Изучение первичной структуры бактериальной формиатдегидрогеназы. Определение N-концевой аминокислотной последовательности и выделение цистеинсодержащих пептидов
Осуществлена иммобилизация НАД-зависимой формиатдегидрогеназы из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp101 на тиоловых носителях. Выделены и охарактеризованы цистеинсодержащие пептиды. Проведена локализация остатка цистеина, ответственного за проявление каталитической активности фермента. Определена...
Saved in:
| Published in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Date: | 1986 |
| Main Authors: | , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1986
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152741 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Изучение первичной структуры бактериальной формиатдегидрогеназы. Определение N-концевой аминокислотной последовательности и выделение цистеинсодержащих пептидов / Т.Б. Устинникова, В.О. Попов, А.М. Егоров, Ц.А. Егоров // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 3. — С. 129-135, 159. — Бібліогр.: 10 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-152741 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Устинникова, Т.Б. Попов, В.О. Егоров, А.М. Егоров, Ц.А. 2019-06-12T17:18:38Z 2019-06-12T17:18:38Z 1986 Изучение первичной структуры бактериальной формиатдегидрогеназы. Определение N-концевой аминокислотной последовательности и выделение цистеинсодержащих пептидов / Т.Б. Устинникова, В.О. Попов, А.М. Егоров, Ц.А. Егоров // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 3. — С. 129-135, 159. — Бібліогр.: 10 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.0001A8 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152741 577.112.5:577.152.121 Осуществлена иммобилизация НАД-зависимой формиатдегидрогеназы из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp101 на тиоловых носителях. Выделены и охарактеризованы цистеинсодержащие пептиды. Проведена локализация остатка цистеина, ответственного за проявление каталитической активности фермента. Определена N-концевая аминокислотная последовательность формиатдегидрогеназы. Здійснено іммобілізацію НАД-залежної форміатдегідрогенази з метилотрофних бактерій Pseudomonas sp101 на тіолових носіях. Виділено та охарактеризовано цистеїнвмісні пептиди. Проведено локалізацію залишка цистеїну, відповідального за прояв каталітичної активності ферменту. Визначено N-кінцеву амінокислотну послідовність форміатдегідрогенази. NAD-dependent formate dehydrogenase from methylotrophic bacteria of Pseudotnonas sp101 was immobilized on thiopropyl-Sepharose 6B and CPG/Thiol activated by 2,2'-di-pyridyl disulphide via the thiol-disulphide exchange reaction. A procedure for the tryptic digestion of the immobilized enzyme was optimized. Cysteine-containing tryptic peptides were isolated and partially characterized. The peptide which contained the essential cysteine residue responsible for the catalytic enzyme activity was located. A method for the determination of the N-terminal amino acids after fragmentation of the immobilized protein was developed. The N-terminal amino acid sequence of the formate dehydrogenase immobilized via its cysteine residues on a controlled porous glass was determined. Авторы выражают благодарность Л. М. Винокурову за определе- ние N-концевой аминокислотной последовательности формиатдегидро- геназы. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Структура и функции биополимеров Изучение первичной структуры бактериальной формиатдегидрогеназы. Определение N-концевой аминокислотной последовательности и выделение цистеинсодержащих пептидов Вивчення первинної структури бактерійної форміатдегідрогенази. Визначення N-кінцевої амінокислотної послідовності і виділення цистеїнвмісних пептидів Primary structure of the bacterial formate dehydrogenase determination of N-terminal amino acid sequence and isolation of cysteine-containing peptides Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Изучение первичной структуры бактериальной формиатдегидрогеназы. Определение N-концевой аминокислотной последовательности и выделение цистеинсодержащих пептидов |
| spellingShingle |
Изучение первичной структуры бактериальной формиатдегидрогеназы. Определение N-концевой аминокислотной последовательности и выделение цистеинсодержащих пептидов Устинникова, Т.Б. Попов, В.О. Егоров, А.М. Егоров, Ц.А. Структура и функции биополимеров |
| title_short |
Изучение первичной структуры бактериальной формиатдегидрогеназы. Определение N-концевой аминокислотной последовательности и выделение цистеинсодержащих пептидов |
| title_full |
Изучение первичной структуры бактериальной формиатдегидрогеназы. Определение N-концевой аминокислотной последовательности и выделение цистеинсодержащих пептидов |
| title_fullStr |
Изучение первичной структуры бактериальной формиатдегидрогеназы. Определение N-концевой аминокислотной последовательности и выделение цистеинсодержащих пептидов |
| title_full_unstemmed |
Изучение первичной структуры бактериальной формиатдегидрогеназы. Определение N-концевой аминокислотной последовательности и выделение цистеинсодержащих пептидов |
| title_sort |
изучение первичной структуры бактериальной формиатдегидрогеназы. определение n-концевой аминокислотной последовательности и выделение цистеинсодержащих пептидов |
| author |
Устинникова, Т.Б. Попов, В.О. Егоров, А.М. Егоров, Ц.А. |
| author_facet |
Устинникова, Т.Б. Попов, В.О. Егоров, А.М. Егоров, Ц.А. |
| topic |
Структура и функции биополимеров |
| topic_facet |
Структура и функции биополимеров |
| publishDate |
1986 |
| language |
Russian |
| container_title |
Биополимеры и клетка |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Вивчення первинної структури бактерійної форміатдегідрогенази. Визначення N-кінцевої амінокислотної послідовності і виділення цистеїнвмісних пептидів Primary structure of the bacterial formate dehydrogenase determination of N-terminal amino acid sequence and isolation of cysteine-containing peptides |
| description |
Осуществлена иммобилизация НАД-зависимой формиатдегидрогеназы из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp101 на тиоловых носителях. Выделены и охарактеризованы цистеинсодержащие пептиды. Проведена локализация остатка цистеина, ответственного за проявление каталитической активности фермента. Определена N-концевая аминокислотная последовательность формиатдегидрогеназы.
Здійснено іммобілізацію НАД-залежної форміатдегідрогенази з метилотрофних бактерій Pseudomonas sp101 на тіолових носіях. Виділено та охарактеризовано цистеїнвмісні пептиди. Проведено локалізацію залишка цистеїну, відповідального за прояв каталітичної активності ферменту. Визначено N-кінцеву амінокислотну послідовність форміатдегідрогенази.
NAD-dependent formate dehydrogenase from methylotrophic bacteria of Pseudotnonas sp101 was immobilized on thiopropyl-Sepharose 6B and CPG/Thiol activated by 2,2'-di-pyridyl disulphide via the thiol-disulphide exchange reaction. A procedure for the tryptic digestion of the immobilized enzyme was optimized. Cysteine-containing tryptic peptides were isolated and partially characterized. The peptide which contained the essential cysteine residue responsible for the catalytic enzyme activity was located. A method for the determination of the N-terminal amino acids after fragmentation of the immobilized protein was developed. The N-terminal amino acid sequence of the formate dehydrogenase immobilized via its cysteine residues on a controlled porous glass was determined.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152741 |
| citation_txt |
Изучение первичной структуры бактериальной формиатдегидрогеназы. Определение N-концевой аминокислотной последовательности и выделение цистеинсодержащих пептидов / Т.Б. Устинникова, В.О. Попов, А.М. Егоров, Ц.А. Егоров // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 3. — С. 129-135, 159. — Бібліогр.: 10 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT ustinnikovatb izučeniepervičnoistrukturybakterialʹnoiformiatdegidrogenazyopredelenienkoncevoiaminokislotnoiposledovatelʹnostiivydeleniecisteinsoderžaŝihpeptidov AT popovvo izučeniepervičnoistrukturybakterialʹnoiformiatdegidrogenazyopredelenienkoncevoiaminokislotnoiposledovatelʹnostiivydeleniecisteinsoderžaŝihpeptidov AT egorovam izučeniepervičnoistrukturybakterialʹnoiformiatdegidrogenazyopredelenienkoncevoiaminokislotnoiposledovatelʹnostiivydeleniecisteinsoderžaŝihpeptidov AT egorovca izučeniepervičnoistrukturybakterialʹnoiformiatdegidrogenazyopredelenienkoncevoiaminokislotnoiposledovatelʹnostiivydeleniecisteinsoderžaŝihpeptidov AT ustinnikovatb vivčennâpervinnoístrukturibakteríinoíformíatdegídrogenaziviznačennânkíncevoíamínokislotnoíposlídovnostíívidílennâcisteínvmísnihpeptidív AT popovvo vivčennâpervinnoístrukturibakteríinoíformíatdegídrogenaziviznačennânkíncevoíamínokislotnoíposlídovnostíívidílennâcisteínvmísnihpeptidív AT egorovam vivčennâpervinnoístrukturibakteríinoíformíatdegídrogenaziviznačennânkíncevoíamínokislotnoíposlídovnostíívidílennâcisteínvmísnihpeptidív AT egorovca vivčennâpervinnoístrukturibakteríinoíformíatdegídrogenaziviznačennânkíncevoíamínokislotnoíposlídovnostíívidílennâcisteínvmísnihpeptidív AT ustinnikovatb primarystructureofthebacterialformatedehydrogenasedeterminationofnterminalaminoacidsequenceandisolationofcysteinecontainingpeptides AT popovvo primarystructureofthebacterialformatedehydrogenasedeterminationofnterminalaminoacidsequenceandisolationofcysteinecontainingpeptides AT egorovam primarystructureofthebacterialformatedehydrogenasedeterminationofnterminalaminoacidsequenceandisolationofcysteinecontainingpeptides AT egorovca primarystructureofthebacterialformatedehydrogenasedeterminationofnterminalaminoacidsequenceandisolationofcysteinecontainingpeptides |
| first_indexed |
2025-11-26T17:53:19Z |
| last_indexed |
2025-11-26T17:53:19Z |
| _version_ |
1850766312026931201 |
| fulltext |
7. Graenwedel D. W. Salt effects on the denaturation of DNA. A calorimetric study of
the helix-coil conversion of the al ternat ing copolymer p o l y [ d ( A T ) ] / / I b i d . — 1975.—
395, N 3,— P. 246—257.
8. Yatiisch-Perroti C., Vieira J., Messing J. Improved M13 phage cloning vectors and host
strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 v e c t o r s / / G e n e . — 1985.—33,
N 1,—P. 103—119.
9. Gotoh O. Prediction of melting profiles and local helix stability for sequenced DNA / /
Adv. Biophys.— 1983.—16.—P. 1—52.
Ин-т молекуляр. генетики АН СССР, Москва Получено 16.09.85
УДК 577.112.5:577.152.121
ИЗУЧЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ
БАКТЕРИАЛЬНОЙ ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ N-КОНЦЕВОЙ
АМИНОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
И ВЫДЕЛЕНИЕ ЦИСТЕИНСОДЕРЖАЩИХ ПЕПТИДОВ
Т. Б. Устинникова, В. О. Попов, А. М. Егоров, Ц. А. Егоров
Введение. НАД-зависимая формиатдегидрогеназа (КФ 1.2.1.2) катали-
зирует окисление формиата до СОг, в ходе которого осуществляется
перенос гидрид-иона от субстрата к молекуле НАД. В предыдущих
работах нами были получены гомогенные препараты НАД-зависимой
формиатдегидрогеназы метилотрофных бактерий Pseudomonas splOl
(прежнее название Achromobacter parvulus) и изучены ее основные
физико-химические свойства [1, 2]. Формиатдегидрогеназа представ-
ляет собой белок с молекулярной массой около 80000, состоящий из
двух идентичных субъединиц и включающий два независимых актив-
ных центра [1, 3]. Нами был подробно исследован кинетический меха-
низм действия формиатдегидрогеназы [4, 5]. Конформацию и струк-
туру активного центра фермента исследовали методами химической
модификации аминокислотных остатков специфическими реагентами,
а также путем картирования аналогами субстратов и кофермента [2,
4]. На основании этих работ были сформулированы основные законо-
мерности протекания ферментативного процесса окисления формиата
[2]. В связи с получением кристаллов формиатдегидрогеназы, пригод-
ных для рентгенографических исследований, возник вопрос об опреде-
лении первичной структуры фермента.
Классические методы определения первичной структуры белков
весьма трудоемки, что связано с необходимостью разделения сложных
смесей пептидов. Особую трудность составляет изучение белков, со-
держащих остатки цистеина, которые отличаются высокой реакционной
способностью. Формиатдегидрогеназа из Pseudomonas splOl характе-
ризуется высоким содержанием тиоловых остатков. Субъединица фер-
мента содержит шесть остатков цистеина, существенно различающихся
по своей реакционной способности и доступности действию модифи-
цирующих реагентов. Наиболее реакционноспособная тиольная группа
находится в районе активного центра фермента. Ее избирательное бло-
кирование приводит к полной потере ферментативной активности [1,
2, 6]. В последнее время успешно развивается новый подход структур-
но-функционального анализа белков, содержащих остатки цистеина и
(или) цистина [7, 8]. Он основан на иммобилизации цистеинсодержа-
Сокращения: ДТТ — дитиотреитол, Д П Д С — 2,2'-дипиридилдисульфид, ДНС-С1 —
5-диметиламинонафталин-1-сульфонилхлорид, ФИТЦ — фенилизотиоцианат, Gu-HCl •—
гуанидингидрохлорид, ТФУ — трифторуксусная кислота, МЭ — 2-меркаптоэтанол,
ЭМА — N-этилморфолинацетатный буфер, ЭДТА-Ыа2 — динатриевая соль этилендиамин-
тетрауксусной кислоты.
Б И О П О Л И М Е Р Ы и КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 3 3 — 6-115 129
щих белков на носителях путем реакции тиол-дисульфидного обмена
с последующим расщеплением конъюгата ферментативными или хи-
мическими способами.
Целью настоящей работы является дальнейшая разработка стра-
тегии структурно-функционального анализа тиолзависимых ферментов
и частичное изучение первичной структуры НАД-зависимой формиат-
дегидрогеназы метилотрофных бактерий Pseudomonas splOl.
Материалы и методы. Р е а г е н т ы . В работе использованы следующие реагенты:
CPG/Thiol , ДНС-С1, ТФУ, ФИТЦ («Pierce», США), ЭДТА-Ыа2, N-(иодоацетиламино-
этил)-5-нафтиламин-1-сульфоновая кислота («Sigma», США), Д П Д С («Aldrich», США),
тиопропил-сефароза 6В («Pharmacia», Швеция), ТРСК-трипсин («Worthington», США).
Ф о р м и а т д е г и д р о г е н а з у из метилотрофных бактерий Pseudomonas splOl
выделяли, как описано ранее [1].
А к т и в а ц и я н о с и т е л я C P G / T h i o l . 25 мл носителя инкубировали при пе-
ремешивании с 20-кратным молярным избытком ДТТ в 50 мл 0,2 Μ ЭМА, рН 8,0, со-
держащего 1 мМ ЭДТА-^та2 и 20 %-ный этанол, в течение 4 ч при 40 °С в атмосфере
азота. Затем носитель промывали на пористом фильтре водой и 50 %-ным МеОН до
удаления ДТТ. Носитель перемешивали в атмосфере азота в течение 1 ч с 50 мл 50 %-
пого раствора МеОН в 0,1 Μ ЭМА, рН 8,0, содержащего Д П Д С (10-кратный молярный
избыток). После этого раствор декантировали, остаток промывали 50 %-ным МеОН и
снова инкубировали с раствором ДПДС. Повторяли до тех пор, пока не прекратилось
выделение тиопиридона. Активированный носитель промывали МеОН до полного уда-
ления Д П Д С и сушили в вакуум-эксикаторе.
И м м о б и л и з а ц и я ф о р м и а т д е г и д р о г е н а з ы н а а к т и в и р о в а н -
н ы х н о с и т е л я х . Для иммобилизации формиатдегидрогеназы на стекле CPG/Thiol
концентрированный раствор фермента добавляли к носителю, уравновешенному 6 Μ
Gu-HCl в 0,05 Μ К-фосфатном буфере, рН 7,6, содержащем 1 мМ 3flTA-Na2 . Объем
носителя составлял 35—25 % объема раствора белка. Иммобилизацию вели при пе-
ремешивании в атмосфере азота в течение 6 ч. Конъюгат промывали последовательно
буфером с 6 Μ Gu-HCl, водой, водным МеОН и МеОН. Конъюгат сушили и хранили при
8 °С. Количество иммобилизовавшегося белка определяли с помощью аминокислотного
анализа. При использовании в качестве носителя тиопропил-сефарозы конъюгат промы-
вали 6 Μ Gu-HCl и уравновешивали соответствующим буфером. Количество иммобили-
зовавшегося белка определяли по выходу 2-тиопиридона [8].
Т р и п т и ч е с к и й г и д р о л и з и м м о б и л и з о в а н н о й ф о р м и а т д е г и д -
р о г е н а з ы . Гидролиз формиатдегидрогеназы, иммобилизованной на тиопропил-сефа-
розе 6В, выполняли при перемешивании в атмосфере азота в течение 4 ч в 0,1 Μ аммо-
ний-бикарбонатном буфере, рН 7,8, при 37 °С (соотношение фермента к субстрату
1 : 100). По окончании гидролиза супернатант отбирали, остаток дважды промывали
1—2 объемами буфера и объединенный супернатант лиофилизировали. Затем остаток
промывали 6 Μ Gu-HCl в 0,1 Μ аммоний-бикарбонатном буфере, рН 7,8, и уравнове-
шивали 0,1 Μ аммоний-бикарбонатным буфером. К полученной суспензии (на 1 объем
геля 1—2 объема буфера) добавляли МЭ из расчета 50 мкл/мл геля и после перемеши-
вания оставляли на 30 мин при комнатной температуре. После восстановления супер-
натант собирали, остаток дважды промывали буфером и объединенную фракцию цисте-
инилпептидов лиофилизировали. Фракцию этих пептидов анализировали высокоэффек-
тивной эксклюзионной хроматографией на колонке TSK 2000 SW в 0,1 %-ной ТФУ, а
в препаративных целях разделяли на био-геле Р-4 в 0,01 н. СН3СООН, содержащей
1 мМ МЭ, с последующим алкилированием 4-винилпиридином [9] при рН 7,5, используя
3-кратный молярный избыток реагента по отношению к МЭ. Фракцию пептидов, не
содержащих остатков цистеина, разделяли на колонке LiChrosorb RP-18 (4,6X250 мм)
в 0,1 %-ной ТФУ и градиенте ацетонитрила.
С п е ц и ф и ч е с к и й г и д р о л и з и м м о б и л и з о в а н н о й ф о р м и а т д е -
г и д р о г е н а з ы т р и п с и н о м п о о с т а т к а м а р г и н и н а . ε-Аминогруппы
остатков лизина фермента, иммобилизованного на CPG/Thiol, предварительно блоки-
ровали ДНС-С1 или ФИТЦ. При дансилировании около 25 мг конъюгата (2 нмоль бел-
ка) помещали в ампулу и добавляли 100—150 мкл 0,2 Μ ЭМА, рН 9,5. После переме-
шивания избыток буфера отбирали. К конъюгату добавляли 50 мкл ДНС-С1 в ацетоне
(6 мг/мл) и инкубировали при 45 °С в течение 60 мин. Затем избыток реагента отби-
рали, остаток промывали ацетоном, водой и окончательно 0,1 Μ ЭМА, рН 7,2. Трипти-
130 Б И О П О Л И М Е Р Ы и КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 3 3 — 6-115 130
ческий гидролиз формиатдегидрогеназы, модифицированной ДНС-С1, вели при рН 7,2 и
37 °С в течение 90 мин (соотношение фермента к субстрату 1 : 150). Затем супернатант
отбирали, остаток промывали б Μ Gu-HCl в буфере, рН 7,8, водой и 0,1 Μ Na-бикарбо-
натным буфером, рН 9,5, для последующего дансилирования. Для блокирования боко-
вых цепочек лизина иммобилизованной формиатдегидрогеназы с помощью ФИТЦ конъ-
югат вначале уравновешивали 50 %-ным ЭМА, рН 9,5, после чего добавляли 5 %-ный
ФИТЦ в ацетонитриле и инкубировали 1 ч при 45 °С в атмосфере аргона. Конъюгат
промывали МеОН для удаления избытка реагента и уравновешивали 0,1 Μ ЭМА,
Рис. 1. Обратимая иммобилизация белка по остаткам цистеина (I) и последующая
фрагментация образовавшегося конъюгата ферментами или химическими агентами (II).
Fig. 1. The reversible protein immobilization via cysteine residues ( I ) followed by frag-
mentation of the conjugate by enzymes or chemical agents (II).
pH 7,2. Триптический гидролиз белка, модифицированного таким образом на носителе,
выполняли, как описано выше.
Р а с щ е п л е н и е и м м о б и л и з о в а н н о й ф о р м и а т д е г и д р о г е н а з ы
б р о м ц и а н о м . Около 50 мг конъюгата (4 нмоль белка) помещали в ампулу, промы-
вали 70 %-ной НСООН, после чего добавляли 100-кратный молярный избыток бром-
циана. Смесь инкубировали в атмосфере азота в темноте 16 ч. Супернатант отбирали,
остаток промывали два раза по 50 мкл 70 %-ной НСООН и объединенную фракцию
лиофилизировали. Остаток промывали дополнительно НСООН, водой и 0,1 Μ Na-би-
карбонатным буфером, рН 9,5.
О п р е д е л е н и е Ν-κ о н ц е в ы х а м и н о к и с л о т и м м о б и л и з о в а н н ы х
п е п т и д о в . N-концевые аминокислоты в пептидах, образующихся при фрагментации
иммобилизованного белка, определяли в виде ДНС-производных. N-концевой анализ
пептидов, уходящих в раствор, проводили, как обычно. N-концевые аминокислоты пеп-
тидов, остающихся на пористом стекле после соответствующей фрагментации белка,
определяли следующим образом. К суспензии остатка конъюгата, уравновешенного бу-
фером с рН 9,5, добавляли равный объем ДНС-С1 в ацетоне (6 мг/мл) и после пере-
мешивания инкубировали при 45 °С в течение 60 мин. Затем избыток реагента отбира-
ли, остаток промывали МеОН и высушивали под уменьшенным давлением прямо в ам-
пуле. К остатку добавляли небольшой избыток 5,7 н. НС1 и гидролизовали в атмосфере
аргона при 110 °С 16 ч. Супернатант отбирали, остаток промывали водой, объединенный
супернатант упаривали и растворяли в минимальном объеме 50 %-ного пиридина.
ДНС-аминокислоты идентифицировали на полиамидных пластинках размером 5 X 5 см.
О п р е д е л е н и е N - к о н ц е в о й а м и н о к и с л о т н о й п о с л е д о в а т е л ь -
н о с т и ф о р м и а т д е г и д р о г е н а з ы . Около 8 нмоль белка, иммобилизованного на
100 мг CPG/Thiol, подвергали анализу N-концевой аминокислотной последовательности
на твердофазном секвенаторе модели APS 240 («Rank Hilger», Англия). Для сравне-
ния анализ N-концевой аминокислотной последовательности белка осуществляли на
жидкофазном секвенаторе модели 890С («Весктап», США). Фенилтиогидантоины ами-
нокислот определяли высокоэффективной жидкостной хроматографией на колонке
Ultrasphere ODS (4,6X250 мм) («Altex», США) в градиенте метанола.
О п р е д е л е н и е а м и н о к и с л о т н о г о с о с т а в а и а м и н о к и с л о т н о й
п о с л е д о в а т е л ь н о с т и п е п т и д о в осуществляли, как в работе [10].
Результаты и обсуждение. Для структурного анализа формиатде-
гидрогеназы использовали обратимую иммобилизацию белка (рис. 1).
Таким путем смесь пептидов разделяется на две группы, одна из ко-
торых, содержит только остатки цистеина. Благодаря этому, кроме селек-
БИОПОЛИМЕРЫ и КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 3 3 — 6-115 131
тивного выделения SH-пептидов, существенно упрощается задача раз-
деления и очистки пептидов. В зависимости от целей и задач
исследования остатки цистеина в пептидах могут быть модифицированы
различными способами и дифференцированно.
В настоящей работе для иммобилизации формиатдегидрогеназы
использовано два типа носителей, содержащих активированную SH-
группу — на основе сефарозы и пористого стекла. Последнее,
CPG/Thio l , может быть активировано до 5—15 мкмоль/г сухого веса.
Емкость носителей в отношении формиатдегидрогеназы не изучали.
Д л я иммобилизации белка в денатурирующих условиях обычно исполь-
зовали 100—200-кратный избыток активированного носителя. В этих
условиях на обоих носителях была достигнута количественная иммо-
билизация белка. В результате кислотного гидролиза иммобилизован-
ной формиатдегидрогеназы на хроматограмме аминокислотного анали-
затора обнаруживаются артефакты, которые мешают определению
только глутаминовой кислоты, пролина и цистина. Носитель на основе
сефарозы удобен для работы в мягких условиях, например при фер-
ментативном гидролизе конъюгата. Носитель же на основе пористого
стекла более пригоден для химической модификации иммобилизо-
ванных белков.
Д л я определения N-концевой аминокислотной последовательности
формиатдегидрогеназы белок анализировали по Эдману на жидкофаз-
ном и твердофазном секвенаторах. В первом случае, исходя из коли-
чества белка 10 нмоль, было идентифицировано 14 аминокислотах
остатков: H2N-Ala-Lys-Val-Leu-Cys-Val-Leu-Gly-Asp-Asp-Pro-Val-Asp-
Туг-... . Во втором случае при иммобилизации белка (8 нмоль) на
пористом стекле и анализе на твердофазном секвенаторе, кроме 5-й
позиции, было определено также 14 аминокислот. Полученные нами
результаты подтверждают, что белки, иммобилизованные по остаткам
цистеина, могут быть успешно проанализированы на твердофазном
секвенаторе.
На рис. 2, Л представлены результаты аналитического разделения
методом эксклюзионной хроматографии цистеинсодержащих триптиче-
ских пептидов формиатдегидрогеназы после их десорбции с носителя
под действием МЭ. Расчет площадей пиков показал, что гидролиз
трипсином иммобилизованной формиатдегидрогеназы идет достаточно
быстро. Уже через 30 мин гидролиза появляются семь пиков, соотно-
шение которых, меняясь в начале гидролиза, остается практически не-
изменным после 120 мин гидролиза, кроме пиков № 2 и 5 (таблица) .
Заметное изменение процентного содержания пика № 2 может быть
обусловлено наличием химотриптической активности в используемом
препарате трипсина. Сравнение с рис. 2, Б, на котором представлена
хроматограмма пептидов, не содержащих остатков цистеина, наглядно
Процентное содержание цистеинсодерэ/сащих пептидов, получающихся при гидролизе
трипсином формиатдегидрогеназы, иммобилизованной на тиопропил-сефарозе 6В
The content (%) of the cysteine containing peptides after tryptic digestion
of the formate dehydrogenase immobilized on thiopropyl-Sepharose 6B
Время гидролиза, мин
№ пика
30 60 120 360
елелы
33,9
37,7
3.3
14.4
следы
10.7
следы
2 9.9
34.5
5.1
19.2
2.8
8,5
25.2
35.4
6,9
19.5
8,6
8 ,6
0,7
20,3
32,3
7.7
23,1
8,4
7,6
* Пик № 7 нспептидпой природы.
132 Б И О П О Л И М Е Р Ы и КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 3 3 — 6-115 132
Рис. 2. Высокоэффективная эксклюзионная (А) и жидкостная (Б) хроматографии пеп-
тидов формиатдегидрогеназы: А — содержащих дистеин, на колонке TSK 2000 SW
(7,6X600 мм); — детекция при 210 нм; ... — то же при 280 нм (после 50-й мин
выходят соли, МЭ, 2-тиопиридон); Б — не содержащих остатков цистеина, на колонке
с обращенной фазой LiChrosorb RP-18 (4,6X250 мм). Условия элюции: буфер А — 4 мин;
линейный градиент от 0 до 100 % буфера Б — 90 мин. Буфер А —0,1 %-ная ТФУ;
Буфер Б — 60 %-ный ацетонитрил в 0,1 %-ной ТФУ. Скорость элюции 1 мл/мин, де-
текция при 210 нм.
Fig. 2. Gel-filtration (A) and reverse phase (Б) HPLC of formate dehydrogenase pepti-
des: A — cysteine containing peptides, TSI\ 2000 SW (7.6X600 mm) column; detection
at 210 nm ( ) and 280 nm (...); salts, mercaptoethanol and 2-thiopyridone are eluted
after 50 min; Б — peptides not containing cysteine; LiChrosorb RP18 (4.6X250 mm) co-
lumn. Elation conditions: buffer A — 4 min, linear gradient from 0 to 100 % buffer Б —
90 min. Buffer A —0.1 % trifluoro acetic acid (TFA). Buffer В — 60 % acetonitril in
0.1 % TFA. Elution rate 1 ml/min, detection at 210 nm.
демонстрирует достоинства предлагаемого варианта разделения пепти-
дов при исследовании первичной структуры белка.
В результате препаративного выделения триптических цистеинсо-
держащих пептидов было получено пять пептидов ТС-1—ТС-5 (соот-
ветственно пикам № 2—6, таблица) , которые были частично секвени-
Б И О П О Л И М Е Р Ь І II КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 3 133
Известно, что одна субъединица формиатдегидрогеназы содержит
шесть остатков цистеина [6]. Наличие лишь пяти цистеинсодержащих
пептидов после стадии триптического гидролиза указывает на то, что
по крайней мере один из них содержит два остатка цистеина. Предпо-
ложительно два остатка цистеина содержатся и в пептиде ТС-1.
Как уже отмечалось, один из остатков цистеина в молекуле фор-
миатдегидрогеназы обладает аномально высокой реакционной способ-
ностью, существен для проявления каталитической активности и может
быть селективно блокирован рядом специфических реагентов [6]. На-
ми осуществлена специфическая модификация этого высокореакционно-
способного тиола с помощью 14С-иодацетамида и N-(иодоэтиламино-
этил) -5-нафтиламин-1-сульфоновой кислоты. В отдельных эксперимен-
тах было показано, что наблюдается линейная корреляция между вклю-
чением метки и каталитической активностью формиатдегидрогеназы
вплоть до модификации ~ 0 , 7 SH-группы на субъединицу фермента.
При иммобилизации препаратов формиатдегидрогеназы, модифи-
цированной флюоресцентной меткой (1,4 молекулы метки на субъеди-
ницу, остаточная активность ~ 6 %) , и последующего триптического
гидролиза не происходит уменьшения числа иммобилизованных пепти-
дов. На матрице остаются все пять исходных цистеинсодержащих пеп-
тидов, причем около 85 % метки включается во фракцию иммобили-
зованных пептидов и лишь около 15 % переходит в растворимую фрак-
цию. До 90 % метки, включенной во фракцию цистеинсодержащих пеп-
тидов, находится в пептиде ТС-1, что позволяет заключить, что данный
пептид содержит два остатка цистеина, один из которых является «су-
щественным». Аналогичные результаты были получены и при исполь-
зовании 14С-иодацетамида.
С целью отработки условий получения более крупных фрагментов
в аналитическом варианте был осуществлен специфический гидролиз
иммобилизованной формиатдегидрогеназы трипсином по остаткам ар-
гинина и проведено расщепление бромцианом. Для этих целей белок
иммобилизовали на пористом стекле. В результате блокирования ε-ами-
ногруппы лизина иммобилизованной формиатдегидрогеназы ДНС-С1 и
ФИТЦ и последующего гидролиза модифицированного белка трипси-
ном на носителе было обнаружено только три N-концевые аминокис-
лоты — аланин, лейцин и глутаминовая кислота. Очевидно, что для
модификации могут быть использованы другие реагенты, в том числе
обратимая защита малеиновым ангидридом [7, 8]. Положительные
результаты были получены и при расщеплении иммобилизованной фор-
миатдегидрогеназы бромцианом. Здесь на носителе были обнаружены
следующие N-концевые аминокислоты: Gly, Ala, lie, Asx, His, а в
растворе — lie, Asx, Туг. Всего теоретически при расщеплении фер-
мента бромцианом, исходя из содержания остатков метионина, можно
ожидать образование восьми фрагментов.
Следует также отметить, что при анализе N-концевых аминокислот
иммобилизованных фрагментов формиатдегидрогеназы в виде дансиль-
134 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 3
рован ы:
ных производных наблюдаемый фон гораздо ниже, чем при дансили-
ровании белков и пептидов в растворе, так как избыток реагента и
побочные продукты реакции перед гидролизом полностью удаляются
метанолом. Этот способ может быть рекомендован для определения
N-концевых аминокислот цистеинсодержащих белков с идентификацией
ДНС-аминокислот на пластинках или высокоэффективной жидкостной
хроматографией.
Таким образом, в данной работе на примере бактериальной фор-
миатдегидрогеназы показана применимость нового подхода для раз-
деления пептидов при определении первичной структуры цистеинсодер-
жащих белков, основанного на ковалентной иммобилизации белка с
помощью реакции тиол-дисульфидного обмена. Выделены и охаракте-
ризованы триптические цистеинсодержащие пептиды. Локализован су-
щественный остаток цистеина, ответственный за проявление каталити-
ческой активности фермента.
Авторы выражают благодарность Л. М. Винокурову за определе-
ние N-концевой аминокислотной последовательности формиатдегидро-
геназы.
PRIMARY STRUCTURE
OF THE BACTERIAL FORMATE DEHYDROGENASE
DETERMINATION OF N-TERMINAL AMINO ACID SEQUENCE
AND ISOLATION OF CYSTEINE-CONTAINING PEPTIDES
Т. B. Ustinnikova, V. O. Popov, A. M. Egorov, Ts. A. Egorov
A. N. Bach Institute of Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Moscow;
N. I. Vavilov Institute of General Genitics,
Academy of Sciences of the USSR, Moscow;
Μ. V. Lomonosov University, Moscow
S u m m a r y
NAD-dependent formate dehydrogenase from methylotrophic bacteria of Pseudomonas
splOl was immobilized on thiopropyl-Sepharose 6B and CPG/Thiol activated by 2,2'-di-
pyridyl disulphide via the thiol-disulphide exchange reaction. A procedure for the tryptic
digestion of the immobilized enzyme was optimized. Cysteine-containing tryptic peptides
were isolated and partially characterized. The peptide which contained the essential cystei-
ne residue responsible for the catalytic enzyme activity was located. A method for the de-
termination of the N-terminal amino acids after f ragmentat ion of the immobilized pro-
tein was developed. The N-terminal amino acid sequence of the formate dehydrogenase
immobilized via its cysteine residues on a controlled porous glass was determined.
1. NAD-dependent formate dehydrogenase from methylotrophic bacterium, strain. I. Pu-
rification and characterization / A. M. Egorov, Т. V. Avilova, Μ. M. Dikov et a l . / /
Eur. J. Biochem.— 1979.—99, N 2 .—P. 569—576.
2. Kinetic and structural properties of NAD-dependent bacterial formate dehydrogena-
s e / A . M. Egorov, V. O. Popov, І. V. Berezin, Yu. V. R o d i o n o v / / J . Solid Phase
Biochem.— 1980.—5, N 1.—P. 19—33.
3. Формиатдегидрогеназа из Bacterium sp. 1: число активных центров и константы
связывания с коферментами / В. О. Попов, Ю. В. Родионов, А. М. Егоров, И. В. Бе-
р е з и н / / Д о к л . АН СССР.— 1978.—239, № 6.—С. 1482—1485.
4. НАД-зависимая формиатдегидрогеназа из метилотрофных бактерий, изучение кине-
тической схемы действия / В. О. Попов, Ю. В. Родионов, А. М. Егоров, И. В. Бе-
резин / /Биоорган . химия.— 1978.—4, № 1.—С. 117—128.
5. Тииіков В. М., Егоров А. М., Попов В. О. Бактериальная формиатдегидрогеназа.
Субстратная специфичность и кинетический механизм окисления S-формилглутатио-
н а / / Б и о х и м и я . — 1983.—48, № 7.—С. 1172—1180.
6. Попов В. О., Егоров А. М. Исследование существенных SH-групп бактериальной
формиатдегидрогеназы/ /Там же.— 1979.—44, № 2.— С. 207—213.
7. Егоров Ц. Α., Шахпаронов М. И., Давидович Ю. А. Получение нерастворимого но-
сителя с активированной SH-группой и его использование в химии белка / / Биоор-
ган. химия.— 1977.—3, № 8.—С. 1111—1115.
(Окончание см. на с. 159).
Б И О П О Л И М Е Р Ы и КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 3 3 — 6-115 135
мент, способный аденилировать тРНК по
З'-концу в присутствии поли(I)-поли(С) и
АТР либо dATP. Предполагают, что этот
процесс может быть одним из механизмов
антивирусного действия интерферона.
Супрессорные тРНК были рассмотрены на
отдельном заседании. В целом изучение су-
прессорных т Р Н К развивается широким
фронтом во многих странах, но, к сожале-
нию, аналогичных работ в СССР проводится
недостаточно.
Участие советских ученых в симпозиуме
по т Р Н К было целиком и полностью оправ-
данным: получена весьма обширная и су-
щественная по своей научной значимости
информация, выходящая за рамки собствен-
но тРНК и аа-тРНК-синтетаз.
Э. Я. БУДОВСКИЙ, P. X. ВИЛЛЕМС,
Л. Л. КИСЕЛЕВ, О. Я. ЛАВРИК,
О. О. ФАВОРОВА
Окончание. Начало см. на с. 129—135.
8. Egorov Ts. АShakhparonov Μ. I. Strategy of thiol protein sequence analysis / / M e t -
hods in peptide and protein sequence analysis / Ed. Chr. Birr.— Amsterdam: Elsevier,
1980.—P. 395—405.
9. Determination of the amino acid sequence of porcine trypsin by sequenator analysis /
M. A. Hermondson, L. H. Ericsson, H. Neurath, K. A. Walsh / /Biochemis t ry .— 1973.—
12, N 17.—P. 3146—3153.
10. Первичная структура α-субъединицы ДНК-зависимой РНК-полимеразы Ε. coli. I.
Пептиды триптического гидролиза / Η. Η. Модянов, В. Μ. Липкин, 10. В. Смирнов и
д р . / / Б и о о р г а н , химия — 1978—4, № 2.—С. 158—179.
Ин-т биохимии им. А. Н. Баха АН СССР, Москва Получено 20.08.85
Ин-т общ. генетики им. Н. И. Вавилова АН СССР,
Москва
МГУ им. М. В. Ломоносова
Б И О П О Л И М Е Р Ы II КЛЕТКА, 1986, т. 2. № 3 159
|