Бактериальная экспрессия полноразмерных и усеченных форм цитокина ЕМАР-2 и цитокинподобного домена тирозил-тРНК синтетазы млекопитающих
В вектор для бактериальной экспрессии рЕТ32а клонированы и секвенированы вставки ДНК, кодирующие полноразмерные цитокин ЕМАР-2 и цитокинподобный домен тирозил-тРНК синтетазы (TyrRS) млекопитающих, а также их делетированные с СООН- и NH₂-концов формы. Получена бактериальная экспрессия всех клонов, и...
Saved in:
| Published in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Date: | 2000 |
| Main Authors: | , , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
2000
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152620 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Бактериальная экспрессия полноразмерных и усеченных форм цитокина ЕМАР-2 и цитокинподобного домена тирозил-тРНК синтетазы млекопитающих / А.Л. Дубровский, Дж. Браун, А.И. Корнелюк, Дж.К. Мюррей, Г.X. Мацука // Биополимеры и клетка. — 2000. — Т. 16, № 3. — С. 229-235. — Бібліогр.: 12 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-152620 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Дубровский, А.Л. Браун, Дж. Карнелюк, А.И. Мюррей, Дж.К. Мацука, Г.Х. 2019-06-12T13:22:08Z 2019-06-12T13:22:08Z 2000 Бактериальная экспрессия полноразмерных и усеченных форм цитокина ЕМАР-2 и цитокинподобного домена тирозил-тРНК синтетазы млекопитающих / А.Л. Дубровский, Дж. Браун, А.И. Корнелюк, Дж.К. Мюррей, Г.X. Мацука // Биополимеры и клетка. — 2000. — Т. 16, № 3. — С. 229-235. — Бібліогр.: 12 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.00056B https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152620 577.152.611 В вектор для бактериальной экспрессии рЕТ32а клонированы и секвенированы вставки ДНК, кодирующие полноразмерные цитокин ЕМАР-2 и цитокинподобный домен тирозил-тРНК синтетазы (TyrRS) млекопитающих, а также их делетированные с СООН- и NH₂-концов формы. Получена бактериальная экспрессия всех клонов, и для полноразмерных форм осуществлены аффинная очистка до гомогенного состояния, протеолитическое удаление константной части слитых рекомбинантных белков, а также тестирование их биологической активности в реакции индукции тканевого фактора. Полноразмерная форма цитокинподобного домена TyrRS не взаимодействует с поликлональными антителами к ЕМАР-2 в вестерн-блот-анализе. Делается вывод о пригодности полученной панели рекомбинантных белков для сравнительного изучения локализации функционально важных участков белков У вектор для бактеріальної експресії рЕТ32а клоновано і секвеновано вставки ДНК, що кодують повнорозмірні цитокін ЕМАР-2 і цитокінподібний домен тирозил-тРНК синтетазы (TyrRS) ссавців, а також їхні делетовані з СООН- і NH₂-кінців форми. Отримано бактеріальну експресію всіх клонів, та для повнорозмірних форм здійснено афінне очищення до гомогенного стану, протеолітичне видалення константної частини злитих рекомбінантних білків, а також тестування їхньої біологічної активності у реакції індукції тканинного фактора. Повнорозмірна форма цитокінподібного домену TyrRS не взаємодіє з поліклональними антитілами до ЕМАР-2 у вестерн-блот-аналізі. Зроблено висновок щодо придатності одержаної панелі рекомбінантньїх білків для порівняльного вивчення локалізації функціонально важливих ділянок білків DNA fragments encoded full-length cytokine EMAP-2 and cytokine-like domain of mammalian TyrRS and truncated from COOH- and NH₂-termini forms were cloned in vector for bacterial expression pET32a. For all clones bacterial overexpression were obtained and full-length forms were purified to homogeneity state by affin chromatography and affinity tag was remove by protease cleavage. Induction of tissue factor for full-length forms was tested. Full-length form of cytokine-like domain of mammalian TyrRS did not interact with polyclonal antibody against EMAP-2 in western-blot analysis. It was concluded that this set of recombinant proteins may be usefull for functional study of these cytokine proteins. Работа выполнена при финансовой поддержке Европейского Молекулярно-Биологического Общества (ЕМБО), номер гранта ASNF 9231. Авторы статьи выражают благодарность М. Тасу (Ноттингемский университет) за любезно предоставленную плазмиду pGEXAt-EMAP и поликлональные антитела против ЕМАР-2, а также В. Ворд л Б (Ноттингемский университет) — за помощь в работе с клеточными культурами. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Структура и функции биополимеров Бактериальная экспрессия полноразмерных и усеченных форм цитокина ЕМАР-2 и цитокинподобного домена тирозил-тРНК синтетазы млекопитающих Бактеріальна експресія повнорозмірних і усічених форм цитокіну ЕМАР-2 і цитокінподібного домену тирозил-тРНК синтетази ссавців Bacterial expression of full-length and truncated forms of cytokine EMAP-2 and cytokine-like domain of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Бактериальная экспрессия полноразмерных и усеченных форм цитокина ЕМАР-2 и цитокинподобного домена тирозил-тРНК синтетазы млекопитающих |
| spellingShingle |
Бактериальная экспрессия полноразмерных и усеченных форм цитокина ЕМАР-2 и цитокинподобного домена тирозил-тРНК синтетазы млекопитающих Дубровский, А.Л. Браун, Дж. Карнелюк, А.И. Мюррей, Дж.К. Мацука, Г.Х. Структура и функции биополимеров |
| title_short |
Бактериальная экспрессия полноразмерных и усеченных форм цитокина ЕМАР-2 и цитокинподобного домена тирозил-тРНК синтетазы млекопитающих |
| title_full |
Бактериальная экспрессия полноразмерных и усеченных форм цитокина ЕМАР-2 и цитокинподобного домена тирозил-тРНК синтетазы млекопитающих |
| title_fullStr |
Бактериальная экспрессия полноразмерных и усеченных форм цитокина ЕМАР-2 и цитокинподобного домена тирозил-тРНК синтетазы млекопитающих |
| title_full_unstemmed |
Бактериальная экспрессия полноразмерных и усеченных форм цитокина ЕМАР-2 и цитокинподобного домена тирозил-тРНК синтетазы млекопитающих |
| title_sort |
бактериальная экспрессия полноразмерных и усеченных форм цитокина емар-2 и цитокинподобного домена тирозил-трнк синтетазы млекопитающих |
| author |
Дубровский, А.Л. Браун, Дж. Карнелюк, А.И. Мюррей, Дж.К. Мацука, Г.Х. |
| author_facet |
Дубровский, А.Л. Браун, Дж. Карнелюк, А.И. Мюррей, Дж.К. Мацука, Г.Х. |
| topic |
Структура и функции биополимеров |
| topic_facet |
Структура и функции биополимеров |
| publishDate |
2000 |
| language |
Russian |
| container_title |
Биополимеры и клетка |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Бактеріальна експресія повнорозмірних і усічених форм цитокіну ЕМАР-2 і цитокінподібного домену тирозил-тРНК синтетази ссавців Bacterial expression of full-length and truncated forms of cytokine EMAP-2 and cytokine-like domain of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase |
| description |
В вектор для бактериальной экспрессии рЕТ32а клонированы и секвенированы вставки ДНК, кодирующие полноразмерные цитокин ЕМАР-2 и цитокинподобный домен тирозил-тРНК синтетазы (TyrRS) млекопитающих, а также их делетированные с СООН- и NH₂-концов формы. Получена бактериальная экспрессия всех клонов, и для полноразмерных форм осуществлены аффинная очистка до гомогенного состояния, протеолитическое удаление константной части слитых рекомбинантных белков, а также тестирование их биологической активности в реакции индукции тканевого фактора. Полноразмерная форма цитокинподобного домена TyrRS не взаимодействует с поликлональными антителами к ЕМАР-2 в вестерн-блот-анализе. Делается вывод о пригодности полученной панели рекомбинантных белков для сравнительного изучения локализации функционально важных участков белков
У вектор для бактеріальної експресії рЕТ32а клоновано і секвеновано вставки ДНК, що кодують повнорозмірні цитокін ЕМАР-2 і цитокінподібний домен тирозил-тРНК синтетазы (TyrRS) ссавців, а також їхні делетовані з СООН- і NH₂-кінців форми. Отримано бактеріальну експресію всіх клонів, та для повнорозмірних форм здійснено афінне очищення до гомогенного стану, протеолітичне видалення константної частини злитих рекомбінантних білків, а також тестування їхньої біологічної активності у реакції індукції тканинного фактора. Повнорозмірна форма цитокінподібного домену TyrRS не взаємодіє з поліклональними антитілами до ЕМАР-2 у вестерн-блот-аналізі. Зроблено висновок щодо придатності одержаної панелі рекомбінантньїх білків для порівняльного вивчення локалізації функціонально важливих ділянок білків
DNA fragments encoded full-length cytokine EMAP-2 and cytokine-like domain of mammalian TyrRS and truncated from COOH- and NH₂-termini forms were cloned in vector for bacterial expression pET32a. For all clones bacterial overexpression were obtained and full-length forms were purified to homogeneity state by affin chromatography and affinity tag was remove by protease cleavage. Induction of tissue factor for full-length forms was tested. Full-length form of cytokine-like domain of mammalian TyrRS did not interact with polyclonal antibody against EMAP-2 in western-blot analysis. It was concluded that this set of recombinant proteins may be usefull for functional study of these cytokine proteins.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152620 |
| citation_txt |
Бактериальная экспрессия полноразмерных и усеченных форм цитокина ЕМАР-2 и цитокинподобного домена тирозил-тРНК синтетазы млекопитающих / А.Л. Дубровский, Дж. Браун, А.И. Корнелюк, Дж.К. Мюррей, Г.X. Мацука // Биополимеры и клетка. — 2000. — Т. 16, № 3. — С. 229-235. — Бібліогр.: 12 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT dubrovskiial bakterialʹnaâékspressiâpolnorazmernyhiusečennyhformcitokinaemar2icitokinpodobnogodomenatiroziltrnksintetazymlekopitaûŝih AT braundž bakterialʹnaâékspressiâpolnorazmernyhiusečennyhformcitokinaemar2icitokinpodobnogodomenatiroziltrnksintetazymlekopitaûŝih AT karnelûkai bakterialʹnaâékspressiâpolnorazmernyhiusečennyhformcitokinaemar2icitokinpodobnogodomenatiroziltrnksintetazymlekopitaûŝih AT mûrreidžk bakterialʹnaâékspressiâpolnorazmernyhiusečennyhformcitokinaemar2icitokinpodobnogodomenatiroziltrnksintetazymlekopitaûŝih AT macukagh bakterialʹnaâékspressiâpolnorazmernyhiusečennyhformcitokinaemar2icitokinpodobnogodomenatiroziltrnksintetazymlekopitaûŝih AT dubrovskiial bakteríalʹnaekspresíâpovnorozmírnihíusíčenihformcitokínuemar2ícitokínpodíbnogodomenutiroziltrnksintetazissavcív AT braundž bakteríalʹnaekspresíâpovnorozmírnihíusíčenihformcitokínuemar2ícitokínpodíbnogodomenutiroziltrnksintetazissavcív AT karnelûkai bakteríalʹnaekspresíâpovnorozmírnihíusíčenihformcitokínuemar2ícitokínpodíbnogodomenutiroziltrnksintetazissavcív AT mûrreidžk bakteríalʹnaekspresíâpovnorozmírnihíusíčenihformcitokínuemar2ícitokínpodíbnogodomenutiroziltrnksintetazissavcív AT macukagh bakteríalʹnaekspresíâpovnorozmírnihíusíčenihformcitokínuemar2ícitokínpodíbnogodomenutiroziltrnksintetazissavcív AT dubrovskiial bacterialexpressionoffulllengthandtruncatedformsofcytokineemap2andcytokinelikedomainofmammaliantyrosyltrnasynthetase AT braundž bacterialexpressionoffulllengthandtruncatedformsofcytokineemap2andcytokinelikedomainofmammaliantyrosyltrnasynthetase AT karnelûkai bacterialexpressionoffulllengthandtruncatedformsofcytokineemap2andcytokinelikedomainofmammaliantyrosyltrnasynthetase AT mûrreidžk bacterialexpressionoffulllengthandtruncatedformsofcytokineemap2andcytokinelikedomainofmammaliantyrosyltrnasynthetase AT macukagh bacterialexpressionoffulllengthandtruncatedformsofcytokineemap2andcytokinelikedomainofmammaliantyrosyltrnasynthetase |
| first_indexed |
2025-11-25T22:45:09Z |
| last_indexed |
2025-11-25T22:45:09Z |
| _version_ |
1850570610486280192 |
| fulltext |
ISSN 0233-7657. Биополимеры и клетка. 2000. Т. 16. № 3
Бактериальная экспрессия полноразмерных
и усеченных форм цитокина ЕМ АР-2
и цитокинподобного домена тирозил-тРНК
синтетазы млекопитающих
А. Л. Дубровский, Дж. Браун 1 , А. И. Корнелюк, Дж. К. Мюррей 1 , Г. X. Мацука
Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины
Ул. Академика Заболотного, 150, Киев, 03143, Украина
*Ноттингемский университет
Ноттингем NG5 1 РВ, Англия
В вектор для бактериальной экспрессии рБТ32а клонированы и секвенированы вставки ДНК,
кодирующие полноразмерные цитокин ЕМ АР-2 и цитокинподобный домен тирозил-тРНК синте
тазы (TyrRS) млекопитающих, а также их делетированные с СООН- и ЫН2-конирв формы.
Получена бактериальная экспрессия всех клонов, и для полноразмерных форм осуществлены
аффинная очистка до гомогенного состояния, протеолитическое удаление константной части
слитых рекомбинантных белков, а также тестирование их биологической активности в реакции
индукции тканевого фактора. Полноразмерная форма цитокинподобного домена TyrRS не взаимо
действует с поликлональными антителами к ЕМ АР-2 в вестерн-блот-анализе. Делается вывод о
пригодности полученной панели рекомбинантных белков для сравнительного изучения локализации
функционально важных участков белков.
Введение. Тирозил-тРНК синтетазы млекопитаю
щих (TyrRS, КФ 6.1.1.1) подобно другим эукарио-
тическим аминоацил-тРНК синтетазам содержат
дополнительный некаталитический С-концевой до
мен [1] . Характерная особенность всех эукариоти-
ческих АРСаз — сродство к полианионным носите
лям — обеспечивается дополнительными доменами
[ 2 ]. Недавно была показана гомология некаталити
ческого домена TyrRS и ЕМАР-2 [1, 3 ] , а также
продемонстрированы EMAP-2-подобные активности
рекомбинантного некаталитического домена [4, 5 ] .
Таким образом, дополнительный домен TyrRS со
держит сайт (ы), ответственный (е) за сродство к
полианионным носителям, и сайт(ы), ответствен
ные за EMAP-2-подобные активности.
Цитокин ЕМАР-2 обладает синергическими
эффектами с T N F H Z [6, 7 ] , вызывает апоптоз в
культуре клеток; его экспрессия наблюдается в
© А. Л ДУБРОВСКИЙ, ДЖ. БРАУН, А. И. КОРНЕЛЮК,
Дж. К, МЮРРЕЙ, Г. X. МАЦУКА, 2000
участках эмбриона, активно подвергающихся апоп-
тозу [8, 9 ] . Как было показано в опытах с синте
тическими пептидами, для большинства (но не
всех) биологических активностей ЕМАР-2 необхо
димым является короткий фрагмент белковой мо
лекулы с VI50 по R164 (аминокислотные остатки
указаны по последовательности ргоЕМАР-2) , рас
положенный с N-конца зрелого ЕМАР-2. Данный
пептид конкурирует с полноразмерным ЕМАР-2 за
связывание с клеточной поверхностью. Тем не
менее, одна из важнейших биологических активно
стей Е М А Р - 2 — индукция тканевого фактора
(тромбопластина) не индуцируется пептидом [10] .
Таким образом, на сегодня идентифицированы не
все участки полипетидной цепи ЕМАР-2, необхо
димые для его биологических активностей.
В настоящее время для выяснения локализа
ции на полипептидной цепи участков, ответствен
ных за различные свойства, активно используется
скрининг панели рекомбинантных белков, пред
ставляющих собой полноразмерную и делетирован-
2 2 9
ДУБРОВСКИЙ А Л И ДР.
ные формы исследуемого белка. Целью данной
работы было получение панели рекомбинантных
белков, включающей в себя полноразмерные и
делетированные c N - и С-концов формы некатали
тического домена TyrRS и цитокина ЕМАР-2.
Материалы и методы. Выбор праймеров для
полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для получе
ния фрагментов ДНК методом ПЦР использовали
следующие пары праймеров:
1. D1 (+)-праймер 5-CCAGCTGTCAAACCA-
TGGGCCCTGCC AAGAATTCG-3';
D2 (-)-праймер 5 -CCTTCTCATAGCGGAT-
ССТТАСАСАААСACTCGCTGА-3' (для получения
кДНК фрагмента, кодирующего С-делетированный
некаталитический домен TyrRS);
2. YCD5F (+)-праймер 5'-AGCCATGGAGAA-
GATTGATGTGGGGG-3';
YCD5R (-)-праймер 5'-CGGGATCCGCCAG-
GTTGGCTAGCTGATG-3' (для получения кДНК
фрагмента, кодирующего N-делетированный нека
талитический домен TyrRS);
3. El (+)-праймер 5'-Т AGCTGG AAGTGCC А-
TGGACTCTAAGCCAATAG-3' ;
З'-рСЯХ-праймер 5'-CCGGGAGCTGCATG-
TGTCAGAGGB (для получения кДНК фрагмента,
кодирующего полноразмерный зрелый ЕМАР-2);
4. Е1 (+)-праймер 5 -TAGCTGGAAGTGCCAT-
GGACTCTAAGCCAATAG-3';
ЕЗ (-)-праймер 5'- AGCTCCTTGTCG AC AG-
GCTCATCCTGGGAAAGC-3' (для п о л у ч е н и я
кДНК фрагмента, кодирующего С-делетированный
ЕМАР-2);
5. Е4 (+)-праймер 5 -CAGATTCTTTGTCCA-
TGGTGGAAGAAGTAGATG-S' ;
З'-рОЕХ-праймер 5'-CCGGGAGCTGCAT-
GTGTCAGAGG-3' (для получения кДНК фрагмен
та, кодирующего N-делетированный ЕМАР-2).
Проведение ПЦР. Реакционные смеси в объеме
100 мкл содержали: 100 нг матричной ДНК (плаз-
мидная Д Н К ) , 1 пмоль каждого праймера,
400 мкмоль каждого dNTP, реакционный буфер и
10 ед. ДНК-полимеразы Tag («Stratagene», США).
Проводили 35 циклов амплификации по следую
щей программе: денатурация матрицы в течение
60 с при 92 °С; отжиг праймеров — 60 с при 57 °С;
достройка праймеров — 60 с при 72 °С. После
завершения реакции образец дополнительно инку
бировали при 72 °С в течение 10 мин.
Клонирование и анализ продуктов ПЦР. Про
дукты ПЦР, полученные с использованием пар
праймеров D l , D2 и YCD5F, YCD5R, обрабатывали
эндонуклеазами рестрикции Ncol и ВатНІ, а про
дукты, полученные с парами Е1, З'-pGEX; Е1, ЕЗ,
и Е 4 , З'-pGEXy — эндонуклеазами рестрикции
Ncol и Sail и лигировали с обработанной указан
ными эндонуклеазами ДНК плазмиды рЕТ32а. Ли
газную смесь использовали для трансформации
компетентных клеток Ecsherichia colt XL-1 Blue.
Рекомбинантные клоны анализировали в ПЦР с
использованием праймеров S-Tag и Т7 terminator
(«Novagen», США) и методом рестрикционного
анализа по сайту Sty/.
В работе использовали эндонуклеазы рестрик
ции и Т4 ДНК-лигазу производства «New England
Biolabs», США. Вставки в клоны, дающие позитив
ный ответ, секвенировали на автоматическом сек-
венаторе нуклеиновых кислот «ALFexpress DNA
Sequencer* фирмы «Pharmacia Biotech» (Швеция).
ДНК клонов, содержащих вставки без мутаций,
трансформировали компетентные клетки Е. coli
BL2KDE3).
Бактериальная экспрессия и очистка реком
бинантных белков. Единичную колонию Е. coli
BL2KDE3) инокулировали на 2 мл среды ТВ,
содержащей 200 мкг/мл карбенициллина, и куль
тивировали при 37 °С с интенсивным встряхивани
ем до достижения оптической плотности O D 6 0 0 =
- 0,4. Клетки осаждали центрифугированием в на
стольной центрифуге при 12 000 об/мин в течение
1 мин. Осадок ресуспендировали в 2 мл свежей ТВ,
и 100 мкл суспензии инокулировали в 8 мл ТВ с
500 мкг/мл карбенициллина. Культуру выращива
ли при тех же условиях до O D 6 0 0 = 0,4. Затем
к л е т к и с о б и р а л и ц е н т р и ф у г и р о в а н и е м при
2800 об/мин в течение 10 мин и ресуспендировали
в 8 мл ТВ с 500 мкг/мл карбенициллина, содержа
щей 0,1 мМ IPTG. После 2 ч культивирования при
тех же условиях клетки собирали цетрифугирова-
нием при 5 000 об/мин в течение 15 мин, надоса-
дочную жидкость удаляли и клеточный осадок
замораживали при - 2 0 ° С
Клеточный осадок размораживали в буфере
для н а н е с е н и я на N i - N T A - а г а р о з у (50 мМ
N a H 2 P 0 4 , рН 8,0, 300 мМ NaCl; 20 мМ имидазол)
с добавлением PMSF до концентрации 1 мМ и
/9-меркаптоэтанола — до 15 мМ. Клетки разрушали
трехкратным замораживанием—оттаиванием в жи
дком азоте и полученный лизат наносили на колон
ку с Ni-NTA-агарозой («Qiagen», США), предвари г
тельно уравновешенную 10 объемами буфера для
нанесения. Колонку промывали 10 объемами буфе
ра для нанесения и последовательно 5 объемами
промывочных буферов следующего состава: промы
вочный буфер WI — 5 0 мМ N a H 2 P 0 4 , рН 6,5,
300 мМ NaCl, 50 мМ имидазол; промывочный бу
фер WII — 50 мМ N a H 2 P 0 4 , рН 8,0, 1 М NaCl,
50 мМ имидазол; промывочный буфер Wil l —
50 мМ N a H 2 P 0 4 , рН 8,0, 300 мМ NaCl, 0,5 %-й
230
тритон Х-100, 20 мМ имидазол. Рекомбинантный
белок элюировали ступенчатым градиентом кон
центрации имидазол а от 30 до 130 мМ. Фракции
анализировали электрофорезом в ПААГ, после чего
фракции, содержащие гомогенный препарат белка,
объединяли и переводили в буфер для расщепления
энтерокиназой (20 мМ трис-хлорид, рН 7,4, 2 мМ
СаС1 2, 50 мМ NaCl).
Расщепление энтерокиназой осуществляли при
4 °С в течение ночи. Нерасщепленный продукт и
константную часть рекомбинантных белков удаля
ли инкубацией с Ni-NTA-агарозой.
Тест на плазмидную стабильность. Бактери
альную культуру наращивали до O D 6 0 0 = 0,8 и про
водили разведения в культуральной среде. Затем
200 мкл разведения 1 0 6 высевали на чашку с
агаром без добавок и чашку с добавлением ампи
циллина (100 мкг/мл); 100 мкл разведения 1 0 5
высевали на чашку с IPTG (1 ммоль) и на чашку
с IPTG и ампициллином. Колонии подсчитывали
на следующий день.
Вестерн-блот-анализ полноразмерных реком-
бинантых белков. Для вестерн-блот-анализа про
водили гель-электрофорез в 12,5 %-м SDS-ПААГ.
Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану
RPN303C («Amersham Life Science*, Англия), ис
пользуя электрофоретическую систему переноса
(«Pharmacia Biotech», 150 мА, 200 В, 60 мин).
После переноса мембрану обрабатывали в 5 %-м
сухом молоке на PBS с 0,1 %-м твином при
температуре 4 °С в течение ночи. Далее мембрану
промывали PBS с 0,1 %-м твином и обрабатывали
последовательно поликлональными антителами
против ЕМАР-2 (в разведении 1 : 2000), антитела
ми против константной части IgG кролика, конъю-
гированными с пероксидазой (в разведении 1 :
: 2000). Результаты блотинга анализировали мето
дом ECL («Amersham Life Science»).
Анализ индукции тканевого фактора. Для
анализа индукции тканевого фактора эндотелиоци-
ты человека из вены пупочного канатика высевали
на 24-луночную планшету. Клетки культивировали
при 37 °С/5 % С 0 2 до образования сплошного
монослоя. Культуральную среду удаляли и вносили
ростовую среду, содержащую соответствующие раз
ведения исследуемых белков, и клетки культивиро
вали при тех же условиях в течение еще 4 ч. После
этого среду удаляли, дважды промывали стериль
ным PBS и вносили раствор хлорида кальция (ко
нечная концентрация 10 ммоль), буфер Оуэна и
цитрированную плазму крови человека. Пробы ин
кубировали на водяной бане при температуре 37 °С
до образования сгустка, определяемого визуально.
Время образования сгустка заносили в таблицу.
БАКТЕРИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ЦИТОКИНА ЕМАР-2
Результаты и обсуждение. Последовательности
праймеров D l , D2, YCD5F и YCD5R выводили из
последовательности кДНК бычьей TyrRS таким
образом, чтобы продукт амплификации D1 и D2
кодировал фрагмент полипептидной цепи TyrRS с
G353 по V469, а продукт амплификации YCD5F и
YCD5R — с Е390 по S528. Праймеры D1 и YCD5F
содержали в своей последовательности сайт ре
стрикции Ncol, а праймеры D2 и YCD5R — ВатШ
для последующего клонирования продукта ПЦР в
рЕТ32си
£соЛ/-фрагмент размером 1186 пар оснований
(п. о.) из плазмиды pKCTD [ 11 ] , кодирующий
аминокислотную последовательность TyrRS с N357
по S528, был клонирован в рЕТ32а по EcoRI-сашу.
Продукты амплификации на Д Н К плазмиды
pKCTD с парами праймеров D1 и D2, YCD5F и
YCD5R размером 400 п. о. были клонированы по
Ncol- и В am Ш-сайтам в рЕТ32си
Последовательности праймеров E l , ЕЗ и Е4
выводили из последовательности кДНК, кодирую
щей предшественник ЕМАР-2. Выбрать праймер,
специфически гибридизующийся на З'-конце кДНК
ЕМАР-2, не удалось, поэтому для амплификации
кДНК ЕМАР-2 в качестве обратного праймера был
использован Ъ'-pGEX праймер («Віо-Rad»). Как
матрицу для амплификации использовали ДНК
плазмиды p&EX-4t-EMAP [12] . Праймеры Е1 и Е4
содержали в своей последовательности сайт ре
стрикции Ncol, а праймер ЕЗ — сайт рестрикции
Sail. Продукт амплификации с праймерами Е1 и
ЕЗ размером около 400 п. о., кодирующий амино
кислотную последовательность ргоЕМАР-2 с D144
по F254, был клонирован в рЕТ32а по сайтам
рестрикции Ncol, Sail. Продукты амплификации с
парами праймеров Е1 и У-pGEX, Е4 и З'-pGEX
размерами около 550 и 500 п. о. соответственно,
кодирующие последовательность аминокислот для
ргоЕМАР-2 с D144 по К310 и с V174 по К310
соответственно, были клонированы в рЕТ32а по
сайтам рестрикции Ncol, Sail. При этом использо
ван £а//-сайт полилинкера плазмиды pGEX4t, в
которую клонировали кДНК ргоЕМАР.
Полученные клоны анализировали на наличие
вставки при помощи ПЦР с праймерами S-Tag и
Т7 terminator («Novagen»). Клоны, давшие положи
тельный сигнал, анализировали на специфичность
вставки рестрикционным картированием по Xbal-
сайту для клонов, содержащих вставку кДНК
TyrRS, и по Styl-camy для клонов, содержащих
вставку кДНК ргоЕМАР-2. Далее вставки секвени
ровали по обеим цепям для обнаружения возмож
ных мутаций. Клоны, не содержащие мутаций,
отбирали для дальнейшей работы.
231
ДУБРОВСКИЙ А. Л. И ДР.
Конструкции получили следующие обозначе
ния (рис. 1): pEYCD3—экспрессирует некатали
тический домен бычьей TyrRS (YCD3); pEYCD4 —
экспрессирует С-делетированный некаталитиче
ский домен бычьей TyrRS (YCD4); pEYCD5 —
экспрессирует N-делетированный некаталитиче
ский домен бычьей TyrRS (YCD5); рЕМАР-їі —
экспрессирует полноразмерный зрелый ЕМАР-2
(EMAP-2f); рЕМЛР-2АС — экспрессирует С-деле-
т и р о в а н н ы й з р е л ы й Е М А Р - 2 ( Е М А Р - 2 А С ) ;
pEMAP-2AN — экспрессирует N-делетированный
зрелый ЕМАР-2 (EMAP-2AN).
ДНК полученных конструкций использовали
для трансформации компетентных клеток Е. coli
BL21 (DE3) для последующей экспрессии. При
использовании стандартного протокола для экс
прессии рекомбинантных белков в р^Г-векторах,
успешно применяемого ранее, экспрессия целевых
белков была снижена практически до нуля. Для
выяснения причин отсутствия экспрессии осущест
влено тестирование на плазмидную стабильность
для клонов, кодирующих полноразмерный и деле
гированные формы цитокинподобного домена
TyrRS.
Результаты теста приведены в таблице. Прак
тически все жизнеспособные клетки вырастают на
чашке 1 без добавок; на чашке 3 с добавкой
ампициллина вырастают лишь клоны, несущие
плазмиду. Таким образом, в культурах, несущих
плазмиды pEYCD4n pEYCD5, при данных услови
ях практически не содержится клонов, несущих
целевые плазмиды. Клоны, выросшие в присутст
вии IPTG, либо не содержат плазмиды, либо не
способны к экспрессии целевой вставки. Клоны,
выросшие на чашке с ампициллином и IPTG,
представляют собой мутанты, содержащие плазми
ду, но не способные к экспрессии целевой вставки.
Как следует из этих результатов, популяция
бактерий, пригодная для экспрессии целевых бел
ков, составляет незначительную часть от общей.
Рис. 1. Выравнивание аминокислотных последовательностей С-концевых некаталитических доменов TyrRS быка, человека,
цитокина ЕМАР-2 (а) и схемы полученной панели рекомбинантных белков (б): YCD3 — некаталитический домен бычьей TyrRS,
аминокислоты с N357 по S528; YCD4 — С-делетированный некаталитический домен бычьей TyrRS. аминокислоты с G353 по V469;
YCD5 — N-делетированный некаталитический домен бычьей TyrRS, аминокислоты с Е390 по S528; рЕМАР-2І — зрелый ЕМДР-2,
аминокислоты с D144 по КЗ 10; рЕМАР-2АС — ЕМАР-2, делетированный с С-конца, аминокислоты с D144 по F254; pEMAP-2AN —
ЕМАР-2, делетированный с N-конца, аминокислоты с D174 по КЗ 10
232
БАКТЕРИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ЦИ7 0КЛНА ЕМАР 2
Таким образом, экспрессия данных белков в рЕТ-
системе приводит к плазмидной нестабильности,
что может указывать на токсичность белкового
продукта для бактериального хозяина.
При замене ампициллина на карбенициллин и
изменении протокола экспрессии на протокол,
предлагаемый фирмой «Novagen» для подобных
случаев, удалось добиться значительного возраста
ния уровня экспрессии для всех конструкций (рис
2).
Для подтверждения биологических активно
стей рекомбинантных белков некаталитический до
мен бычьей TyrRS и полноразмерный зрелый
ЕМАР-2 были выделены и аффинно очищены в
виде fusion-белков при помощи хроматографии на
Ni-NTA-агарозе. Константные части fusion-белков
были удалены протеолизом энтерокиназой (белки с
отщепленной константной частью в конце обозна
чены индексом «е»). Активность полученных пре
паратов анализировали по индукции тканевого
фактора на поверхности эндотелиоцитов вены пу
почного канатика человека (рис 3) . При этом
исследовали диапазон концентраций от 100 до
0,1 пмоль. Активность YCD3e сопоставима с тако
вой EMAP-2fe. Ранее Као в опытах с синтетически
ми пептидами было показано, что при замене 1157
на А пептид теряет способность индуцировать хе
мотаксис полиморфноядерных лейкоцитов. Полу
ченные нами данные указывают на то, что для
способности индуцировать тканевый фактор замена
1157 на V несущественна.
Для изучения иммунологических свойств пол
ученных препаратов белков был проведен имму-
ноблотинг с поликлональными антителами против
ЕМАР-2 [11] (рис 4) . Как видно, несмотря на
высокий уровень гомологии некаталитического до
мена TyrRS и ЕМАР-2, рекомбинантные белки не
имеют иммунологического перекреста в иммуноб-
Резулыпаты тестирования стабильности пяазмид, экспрессирующих полноразмерный и делетированные формы
цитокинподобного домена TyrRS (в качестве контроля взята рЕТ32а)
б
Рис. 2. Бактериальная экспрессия зрелой полноразмерной и делегированной форм цитокинподобного домена бычьей TyrRS (а) и
цитокина ЕМАР-2 (61; а — лизат BL21 (DE3)/рЕYCD3, экспрессирующий полноразмерный домен до индукций (/) и через 2 ч после
нее (2); лизат BL21 (DE3)/pEYCD4, экспрессирующий С-делетированный домен до индукции (3) и через 2 ч после (4); лизат
BL21 (DE3)/pEYCD5, экспрессирущий N-делетированный домен до индукции (5) и через 2 ч после (6); б — лизат BL2KDE3)/
/pEMAP-lU экспрессирующий полноразмерный цитокин до индукции (У) и через 2 ч после (2); лизат BL21 ФЕЗ)/рЕМ АР-1С,
экспрессирующей С-делетированный цитокин до индукции (3) и через 2 ч после (4)\ лизат BL21 (DE3)/pEMAP-2&N, экспрессиру
щий N-делетированный цитокин до индукции (5) и через 2 ч после (6)
2 3 3
ДУБРОВСКИЙ А. Л- И ДР.
Таким образом, нами получена панель реком-
4 м 1 2 бинантных зрелого ЕМАР-2 и некаталитического
домена бычьей TyrRS и их делетированных форм,
пригодная для изучения функционально важных
участков этих белков.
Работа выполнена при финансовой поддержке
Европейского Молекулярно-Биологического Обще
ства (ЕМБО), номер гранта ASNF 9231.
Авторы статьи выражают благодарность М. Та-
су (Ноттингемский университет) за любезно предо
ставленную плазмиду pGEXAt-EMAP и поликло-
нальные антитела против ЕМАР-2, а также В. Ворд
л Б (Ноттингемский университет) — за помощь в рабо
те с клеточными культурами.
Рис. 4. А: протеолиз энтерокиназой и разделение на Ni-NTA-
агарозе белков YCD3 (У), EMAP-2f (3) и несвязавшаяся с
носителем фракция, содержащая YCD3e (2) и EMAP-2fe (4); Б:
вестерн-блот-анализ белков EMAP-2fe (У) и YCD3e (2) с поли-
клональными антителами против цитокина ЕМАР-2
О. Л. Дубровський, Дж. Браун, О. L Корнелюк, Дж. К. Мюррей,
Г. X. Маиука
Бактеріальна експресія повнорозмірних і усічених форм
цитокіну ЕМАР-2 і цитокінподібного домену тирозил-тРНК
синтетази ссавців
лотинге. Это может свидетельствовать о том, что
большинство антигенных детерминант, на которые
вырабатываются антитела к данным белкам, кон-
формационные. Секвенационные детерминанты
взаимно не перекрываются в этом случае. Тем не
менее, возможны и другие объяснения полученного
результата.
Резюме
У вектор для бактеріальної експресії рЕТ32а клоновано і
секвеновано вставки ДНК, що кодують повнорозмірні цитокін
ЕМАР-2 і цитокінподібний домен тирозил-тРНК синтетазы
(TyrRS) ссавців, а також їхні делетовані з С ООН- і NH2-
кінців форми. Отримано бактеріальну експресію всіх клонів,
та для повнорозмірних форм здійснено афінне очищення до
гомогенного стану, протеолітичне видалення константної
частини злитих рекомбінантних білків, а також тестування
їхньої біологічної активності у реакції індукції тканинного
фактора. Повнорозмірна форма цитокінподібного домену
234
БАКТЕРИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ЦИТОКИНА ЕМАГ :
TyrRS не взаємодіє з поліклональними антитілами до ЕМАР-2
у вестерн-блот-аналізі. Зроблено висновок щодо придатності
одержаної панелі рекомбінантньїх білків для порівняльного
вивчення локалізації функціонально важливих ділянок білків.
A. L. Dubrovsky, Jn. Brown, А. I. Kornelyuk, J. С. Murray,
G. Юг. Matsuka
Bacterial expression of full-length and truncated forms of cytokine
EMAP-2 and cytokine-like domain of mammalian tyrosyl-tRNA
synthetase
Summary
DNA fragments encoded full-length cytokine EMAP-2 and cytokine-
like domain of mammalian TyrRS and truncated from С ООН- and
NH2-termini forms were cloned in vector for bacterial expression
pET32a. For alt clones bacterial overexpression were obtained and
full-length forms were purified to homogeneity state by affin
chromatography and affinity tag was remove by protease cleavage.
Induction of tissue factor for full-length forms was tested. Full-
length form of cytokine-like domain of mammalian TyrRS did not
interact with polyclonal antibody against EMAP-2 in western-blot
analysis. It was concluded that this set of recombinant proteins may
be usefull for functional study of these cytokine proteins.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Леванец О. В., Найденов В. Г., Вудмаска М. #., Мацука Г.
X., Корнелюк А. И. Клонирование кДНК, кодирующей
С-концевую часть тирозил-тРНК синтетазы млекопитаю
щих, с использованием ПЦР-амплифицированного радио
активно меченного гибридизационного зонда / / Биополи
меры и клетка.—1997.—13, № 2 . - С . 121—126.
2. Mirande М. Aminoacyl-tRNA synthetase family from proka-
ryotes and eukaryotes: structural domains and their implica
tions / / Progr. Nucl. Acids Res. and Мої. Biol.—1991.—40.—
P. 95—141.
3. Kleeman T. A , Wei D. В., Simpson К L, First E. A. Human
tyrosyl-tRNA synthetase shares amino acid sequence homology
with a putative cytokine / / J. Biol. Chem.—1997.—272.—
P. 14420—14425.
4. Kornelyuk A , Tas M. P. R., Dubrovsky A. JLt Murray C. J.
Cytokine activity of non-catalytic EMAP-2-like domain of
mammalian tyrosyl-tRNA synthetase / / Biopolimery і kletka
(Kyiv).—1999.—15, N 2 . - P . 168—172.
5. Wakasugi 1С, Schimmel P. T Two distinct cytokine released
from a human aminoacyl-tRNA synthetase / / Science.—
1999.—284.—P. 147—151.
6. Kao J., Ryan J., Brett G., Chen J., Shen H, Fan Y. G,
Godman G.t Familletti P. C , Wang F, Pan Y. C , Stern D.,
Clauss M. Endothelial monocyte-activating polypeptide II. A
novel tumor-derived polypeptide that activates host-response
mechanisms / / J. Biol. Chem.—1992.—267.—P. 20239—
20247.
7. Kao J., Houck K, Fan Y, Haehnel I., Libutti S. K, Kayton
M. JL, Grikscheit Г., Chabot J., Nowygrod R., Greenberg S.,
Kuang W.-J., Leung D.f Hayward J. R., Kisiel W., Heath M.,
Brett Stern D. M. Characterization of a novel tumor-
derived cytokine. Endothelial monocyte-activating polypeptide
II / / J. Biol. Chem.—1994.—269.—P. 25106—25119.
8. Schwarz M., Lee M., Zhang F., Zhao J., Jin Y, Smith S.,
Bhuva Stern D.t Warburton £>., Starnes V. EMAP II: a
modulator of neovascularization in the developing lung / /
Amer. J. Physiol.—1999.—276.—P. 365—375.
9. Schwarz M. A., Kandel J., Brett J., Li J., Hayward J.,
Schwarz R. E., Chappey O., Wautier J. L., Chabot J., Lo
Gerfo P., Stern D. Endothelial-monocyte activating polypeptide
II, a novel antitumor cytokine that suppresses primary and
metastatic tumor growth and induces apoptosis in growing
endothelial cells / / J. Exp. Med.—1999.—190.—P. 341—354.
10. Kao J., Fan У. G., Haehnel I., Brett J., Greenberg S., Clauss
M., Kayton M.y Houck K, Kisiel W.t Seljelid R., Burnier /.,
Stern D. A peptide derived from the amino terminus of
endothelial-monocyte-activating polypeptide II modulates mo
nonuclear and polymorphonuclear leukocyte functions, defines
an apparently novel cellular interaction site, and induces an
acute inflammatory response III. Biol. Chem.—1994.—269.—
P. 9774—9782.
11. Дубровский А Л., Савинская Л. А., Корнелюк А. И.
Клонирование и бактериальная экспрессия цитокинподоб
ного некаталитического домена бычьей тирозил-тРНК син
тетазы / / Биополимеры и клетка.—1998.—14, № 5.—
С. 449—452.
12. Tas М. P. R., Houghton J., Jakobsen А. М., Tolmachova Т.,
Carmichael J., Murray J. С. Cloning and expression of human
endothelial-monocyte-activating polypeptide 2 r(EiSlAP-2) and
identification of its putative precursor / / Cytokine.—1997 —
9.—P. 535—539.
УДК 577.152.611
Поступила в редакцию 29.11.99
235
|