Конструирование гибридных генов lacZ для изучения механизмов регуляции экспрессии генов rpljl-оперона Escherichia coli
С использованием в качестве векторной плазмиды pNM481 было проведено слияние 5'-концевых фрагментов генов rplJ и rplL с геном IacZ и сравнение уровней активности бета-галактозидазы, обеспечиваемых присутствием в клетках гибридных генов rpl J'-lacZ и rplL'-lacZ. Не обнаружено влияния п...
Saved in:
| Published in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Date: | 1990 |
| Main Authors: | , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1990
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152949 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Конструирование гибридных генов lacZ для изучения механизмов регуляции экспрессии генов rpljl-оперона Escherichia coli / И.В. Крупская, А.Н. Живолуп, Е.Б. Патон // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 2. — С. 91-100. — Бібліогр.: 30 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860106712037457920 |
|---|---|
| author | Крупская, И.В. Живолуп, А.Н. Патон, Е.Б. |
| author_facet | Крупская, И.В. Живолуп, А.Н. Патон, Е.Б. |
| citation_txt | Конструирование гибридных генов lacZ для изучения механизмов регуляции экспрессии генов rpljl-оперона Escherichia coli / И.В. Крупская, А.Н. Живолуп, Е.Б. Патон // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 2. — С. 91-100. — Бібліогр.: 30 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Биополимеры и клетка |
| description | С использованием в качестве векторной плазмиды pNM481 было проведено слияние 5'-концевых фрагментов генов rplJ и rplL с геном IacZ и сравнение уровней активности бета-галактозидазы, обеспечиваемых присутствием в клетках гибридных генов rpl J'-lacZ и rplL'-lacZ. Не обнаружено влияния промотора Pl12 на эффективность экспрессии гена rplL'-lacZ. Уровень активности бета-галактозидазы, кодируемой rplL'-lacZ, во всех случаях превосходит активность, обеспечиваемую rplJ'-lacZ. В отличие от rplJ'-lacZ с увеличением длины фрагмента rplL активность кодируемой им бета-галактозидазы не уменьшалась. Транскрипция гибридных генов с промотора Pbeta сохранила превосходство уровня экспрессии rplL'-lacZ. Предполагается, что регуляция активности генов rplJL oneрона Е. coli, обеспечивающая избыточный синтез белка L7/L12, может осуществляться на уровне трансляции бицистронной мРНК rplJL.
З використанням як векторної плазміди pNM481 проведено злиття 5' -кінцевих фрагментів генів rplJ і rplL з геном lacZ і порівняння рівнів активності бета-галактозидази, забезпечуваних присутністю в клітинах гібридних генів rpl J'-lacZ і rplL'-lacZ. Не виявлено впливу промотору Pl12 на ефективність експресії гена rplL'-lacZ. Рівень активності бета-галактозидази, кодованої rplL'-lacZ, у всіх випадках перевищує активність, забезпечувану rplJ'-lacZ. На відміну від rplJ'-lacZ із збільшенням довжини фрагмента rplL активність кодованої їм бета- галактозидази не зменшується. Транскрипція гібридних генів з промотору Pbeta зберігає перевагу рівня експресії rplL'-lacZ. Передбачається, що регулювання активності генів rplJL-oneрону Е. coli, яке забезпечує надлишковий синтез білка L7/L12, може здійснюватися на рівні трансляції біцістронной мРНК rplJL.
Using the pNM481 plasmid vector 5'-terminal fragments of rplJ and rplL genes were fused in-frame to gene lacZ. Hybrid p-alactosidases activity, encoded by genes rplJ'— lacZ and rplL'-lacZ was compared. In contrast to rplL'-lacZ, extension of rplJ fused portion resulted in the decrease of the p-gal activity level. Different efficiency of translations seems to be the most probable mechanism, providing the excess synthesis of r-protein L7/L12 in vivo.
|
| first_indexed | 2025-12-07T17:31:40Z |
| format | Article |
| fulltext |
Генноинженерная
биотехнология
У Д К 577.21
И. В. Крупская, А. Н. Живолуп, Е. Б. Патон
КОНСТРУИРОВАНИЕ ГИБРИДНЫХ ГЕНОВ IacZ
ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕХАНИЗМОВ РЕГУЛЯЦИИ
ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ rplJL-ΟΠΕΡΟΗΑ ESCHERICHIA COLI
С использованием в качестве векторной плазмиды pNM481 было проведено слияние
о'-концевых фрагментов генов rpU и rplL с геном IacZ и сравнение уровней активности
β-галактозид азы, обеспечиваемых присутствием в клетках гибридных генов rpl J'-IacZ
и rplL'-lacZ. Не обнаружено влияния промотора Рь\і на эффективность экспрессии гена
rplL'-lacZ. Уровень активности $-галактозидазы, кодируемой rplL'-lacZ, во всех слу-
чаях превосходит активность, обеспечиваемую rplJ'-lacZ. В отличие от rplJ'-lacZ с уве-
личением длины фрагмента rplL активность кодируемой им β-галактозидазы не умень-
шалась. Транскрипция гибридных генов с промотора Pβ сохранила превосходство уров-
ня экспрессии rplL'-lacZ. Предполагается, что регуляция активности генов rplJL one-
рона Ε. coli, обеспечивающая избыточный синтез белка L7/L12, может осуществляться
на уровне трансляции бицистронной мРНК rplJL.
Введение. Гены rplKAJL, гроВС, расположенные в rif-области на 88-й
минуте хромосомы Е. coli, программируют синтез рибосомных белков
Lll, Ll, LlO и L7/L12 (последний из них присутствует в рибосоме в
4-кратном молярном избытке по отношению ко всем остальным белкам)
[1, 2], а также β- и β'-субъединиц РНК-полимер азы Е. coli. В отноше-
нии регуляции экспрессии данных генов на уровне транскрипции и
трансляции из литературы известно следующее. В инициации транс-
крипции генов rplKAJL принимают участие два основных промотора —
PLU, инициирующий наиболее обильный в опероне тетрацистронный
транскрипт генов rplKAJL и бицистронный транскрипт rplKA, и про-
мотор PL\О, инициирующий бицистронный транскрипт rplJL [3]. В си-
лу так называемой промоторной окклюзии P L I O не проявляет макси-
мальной эффективности в присутствии PLU [4, 5]. Интергенная область
оперона rplJL содержит также минорный промотор PLI2, функция ко-
торого in vivo окончательно не выяснена. Из данных по конструиро-
ванию рекомбинантных плазмид для тестирования промоторов извест-
но, что сила промоторов PL\\, P L I O , PL\2 СООТНОСИТСЯ как 1,5 : 1 : 0,05
[6, 7], и установлено наличие минорных промоторов Pβ и перед
генами гроВ и гроС, кодирующих синтез β- и β'-субъединиц РНК-поли-
меразы Е. coli. Присутствие дополнительного промотора перед геном
rplL было причиной тщательного изучения возможности обеспечения
им избыточного синтеза белка L7/L12. Активность PLI 2 была выявлена
с помощью промотор-детекторных плазмид [8], однако Si-картирова-
ние не выявило инициации транскрипции в интергенной области ин-
тактного rplJL-onepoHa [3]. Для бицистронной мРНК rplJL было об-
наружено наличие двух 5'-концов: от промотора P L I O И на 150 п. о.
ниже него и высказано предположение о том, что второй 5'-конец об-
разуется при процессинге мРНК, инициируемой промотором P L I O [ 3 ] .
Гетерогенности 3'- и 5'-концов мРНК в областях, соответствующих
структурным последовательностям генов грі] и rplL, не обнаружено
[3]. В отношении мРНК Lll — Ll известно, что трансляция дисталь-
ного цистрона (Li) сопряжена с проксимальным, удаленным на шесть
оснований [9].
ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1990. т. 6. № 2 7* 91
Различный уровень экспрессии генов, кодируемых единой поли-
цистронной мРНК, может контролироваться рядом механизмов. На
уровне транскрипции таким регуляторным элементом может являться
дополнительный промотор, на уровне трансляции — различная эффек-
тивность ее инициации (в силу большей эффективности инициаторной
области) и элонгации (в результате различий во вторичной структуре
и частоте встречаемости редких ко донов). Кроме того, разный уровень
экспрессии может обусловливаться неодинаковой стабильностью от-
дельных цистронов мРНК. Известны также случаи участия природных
антисмысловых РНК в регуляции уровня экспрессии отдельных генов.
Для изучения механизмов, регулирующих экспрессию генов rif-области,
на первом этапе исследования мы обратились к традиционному мето-
ду слияния отдельных фрагментов области с детекторным геном IacZ.
В качестве векторной была использована плазмида pNM481 [8], со-
держащая структурную последовательность гена IacZ, в которой 21 п. о.
на 5'-конце заменена на полилинкерный участок. Восполнение гена
IacZ с соблюдением его рамки считывания фрагментами чужеродной
ДНК, сохраняющими сигналы инициации как транскрипции, так и
трансляции (или только трансляции) для тестируемых генов, позволяет
судить об уровне их экспрессии по активности β-галактозидазы, коди-
руемой гибридным геном IacZ. При отсутствии промотора перед геном,
сливаемым с IacZ, транскрипция его обеспечивается слабым промото-
ром P4, что делает pNM481 аналогом специальных векторных плазмид,
предназначенных для сравнения и измерения эффективности сигналов
инициации трансляции.
Материалы и методы. Π л а з м и д ы. Д л я клонирования фрагментов rp / /L-оперона
Е. coli использована плазмида pNM481 [8].
Б а к т е р и а л ь н ы е ш т а м м ы . В качестве реципиентных применяли штаммы
Е. coli К12: JMlOl (supE, thi, A(lac-rpoAB) j F' traD36, proAB, IacliZbN 15 [10],
MC1061 (araD 139, A(ara, leu)7697, Mac74, galU, hsdR, rpsL) [8], TGl (A(lac-pro), supE,
thi, hsdD5 / F'traD36, proAB, IaclQt lacZAM15) [8]. В качестве контроля при изменении
активности β -галактозидазы использовали штаммы Е. coli К802 (IisdR+, HsdM+, gal~,
niet~, sup Ε) [11] и ΑΒ259 Hfrj любезно предоставленные С. И. Черных ( И М Б и Г
А Н У С С Р ) .
П р е п а р а т ы ф е р м е н т о в . В работе т а к ж е использованы эндонуклеазы рест-
рикции: EcoRl, выделенная и любезно предоставленная Э. Ким (Ин-т молекуляр. био-
логии и генетики ( И М Б и Г ) А Н У С С Р ) ; FokI, RsaI, VspI, HinfI производства Н П О
«Вектор» (Бердск) ; NruI фирмы «Boehr inger» ( Ф Р Г ) ; AluI, BamHI, BspRI, Cfr9I,
Есо1051, HinlI, HindIlIf KpnI, PstI, SalGI, SmaI Н П О «Фермент» (Вильнюс); Д Н К -
лигаза фага Т4, выделенная в И М Б и Г АН УССР, фрагмент Кленова ДНК-полимера -
зы I Е. coli и нуклеаза Si ( Н П О «Вектор», Бердск) .
Ф е р м е н т а т и в н ы е о б р а б о т к и и а н а л и з ф р а г м е н т о в Д Н К ·
При обработке соблюдали условия, рекомендуемые Н П О «Фермент» (Вильнюс). До-
стройка одноцепочечных концов с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I
Е. coli, трансформация бактериальных клеток плазмидной Д Н К , получение плаз-
мидной Д Н К , электрофоретическое разделение Д Н К в агарозных и полиакриламидных
гелях и выделение фрагментов Д Н К из гелей проводили по общепринятым методикам,
описанным в руководстве Маниатиса и др. [11], без существенных изменений.
К о н с т р у и р о в а н и е р е к о м б и н а н т н ы х п л а з м и д . Фрагменты генов
rplJ и rplE, встраиваемые в ρΝΜ481, выделяли из рекомбинантных плазмид, сконструи-
рованных на основе плазмид pUC и описанных нами ранее [12, 13]. Первоначальным
источником фрагментов Д Н К генов rplKAJL Ε. coli служила рекомбинантная плазмида
pJC703 [14] .
Д л я встраивания фрагментов генов rplJ и rplE в плазмиду pNM481 ее предвари-
тельно расщепляли соответствующими рестриктазами с учетом рамки считывания гена
IacZ. В случае необходимости правильная рамка считывания обеспечивалась дострой-
кой концов фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I Е. coli. Характеристика встраива-
емых фрагментов приведена в таблице и на схеме конструирования рекомбинантных
плазмид (рисунок). Наличие встроенного фрагмента обеспечивало экспрессию гена
IacZ, т. е. проявление £ас+-фенотипа на среде, содержащей хромогенный субстрат
9 2 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1990. т. 6. № 2 7* 92
β - г а л а к т о з и д а з ы ZGal (5 -бром-3-индолил-Р-£-галактопиранозид) . Использовали ZGal ,
синтезированный А. Г. Терентьевым ( И М Б и Г А Н У С С Р ) . В правильной ориентации
встроенного фрагмента убеждались по локализации асимметричных сайтов расщепления
определенными рестриктазами, известных из первичной последовательности генов
rplKAJL [15].
Селекцию рекомбинантных плазмид вели на среде LB [16] , включавшей 50 м г / м л
ампициллина отечественного производства и ZGal в концентрации 0,15 м г / м л .
Активность β -галактозидазы измеряли по методу Миллера [16] без существенных
изменений. Использовали О Н Ф Г (о-нитрофенил-р-Л-галактозид) , синтезированный и лю-
безно предоставленный А. Г. Терентьевым.
Характеристика рекомбинантных плазмид, обеспечивающих синтез гибридных
β-галактозид аз
Characterization of recombinant plasmids, providing synthesis of hybrid fi-galactosidases
Встроенный фрагмент Активность β-
галактозидазы
относиїельно Плазмида
Ген, сливае-мый с IacZ Концевые
Промотор
Общая длина, Длина 5'-
Активность β-
галактозидазы
относиїельно
сайты рестрик- Промотор п. о. фрагмента, РІК7, % ции п. о.
Г!. о.
р J К 4 rplJ EcoRI-PstI PIA 0 9 1 4 7 5 , 5 0
PI КЗ rplL PstI-PstI PlA 2 6 4 6 156 і 0 0
РІК8 r pi L SmaI-PstI PL 12 4 5 5 156 9 9
РІК9 rplL HinlI PL 12 3 6 2 156 101 РІК9
(AcyI)-PstI
PlKlO r pi L HindIII-PslI IjLVl 2 8 7 156 9 8
pJKl'2 r pi L BspRI-BspRI l'' L 1 2 8 8 2 131 101
РІК20 r pi L Alul-Alul IjL 12 1 14 4 0 104
plKl rplL Eco 1051
(SnaBI)-
PstI
190 156 100
РІК21 r pi L Есо1051
(SnaBI)-
Hinfl
3 0 2 2 6 7 105
РІК 14 rplJ BsoRl-PstI — Г> 1 4 156 122
pi Kl 8 rplL PsU-PstI — 2 5 2 156 110
РІК 13 rplJ BspRI-PstI — 2 6 2 7 5 49
pi К16 rplJ FokI-PstI — 106 7 5 4 4
РІК23 rplJ BspRl-Nrul — 3 2 5 137 3 3
РІК22 rplJ BspRl-Rsal — 3 8 5 198 14
РІКИ rplJ BspRI-SmaI — 4 5 3 2 6 6 13
РІК5 rplJ FokI-Smal — 2 9 7 2 6 6 9
РІК27 rplJ РІК5+
H - ( E c o R I -
1344 2 6 6 40
РІК28 rplJ
EcoRI)
РІК28 rplJ р1К5+
+(EcoRI-
— 1352 2 6 6 6
РІК29 rplL
EcoRI)
РІК29 rplL РІК7+
+(EcoRI-
p I i 1232 156 150
рІКЗО rplL
EcoRl)
РІК7+
+(EcoRI-
рІКЗО rplL
EcoRl)
РІК7+
+(EcoRI-
— 1232 156 120
рІКЗІ rplL
EcoRI)
рІКЗІ rplL РІК7+ — 4 0 0 3 6 6 4 6
+(Pstl-
Psi I )
Результаты и обсуждение. Конструирование гибридных генов IacZ
с помощью плазмиды ρΝΜ48ΐ, описанное ранее [17], показало, что
ρΝΜ481 благодаря наличию промотора P4 может быть использована
для сравнения эффективности сигналов инициации трансляции путем
слияния 5'-концов изучаемых фрагментов с детекторным геном IacZ.
Удобство гена IacZ в качестве репортерного заключается в простоте се-
лекции рекомбинантных клонов Е. coli по /,ас+-фенотипу, выявленно-
му с помощью хромогенного субстрата β-галактозидазы — ZGal,— а
также в возможности оценки экспрессии гибридных генов по активно-
сти кодируемой ими β-галактозидазы. Слияние оперона с геном IacZ
приводит к тому, что уровень синтеза β-галактозидазы изменяется под
ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1990. т. 6. № 2 7* 9 3
Схема конструирования рекомбинантных плазмид, содержащих гибридные гены rplJ'-
IacZ и rplL'-lacZ. Двойными линиями показаны 5 ' -концевые фрагменты, встроенные в
векторную плазмиду pNM481 [8] (физико-генетическая карта приведена слева) . Двой-
ной прерывистой линией показана делеция NruI-SnaBI (Есо105І) (рЩ14у pIK18). В
случае необходимости (для совпадения рамки считывания встраиваемых фрагментов и
гена IacZ pNM481) в ρΙΚΙΟ, ρΙΚ9, ρΙΚ8, рІК18, рІКЗ встроенные фрагменты сохраняют
участки полилинкерной области плазмид-источников £12, 13]
Schemat ic p resen ta t ion of the hybrid rplJf-lacZ and rplL'-lacZ con ta in ing recombinant
p lasmids . Б ' - Ї е гт іпа ї f r a g m e n t s inserted into the pNM481 p lasmid ( shown in the left
upper corner) are indicated by dupl ica te lines. Broken line shows the NruI-SnaBI
(Eeol05I) genera ted delet ion in pIK14 and ГІК18. To make in - f rame fus ions to IacZ
gene, por t ions of the pa ren ta l recombinant p lasmid polyl inker a reas were res tored on
f r a g m e n t s used for ρΙΚΙΟ, pIK9, pIK8, pIK18 and рІКЗ cons t ruc t ion
94 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1990. т. 6. № 2 7* 94
действием исследуемого регуляторного элемента оперона, в нашем слу-
чае— rplKAJL. Соединение же 5'-концевого фрагмента чужеродного
гена с лишенным собственного сайта инициации трансляции геном IacZ
векторной плазмиды (белковое слияние) помещает последний под кон-
троль области инициации трансляции исследуемого. Таким образом,
комбинация оперонного и белкового слияния делает возможным опре-
деление степени регуляции экспрессии β-галактозидазы, т. е. достига-
ется определенный уровень ее экспрессии на транскрипционном или
трансляционном уровнях.
Слиянием с lacZ-reном 5'-концевых фрагментов генов rplJ и rplL
с сохранением собственных промоторов PL\O И PL 12 (плазмиды р1К4 и
рІКЗ) мы определили, что уровни активности гибридных β-галактози-
даз соответствуют 150 и 100 ед. Миллера [16]. Учитывая соотношение
силы промоторов P L I O И Pl\2 1 0 0 : 8 [ 7 ] , высокий уровень экспрессии
гена rplL'-IacZ мог быть результатом, в частности, более эффектив-
ной трансляции гена rplL'-IacZ.
Известно, что в отличие от всех остальных рибосомных белков E.
coli L7/L12, кодируемый геном rplLy синтезируется в 4-кратпом избыт-
ке. Поэтому в центре внимания данного исследования было изучение
механизмов регуляции экспрессии генов rplJL с помощью техники бел-
кового слияния. Для выделения фрагментов генов, клонируемых в
ρΝΜ481, использовали расщепление эндонуклеазами рестрикции по
сайтам, расположенным в интактном опероне rplKAJL Ε. coli, а также
удлинение фрагментов за счет полилинкерных областей рекомбинантных
плазмид — их источников, что обеспечивало необходимую для слияния
с IacZ рамку считывания б'-концевого фрагмента. Общая схема констру-
ирования плазмид и результаты измерения активности β-галактозидаз,
кодируемых гибридными генами, приведены на рисунке и в таблице.
Ранее мы показали [17], что при транскрипции с промотора P4
векторной плазмиды ρΝΜ481 активность β-галактозидазы, обеспечива-
емая геном rplL'-lacZ (pIK7), значительно превосходит таковую для
rplJ'-IacZ (pIK5 ) . Естественно, что это превосходство в экспрессии в
силу используемого метода конструирования гибридных генов IacZ
могло быть обусловлено рядом факторов, в частности, разной стабиль-
ностью мРНК и гибридных β-галактозидаз, а также возникновением
нового промотора в результате клонирования. Поэтому в ходе дальней-
шего исследования мы считали целесообразным провести соответству-
ющие дополнительные эксперименты, в том числе: а) исключить воз-
можность того, что высокий уровень экспрессии гена VplLr-IacZ (р1К7)
связан с образованием в pNM481 в результате встраивания чужерод-
ной Д Н К «случайного» промотора, транскрипция с которого обеспечила
высокий уровень экспрессии гибридного гена; б) убедиться в том, что
разный уровень экспрессии генов rplJ'-lacZ и rplL'-lacZ не является
следствием разной копийности содержащих их рекомбинантных плазмид.
Экспериментально показано сохранение активности гибридных β-
галактозидаз при замене восьми N-концевых аминокислотных остатков
и очень протяженными чужеродными полипептидными последователь-
ностями [18, 19]. Однако стабильность таких белков может значитель-
но отличаться от нативного. Поэтому следовало исключить возмож-
ность того, что разная активность β-галактозидаз, кодируемых rplJ
IacZ и rplU-lacZ, обусловлена меньшей стабильностью первого.
Мы считали целесообразным также сравнить уровни экспрессии ге-
нов rplJ'-lacZ и rplL'-lacZ при транскрипции их с промотора, отлично-
го от P4, что позволило бы выявить возможное специфическое влияние
структуры гибридной мРНК.
Рассматривая возможность образования нового промотора (в мес-
те лигирования SnaBI-конца фрагмента rplL в р1К7 и р1К21), эффек-
тивно транскрибирующего ген rplL-lacZ, мы обратились к анализу пер-
вичной последовательности полилинкерной области pNM481 [8] и
встроенного фрагмента [15]. Можно было предположить, что при ли-
гировании SmaI-конца pNM481 с EcolOSI (SnaBI) -концом встраивае-
ISSN 02ЭЗ-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И KJTtTKA. 1990. т. 6. № 2 9 5
мого фрагмента rplL последовательность CCC GTATAA
TTCAGGAACAATTTAAATG (на 31 п. о. левее ATG-кодона гена
rplL) в силу большой гомологии с «—10»-областыо среднестатистиче-
ского промотора рибосомных белков Е. coli [1] могла стать «—10»-об-
ластыо «случайного» промотора перед геном rplL'-IacZt У ч и т ы в а я , что
изменение расстояния между «—35»- и «—10»-областями любого про-
мотора сказывается на его эффективности и, следовательно, должно
отразиться на уровне экспрессии контролируемого им гена. Для увели-
чения расстояния между «—35»- и «—10»-областями предполагаемого
новообразованного промотора в данную область было введено 4 п. о.
Для этого плазмиду р1К7 расщепляли по уникальному сайту EcoRI9
расположенному на 7 п. о. выше места сочленения SmaI-Ecol05I-кон-
цов, и после достройки фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I Е. coli
подвергали лигированию. О правильном восполнении и последующем
лигировании EcoRI-концов свидетельствовало возникновение сайта рас-
щепления рестриктазы VspI, узнающей последовательность АТТААТ.
Уровни активности β-галактозидазы, кодируемой геном rplL'-IacZ
ρΙΚ7, до и после введения 4 п. о. в сайт EcoRI были одинаковы, свиде-
тельствуя, таким образом, об отсутствии «новообразованного» промо-
тора. Помимо этого, последовательность выше «—10»-области предпо-
лагаемого промотора изменялась также и в результате введения деле-
ции ANruI-SnaBI (Есо1051) (ρΙΚ4, р1К18), которая не снижала уров-
ня экспрессии гена rplL'-lacZ (таблица). Таким образом, причина пре-
восходства активности β-галактозидазы, кодируемой генами rplLf-IacZ,
не связана с образованием дополнительного промотора.
Сравнение термостабильности гибридных β-галактозидаз, кодиру-
емых генами rplJ'-lacZ (piКІЗ и piKU) и rplU-IacZ (pIK20, ρΙΚ7),
по методу [20] обнаружило, что уже при 37 °С стабильность гибридных
белков значительно ниже, чем у нативной β-галактозидазы, кодируемой
геном IacZ, хромосомы в штаммах Е. coli KI2 К802 (hsdR+, hsdM+,
gah, met~, supE). Однако стабильность гибридной β-галактозидазы для
генов грІҐ-lacZ не была ниже, чем для rplLr-IacZ, и, следовательно,
не явилась причиной более низкого уровня экспрессии.
Активность β-галактозидазы, кодируемой гибридным геном, может
зависеть от штамма-реципиента [21]. В нашем случае, однако, измере-
ние активности β-галактозидаз при культивировании сконструирован-
ных плазмид в штаммах Е. coli TG-I, МС1061 и JM101, дефектных
по гену IacZ, не выявило отличий. Не наблюдалось также различия в
конийности рекомбинантных плазмид, которое могло бы стать причи-
ной разного уровня β-галактозидазной активности, обеспечиваемой ге-
нами грІГ-lacZ и rplL'-lacZ.
Помимо вышеперечисленного мы считали целесообразным срав-
нить уровни экспрессии генов грІГ-lacZ и rplLf-IacZ при транскрипции
их с промотора, отличного от P4. Учитывая слабую силу промотора P4
по отношению, например, к PLЮ (сравнить р1К4 и ρΙΚ5, см. таблицу),
для встраивания в р1К5 и р1К7 был использован минорный промотор
гроВС-оперона Е. coli Ρβ. Транскрипция генов грІГ-lacZ и rplL'-lacZ с
Pp повысила уровень экспрессии обоих генов, сохранила превосходство
экспрессии гена rplL'-lacZ, которое, однако, стало менее значительным.
Известно, что наиболее достоверную разницу в экспрессии гена удается
регистрировать при единственной его копии [20, 22]. Так, например,
присутствие /^^-последовательности в гене tnalE хромосомы снижает
уровень его экспрессии в 9 раз, в случае же нахождения гена malE на
плазмиде—в 2—3 раза [22]. В силу этого можно предположить, что
превосходство гена rplL'-lacZ (pIK29) стало менее заметным в резуль-
тате повышения экспрессии обоих гибридных генов (р1К27 и р1К29),
обеспечиваемом транскрипцией с более сильного промотора Ρβ.
Предварительные результаты слияния с геном IacZ 5'-концевых
фрагментов генов rplJ и rplL [17] свидетельствуют о том, что одним
из механизмов регуляции более высокого уровня экспрессии гена rplL
в иптактном опероне rplIL Е. coli может быть различная эффективность
9 6 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1990. т. 6. № 2 7* 96
трансляции цистронов rplJ и rplL в общей бицистронной матрице. Ес-
ли бы различие существовало уже на стадии инициации трансляции,
можно было бы ожидать превосходства экспрессии гена rplL'-lacZ над
rplJ'-lacZ при слиянии с геном IacZ рибосомосвязывающих участков
данных генов. Мы предположили, что при низком уровне экспрессии
гибридных генов, обеспечиваемом транскрипцией с очень слабого про-
мотора P4 путем удлинения сливаемого с IacZ 5'-концевого фрагмента,
можно было бы зарегистрировать различный уровень экспрессии гиб-
ридных генов, если бы он контролировался неодинаковой эффектив-
ностью элонгации трансляции.
Для проверки этого предположения мы клонировали в pNM481
фрагменты генов rplJ и rplL различной протяженности. Наши резуль-
таты (таблица) свидетельствуют о том, что общая протяженность
встраиваемого фрагмента Д Н К не влияет на эффективность экспрес-
сии гибридного гена (активность β-галактозидазы). Это согласуется с
данными Лумана и др. [23], полученными при сравнении эффективно-
сти областей инициации трансляции ряда генов, проведенном с помо-
щью плазмиды pKL203 [23]. В то же время изменение протяженности
5'-концевых фрагментов генов rplJ и rplL, присоединяемых к гену IaeZy
позволило выявить следующую закономерность. Увеличение с 60 до
266 п. о. фрагмента гена rplL (плазмиды ρΙΚ20, р1К7у р1К21) не при-
вело к существенному изменению уровня активности кодируемой геном
β-галактозидазы. В случае же гена rplJ'-IaeZ — снижало активность ко-
дируемых β-галактозидаз. Последовательное увеличение фрагмента ге-
на грі] от сайта узнавания PstI ( р І К І б ) до SmaI (р1К5) снизило уро-
вень активности кодируемой гибридной β-галактозидазы в 5 раз. Дан-
ные исследования показали, что снижение активности не обусловлено
падением стабильности гибридной β-галактозидазы. Для изучения вли-
яния указанной области гена rplJ она была выделена из рІК5 в виде
PstI-PstI-фрагыента и встроена в рІК7 в сайт лигирования rplL'- и IacZ-
фрагментов гибридного гена с сохранением сквозной рамки считыва-
ния. Выяснилось, что встраивание этого фрагмента привело к сниже-
нию активности β-галактозидазы, кодируемой рІКЗІ, в 2,2 раза по срав-
нению с р1К7. Уменьшение экспрессии гена rplL'-IaeZ под влиянием ука-
занного фрагмента гена rplJ могло быть вызвано иными факторами,
которые исследуются в настоящее время. Возможно, однако, что ука-
занная область гена rplJ участвует в регуляции его экспрессии в ип-
тактном опероне rplJL Ε. coli, дифференцируя уровень синтеза белков
LlO и L7/L12.
Интергенная область оперопа rpUL содержит минорный промотор
P i 12, активность которого показана при клонировании в промотор-де-
текторные плазмиды [24], однако не выявлена с помощью Si-картиро-
вания [3]. Известно, что основной промотор оперона rplJL — P l i o — не
проявляет максимальной эффективности в присутствии вышележащего
сильного промотора Р щ . Известны также факты [25, 26] влияния ок-
ружающих промотор последовательностей на проявляемую им силу.
Слияние с IacZ фрагментов гена rplL, сохраняющих промотор P112,
фланкированный последовательностями различной протяженности
(pIK8} pIK9y pIKlO, ρΙΚ12, рІКІЗ), не повлияло на уровень экспрессии
гена rplL'-lacZ и, следовательно, на эффективность промотора Pl\2-
.Различная протяженность последовательностей, фланкирующих про-
мотор Р[Л2 во фрагментах с 5'-концом rplLy сливаемого с IacZ, не из-
меняла уровня экспрессии гена rplL'-IacZy что указывает на отсутствие
влияния вышележащей области на эффективность промотора PLU- Уда-
ление промотора Pl\2 в ρΙΚ7, делеция участка ΔNrul-Eeol051 (pIK14y
ρΙΚ18) также не оказали заметного эффекта.
В отношении гена rplJ Ε. coli показано [27], что мутации, влияю-
щие на эффективность трансляции мРНК ^plJy сосредоточены в области
70—195 основаниями выше ATG-кодона.
В сконструированных нами гибридных генах rplJr-lacZ делеция
BspRI-FokI-участка приводила к снижению экспрессии гибридных ге-
I S S N 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И К Л Е Т К А . 1990. т. 6. № 2 7 — 9.923 97
нов ( р І К І б по сравнению с рІКІЗ и рЩ15 по сравнению с pIKll).
Таким образом, BspRI-FokI-участок от 106 до 261 основания выше
ATG содержит области, необходимые для оптимальной экспрессии
гена rplJ.
По аналогии с этим можно было предположить, что области, на-
ходящиеся выше рибосомосвязывающего сайта гена rplL, участвуют в
определении эффективности трансляции его мРНК. Сравнение уровня
экспрессии гена rplL'-IacZ в рІКЗ, ρΙΚ8, ρΙΚ9, р / І Ш , ρΙΚ12, рЩ20 и
р1К7, где область, расположенная выше SD rplL, последовательно де-
летируется, не выявляет закономерностей, аналогичных эффекту при-
сутствия BspRI-FokI-участка перед геном rplJ. Плазмида pIKM с де-
лецией ΔNruI-EcolOBI обеспечивала больший уровень экспрессии гена
rplL'-lacZ по сравнению с ρΙΚ7, что, по-видимому, явилось следствием
сохранения SD-области гена rplJ, принимающей участие в инициации
трансляции гибридной мРІТК. По аналогии с вышеописанным эффек-
том можно было предположить, что последовательности, окружающие
рибосомосвязывающий сайт мРНК, также влияют на эффективность
трансляции. Систематическое детерминирование участков выше 5'-кон-
ца rplL (рІКЗ, р Ш , ρΙΚ9, ρΙΚΙΟ, ρΙΚ12, р1К20 и р1К7) не выявило за-
кономерного влияния. Однако делеция ΔNruI-SnaBI увеличила уро-
вень экспрессии rplL-lacZ в р1К14 по сравнению с р1К12 и р1К18 по
сравнению с рІКЗ. Природа этого эффекта в настоящее время неясна.
Известно, что трансляция цистронов Lll и Ll в мРНК Lll-Ll со-
пряжена. Слияние гена rplA с IacZ (ρΙΚΙ5) показало, что rplA обла-
дает достаточно эффективным рибосомосвязывающим участком, кото-
рый, однако, маскируется вторичной структурой в бицистронной матри-
це, препятствуя самостоятельной инициации в самом цистроне [28, 29].
В отличие от мРНК Lll — Ll, где цистроны разделены тремя ос-
нованиями, трансляция обоих цистронов также сопряжена, но проис-
ходит последовательно, приводя, однако, к 4-кратному избытку синте-
за белка L7/L12.
По результатам Si-картирования, стабильность обоих цистронов
мРНК rplJL одинакова и, следовательно, не определяет различного
уровня синтеза LlO и L7/L12. Еще одним механизмом контроля экс-
прессии в прокариотических организмах является регуляция антисмыс-
ловой РНК.
Установив возможность снижения экспрессии гена rplJ антисмыс-
ловой РНК в большом молярном избытке по отношению к смысловой,
мы исследовали возможность такой регуляции в rplIL-ouepone Ε. coli.
Для этого с помощью клонирования фрагментов оперона rplJL прово-
дили поиск сравнимого по силе с PLЮ промотора, который мог бы ини-
циировать синтез антисмысловой РНК in vivo. Встраиванием Br>pRI~
BspRl-фрагмента и его субфрагментов, полученных расщеплением ре-
стриктазами SmaIy DraI, RsaI, NruI, мы не обнаружили в антисмысло-
вой rplJ ориентации промотора, сравнимого по силе с PLIO-
Таким образом, закономерно предположить, что одним из наибо-
лее вероятных механизмов контроля экспрессии генов rplJL является
разная эффективность трансляции.
При сравнении гибридных генов грІҐ-lacZ и rplLr-IacZ, транскри-
бируемых с промотора P4 , проявилось преимущество экспрессии вто-
рого, увеличивающееся с удлинением фрагментов, соединяемых с IacZ.
Сопоставление первичной структуры рибосомосвязывающих участ-
ков rplJ и rplL с параметрами, оптимальными для экспрессии [30], не
выявило очевидных преимуществ какого-либо из них. В силу этого мож-
но предположить, что, если механизмом дифференциации экспрессии
генов rplJ и rplL в интактном опероне Е. coli является разная эффек-
тивность трансляции, причиной ее могут быть особенности вторичной
структуры мРНК.
Авторы выражают искреннюю благодарность А. В. Ельской за об-
суждение результатов работы и ценные замечания.
9 8 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1990. т. 6. № 2 7* 98
C O N S T R U C T I O N O F H Y B R I D L A C Z G E N E S TO S T U D Y T H E E. C O L I R P L J L
O P E R O X G E N E S E X P R E S S I O N M E C H A N I S M S
I. V. Kroupskaya, A. N. Zhyvoloup, E. B. Paton
I n s t i t u t e of M o l e c u l a r B i o l o g y a n d Gene t ics ,
A c a d e m y of Sc iences of the U k r a i n i a n S S R , Kiev
S u m m a r у
U s i n g the pNM48l p l a s m i d vec to r S ' - t e rmina l f r a g m e n t s of rplJ a n d rplL g e n e s w e r e
f u s e d i n - f r a m e to g e n e IacZ. H y b r i d β - a l a c t o s i d a s e s ac t iv i ty , encoded by g e n e s rplJ'—
IacZ and rplL'-lacZ w a s c o m p a r e d . In c o n t r a s t to rplU-lacZ, e x t e n s i o n of rplJ f u s e d por -
t ion resu l t ed in the dec rease of the β - g a l ac t iv i ty level. D i f f e r e n t e f f i c i ency of t r a n s l a t i -
o n s s eems to be t h e m o s t p r o b a b l e m e c h a n i s m , p r o v i d i n g t he excess s y n t h e s i s of r -p ro te in
17/112 in vivo.
С П И С О К Л И Т Е Р А Т У Р Ы
1. LituiuiU L., Zengel J. Al. R i b o s o m a l g e n e s in Escherichia coli// Ann . Rev. Gene t —
1986,—20, P. 297—326.
2. Nomura M., Course R., Baughman G. R e g u l a t i o n of the s y n t h e s i s of r i b o s o m e s and
r e b o s o m a l c o m p o n e n t s / / A n n . Rev. B iochem.— 1984.— 53.— P. 75—118 і.
3. Downing 1Г. L., Dennis P. P. T r a n s c r i p t i o n p r o d u c t s f rom the rplKAJL-rpoBC g e n e
c lus te r / / J . Мої. Biol.— 1987.—• 194, N 4.— P. 609—620.
4. Morgan Β. A., Ilayward R. S. Sl a n a l y s i s of PLIO ac t iv i ty in the E. coli rpoBC ope-
ron a f t e r a m i n o a e y l - t R N A l imi ta t in or r i f amp ic in t r e a t m e n t / / S e q u e n c e speci i i ty in
t r a n s c r i p t i o n and t r a n s l a t i o n . — N e w York: A l a n R. Liss , Inc., і985.— P. 31—40.
5. Jinks-Robertson S., Nomura M. R i b o s o m e s a n d t R N A / / Escherichia coli and Salmo-
nella typhimurium ce l lu la r and m o l e c u l a r b io logy .— N e w York: Amor. Soc. Microbi-
ol, 1987 .—Vol . 2 , — P . 1358—1385.
6. An C.} Friesen J. C h a r a c t e r i z a t i o n of p r o m o t e r - c l o n i n g p l a s m i d s a n a l y s i s oi operori
s t r u c t u r e in tiie rij r eg ion Escherichia coli and i so l a t ion of an e n h a n c e d in t e rna l
p r o m o t e r m u t a n t / / J . B a c t e r i o I . - 1980,— 144, N 3 . — P . 904—916.
7. Railing C., Linn T. Re la t ive ac t iv i t ies of the t r ansc r ip t iona l · r e g u l a t o r y s i tes in the
rplKAJ L-rpoBC g e n e c lus te r of Escherichia coli// Ibid.— 1984,— 158, N 1 0 — P . 4922—
4926.
8. Minion N. P. I m p r o v e d p l a s m i d v e c t o r s for i so l a t ion of t r a n s c r i p t i o n a l lac gene fus i -
o n s / / Gene — 1 9 8 4 , - 31, N 2 , — P . 269—273.
9. Baughman GNomura M. Loca l i za t i on of the t a r g e t s i te fo r t r a n s l a t i o n r e g u l a t i o n
of the Lll ope ron and d i rec t -ev idence for t r a n s l a t i o n a l c o u p l i n g in Escherichia coli //
Cell — 1983 — 34, N 3. P. 979—988.
10. YanisiΊι-Perroti C., Vieira J., Messing J. I m p r o v e d M13 p h a g e c l o n i n g v e c t o r s a n d
hos t s t r a in s : sequences nuc leo t ide oi the M13mpl8 and pUC19 vectors / / Gene .—
1985,— 33, N 1 , — P . 103—119.
11. Маниатие Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. М о л е к у л я р н о е клонирование .—М. : Мир,
1 9 8 4 , — 4 7 7 с.
12. Патон Е. В., Крупская И. В., Живолуп А. Н. О д н о н а п р а в л е н н а я о р и е н т а ц и я при
клонировании ф р а г м е н т о в rplKAJL-rpoBC-onepoua Escherichia coli в многокопийной
п л а з м и д е pUC // Б и о п о л и м е р ы и клетка .— 1989.— 5, № 1.— С. 58—66.
13. Патон Е. В., Живолуп A. П., Вариница JI. А. П р и с у т с т в и е д в у х сильных промото-
ров определяет ориентацию ф р а г м е н т а Д Н К при встраивании в п л а з м и д у pUC19 / /
Там же ,— 1986,— 2, ,Nb 4 — С . 217—219.
14. Collins J. Dele t ions , inse r t ion and r e a r r a n g e m e n t a f f e c t i n g rpoB g e n e e x p r e s s i o n / /
Мої. and Gen. Gene t .— 1979.— 173, N 1 . — P . 217—220.
15. Nucleotide s equence of the r i bosoma l p ro te in gene c lus t e r a d j a c e n t to the g e n e fo r
R N A - p o l y m e r a s c subun i t in Escherichia coli / L. F. P o s t , G. D. S t r y c h a r z , M. N o m u -
ra, H. L e w i s / / P r o c . Na t . Acad . Sci. U S A . — 1 9 7 9 . — 7 6 , N 4 . — P . 1697—1701.
16. Миллер Дж. Эксперименты в м о л е к у л я р н о й генетике.— М. : Мир , 1976.— 436 с.
17. Патон E. В., Крупская И. В., Живолуп А. Н. Изучение регуляции экспрессии гена
rplL Escherichia coli методом слияния с геном IacZ в п л а з м и д е pNM481 / / Биополи-
меры и клетка .— 1989 .—5, № 2 . — С . 99—102.
18. Conversion of β - g a l a c t o s i d a s e t o a m e m b r a n e - b o u n d s t a t e by g e n e f i s ion / T. J . Si l-
havy , M. J. C a s a d a b a n , H. A. S h u m a n , J . R. Beckwi th / / P r o c . Na t . Acad . Ssi . U S A . —
1976 — 73, N 1 0 . - - P . 3423—3427.
19. Close T. J., Christman J. L., Rodrigues R. L. M13 b a c t e r i o p h a g e a n d pUC p l a s m i d s
c o n t a i n i n g D N A inser t bu t s t i l l c a p a b l e of β - g a l a c t o s i d a s c α - c o m p l e m e n t a t i o n / /
Gene .— 19'83.— 23, N 1 . — P . 131 — 136.
20. Effects of h e t e r o l o g o u s r i b o s o m a l b i n d i n g s i tes on the transcription and translation of
the IacZ g e n e of Escherichia coli / / Ib id .— 1985.—37, N 1 . — P . 145—154.
21. Iborra F., Rayatial A., Gueritieau N. The p r o m o t e r of t he β - g l u c o s i d a s e g e n e f r o m
Kluyveromyces fragilis c o n t a i n s sequences t ha t act a s u p s t r e a m r e p r e s s i n g s e q u e n c e s
ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1990. т. 6. № 2 7* 9 9
in Saccharomyces eerevisiae / / Мої . and Gen. Gene t .— 1988 ,—213 , N 4 . — P . 150—154.
22. Newbury S. FSmZ/Λ W. Hifygins C. F. D i f f e r e n t i a l m R N A s tab i l i ty c o n t r o l s re la -
t ive g e n e e x p r e s s i o n wi th in a po lyc i s t ron ic o p e r o n / / C e l l . — 1 9 8 7 . — 5 1 , N 7.—
P. 1131 — 1143.
23. Secondary s t r u c t u r e a s p r i m a r y d e t e r m i n a n t of the e f f i c iency of r i bosoma l b i n d i n g
s i tes in Escherichia coli / A. C. L o o m a n , J . B o d l a e n d e r , M. de G r u y t e r et a l . / / N u c I .
Ac ids Res.— 1 9 8 6 . - 14, N 1 3 . - P. 5 4 8 1 - 5 4 9 7 .
24. Крупская И. В., Патон Ε. Б., Живолуп А. Н. Внутренний промотор r / ; / /L -onepona
Escherichia coli п р о я в л я е т высокую э ф ф е к т и в н о с т ь в рекомбинантноп п л а з м и д е
pNM481 / / Г е н е т и к а . — 1989.—25, № 1 . — С . 154—157.
25. Kuhlmeier С., Fluhr R., Chua N.-H. U p s t r e a m sequences d e t e r m i n e the d i f f e r ence in
t r a n s c r i p t a b u n d a c e of pea rpcS g e n e s / / М о ї . a n d Gen. Gene t .— 1988 .—212, N 4 —
. p . 405—411.
26. Iborra F. Francingues M.-C., Guerineau M. Loca l i z a t i on of t h e u p s t r e a m r e g u l a t o r y
s i t e s of yeas t i so2 -cy toch rome 5 g e n e / / Ib id .— 1985.— 199, N 2 . — P . 117—122.
27. Friesen J. D., Tropak M., An G. M u t a t i o n in t he rpll l eader of Escherichia coli t h a t
abol i sh f eedback r e g u l a t i o n / / C e l l . — 1983 .—32, N 2 . — P . 361—369.
28. Gouy M., Gautier C. C o d o n u s a g e in bac t e r i a : co r r e l a t i on w i th g e n e exp re s s ion / /
Nucl . Ac ids Res .— 1982,— 10, N 2 5 . — P . 7055—7074.
29. Sharp P. M., Li W.-H. C o d o n u s a g e in r e g u l a t o r y g e n e s in Escherichia coli does no t
re f lec t se lec t ion for «гаге» c o d o n s / / I b i d . — 1 9 8 6 . — 14, N 1 9 . — P . 7737—7749.
30. Tinoco I., Uhlenbeck 0. C., Levine M. D. E s t i m a t i o n of s e c o n d a r y s t r u c t u r e in r ibo-
nuc le ic ac id s / / N a t u r e . — 1971,— 230,— P. 362—367.
PIH-T м о л е к у л я р . биологии и генетики А Н У С С Р , Киев Получено 04.06.89
У Д К 579.I25.4.2.862.1 :037.136.5
J I . М . Румер, В . А. Лившиц
ТРАНСФОРМАЦИЯ СФЕРОПЛАСТОВ
STRE PTOCOCCUS LACTIS ПЛАЗМИ ДАМИ
Определены оптимальные условия получения трансформабельных сферопластов S. Iac-
Iis с помощью лизоцима. Установлено, что жизнеспособность клеток S. Iaciis быстро
падает с увеличением концентрации лизоцима и времени инкубации с ним.
Осуществлена трансформация сферопластов чужеродными гетерологичными плаз-
мидами pRT84 и pLF2. Показана экспрессия в клетках S. Iactis гена Bacillus amylo-
liquefaciens, кодирующего а-амилазу, клонированного в составе pRT84.
Введение. Молочные стрептококки широко используются в производ-
стве кисломолочных продуктов и в сыроделии. Некоторые штаммы 5.
Iactis являются продуцентами пептидного антибиотика низина, который
применяется в качестве консерванта в пищевой промышленности. Транс-
формация молочных стрептококков плазмидами является важной пред-
посылкой для их генетического изучения и применения методов генной
инженерии в селекционной работе с ними.
В последние годы описано получение протопластов S. Iactis и
трансформация их как собственными, так и некоторыми чужеродными
,плазмидами [1 —10]. В этих работах для удаления клеточной стенки
Использовали лизоцим из яичного белка, мутанолизин (N-ацетилмура-
мидазу из Streptomyces globisporus) или их комбинацию, а также осу-
ществляли дополнительную обработку клеток протеолитическими фер-
ментами и определенными препаратами а-амилазы [2—4]. Однако опи-
санные методики плохо воспроизводятся в различных лабораториях
[11]. Причины, влияющие на эффективность трансформации протоплас-
тов S. Iaetis плазмидами, до сих пор слабо изучены. Следует также от-
метить, что применение мутанолизина для растворения клеточной стен-
ки у молочнокислых бактерий ограничено малодоступностью этого пре-
парата.
Целью настоящей работы является определение оптимальных ус-
ловий получения трансформабельных сферопластов 5. Iaetis с помо-
щью лизоцима. Кроме того, интересно было изучить возможность под-
держания в клетках молочных стрептококков некоторых чужеродных
плазмид, перспективных для использования их в качестве векторов при
молекулярном клонировании.
1 0 0 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1990. т. 6. № 2 7* 100
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-152949 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7657 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T17:31:40Z |
| publishDate | 1990 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Крупская, И.В. Живолуп, А.Н. Патон, Е.Б. 2019-06-13T11:09:47Z 2019-06-13T11:09:47Z 1990 Конструирование гибридных генов lacZ для изучения механизмов регуляции экспрессии генов rpljl-оперона Escherichia coli / И.В. Крупская, А.Н. Живолуп, Е.Б. Патон // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 2. — С. 91-100. — Бібліогр.: 30 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000262 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152949 577.21 С использованием в качестве векторной плазмиды pNM481 было проведено слияние 5'-концевых фрагментов генов rplJ и rplL с геном IacZ и сравнение уровней активности бета-галактозидазы, обеспечиваемых присутствием в клетках гибридных генов rpl J'-lacZ и rplL'-lacZ. Не обнаружено влияния промотора Pl12 на эффективность экспрессии гена rplL'-lacZ. Уровень активности бета-галактозидазы, кодируемой rplL'-lacZ, во всех случаях превосходит активность, обеспечиваемую rplJ'-lacZ. В отличие от rplJ'-lacZ с увеличением длины фрагмента rplL активность кодируемой им бета-галактозидазы не уменьшалась. Транскрипция гибридных генов с промотора Pbeta сохранила превосходство уровня экспрессии rplL'-lacZ. Предполагается, что регуляция активности генов rplJL oneрона Е. coli, обеспечивающая избыточный синтез белка L7/L12, может осуществляться на уровне трансляции бицистронной мРНК rplJL. З використанням як векторної плазміди pNM481 проведено злиття 5' -кінцевих фрагментів генів rplJ і rplL з геном lacZ і порівняння рівнів активності бета-галактозидази, забезпечуваних присутністю в клітинах гібридних генів rpl J'-lacZ і rplL'-lacZ. Не виявлено впливу промотору Pl12 на ефективність експресії гена rplL'-lacZ. Рівень активності бета-галактозидази, кодованої rplL'-lacZ, у всіх випадках перевищує активність, забезпечувану rplJ'-lacZ. На відміну від rplJ'-lacZ із збільшенням довжини фрагмента rplL активність кодованої їм бета- галактозидази не зменшується. Транскрипція гібридних генів з промотору Pbeta зберігає перевагу рівня експресії rplL'-lacZ. Передбачається, що регулювання активності генів rplJL-oneрону Е. coli, яке забезпечує надлишковий синтез білка L7/L12, може здійснюватися на рівні трансляції біцістронной мРНК rplJL. Using the pNM481 plasmid vector 5'-terminal fragments of rplJ and rplL genes were fused in-frame to gene lacZ. Hybrid p-alactosidases activity, encoded by genes rplJ'— lacZ and rplL'-lacZ was compared. In contrast to rplL'-lacZ, extension of rplJ fused portion resulted in the decrease of the p-gal activity level. Different efficiency of translations seems to be the most probable mechanism, providing the excess synthesis of r-protein L7/L12 in vivo. Авторы выражают искреннюю благодарность А. В. Ельской за обсуждение результатов работы и ценные замечания. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Генно-инженерная биотехнология Конструирование гибридных генов lacZ для изучения механизмов регуляции экспрессии генов rpljl-оперона Escherichia coli Конструювання гібридних генів lacZ для вивчення механізмів регуляції експресії генів rpljl-оперона Escherichia coli Construction of hybrid lacZ genes to study the E. coli rpljl operon genes expression mechanisms Article published earlier |
| spellingShingle | Конструирование гибридных генов lacZ для изучения механизмов регуляции экспрессии генов rpljl-оперона Escherichia coli Крупская, И.В. Живолуп, А.Н. Патон, Е.Б. Генно-инженерная биотехнология |
| title | Конструирование гибридных генов lacZ для изучения механизмов регуляции экспрессии генов rpljl-оперона Escherichia coli |
| title_alt | Конструювання гібридних генів lacZ для вивчення механізмів регуляції експресії генів rpljl-оперона Escherichia coli Construction of hybrid lacZ genes to study the E. coli rpljl operon genes expression mechanisms |
| title_full | Конструирование гибридных генов lacZ для изучения механизмов регуляции экспрессии генов rpljl-оперона Escherichia coli |
| title_fullStr | Конструирование гибридных генов lacZ для изучения механизмов регуляции экспрессии генов rpljl-оперона Escherichia coli |
| title_full_unstemmed | Конструирование гибридных генов lacZ для изучения механизмов регуляции экспрессии генов rpljl-оперона Escherichia coli |
| title_short | Конструирование гибридных генов lacZ для изучения механизмов регуляции экспрессии генов rpljl-оперона Escherichia coli |
| title_sort | конструирование гибридных генов lacz для изучения механизмов регуляции экспрессии генов rpljl-оперона escherichia coli |
| topic | Генно-инженерная биотехнология |
| topic_facet | Генно-инженерная биотехнология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152949 |
| work_keys_str_mv | AT krupskaâiv konstruirovaniegibridnyhgenovlaczdlâizučeniâmehanizmovregulâciiékspressiigenovrpljloperonaescherichiacoli AT živolupan konstruirovaniegibridnyhgenovlaczdlâizučeniâmehanizmovregulâciiékspressiigenovrpljloperonaescherichiacoli AT patoneb konstruirovaniegibridnyhgenovlaczdlâizučeniâmehanizmovregulâciiékspressiigenovrpljloperonaescherichiacoli AT krupskaâiv konstruûvannâgíbridnihgenívlaczdlâvivčennâmehanízmívregulâcííekspresíígenívrpljloperonaescherichiacoli AT živolupan konstruûvannâgíbridnihgenívlaczdlâvivčennâmehanízmívregulâcííekspresíígenívrpljloperonaescherichiacoli AT patoneb konstruûvannâgíbridnihgenívlaczdlâvivčennâmehanízmívregulâcííekspresíígenívrpljloperonaescherichiacoli AT krupskaâiv constructionofhybridlaczgenestostudytheecolirpljloperongenesexpressionmechanisms AT živolupan constructionofhybridlaczgenestostudytheecolirpljloperongenesexpressionmechanisms AT patoneb constructionofhybridlaczgenestostudytheecolirpljloperongenesexpressionmechanisms |