Каталитическая активность микрокристаллов аспартатамннотрансферазы
Впервые показана энзиматическая активность кристаллической аспартатаминотрансферазы (КФ 2.6.1.1) из цитозоля сердца кур в растворах сульфата аммония (50 %) и полиэтиленгликоля (20 %); активность микрокристаллов составляет 32 и 40 % активности фермента в растворе соответственно. Вперше показано ензим...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Дата: | 1986 |
| Автор: | |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Російська |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1986
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152713 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Каталитическая активность микрокристаллов аспартатамннотрансферазы / В.М. Кочкина // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 2. — С. 69-73. — Бібліогр.: 10 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859723881753870336 |
|---|---|
| author | Кочкина, В.М. |
| author_facet | Кочкина, В.М. |
| citation_txt | Каталитическая активность микрокристаллов аспартатамннотрансферазы / В.М. Кочкина // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 2. — С. 69-73. — Бібліогр.: 10 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Биополимеры и клетка |
| description | Впервые показана энзиматическая активность кристаллической аспартатаминотрансферазы (КФ 2.6.1.1) из цитозоля сердца кур в растворах сульфата аммония (50 %) и полиэтиленгликоля (20 %); активность микрокристаллов составляет 32 и 40 % активности фермента в растворе соответственно.
Вперше показано ензиматичну активність кристалічної аспартатамінотрансферази (КФ 2.6.1.1) з цитозолю серця курей у розчинах сульфату амонію (50 %) і поліетиленгліколю (20 %); активність мікрокристалів становить 32 і 40 % активності ферменту в розчині відповідно.
The enzymic activity of crystalline cytosolic aspartate aminotransferase (L-aspartate: aminotransferase 2-oxoglutarate, EC 2.6.1.1) was determined in suspensions of micro-crystals in 50 % ammonium sulphate and 20 % (wt/vol) polyethylene glycol. The crystals (1-2 μm wide) were small enough to preclude diffusional rate limitation. The catalytic activity of the crystalline enzyme is 32 % and 40 % of the enzyme activity in solution, respectively.
|
| first_indexed | 2025-12-01T10:51:07Z |
| format | Article |
| fulltext |
Структура
и функция
биополимеров
УДК 577.152.261.45
КАТАЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ
МИКРОКРИСТАЛЛОВ АСПАРТАТАМИНОТРАНСФЕРАЗЫ
В. М. Кочкина
Введение. Первые работы по определению энзиматической активности
кристаллов ферментов появились около 20 лет назад. К их числу от-
носятся работы по изучению активности кристаллов РНКазы S [1] и
карбоксипептидаз А [2] и В [3]. Эти исследования проводили с кри-
сталлами, ковалентно сшитыми глутаровым альдегидом, или в раство-
рах с высокими концентрациями солей, препятствующих растворению
кристаллов. Недавно опубликована работа по определению ката-
литической активности микрокристаллов митохондриальной аспарта-
таминотрансферазы (ААТ) из сердца кур [4] в растворе полиэтилен-
гликоля (30 %, вес/объем). Авторами было установлено, что молярная
активность кристаллов фермента на порядок ниже, чем активность
фермента в растворе. Несмотря на то, что во многих лабораториях
нашей страны проводят исследования белков, находящихся в кристал-
лическом состоянии, работ по определению активности в кристаллах
до сих пор нет. В то же время подобные исследования необходимы,
поскольку кристаллы многих белков изучают рентгеновским способом'
для установления их пространственной структуры. К числу успешно
изучаемых ферментов относится ААТ из цитозоля сердца кур. Для это-
го белка установлена пространственная структура при разрешении
0,28 нм [5, 6]. Если при установлении трехмерной структуры фермента
достаточно качественной характеристики каталитических свойств кри-
сталлов фермента по типу «да — нет», то для изучения механизма
действия фермента качественных данных недостаточно. В этом случае
необходимы количественные сведения о каталитической активности
кристаллов, так как результаты, полученные при исследовании мало-
активных кристаллов, не будут отражать реально происходящие в
активном центре процессы.
Выяснению функциональных способностей ААТ из цитозоля серд-
ца кур в двух физических ее состояниях — растворе и кристаллах —
посвящено данное исследование.
Материалы и методы. Фермент выделяли из сердца кур, удельная активность фер-
мента составляла 70000 ед/мг. Активность фермента в растворе определяли прямым
спектрофотомстрическим методом [7] при рН 7,5 в термостатированной на 25 °С кювете.
Реакцию начинали добавлением 5—10 мкл кристаллического фермента к пробе в кю-
вете объемом 1 мл с длиной светового пути 1 см. Активность регистрировали в течение
3 мин после начала реакции. Активность микрокристаллов определяли этим же мето-
дом в аналогичных условиях, но в присутствии 20 % полиэтиленгликоля (ПЭГ) или
50 % сульфата аммония (СА).
Концентрацию белка определяли спектрофотометрически после растворения мик-
рокристаллов, принимая А ^ = 1 4 , 0 [8]. Спектрофотометричсские измерения проводили
на спектрофотометре «Сагу 118» («Varian», США).
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1986, т. 2, № 2 3 — 5-901 69
В работе использовали L-аспартат и 2-оксоглутарат фирмы «Sigma» (США), ПЭГ
с молекулярной массой 6000 фирмы «Loba—Chemie» (Австрия), реактивы отечествен-
ного производства квалификации осч.
Результаты и обсуждение. К р и с т а л л и з а ц и я . Микрокристал-
лы цитоплазматической ААТ выращивали из двух кристаллизационных
сред — СА и ПЭГ. Для того, чтобы кристаллографические параметры
Рис. 1. Кристаллы аспартатаминотрансфсразы, выращенные из раствора:
а —СА; б — П Э Г . Х500.
Fig. 1. Aspartate aminotransferase crystals grown from the solution: a — SA;
6 — P E G . X500.
микро- и макрокристаллов не отличались, микрокристаллы из раствора
СА получали в тех же условиях, при которых выращивали крупные
кристаллы [9], используемые для рентгенографического исследования
фермента [5]. Кристаллизацию проводили при 4 °С в стеклянных про-
бирках (10X60 мм) в 0,1 Μ калий-фосфатном буферном растворе,
рН 7,5, в присутствии 40 %' СА и 7 % метилпентандиола. Концентрация
70 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, М- 2
белка в пробе составляла 18—20 мг/мл. После выпадения основной
массы фермента в виде кристаллов (обычно через 5—7 дней) суперна-
тантный маточный раствор отбирали, заменяя его стабилизирующей
смесью, которая содержала 50 % СА в 0,3 Μ калий-фосфатном буфере,
рН 7,5. В среде такого состава выпавшие кристаллы не растворялись
(растворимость кристаллов контролировали микроскопически). Для луч-
шего отмывания кристаллов от маточного ферментного раствора их
взмучивали в стабилизирующей смеси и оставляли не менее чем на
сутки в холодильнике. Процедуру отмывания кристаллов повторяли до
тех пор, пока в промывной смеси не исчезала ферментная активность,
обычно 6—7 раз. Хранили кристаллы в холодильнике.
Эффективность каталитического действия фермента в кристалли-
ческом состоянии в основном зависит от упаковки кристалла, его высо-
ты и ширины, а также от влияния кристаллизационной или стабили-
зирующей среды. Влияние упаковки и среды можно только учесть, но
не изменить. Изменить можно высоту и ширину кристалла. Чем меньше
эти параметры, тем быстрее проникнут в глубь кристалла субстраты.
Для цитозольной ААТ высота кристалла в 5—10 раз меньше его шири-
ны, поэтому скорость диффузии ограничивается только шириной кри-
сталла. В данном исследовании получили кристаллы шириной 1—2 мкм
(рис. 1, а).
Как упоминалось ранее, исследования активности кристалличе-
ской митохондриальной ААТ [4] проводили на кристаллах, выращен-
ных из раствора ПЭГ. Для сравнения каталитической способности
цитозольного и митохондриального изоферментов были получены кри-
сталлы цитозольной ААТ из раствора ПЭГ (19 %, вес/объем). Кри-
сталлизацию проводили при комнатной температуре в 0,1 Μ калий-
фосфатном буфере, рН 7,5. Концентрация белка в пробе составляла
17—25 мг/мл. В стеклянную пробирку (7X40 мм) вносили 0,2 мл
38 %-ного ПЭГ в 0,1 Μ калий-фосфатном буфере, рН 7,5, затем осто-
рожно наслаивали 0,2 мл ферментного раствора в таком же буфере.
Пробирки плотно закрывали и оставляли в комнате. Кристаллы
(рис. 1, б) выпадали через 3—4 дня. После выпадения кристаллов из
пробирок отбирали маточный ферментный раствор, не выпавший в
виде кристаллов, и добавляли 20 %'-ный ПЭГ в 0,1 Μ калий-фосфат-
ном буфере, рН 7,5. Кристаллы для лучшего отмывания от маточного
раствора взмучивали и оставляли на сутки при комнатной температуре.
Процедуру отмывания кристаллов от маточного раствора фермента
повторяли до тех пор, пока в промывных средах не исчезала фермент-
ная активность (обычно б—7 раз) . Специальной сортировки кристаллов
не проводили. Хранили отмытые кристаллы в 20 %-ном ПЭГ в 0,1 Μ
калий-фосфатном буфере, рН 7,5, при комнатной температуре.
А к т и в н о с т ь ф е р м е н т а . Определение функциональной спо-
собности фермента в двух физических его состояниях — кристаллах и
растворе — для большей достоверности и сравнимости результатов про-
водили только на ферменте из кристаллического состояния. Аликвоту
предварительно взмученных в стабилизирующей смеси кристаллов вно-
сили в кювету со средой, не содержавшей СА или ПЭГ. Кристаллы
растворяли непосредственно в кювете, перемешивая раствор перед опре-
делением активности, регистрируя, таким образом, активность фермента
в состоянии раствора. Активность фермента в кристаллическом состоя-
нии измеряли в среде, препятствующей растворению кристаллов — в
50 %-ном СА или 20 %-ном ПЭГ. В кювету вносили аликвоту суспен-
зии микрокристаллов, закрывали ее тефлоновой пробкой и несколько
раз поворачивали вверх—вниз для перемешивания содержимого кю-
веты. В процессе измерения активности фермента в кристаллическом
состоянии также проводили перемешивание реакционной среды. Ре-
зультаты измерения активности не менялись после перемешивания,
поскольку кристаллы таких размеров в используемых для ее опреде-
ления средах находились во взвешенном состоянии. В ходе исследова-
ния необходимо было учитывать ингибирующее действие на процесс
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1986, т. 2, № 2 3 — 5-901 71
переаминирования высоких концентраций субстратов [10], а также
СА или ПЭГ. Энзиматическую активность измеряли в растворе, со-
державшем 30 мМ аспартат и 3 мМ 2-оксоглутарат, поскольку при
таких концентрациях субстратов для цитозольной ААТ из сердца кур
ингибирования субстратами еще не наблюдали. Для того, чтобы в
какой-то степени учесть влияние СА или ПЭГ, реакцию по определе-
нию активности проводили в пробах с различным процентным содер-
жанием осадителей. Активность микрокристаллов, выращенных из рас-
твора СА, определяли в реакционных средах, не содержавших СА, а
также с его 25- и 50 %-ной конечных концентрациях. На рис. 2, а
представлены результаты
определений. Как видно, в
среде с 25%-ным раствором
СА активность фермента (в
Рис. 2. Активность кристалличес-
кого фермента (9 мкг) в средах:
а —без СА (1)\ с 25%-ным (2);
50%-ным СА (3) ; б — б е з ПЭГ
(1); с 10%-ным (2); 15 %-ным
(3); 20 %-ным ПЭГ (4).
Fig. 2. The activity of crystalline
aspartate aminotransferase (9 μ^)
in media: a — without SA (1)\ in
25 % SA (2); in 50 % SA (3);
6 — without PEG (7); in 10 % PEG
(2); in 15 % PEG (3); in 20 %
PEG (4).
состоянии раствора) снижается и составляет 78 % исходной. Увеличе-
ние насыщения СА до 50 % еще сильнее тормозит реакцию переамини-
рования. Активность фермента в кристаллическом состоянии состав-
ляет 41 % активности фермента в растворе 25%-ного СА и 32 % актив-
ности в пробе, не содержащей СА. При определении активности фер-
мента в состоянии раствора в 0,4 Μ калий-фосфатном буфере, рН 8, с
постепенным увеличением в среде насыщения СА от 0 до 30 % (шаг
5 % ) наблюдали плавное снижение активности. Экстраполяция кривой
зависимости активности от насыщения СА показала, что нулевая актив-
ность фермента будет при 48%-ном насыщении СА в среде. Таким об-
разом, активность кристаллического фермента, наблюдаемая в среде
с 50%-ным насыщением СА, очень велика, несмотря на то, что она
составляет лишь 32 % исходной
Результаты по определению активности кристаллов, выращенных
из раствора ПЭГ, представлены на рис. 2, б. Активность измеряли в
средах, не содержавших ПЭГ и содержавших его 10, 15, 20 и 28 %.
Оказалось, что наличие в реакционной среде 10 %-ного ПЭГ практиче-
ски не оказывает влияния на каталитическую активность фермента.
При 15 %-ном ПЭГ в пробе активность снижается на 18—23 %' исход-
ного значения. В реакционной среде с 10 и 15 %-ным ПЭГ кристаллы,
вносимые в пробу, растворялись и определяемая активность принадле-
жала ферменту в состоянии раствора. Активность фермента в среде с
20 %-ным ПЭГ является активностью фермента в кристаллическом со-
стоянии, она составляет 40 %' активности фермента в состоянии раство-
ра в среде без ПЭГ. При 28 %-ном ПЭГ в реакционной среде субстра-
ты начали выпадать в осадок и поэтому данные этого опыта нельзя
сравнивать с данными других опытов.
Итак, кристаллы цитозольной ААТ из сердца кур, выращенные из
растворов СА и ПЭГ, обладают высокой энзиматической активностью
и вполне пригодны для исследования механизма действия фермента
кристаллографическим методом.
72 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 2
CATALYTIC ACTIVITY
OF ASPARTATE AMINOTRANSFERASE MICROCRYSTALS
V. M. Kochkina
Institute of Molecular Biology, Academy of Sciences of the USSR, Moscow
S u m m a г у
The enzymic activity of crystalline cytosolic aspartate aminotransferase (L-aspartate:
aminotransferase 2-oxoglutarate, EC 2.6.1.1) was determined in suspensions of micro-
crystals in 50 % ammonium sulphate and 20 % (wt/vol) polyethylene glycol. The crystals
(1-2 μηι wide) were small enough to preclude diffusional rate limitation. The catalytic
activity of the crystalline enzyme is 32 % and 40 % of the enzyme activity in solution,
respectively.
1. Doscher M. S., Richards F. M. The activity of an enzyme in the crystalline state: ri-
bonuclcase S / / J . Biol. Chem.— 1963.—238, N 7 .—P. 2399—2406.
2 S pi lb игр' СBeihune J. L., Vallee B. L. Kinetic properties of crystalline enzymes. Car-
boxypeptidase A/ /B iochemis t ry .— 1977.—16, N 6 .—P. 1142—1150.
3. Kinetic properties of carboxypeptidase В in solution and crystals / G. M. Alter,
D. L. Leussing, H. Neurath, B. L. Vallee / / Ibid.— 1977.—16, N 16.—P. 3663—3668.
4. Kirsten H., Christen P. Catalytic activity of microcrystals of aspartate aminotransfe-
rase / / Biochem J.— 1983,—211, N 2.— P. 427—434.
5. Изменения конформации цитозольной аспартатаминотрансферазы, индуцируемые
оксоглутаратом / В. Н. Малашкевич, В. М. Кочкина, Ю. М. Торчинский, Э. Г. Ару-
т ю н я н / / Д о к л . АН СССР,— 1982.—267, № 5.—С. 1257—1261.
6. Конформации аспартатаминотрансферазы в кристалле / В. В. Борисов, С. Н. Бори-
сова, Н. И. Сосфенов, X. Ф. Б. Диксон / / Молекуляр. биология.— 1983.—17, № 4.—
С. 705—713.
7. Jenkins W. Т., Yphaniis D. Α., Sizer /. W. Glutamic aspartic t ransaminase / / J. Biol.
C h e m , - 1959.—234, N 1.— P. 51—57.
8. Bertland L. H., Kaplan N. O. Studies of the conformations of the multiple forms of
chicken heart aspartate aminotransferase / /Biochemis t ry .— 1970.—9, N 13.— P. 2653—
2665.
9. Кочкина В. Μ. Влияние ионов металлов на размер кристаллов аспартаттрансамина-
зы, получение тяжелоатомных производных кристаллов фермента / /Кристаллогра-
фия,—1983.—28, № 5.—С. 1013—1017.
10. Kiick D. Μ., Cook P. F. pH Studies toward the elucidation of the auxiliary catalyst
for pig heart aspartate aminotransferase / / Biochemistry.— 1983.—22, N 2.— P. 375—
382.
Ин-т молекуляр. биологии АН СССР, Москва Получено 27.06.85
УДК 577.112.5:578.841
СТРОЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ХИМОТРИПТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ
ГРАНУЛИНА ВИРУСА ГРАНУЛЕЗА ОЗИМОЙ СОВКИ,
AGROTIS SEGETUM
Т. Л. Левитина, Н. В. Роднин, С. Б. Серебряный, Э. А. Козлов
В предыдущей работе [1] описаны результаты выяснения строения
триптических пептидов гранулина вируса гранулеза (ВГ) A. segetum.
В настоящей статье приведены данные, полученные при изучении химо-
триптических пептидов этого белка.
Материалы и методы. Получение белка, восстановление и карбоксиметилирование
описано ранее [1]. Химотрипсин («Reanal», ВНР) обрабатывали ингибитором трипсина
из бобов сои [2]. Расщепление химотрипсином проводили в 0,2 н. бикарбонате аммо-
ния (рН 7,8), содержащем 2 Μ мочевину, в течение 22 ч при 37 °С. Фермент-субстрат-
ное соотношение 1 : 50. Реакцию останавливали лиофилизацией. Химотрипсиновый гид-
ролизат растворяли в 50 %-ной муравьиной кислоте и разделяли гель-фильтрованием
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1986, т. 2, № 2 3 — 5-901 73
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-152713 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7657 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-01T10:51:07Z |
| publishDate | 1986 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Кочкина, В.М. 2019-06-12T16:22:36Z 2019-06-12T16:22:36Z 1986 Каталитическая активность микрокристаллов аспартатамннотрансферазы / В.М. Кочкина // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 2. — С. 69-73. — Бібліогр.: 10 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.00019E https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152713 577.152.261.45 Впервые показана энзиматическая активность кристаллической аспартатаминотрансферазы (КФ 2.6.1.1) из цитозоля сердца кур в растворах сульфата аммония (50 %) и полиэтиленгликоля (20 %); активность микрокристаллов составляет 32 и 40 % активности фермента в растворе соответственно. Вперше показано ензиматичну активність кристалічної аспартатамінотрансферази (КФ 2.6.1.1) з цитозолю серця курей у розчинах сульфату амонію (50 %) і поліетиленгліколю (20 %); активність мікрокристалів становить 32 і 40 % активності ферменту в розчині відповідно. The enzymic activity of crystalline cytosolic aspartate aminotransferase (L-aspartate: aminotransferase 2-oxoglutarate, EC 2.6.1.1) was determined in suspensions of micro-crystals in 50 % ammonium sulphate and 20 % (wt/vol) polyethylene glycol. The crystals (1-2 μm wide) were small enough to preclude diffusional rate limitation. The catalytic activity of the crystalline enzyme is 32 % and 40 % of the enzyme activity in solution, respectively. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Структура и функции биополимеров Каталитическая активность микрокристаллов аспартатамннотрансферазы Каталітична активність мікрокристалів аспартатамінотрансферази Catalytic activity of aspartate aminotransferase microcrystals Article published earlier |
| spellingShingle | Каталитическая активность микрокристаллов аспартатамннотрансферазы Кочкина, В.М. Структура и функции биополимеров |
| title | Каталитическая активность микрокристаллов аспартатамннотрансферазы |
| title_alt | Каталітична активність мікрокристалів аспартатамінотрансферази Catalytic activity of aspartate aminotransferase microcrystals |
| title_full | Каталитическая активность микрокристаллов аспартатамннотрансферазы |
| title_fullStr | Каталитическая активность микрокристаллов аспартатамннотрансферазы |
| title_full_unstemmed | Каталитическая активность микрокристаллов аспартатамннотрансферазы |
| title_short | Каталитическая активность микрокристаллов аспартатамннотрансферазы |
| title_sort | каталитическая активность микрокристаллов аспартатамннотрансферазы |
| topic | Структура и функции биополимеров |
| topic_facet | Структура и функции биополимеров |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152713 |
| work_keys_str_mv | AT kočkinavm katalitičeskaâaktivnostʹmikrokristallovaspartatamnnotransferazy AT kočkinavm katalítičnaaktivnístʹmíkrokristalívaspartatamínotransferazi AT kočkinavm catalyticactivityofaspartateaminotransferasemicrocrystals |