 56.—P. 125—158. 2. Arnez J., Moras D. Structural and functional consideration of the aminoacylation reaction / / TIBS.—1997.—22.—P. 211 — 216. 3. Cusack S., Berlhet-Colominas C, Hartlein M., Nassar N, Leberman R. A second class of synthetases structure revealed by X-rays analysis of Escherichia coli seryl-tRNA synthetase at 2.5 A / / Nature.—1990.—347.—P. 249—255. 4. Корнелюк А. И., Курочкин И. В., Маиука Г. X. Тирозил- тРНК синтетаза из печени быка. Выделение и физико- химические свойства / / Молекуляр. биология.—1988.—22, № 1.—С. 176—186. 5. Леванец О. В., Найденов В. Г., Вудмаска М. И., Мацука Г. X., Корнелюк А. И. Клонирование кДНК, кодирующей С-концевую часть тирозил-тРНК синтетазы млекопитаю­ щих, с использованием ПЦР-амплифицированного радио­ активно меченного гибридизационного зонда / / Биополи­ меры и клетка.—1997.—13, № 2.—С. 121 — 126. 6. Леванец О. В., Найденов В. Г., Вудмаска М. И., Мацука Г X., Корнелюк А. И. ПЦР-амплификация, клонирование и секвенирование фрагмента кДНК, кодирующего нуклео- тидсвязывающий домен тирозил-тРНК синтетазы млеко­ питающих / / Биополимеры и клетка.—1996.—12, № 5.— С. 66—70. 7. Курочкин И. В., Корнелюк А. И., Мацука Г. X. Взаимо- 279 НАЙДЕНОВ В. Г. И ДР. действие эукариотической тирозил-тРНК-синтетазы с вы­ сокомолекулярными РНК / / Молекуляр. биология.— 1991.-25, № З . - С . 779 -785 . 8. Гнатенко Д В., Корнелюк А. #., Мацука Г. X. Тирозил- тРНК-синтетаза из печени быка. Изучение функциональ­ ной роли остатков гистидина / / Биоорг. химия.—1991.— 17, № 8.—С. 1033—1037. 9. Гнатенко Д В., Корнелюк А И., Мацука Г. X. Изучение функциональной роли остатков лизина тирозил-тРНК син­ тетазы из печени быка методом химической модификации о-фталевым альдегидом / / Докл. АН УССР. Сер. Б.— 1991.—№ 5.—С. 140—143. 10. Гнатенко Д В., Корнелюк А. Лаврик О. И. Хи­ мическая модификация остатков лизина тирозил-тРНК синтетазы из печени быка с помощью пиридоксаль-5'- фосфата / / Биохимия.—1991.—56, № П.—С. 56—60. 11. Gnatenko D. К, Kornelyuk A I., Matsuka G. Kh One lysine residue of tyrosyl-tRNA synthetase from bovine liver is critical for aminoacylation of tRNA1^1" / / Absracts of 21th FEBS Meeting, Suppl. Abstracts.—Dublin, 1992.—Tu 180. 12. Wakasugi K, Quinn C , Too N., Schimmel P. Genetic code in evolution: switching species-specific aminoacylation with a peptide transplant / / EMBO J.—1998.—17.—P. 297—305. 13. Kleeman T. A , Wei D., Simpson К L, First E. A Human tyrosyl-tRNA synthetase shares amino acid sequence homology with a putative cytokine / / J. Biol. Chem.—1999.—272, N 22.—P. 14420—14425. 14. Barik S. Mutagenesis and gene fusion by megaprimer PCR / / Methods in Molecular Biology. PCR Cloning Protocols / Ed. B. A. White.—New York: Humana press, 1997.—V. 6.— P. 173—182. 15. GST Gene Fusion System. Third Edition.—New York: Phar­ macia Biotech, 1997. 16. Beduelle H. Recognition of tRNA T y f by tyrosyl-tRNA syn­ thetase / / Biochimie.—1990.—72.—P. 589—598. 17. Ferst A. R., Knill-Jones Bedouelle #., Winter G. Recon­ struction by site-directed mutagenesis of the transition state for the activation of tyrosine by the tyrosyl-tRNA synthetase: a mobile loop envelopes the transition state in an induced-fit mechanism / / Biochemistry—1988.—27.—P. 1581 — 1587. УДК 577.152.611:576.31 Поступила в редакцию 29.12.99 280

Ähnliche Einträge