Опыт аналитического изоэлектрофокусирования в сверхтонких блоках полиакриламидного геля с применением алмалитов — амфолитов-носителей
Представлены данные о применении амфолитов-носителей, синтезированных в Казахском госуниверситете, для целей изоэлектрического фокусирования (ИЭФ) в сверхтонких блоках полиакриламидных гелей (ПААГ). Приведены основные характеристики амфолитов-носителей. Показана стабильность формируемого градиента р...
Saved in:
| Published in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Date: | 1986 |
| Main Authors: | , , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1986
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152973 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Опыт аналитического изоэлектрофокусирования в сверхтонких блоках полиакриламидного геля с применением алмалитов — амфолитов-носителей / А.В. Шурхал, Г.Т. Азимбаева, А.В. Подогас, К.Б. Мусабеков, В.А. Пасечник // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 5. — С. 261-266. — Бібліогр.: 7 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-152973 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Шурхал, А.В. Азимбаева, Г.Т. Подогас, А.В. Мусабеков, К.Б. Пасечник, В.А. 2019-06-13T11:53:32Z 2019-06-13T11:53:32Z 1986 Опыт аналитического изоэлектрофокусирования в сверхтонких блоках полиакриламидного геля с применением алмалитов — амфолитов-носителей / А.В. Шурхал, Г.Т. Азимбаева, А.В. Подогас, К.Б. Мусабеков, В.А. Пасечник // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 5. — С. 261-266. — Бібліогр.: 7 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.0001C0 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152973 543.545 Представлены данные о применении амфолитов-носителей, синтезированных в Казахском госуниверситете, для целей изоэлектрического фокусирования (ИЭФ) в сверхтонких блоках полиакриламидных гелей (ПААГ). Приведены основные характеристики амфолитов-носителей. Показана стабильность формируемого градиента рН, а также представлены результаты разделения методом ИЭФ в ПААГ ферментов, водорастворимых и мембранных белков животных и растений. Представлено дані щодо застосування амфолітів-носіїв, синтезованих у Казахському держуніверситеті, для цілей ізоелектричного фокусування (ІЕФ) у надтонких блоках поліакриламідних гелів (ПААГ). Наведено основні характеристики амфолітів-носіїв. Показано стабільність градієнта величини рН, який формується, а також представлено результати поділу методом ІЕФ у ПААГ ферментів, водорозчинних і мембранних білків тварин і рослин. Results obtained from examination of carriers-ampholytes (hereafter named «almalite») prepared at the Kazakh State University by IEF in column of sucrose density are presented: pH gradient is constructed, conductivity and absorption of 280 nm UV light are measured. Almalite is used for analytical IEF in thin-layer PAGE. Linearity and stability of the formed pH gradient are shown. Isoelectric separation of enzymes, soluble and membrane proteins of various plants and animals is conducted. Conclusions are made that almalites do not inhibit some enzymes and effectively separate complex mixtures of soluble and membrane proteins of plants and animals. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Структура и функции биополимеров Опыт аналитического изоэлектрофокусирования в сверхтонких блоках полиакриламидного геля с применением алмалитов — амфолитов-носителей Досвід аналітичного ізоелектрофокусування у надтонких блоках поліакриламідного гелю із застосуванням алмалітів амфолітів-носіїв Experience of anaeytical isoelectrofocusing in ultrathin-layer page using aemalites, carriers-ampholytes Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Опыт аналитического изоэлектрофокусирования в сверхтонких блоках полиакриламидного геля с применением алмалитов — амфолитов-носителей |
| spellingShingle |
Опыт аналитического изоэлектрофокусирования в сверхтонких блоках полиакриламидного геля с применением алмалитов — амфолитов-носителей Шурхал, А.В. Азимбаева, Г.Т. Подогас, А.В. Мусабеков, К.Б. Пасечник, В.А. Структура и функции биополимеров |
| title_short |
Опыт аналитического изоэлектрофокусирования в сверхтонких блоках полиакриламидного геля с применением алмалитов — амфолитов-носителей |
| title_full |
Опыт аналитического изоэлектрофокусирования в сверхтонких блоках полиакриламидного геля с применением алмалитов — амфолитов-носителей |
| title_fullStr |
Опыт аналитического изоэлектрофокусирования в сверхтонких блоках полиакриламидного геля с применением алмалитов — амфолитов-носителей |
| title_full_unstemmed |
Опыт аналитического изоэлектрофокусирования в сверхтонких блоках полиакриламидного геля с применением алмалитов — амфолитов-носителей |
| title_sort |
опыт аналитического изоэлектрофокусирования в сверхтонких блоках полиакриламидного геля с применением алмалитов — амфолитов-носителей |
| author |
Шурхал, А.В. Азимбаева, Г.Т. Подогас, А.В. Мусабеков, К.Б. Пасечник, В.А. |
| author_facet |
Шурхал, А.В. Азимбаева, Г.Т. Подогас, А.В. Мусабеков, К.Б. Пасечник, В.А. |
| topic |
Структура и функции биополимеров |
| topic_facet |
Структура и функции биополимеров |
| publishDate |
1986 |
| language |
Russian |
| container_title |
Биополимеры и клетка |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Досвід аналітичного ізоелектрофокусування у надтонких блоках поліакриламідного гелю із застосуванням алмалітів амфолітів-носіїв Experience of anaeytical isoelectrofocusing in ultrathin-layer page using aemalites, carriers-ampholytes |
| description |
Представлены данные о применении амфолитов-носителей, синтезированных в Казахском госуниверситете, для целей изоэлектрического фокусирования (ИЭФ) в сверхтонких блоках полиакриламидных гелей (ПААГ). Приведены основные характеристики амфолитов-носителей. Показана стабильность формируемого градиента рН, а также представлены результаты разделения методом ИЭФ в ПААГ ферментов, водорастворимых и мембранных белков животных и растений.
Представлено дані щодо застосування амфолітів-носіїв, синтезованих у Казахському держуніверситеті, для цілей ізоелектричного фокусування (ІЕФ) у надтонких блоках поліакриламідних гелів (ПААГ). Наведено основні характеристики амфолітів-носіїв. Показано стабільність градієнта величини рН, який формується, а також представлено результати поділу методом ІЕФ у ПААГ ферментів, водорозчинних і мембранних білків тварин і рослин.
Results obtained from examination of carriers-ampholytes (hereafter named «almalite») prepared at the Kazakh State University by IEF in column of sucrose density are presented: pH gradient is constructed, conductivity and absorption of 280 nm UV light are measured. Almalite is used for analytical IEF in thin-layer PAGE. Linearity and stability of the formed pH gradient are shown. Isoelectric separation of enzymes, soluble and membrane proteins of various plants and animals is conducted. Conclusions are made that almalites do not inhibit some enzymes and effectively separate complex mixtures of soluble and membrane proteins of plants and animals.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152973 |
| citation_txt |
Опыт аналитического изоэлектрофокусирования в сверхтонких блоках полиакриламидного геля с применением алмалитов — амфолитов-носителей / А.В. Шурхал, Г.Т. Азимбаева, А.В. Подогас, К.Б. Мусабеков, В.А. Пасечник // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 5. — С. 261-266. — Бібліогр.: 7 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT šurhalav opytanalitičeskogoizoélektrofokusirovaniâvsverhtonkihblokahpoliakrilamidnogogelâsprimeneniemalmalitovamfolitovnositelei AT azimbaevagt opytanalitičeskogoizoélektrofokusirovaniâvsverhtonkihblokahpoliakrilamidnogogelâsprimeneniemalmalitovamfolitovnositelei AT podogasav opytanalitičeskogoizoélektrofokusirovaniâvsverhtonkihblokahpoliakrilamidnogogelâsprimeneniemalmalitovamfolitovnositelei AT musabekovkb opytanalitičeskogoizoélektrofokusirovaniâvsverhtonkihblokahpoliakrilamidnogogelâsprimeneniemalmalitovamfolitovnositelei AT pasečnikva opytanalitičeskogoizoélektrofokusirovaniâvsverhtonkihblokahpoliakrilamidnogogelâsprimeneniemalmalitovamfolitovnositelei AT šurhalav dosvídanalítičnogoízoelektrofokusuvannâunadtonkihblokahpolíakrilamídnogogelûízzastosuvannâmalmalítívamfolítívnosíív AT azimbaevagt dosvídanalítičnogoízoelektrofokusuvannâunadtonkihblokahpolíakrilamídnogogelûízzastosuvannâmalmalítívamfolítívnosíív AT podogasav dosvídanalítičnogoízoelektrofokusuvannâunadtonkihblokahpolíakrilamídnogogelûízzastosuvannâmalmalítívamfolítívnosíív AT musabekovkb dosvídanalítičnogoízoelektrofokusuvannâunadtonkihblokahpolíakrilamídnogogelûízzastosuvannâmalmalítívamfolítívnosíív AT pasečnikva dosvídanalítičnogoízoelektrofokusuvannâunadtonkihblokahpolíakrilamídnogogelûízzastosuvannâmalmalítívamfolítívnosíív AT šurhalav experienceofanaeyticalisoelectrofocusinginultrathinlayerpageusingaemalitescarriersampholytes AT azimbaevagt experienceofanaeyticalisoelectrofocusinginultrathinlayerpageusingaemalitescarriersampholytes AT podogasav experienceofanaeyticalisoelectrofocusinginultrathinlayerpageusingaemalitescarriersampholytes AT musabekovkb experienceofanaeyticalisoelectrofocusinginultrathinlayerpageusingaemalitescarriersampholytes AT pasečnikva experienceofanaeyticalisoelectrofocusinginultrathinlayerpageusingaemalitescarriersampholytes |
| first_indexed |
2025-11-24T16:09:55Z |
| last_indexed |
2025-11-24T16:09:55Z |
| _version_ |
1850850878389485568 |
| fulltext |
3. Универсальная установка для жидкостного колоночного электрофореза биополиме-
р о в / Л . Е. Король, I I. И. Коньшин, Г. Ю. Ажицкий, В. И. Андриенко/ /Молекуляр
биология. — 1984. — Вып. 36. — С. 70—71.
Получено 21.10.85 Рост. гос. ун-т им. М. А. Суслова
Ин-т молекуляр. биологии и генетики АН УССР, Киев
УДК 543.545
ОПЫТ АНАЛИТИЧЕСКОГО ИЗОЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНИЯ
В СВЕРХТОНКИХ БЛОКАХ ПОЛИАКРИЛАМИДНОГО ГЕЛЯ
С ПРИМЕНЕНИЕМ АЛМАЛИТОВ — АМФОЛИТОВ-НОСИТЕЛЕЙ *
А. В. Шурхал, Г. Т. Азимбаева, А. В. Подогас,
К. Б. Муеабеков, В. А. Пасечник
Введение. Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) является одним
из наиболее распространенных и прогрессивных методов анализа
свойств биологических полимеров. Принципиальная идея метода сфор-
мулирована в работах Колина и Свенсона (Рилби) (цитировано по
[1]) и заключается в том, что макромолекулы, несущие заряд, под дей-
ствием электрического поля мигрируют вдоль градиента рН, пока не
достигнут соответствующего значения изоэлектрической ТОЧКИ (pi) .
В настоящее время успешно развиваются вопросы общей теории ИЭФ
[2] и разработан широкий диапазон его методических модификаций [3].
В качестве субстрата для формирования градиента рН используются
разнообразные химические агенты, однако наибольшее распространение
получили синтетические амфолиты-носители, из которых более пред-
почтительными являются амфолиты, известные под коммерческими
(названиями «амфолины» производства «LKB» (Швеция); «сервалиты» и
«фармалиты», выпускаемые соответствующими фирмами «Serva» (ФРГ)
и «Pharmacia» (Швеция). В Советском Союзе ранее были предприняты
попытки синтезировать собственные амфолиты [4, 5]. В данном сооб-
щении представлены результаты опытов по аналитическому ИЭФ в
сверхтонких слоях полиакриламидного геля (ПААГ), где амфолитами-
носителями служили препараты, синтезированные в Казахском государ-
ственном университете им. С. М. Кирова.
Материалы и методы. Амфолит-носитель синтезирован в Казахском государствен-
ном университете им. С. М. Кирова на кафедре коллоидной химии и получил название
«Алмалит». Синтез проведен на основе взаимодействия промышленных смесей полн-
этиленполиаминов (ПЭПА) с непредельными карбоновыми кислотами при соотношении
амино- и карбоксильных групп (N/COOH) в исходных реагентах 2 : 1 . Реакцию про-
водили в круглодонной колбе, снабженной мешалкой, путем взаимодействия кислоты с
водным раствором ПЭПА в течение 1 ч в токе инертного газа. Для завершения реакции
смесь термостатировали при 70 °С в течение 5 ч. Синтезированный продукт получали в
виде 40%-ного водного раствора. Синтезированные таким образом алмалиты были ис-
следованы методом ИЭФ в градиенте плотности сахарозы в колонке «LKB» объемом
110 мл. В ходе опыта одновременно измеряли градиент рН, электропроводность и по-
глощение в УФ-части спектра при 280 нм. Свойства алмалитов в режиме ИЭФ иссле-
дованы методом аналитического ИЭФ в сверхтонких гелях полиакриламида. Техника
приготовления растворов гелей, содержащих алмалиты-носители, формирование сверх-
тонких гелевых блоков и основные параметры режима ИЭФ описаны нами ранее [6].
В опытах использованы источники питания фирмы «Desaga» «Desatronic-2000», а так-
же источники, разработанные в СКВ БФА, ИГ1Э-2000-02 с режимом стабилизации по
мощности. Префокусирование и разделение проводили при 4 °С. Распределение гради-
* Амфолиты-носители синтезированы в Казахском госуниверситете.
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 5 261
ента рН определяли с помощью поверхностного электрода фирмы «Ingold» при той же
температуре. Продолжительность режима ИЭФ контролировали по количеству Вольт-
часов, которое в опытах на тонких слоях составляло 3500. В качестве исследуемых об-
разцов сложных белковых смесей применяли следующие материалы: водорастворимые
экстракты семян нескольких видов хвойных из рода сосна — с целью изучения спектров
ряда ферментов и определения изоэлектрических точек изоферментов, а также для
изучения общего спектра водорастворимых белков растений; экстракты лизис-буфером
(9,5 Μ мочевина, 2 %-ный меркаптоэтанол и 2 %-ный тритон Х-100) для изучения спект-
ров мембранных белков и белков цитоскелета; водные и лизис-буферные экстракты
мышц близкородственных видов копытных млекопитающих для исследования спектров
водорастворимых и мембранных белков мышечной ткани. Фиксацию, окрашивание изо-
электрофореграмм (ИЭФГ) исследуемых ферментов и общих спектров белков проводи-
ли по ранее описанным методам [6, 7].
Результаты и обсуждение. На рис. 1 представлены результаты
колоночного ИЭФ алмалита. Анализ этих данных показывает, что син-
тезированные алмалиты не обладают тем оптическим пропусканием при
280 нм, которое характерно для амфолинов «LKB». Однако применение
многократной очистки алмалитов активированным углем позволяет
значительно снизить поглощение в указанном спектре (рис. 2). Здесь
уместно заметить, что для целей аналитического ИЭФ в гелевых блоках
этот параметр не является существенным.
Молекулярно-массовое распределение (ММР) для синтезированных
алмалитов определяли методом гель-фильтрации на сефадексе G-25.
Для калибровки использовали белки с различной молекулярной мас-
Рис. 1. Результаты ИЭФ амфолита-носителя (алмалита) в колонке: 1 — градиент рН
4—9; 2 — изменение пропускания (Τ, %) вдоль градиента рН; 3 — изменение удельной
электропроводности (κ, О м - 1 - с м - 1 ) при Е2зо вдоль градиента рН.
Fig. 1. Results of isoelectrofocusing of carrier-ampholyte (almalite) in column: 1 — pH
gradient of 4-9; 2 — change of transmission (T, %) along pH gradient; 3 — change of
conductivity (κ ohm- 1 cm- 1 ) at E2so along pH gradient.
Рис. 2. УФ-спектры алмалита: 1 — необеспеченный; 2 — обесцвеченный многократной
обработкой активированным углем.
Fig. 2. UV patterns of almalite: 1 — undestained; 2 — destained by manifold treatment
with activated carbon.
сой. Установленная в этом опыте форма ММР соответствует требова-
ниям, предъявляемым к амфолитам-иосителям, диапазон распределения
составляет 500—1000.
Для определения буферной емкости готовили элюаты девяти по-
следовательных фракций после проведения ИЭФ в оолиакриламидном
блоке. Выделенные фракции исследовали потенциометрическим титро-
ванием для определения буферной емкости амфолита-носителя вдоль
градиента рН. Как показали результаты анализа (рис. 3), буферная
емкость синтезированных алмалитов в диапазоне рН 4—9 имеет тот же
порядок, что и у амфолинов «LKB» и приблизительно равна
4μ-экв/pH·мл. Поскольку цель настоящего сообщения обобщить опыт
ИЭФ в тонких слоях ПААГ, то более подробное описание анализа ал-
малитов на колонке и приготовления элюатов будет опубликовано в
дальнейшем.
262 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 5 262
Для изучения свойств алмалитов в условиях ИЭФ іна блоках по-
лиакриламидных гелей были проведены опыты по разделению сложных
смесей белков. В качестве исследуемых образцов применяли тестерные
смеси маркерных белков с известными значениями изоэлектрических
точек, а также экстракты водорастворимых и мембранных белков не-
скольких видов растений и животных. На рис. 4, А представлены спект-
Рис. 3. Изменение буферной емкости в градиенте рН
4—9: 1 — амфолин «LKB»; 2 — алмалит.
Fig. 3. Change of buffer capacity in pH gradient of
4-9: 1 — «LKB» ampholine, 2 — almalite.
Рис. 4. ИЭФ-спектры маркерных белков и белков сыворотки крови баранов: 1—4 — раз-
ные препараты сыворотки крови. /1 — на амфолинах «LKB»; Б — на алмалитах. Минус
сверху.
Fig. 4. IEF patterns of marker proteins and serum blood proteins of sheep (minus on the
top): 1-4 — sera of sheep. A — gel with «LKB» ampholines; Б — with almalites.
Рис. 5. ИЭФ-спектры экстрактов водорастворимых белков мышечной ткани косули. Ми-
нус сверху.
Fig. 5. IEF patterns of soluble proteins extracted from roe muscle tissue (minus on the
t o p ) .
ры маркерных белков и белков сыворотки крови баранов на амфоли-
нах «LKB», на рис. 4, Б — на алмалитах, синтезированных в Казахском
госуниверситете. По распределению фракций маркерных белков разде-
ление в градиенте рН на алмалитах достаточно надежно воспроизводит
спектр тех же белков на амфолинах «LKB» с незначительной поправкой
на различие в диапазонах рН. Имеющиеся в нашем распоряжении
данные позволяют предположить, что некоторое искривление фракций
на алмалитах (рис. 4, Б) и более четкое разделение белковых зон на
амфолинах «LKB» (рис. 4, А) обусловлено не вполне оптимальным для
алмалитов подбором растворов электролитов. На рис. 5 представлен
спектр ИЭФ экстрактов водорастворимых белков мышечной ткани од-
ного из наиболее распространенных видов копытных млекопитающих —
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 5 263
косули. В рамках программы по изучению генетической структуры
географических форм проведена серия исследований с применением ал-
малитов, на рисунке проиллюстрирован один из вариантов, когда метод
позволяет выявить различия по изоэлектрическим точкам между водо-
растворимыми белками.
Как известно, разделение смесей белков растительного происхож-
дения в отличие от экстрактов из тканей животных сопряжено с из-
вестными трудностями, в частности вследствие насыщенности первых
Рис. 6. ИЭ;Ф-спектры ферментов эндосперма сосны сибирской
и градиенты рН в геле: А — глюкозофосфатизомераза; Б — эс-
тераза.
Fig. 6. IEF patterns of enzymes from cedar pine endosperm, and
pH gradient in gel: A — glucose-phosphate isomerase: Б — es-
terase.
фенольными соединениями. Именно по этой причине особое значение
имеют такие методы, которые позволяют достаточно надежно дифферен-
цировать биохимические генные маркеры растений, в том числе мно-
жественные наследственные изоформы ферментов. Для того чтобы изу-
чить, в какой мере пригодны алмалиты для решения этих проблем, нами
были предприняты попытки исследовать водорастворимые экстракты
растительных тканей с последующим гистохимическим окрашиванием
ИЭФГ для выявления различных классов ферментов: гидролаз, изоме-
раз и дегидрогеназ. На рис. 6, А представлена ИЭФГ глюкозофосфат-
изомеразы (ГФИ) из тканей эндосперма сосны сибирской. В конце опы-
та построена форма градиента рН с помощью поверхностного электрода,
что позволило охарактеризовать выявленные изоферментные формы
ГФИ по их изоэлектрическим точкам. Было выявлено пять фракций
изоферментов ГФИ, которые кодируются тремя локусами и обладают
значениями pi соответственно: 4,8; 5,2; 5,3; 5,8; 6,7. Аналогичным мето-
дом изучен ИЭФ-спектр другого класса ферментов-гидролаз — эстера-
зы (ЭС) (рис. 6, Б) . Обнаружено восемь фракций изоферментов ЭС,
кодируемых четырьмя локусами. Значения pi изоферментов ЭС распре-
делены соответственно: 4,6; 4,8; 5,3; 5,9; 6,05; 6,2; 6,6 и 6,95. Таким же
образом был изучен ИЭФ-спектр одного из ферментов класса дегидро-
геназ ФГД. Что касается характера распределения градиента рН,
создаваемого алмалитами в плоских нормальных и сверхтонких гелях,
то форма градиента во всех изученных партиях алмалитов была прямо-
линейной и достаточно надежно воспроизводилась, а форма градиента
одной партии воспроизводится даже в деталях. Все упомянутые опыты
по ИЭФ с помощью алмалитов были проведены по разделению смесей
водорастворимых белков, между тем в последнее время все большее
внимание исследователей уделяется классу мембранных белков, как
наиболее важным биологическим макромолекулам в функциональном
и эволюционном аспектах. С этой целью нами были подобраны условия
для исследования мембранных белков методом ИЭФ с применением
264 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 5 264
алмалитов. На рис. 7 представлены спектры мембранных белков не-
скольких видов хвойных и цветковых растений. Препараты мембранных
белков растений готовили из тканей семян сосны и стебля примулы,
для этой пели применяли лизис-буфер, содержащий 9 Μ мочевину и
2 %-ный меркаптоэтанол. Результаты разделения с помощью алмали-
тов воспроизводятся в достаточно высокой степени и на представленной
ИЭФГ можно обнаружить определенные различия в спектрах мембран-
ных белков исследованных видов.
ι
Рис.. 7. ИЭФ-спектры мембранных белков некоторых
гидов хвойных и цветковых растений (стрелками по-
казаны различия). Минус сверху.
•Fig. 7. IEF patterns of membrane proteins of some
specics of coniferous and flower plants (differences
are indicated by ( f ) ) (minus on the top).
Таким образом, результаты нашего опыта по применению алмали
тов для целей ИЭФ сложных смесей белков в нормальных и сверх-
тонких гелях позволяют заключить, что при использовании алмалитов-
носителей, синтезированных в Казахском госуниверситете для целей
ИЭФ в плоских гелях, по всей длине пластины формируется ровный
градиент рН. Форма и характер градиента рН на алмалитах имеют
равномерное и прямолинейное распределение значений рН. Инфра-
структура формы градиента рН воспроизводится в опытах одной серии
синтеза, а также в разных партиях алмалитов. Кроме того, можно сде-
лать заключение о том, что в градиенте рН, образованном на алмали-
тах, эффективно распределяются сложные смеси водорастворимых и
мембранных белков из тканей различных видов растений и животных.
Существенно, что алмалиты не обладают ингибирующим эффектом в
отношении трех основных классов ферментов: гидролаз, изомераз и
дегидрогеназ, поскольку для соответствующих ферментов этих классов
(эс.теразы, фосфоглюкозоизомеразы и 6-фосфоглюконатдегидрогеназы)
выявлены спектры активных фракций в присутствии алмалитов. Таким
образом, на основании представленных данных можно утверждать, что
в Казахском госуниверситете отработаны методы синтеза амфолитов-
посителей, способных создавать устойчивые формы градиента рН, для
аналитического ИЭФ в плоских блоках ПААГ.
EXPERIENCE OF ANALYTICAL ISOELECTROFOCUSING
IN ULΤRΑΤΗIN - LAYΕR PAGE USING ALMALITES,
CARRIERS-AMPHOLYTES
A. V. Shurkhal, G. T. Azimbaeva, Α. V. Podogas, K. B. Musabekov, V. A. Pasechnik
N. I. Vavilov Institute of General Genetics,
Academy of Sciences of the USSR, Moscow
S u m m a г у
Results obtained from examination of carriers-ampholytes (hereafter named «almalite»)
prepared at the Kazakh State University by IEF in column of sucrose density are presen-
ted: pH gradient is constructed, conductivity and absorption of 280 nm UV light are
measured. Almalite is used for analytical IEF in thin-layer PAGE. Linearity and stability
of the formed pH gradient are shown. Isoelectric separation of enzymes, soluble and
membrane proteins of various plants and animals is conducted. Conclusions are made
that almalites do not inhibit some enzymes and effectively separate complex mixtures of
soluble and membrane proteins of plants and animals.
262 Б И О П О Л И М Е Р Ы И К Л Е Т К А , 1986, т . 2, № 5 265
1. Righetti P. G., Drysdale J. W. Laboratory techniques in biochemistry and molecular
biology: isoelectric focusing. — Amsterdam : North Holland Publ. Co., 1976—260 p.
2. Бабский В. Г., Жуков Μ. Ю., Юдович В. И. Математическая теория электрофореза. —
Киев : Наук, думка, 1983.—204 с.
3. Kolin A. Evolution of ideas in electrophoretic developments — selected h i g h l i g h t s / /
Electrophoresis 82. — Berlin — New York: Walter de Gruyter and Co., 1 9 8 3 . - P . 3 - 4 8 .
4. A. c. 802310 СССР, C08 G 73/02. Синтетический амфолит-носитель для разделения
биополимеров методами изоэлектрофокусирования и изотахофореза / / А. П. Мурель,
Ю. Р. Сийгур / / Открытия. Изобретения. — 1981. — № 5. — С. 90.
5. Мурель А. П. Синтез улучшенных и недорогих амфолитов-носителей для изоэлектро-
фокусирования / /Известия АН ЭССР.— 1980.—29, № 3. — С . 201—209.
6. Шурхал А. В., Подогас А. ВАлтухов Ю. П. Генетический полиморфизм и редкие
варианты αι-антитрипсина в населении Москвы. Исследование с помощью изоэлек-
трофокусирования в сверхтонком г е л е / / Г е н е т и к а . — 1984.—20, № 12. — С. 2066—
2069.
7. Алтухов Ю. П., Хильчевская Р. И., Шурхал А. В. Уровни полиморфизма и гетеро-
зиготности русского населения Москвы: данные о 22 генных локусах, кодирующих
белки крови / ' / Там же. — 1981.—17, № 3. — С. 548—555.
Ин-т общ. генетики им. Н. И. Вавилова АН СССР, Получено 21.10.85
Москва
УДК 578.087.9
ИЗОТАХОФОРЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ БИОСИНТЕЗА СоА
КУЛЬТУРОЙ STREPTOMYCES LAVENDOFUSEUS
Α. X. Жагарс, А. А. Зелтиныы, Д. Я. Павловича,
Ю. А. Земитис, Я. Я. Дрегерис
Введение. Капиллярный аналитический изотахофорез (ИТФ) имеет ряд
важных преимуществ перед другими аналитическими электрофоретиче-
скими и хроматографическими методами. Изотахофоретическое разделе-
ние происходит в капилляре из непроводящего материала с внутрен-
ним диаметром 0,4—0,6 мм, іна одном конце которого находится непод-
вижный детектор, в капилляре устранен гидродинамический тюток и
нет опорной среды. Это дает высокую воспроизводимость анализа, воз-
можность проведения разделения при любых значениях рН от 2 до 12
и анализа белков без денатурации и предварительного обесцвечивания.
Применение в качестве электролитов таких популярных веществ, как
трис, β-аланин, глицин, НС1, СН3СООН и др., и малый расход мл)
разбавленных (0,01—0,001 М) растворов делают этот метод очень эко-
номичным. По времени анализа (10—20 мин), объему образца ( ~ 0 , 5 —
50 мкл) и количеству детектируемого вещества (10~9—Ю-10 моль) ка-
пиллярный ИТФ особенно пригоден в биохимии для исследования хода
и продуктов ферментативных реакций [1—3].
Проблема получения биологически активных веществ путем микро-
биологического синтеза связана с несколькими этапами исследования:
получение культуры продуцента, подбор наиболее подходящих условий
культивирования, выделения необходимого продукта. Очень важно на-
личие удобной и легко осуществимой методики анализа для контроля
биосинтеза.
Культура Streptomyces lavendofuseus является продуцентом кофер-
мента А (СоА): при росте стрептомицета на простой минеральной сре-
де без предшественников биосинтеза в культуральной жидкости выделя-
ется СоА [4]. По-видимому, у Streptomyces lavendofuseus существует
активный СоА-синтезирующий ферментный комплекс, способный осуще-
ствить биосинтез СоА из предшественников с высоким выходом, что не-
обходимо было проверить.
В работе с продуцентом СоА неизбежно возникает проблема опре-
деления кофермента. В практике обычно используют традиционные фер-
ментативные методы определения [5, 6], вполне пригодные в скрининг-
266 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 5 266
|