Development of the system for gene therapy of AIDS on the basis of antisense RNAs
Based on adeno-associated virus derived plasmid construct that are able to synthesize in cells antisense RNAs directed against key genes of HIV. Gematopoietic human cells carrying the created structure, acquired resistance to HIV infection, as evidenced by the reduction in infectious titer of HIV in...
Gespeichert in:
| Veröffentlicht in: | Вiopolymers and Cell |
|---|---|
| Datum: | 2013 |
| Hauptverfasser: | , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | English |
| Veröffentlicht: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
2013
|
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152999 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Development of the system for gene therapy of AIDS on the basis of antisense RNAs / A.D. Shved, O.P. Kukharenko // Вiopolymers and Cell. — 2013. — Т. 29, № 4. — С. 348-353. — Бібліогр.: 14 назв. — англ, укр. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-152999 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Shved, A.D. Kukharenko, O.P. 2019-06-13T12:12:07Z 2019-06-13T12:12:07Z 2013 Development of the system for gene therapy of AIDS on the basis of antisense RNAs / A.D. Shved, O.P. Kukharenko // Вiopolymers and Cell. — 2013. — Т. 29, № 4. — С. 348-353. — Бібліогр.: 14 назв. — англ, укр. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000829 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152999 616.98 : 578.828.6-097-08 Based on adeno-associated virus derived plasmid construct that are able to synthesize in cells antisense RNAs directed against key genes of HIV. Gematopoietic human cells carrying the created structure, acquired resistance to HIV infection, as evidenced by the reduction in infectious titer of HIV in cell culture. The resulting system of intracellular resistance to retrovirus can be seen as a model of gene therapy of AIDS. На базі аденоасоційованого вірусу отримано плазмідну конструкцію, здатну до синтезу в клітині антисенсових РНК, спрямованих проти ключових генів ВІЛ. Гемопоетичні клітині людини, що несуть в собі створену конструкцію, набувають стійкості до ВІЛ-інфекції, що засвідчує зниження інфекційного титру ВІЛ у культурі клітин. Одержану систему внутрішньоклітинної резистентності до ретровірусу можна розглядати як модель генотерапії СНІДу. На базе аденоассоциированного вируса получена плазмидная конструкция, способная синтезировать в клетке антисмысловые РНК, направленные против ключевых генов ВИЧ. Гемопоетические клетки человека, несущие созданную конструкцию, приобретают устойчивость к ВИЧ-инфекции, о чем свидетельствует снижение инфекционного титра ВИЧ в культуре клеток. Полученную систему внутриклеточной резистентности к ретровирусу можна рассматривать как модель генотерапии СПИДа. en Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Вiopolymers and Cell Reviews Development of the system for gene therapy of AIDS on the basis of antisense RNAs Створення системи генної терапії СНІДу на основі антисенсових РНК Создание системы генной терапии СПИДа на основе антисмысловых РНК Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Development of the system for gene therapy of AIDS on the basis of antisense RNAs |
| spellingShingle |
Development of the system for gene therapy of AIDS on the basis of antisense RNAs Shved, A.D. Kukharenko, O.P. Reviews |
| title_short |
Development of the system for gene therapy of AIDS on the basis of antisense RNAs |
| title_full |
Development of the system for gene therapy of AIDS on the basis of antisense RNAs |
| title_fullStr |
Development of the system for gene therapy of AIDS on the basis of antisense RNAs |
| title_full_unstemmed |
Development of the system for gene therapy of AIDS on the basis of antisense RNAs |
| title_sort |
development of the system for gene therapy of aids on the basis of antisense rnas |
| author |
Shved, A.D. Kukharenko, O.P. |
| author_facet |
Shved, A.D. Kukharenko, O.P. |
| topic |
Reviews |
| topic_facet |
Reviews |
| publishDate |
2013 |
| language |
English |
| container_title |
Вiopolymers and Cell |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Створення системи генної терапії СНІДу на основі антисенсових РНК Создание системы генной терапии СПИДа на основе антисмысловых РНК |
| description |
Based on adeno-associated virus derived plasmid construct that are able to synthesize in cells antisense RNAs directed against key genes of HIV. Gematopoietic human cells carrying the created structure, acquired resistance to HIV infection, as evidenced by the reduction in infectious titer of HIV in cell culture. The resulting system of intracellular resistance to retrovirus can be seen as a model of gene therapy of AIDS.
На базі аденоасоційованого вірусу отримано плазмідну конструкцію, здатну до синтезу в клітині антисенсових РНК, спрямованих проти ключових генів ВІЛ. Гемопоетичні клітині людини, що несуть в собі створену конструкцію, набувають стійкості до ВІЛ-інфекції, що засвідчує зниження інфекційного титру ВІЛ у культурі клітин. Одержану систему внутрішньоклітинної резистентності до ретровірусу можна розглядати як модель генотерапії СНІДу.
На базе аденоассоциированного вируса получена плазмидная конструкция, способная синтезировать в клетке антисмысловые РНК, направленные против ключевых генов ВИЧ. Гемопоетические клетки человека, несущие созданную конструкцию, приобретают устойчивость к ВИЧ-инфекции, о чем свидетельствует снижение инфекционного титра ВИЧ в культуре клеток. Полученную систему внутриклеточной резистентности к ретровирусу можна рассматривать как модель генотерапии СПИДа.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/152999 |
| citation_txt |
Development of the system for gene therapy of AIDS on the basis of antisense RNAs / A.D. Shved, O.P. Kukharenko // Вiopolymers and Cell. — 2013. — Т. 29, № 4. — С. 348-353. — Бібліогр.: 14 назв. — англ, укр. |
| work_keys_str_mv |
AT shvedad developmentofthesystemforgenetherapyofaidsonthebasisofantisensernas AT kukharenkoop developmentofthesystemforgenetherapyofaidsonthebasisofantisensernas AT shvedad stvorennâsistemigennoíterapíísnídunaosnovíantisensovihrnk AT kukharenkoop stvorennâsistemigennoíterapíísnídunaosnovíantisensovihrnk AT shvedad sozdaniesistemygennoiterapiispidanaosnoveantismyslovyhrnk AT kukharenkoop sozdaniesistemygennoiterapiispidanaosnoveantismyslovyhrnk |
| first_indexed |
2025-11-24T16:09:55Z |
| last_indexed |
2025-11-24T16:09:55Z |
| _version_ |
1850482818220556288 |
| fulltext |
UDC 616.98 : 578.828.6-097-08
Ство рен ня сис те ми ген ної те рапії СНІДу
на основі ан ти сен со вих РНК
А. Д. Швед, О. П. Ку ха рен ко
Iнсти тут мо ле ку ляр ної біології і ге не ти ки НАН Украї ни
Вул. Академіка За бо лот но го, 150, Київ, 03680, Украї на
adshved@email.ua
На базі аде но а соційо ва но го вірусу от ри ма но плазмідну ко нструкцію, здат ну до син те зу в клітині ан ти -
сен со вих РНК, спря мо ва них про ти клю чо вих генів ВІЛ. Ге мо по е тичні клітині лю ди ни, що не суть в собі
ство ре ну ко нструкцію, на бу ва ють стійкості до ВІЛ-інфекції, що засвідчує зни жен ня інфекційно го
тит ру ВІЛ у куль турі клітин. Одер жа ну сис те му внутрішньоклітин ної ре зис тен тності до рет рові-
русу мож на роз гля да ти як мо дель ге но те рапії СНІДу.
Клю чові сло ва: ВІЛ-СНІД, аде но а соційо ва ний вірус, ан ти сен сові РНК, ген на те рапія, ге мо по е тичні
клітині лю ди ни.
Роз ви ток ме тодів сек ве ну ван ня та штуч но го син те -
зу нук леї но вих кис лот, відкрит тя фер ментів рест-
рикції і зво рот ної транс крипції, роз роб ка техніки
поліме раз ної лан цю го вої ре акції (ПЛР), а та кож роз-
крит тя при род но го ме ханізму ан ти сен со вої ре гу -
ляції експресії генів відігра ли ре во люціонізу валь ну
роль у до корінній зміні уяв лень щодо мож ли вості
мо ле ку ляр ної біології у вирішенні на й ак ту альні-
шої про бле ми всесвітньої на уки – ке ро ваній ре гу -
ляції ген ної експресії. На у ко во-прак тичні за хо ди в
по до ланні цієї про бле ми на бу ли цілес пря мо ва но го
ха рак те ру і роз ви ва ли ся в двох на прям ках: штуч но -
го син те зу ан ти сен со вих оліго нук ле о тидів і ство -
рен ня сис тем внутрішньоклітин но го біосин те зу ан-
ти сен со вих РНК-транс криптів, ком пле мен тар них
пев ним ділян кам мРНК об ра но го гена-мішені. Пра -
цю ю чи в меж ах української про гра ми Національ но -
го Комітету бо роть би зі СНІДом, у 90-ті роки ми ну -
ло го століття ми теж свої зу сил ля ске ру ва ли у цьо му
на прям ку.
Загаль на стра тегія, ви роб ле на за кілька років до-
свіду ви ко рис тан ня асРНК для при гнічен ня реп ро -
дукції вірусів, пе ре дба чає де які певні пра ви ла ви бо -
ру ге на-мішені в меж ах усьо го вірус но го ге но му [1,
2]. Те орія й ек спе ри мен ти по ка зу ють, що в більшо-
сті ви падків ефек тивність асРНК у бло ку ванні від-
повідної мРНК за ле жить від їхньо го мо ляр но го спів-
відно шен ня в клітині про тя гом експресії [2, 3]. От-
же, мішень у клітині має бу ти низ ь ко копійною, щоб
існу ва ла мож ливість ство рен ня над лиш ку ан ти сен-
со вих транс криптів над ко ду ю чи ми вірус ни ми
мРНК. Саме то му дію асРНК доцільно спря мо ву ва ти
на ранні вірусні ге ни, що ко ду ють ре гу ля торні фак -
то ри, копійність мРНК яких не знач на. Це над асть
більше шансів до сяг ти над лиш ку асРНК і впли ну ти
на кіне ти ку її взаємодії з мРНК-мішен ню на ко ристь
утво рен ня гібри ду сенс–ан ти сенс.
Ме то дом ком п’ю тер но го аналізу опубліко ва них
по слідов нос тей ба гать ох ізо лятів ВІЛ-1 за мішень для
ан ти сен со во го впли ву об ра но іншу об ласть – ек зон
TatARev з флан га ми, де пе ре кри ваються рам ки зчи -
ту ван ня ранніх ре гу ля тор них і пізніх струк тур них
вірус них білків. Виз на че на лан ка ВІЛ-ге но му ко дує
життєво важ ливі для про дук тив ної інфекції віру су
ре гу ля торні білки та клю чові ге не тичні сиг на ли і є
кон сер ва тив ною для більшості ізо лятів ВІЛ-1.
348
ISSN 0233–7657. Biopolymers and Cell. 2013. Vol. 29. N 4. P. 348–353 doi: 10.7124/bc.000829
Institute of Molecular Biology and Genetics, NAS of Ukraine, 2013
349
СТВО РЕН НЯ СИС ТЕ МИ ГЕН НОЇ ТЕ РАПІЇ СНІДУ НА ОСНОВІ АН ТИ СЕН СО ВИХ РНК
Нас туп ним кро ком у ко нстру ю ванні ге на асРНК
став вибір про мо то ру, який має на прав ля ти їхній
син тез у клітині. Бу ло виріше но, що для експресії
про тивірус них ан ти сен со вих транс криптів доціль-
ним бу де ре алізу ва ти при нцип зво рот но го зв’яз ку
між ан ти сен со вим ге ном і ге но мом ВІЛ-1. Це мож -
ли во, як що син тез асРНК бу де на прав ле ний про мо -
то ром ВІЛ, який ак ти вується ранніми про дук та ми
ВІЛ-ге но му, а са ме – транс актив а то ром Tat. Тоді рі-
вень експресії асРНК за ле жа ти ме від експресії най-
важ ливіших генів ВІЛ-1 (рис. 1), тоб то у клітині має
вста но ви ти ся стан рівно важ ної про тидії, де асРНК
кон тро лю ють рівень клю чо вих вірус них про дуктів
на підпо ро го во му рівні та бло ку ють тим амим пе -
рехід вірус ної інфекції до про дук тив ної фа зи. По-
дібний при нцип за сто су ван ня влас ної транс крип-
ційної сис те ми про мо то ру ВІЛ уже бу ло із знач ним
успіхом ви ко рис та но в інших ла бо ра торіях [4] для
внутрішньоклітин ної експресії де я ких генів з ан ти-
ВІЛ-ак тивністю або над е кспресії різних ре комбі-
на нтних генів з не спе цифічною ан тивірус ною ак -
тивністю (інтер фе ро ни та ін.). У відповідності до
виз на че них ознак бу ло спро ек то ва но бе зен хан сер -
ний про мо тор ВІЛ з по трійним тан де мом еле ментів
SP-1 транс крипційних фак торів та TAR-еле мен том
для взаємодії з ВІЛ-транс актив а то ром Tat. Та кий
про мо тор у не тран сфор мо ваній клітині є сильні-
шим за на тив ний, оскільки не піддається впли вам
негатив них клітин них фак торів. Сек ве ну ван ня ство-
ре но го ре комбіна нтно го про мо то ру по ка за ло, що
його по слідовність відповідає транс крипційній оди-
ниці ВІЛ з ТАТА-ініціато ром, основ ни ми еле мен -
та ми ініціації транс крипції SP-1 та TAR- еле мен том
(рис. 2).
За век тор ми об ра ли аде но а соційо ва ний вірус
(ААВ) лю ди ни, пе ре ва ги яко го висвітле но у низці
Рис. 1. Схе ма внутрішньо-
клітин ної ре гу ляції транс -
крипції ан ти сен со вих РНК
про ти Tat/Rev мРНК ВІЛ-
1 та ме ханізм не га тив но го
зво рот но го зв’яз ку з ре гу -
ля тор ни ми ге на ми вірусу.
У верхній час тині на ве де-
но ан ти сен со вий ген, у ниж-
ній – ге ном провірусу
ВІЛ-1 [4]
публікацій [5, 6]. Крім то го, про ек тний век тор по ви-
нен не сти се лек тив ний мар кер для відбо ру трансфі-
ко ва них клітин. Для цьо го тра диційно об ра но ген
не оміцин фос фот ран сфе ра зи, що за без пе чує стій-
кість до аміногліко зид них ан тибіот иків nеоr і надає
мож ливість вес ти се лекцію трансфіко ва них клітин
на се ре до вищі з ан тибіот и ком G418. Для термінації
тра нскрипції асРНК на ми ви ко рис та но влас ний тер-
міна тор век тор но го ААВ.
Ство ре ну ан ти сен со ву ко нструкцію pHIV-as-
neo пред став ле но на рис. 3. Осно вою мо ле ку ляр но -
го век то ра є ге ном ААВ, по збав ле ний генів струк -
тур них білків, та кло но ва ний у ген аmрr плазміди
pBR322. На місце генів струк тур них білків у век тор
ААВ кло но ва но се лек тив ний ген nеоr, а та кож
ВІЛ-ан ти сен со вий ген. За транс фекції цієї плазміди
у кліти ни по слідовність ДНК, флан ко ва на кінце ви -
ми по вто ра ми (ITR ААВ), по вин на стабільно інте-
гру ва ти в хро мо со му ге мо по е тич них клітин лю ди -
ни. Тра нскрипція асРНК з цієї ре комбіна нтної кон-
струкції за без пе чується кло но ва ним і по збав ле ним
ен хан се ра влас ним про мо то ром ВІЛ-1.
Сек ве ну ван ня кло но ва но го фраг мен та по ка за -
ло, що йо го по слідовність відповідає транс крип-
ційній оди ниці ВІЛ з ТАТА-ініціато ром, основ ни -
ми еле мен та ми ініціації транс крипції SP-1 та TAR-
еле мен том, ефек тивність яко го здат на підви щу ва -
ти ся білком Tat че рез TAR-еле мент. Кон сти ту тив на
експресія у цій ко нструкції по си ле на роз та шо ва -
ним ви ще про мо то ром Тn5. Та ким чи ном, асРНК
син те зується як скла до ва час ти на мРНК ге на nео у
5'-не ко ду ючій йо го час тині. Окрім ан ти сен со во го
ме ханізму при гнічен ня реплікації ВІЛ, який за без -
пе чує ство ре ний ан ти сен со вий ген, мож на сподіва -
ти ся на до дат ко вий вплив на ВІЛ з бо ку білка Rep
ААВ, про що в літе ра турі вже сповіща ло ся [7–10],
та еле мен та TAR, що та кож зга дується в публікаці-
ях як ви ко нав ча лан ка ме ханізму бло ку реплікації
ВІЛ під на звою TAR-decoy [11, 12].
Тес ту ван ня чут ли вості інтак тних ге мо по е тич -
них клітин ембріональ ної печінки лю ди ни до ВІЛ-
інфекції по ка за ло, що з 25 дослідже них зразків клі-
тин, ізоль о ва них з різних ембріонів, ли ше у двох
(зраз ки 7 і 10) син тез ан ти ге ну р24 (рис. 4, а) та тит -
ри інфекційно го віру су (рис. 4, б) бу ли порівняль -
ни ми з ци ми по каз ни ка ми вірус ної реп ро дукції у
стан дартній куль турі клітин МТ-4, яку тра диційно
ви ко рис то ву ють в ек спе ри мен тах з виділен ня і тит -
350
ШВЕД А. Д. , КУ ХА РЕН КО О. П.
BamHI HindIII
GGAtc agggaggcgt/…..…./gcttaagcctcaataaagctt
165 bp XbaI
Sal I
pTN5
+1
386 bp
HIV antisense fragment
BamHI
Pst ISP1 elements TAR
TATA
PolyA (AAV)
neor
Рис. 2. Тра нскрипційна оди -
ни ця ство ре но го ан ти сен со-
вого гена. 165-нук ле о тид ний
фраг мент – бе зен хан сер ний
про мо тор LTR ВІЛ-1 із сай -
та ми зв’я зу ван ня транс крип-
ційних фак торів SP-I, ТАТА-
бок сом та TAR-еле мен том
про мо то ру ВІЛ; +1 – старт
транс крипції; 386-нук лео-
тид ний фраг мент – послі-
довність ге но му ВІЛ, кло но -
ва на в ан ти сен совій орієнта-
ції сто сов но про мо то ру ВІЛ
[4]
Рис. 3. Схе ма век то ра pHIV-as-neo, що експре сує про ти-ВІЛ
асРНК
ру ван ня ВІЛ. У на ших дослідах інфекційний титр
віру су в 12-му зраз ку був ни жчим за всі інші, а в
11-му – при сут ності віру су не ви яв ле но зовсім, що
свідчить про знач но ви ра женішу або цілко ви ту
стійкість цих клітин до ВІЛ-інфекції. У куль ту рах
клітин з реш ти ембріональ них зразків інфекційні
по каз ни ки бу ли до сить ви со ки ми – інко ли на 2 lg
ID50 пе ре вер шу ва ли титр ВІЛ у кліти нах МТ-4 (рис.
4, б, зраз ки 2, 6).
Чис ленні літе ра турні дже ре ла свідчать про те,
що по ряд з пацієнта ми, у яких спос терігається ти -
по вий темп роз вит ку ВІЛ-інфекції, тоб то бур хли -
вий пе рехід до стадії СНІДу, існу ють і такі, у кот -
рих цей про цес про хо дить ду же повільно, з-поміж
них не ве ли ка час ти на за ли шається здо ро вою, не -
зва жа ю чи на ми нулі, нерідко не одно ра зові, ви пад -
ки інфіку ван ня. Ви яв лені в на ших дослідах не одна -
кові по каз ни ки стійкості до ВІЛ різних зразків гемо-
по е тич них клітин де що на га ду ють роз поділ клініч-
них темпів роз вит ку інфекції, хо ча точ но го їхньо го
збігу очіку ва ти не вар то че рез відсутність у на шо -
му ек спе ри менті in vitro ком по нентів імун но го за -
хис ту мак ро ор ганізму. Однак мож на ствер джу ва ти,
що одер жані дані на клітин но му рівні опо се ред ко -
ва но підтвер джу ють існу ван ня при род них ме ханіз-
мів стійкості до ВІЛ-інфекції.
Ре зуль та ти віру со логічних досліджень пред став-
ле но на рис. 5. У кліти нах, трансфіко ва них век тор -
ною плазмідою pDL52-91neo, яка не се по слідовно-
сті Rep-білка ААВ, але не має ан ти сен со во го фраг-
мен та, за се лек тив них умов куль ти ву ван ня (з ан -
тибіот и ком G418) відбу вається при гнічен ня реп ро -
дукції ВІЛ на 15–25 %. Ефект інгібу ван ня репліка-
ції віру су в да но му досліді (кон троль век то ра) мо же
бу ти зу мов ле ний дією са ме Rep-білка ААВ. У конт-
роль но му ек спе ри менті, де в кліти ни трансфіку ва ли
плазміду, яка містить ли ше ITR ААВ (тоб то не здат-
ну син те зу ва ти Rep-білок ААВ), помітно го впли ву
на ВІЛ-інфекцію не відміче но. Це опо се ред ко ва но
підтвер джує дані [7–10] про здатність ААВ-специ-
фічно го Rep-білка при гнічу ва ти реп ро дукцію ВІЛ.
При виз на ченні тит ру віру су і про дукції йо го ан-
ти ге ну р24 у по пу ляції клітин, трансфіко ва них ан -
ти сен со вою плазмідою і куль ти во ва них за при сут-
351
СТВО РЕН НЯ СИС ТЕ МИ ГЕН НОЇ ТЕ РАПІЇ СНІДУ НА ОСНОВІ АН ТИ СЕН СО ВИХ РНК
2 6 10 11 12 131 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
0
1,6
3,2
4,8
6,4
103
0
4
5
6
3
2
1
Рис. 4. Реп ро дукція ВІЛ-
1 у ге мо по е тич них кліти -
нах ембріональ ної печін-
ки людини: 1–12 – но ме -
ри куль тур з різних емб-
ріонів; 13 – клітини лінії
МТ-4. Для ілюс трації на -
ве де но ти пові дані [14]
Рис. 5. Вплив ан ти сен -
со вої век тор ної конст-
рукції на реп ро дукцію
ВІЛ у ге мо по е тич них
кліти нах: А – за при сут -
ності ан тибіот и ка G-
418; Б – без ан тибіот и ка
(а – не трансфіко вані клі-
тини; б – клітини, транс-
фіко вані век тор ною кон-
струкцією pDL52-91neo;
в – клітини, трансфіко -
вані ан ти сен со вою век -
тор ною ко нструкцією
pHIV-as-neo) [4]
ності се лек тив но го ан тибіот и ка, спос теріга ли змен-
шен ня про ду ку ван ня ан ти ге ну на 66 % і інфекцій-
но го тит ру ВІЛ на 99 % порівня но з куль ту ра ми, що
не не суть ан ти сен со вих ко нструкцій. Зни жен ня ін-
фекційно го тит ру віру су (на два по ряд ки) є пе ре кон-
ли вим по каз ни ком інгібітор ної дії, про те рівень
син те зу вірус спе цифічно го білка р24 у на ших екс-
пе ри мен тах мож на бу ло б оціню ва ти з мен шою мі-
рою оптимізму. Однак аналіз от ри ма них да них свід-
чить про те, що ні в пла ну ванні ек спе ри мен ту, ні в
по бу дові ге не тич них ко нструкцій та їхніх вип ро бу -
ван нях суттєвих по ми лок ми не при пус ти ли. Аргу-
менти на ко ристь остан ньо го твер джен ня мож на ви-
клас ти в на ступ них мірку ван нях.
Най пе ре кон ливішим до ка зом про ти-ВІЛ ефек -
тив ності ство ре ної ан ти сен со вої ко нструкції є са ме
по каз ник суттєво го змен шен ня тит ру інфекційно го
віру су в трансфіко ва них нею кліти нах. АсРНК-
транс крип ти в роз роб леній на ми сис темі спря мо -
вані на при гнічен ня експресії ре гу ля тор них білків
Tat і Rev ВІЛ, які, про що вже зга ду ва ло ся ви ще,
яв ля ють со бою кри тичні лан ки у циклі реплікації
віру су. Тра диційно ужи ва ний ме тод де текції вірус-
ної інфекції за рівнем син те зу білка р24 у вип ро бу -
ван нях ство ре ної на ми ко нструкції не мо же відоб -
рази ти ре аль ної кар ти ни інфекційно го про це су, ос-
кільки до ме ханізму біосин те зу цьо го білка во на
прямо го відно шен ня не має. Білок р24 – про дукт ге -
на gag – є струк тур ним гру пос пе цифічним білком,
що бу дує об олон ку нук ле ої ду ВІЛ і син те зується у
ве ликій кількості.
Ре алізація функцій ство ре ної на ми ко нструкції
відбу вається у відповідь на по я ву в клітині ВІЛ, а
са ме – йо го ран ньо го про дук ту білка Tat. Але цей
білок ак ти вує ще й транс крипцію вірус но го ге но му,
внаслідок чо го за пус кається син тез і інших вірус -
них білків, з-поміж яких про дук ти ге на gag. Транс-
крипція влас но го ге но му ВІЛ при пи няється че рез
на ко пи чен ня у клітині асРНК, але син тез р24 про -
дов жу ва ти меть ся на РНК-транс крип тах, які ви ник -
ли в пер вин ний період вірус ної інфекції, до їхньої
по вної дег ра дації. Оскільки збірка віріонів про хо -
дить на знач но пізніших стадіях інфекційно го про-
це су і виз на чається на явністю всіх струк тур них ком -
понентів, син тез яких не одмінно за ле жить і від без -
пе реш код но го функціону ван ня ре гу ля тор них ме -
ханізмів, по шкод жен ня останніх ан ти сен со вим впли-
вом відби вається і на фор му ванні інфекційних ві-
рус них час ток. На на шу дум ку, са ме та кий пе ребіг
подій віддзер ка лю ють одер жані на ми дані: по каз -
ни ки ви хо ду зріло го (інфекційно го) ВІЛ у кліти нах,
трансфіко ва них ан ти сен со вою ко нструкцією, ви яв-
ляють ся у знач но мен ших рівнях, ніж по каз ни ки вмі-
сту вірус спе цифічно го ан ти ге ну p24.
Вар то за зна чи ти, що в кліти нах, трансфіко ва -
них як ан ти сен со вою плазмідою, так і кон троль ни -
ми век тор ни ми плазміда ми, у разі куль ти ву ван ня
без се лек тив но го тис ку суттєво го при гнічен ня ві-
рус ної реп ро дукції не відміче но (рис. 5, в). Це зу -
мов ле но тим, що ли ше 3–5 % по пу ляції інфіко ва -
них клітин за без пе чені ан ти сен со вим внутрішньо-
клітин ним імуніте том. Більша час ти на клітин по -
пу ляції не трансфіко ва на, і за відсут ності ан ти ме та-
боліту (аміногліко зид но го ан тибіот и ка) зберігає нор-
маль ний рівень життєздат ності, а відтак і зви чай ну
чут ливість до ВІЛ-інфекції. За умов се лек тив но го
тис ку G418 час ти на клітин ги не, у час ти ни – ме та -
болізм при гніче ний: во ни або ма ло при датні для
підтрим ки вірус но го реп ро дук тив но го цик лу, або
цей про цес у них вза галі не мож ли вий.
Вра хо ву ю чи до сяг нуті по зи тивні ре зуль та ти з
при гнічен ня in vitro реплікації ВІЛ у ге мо по е тич -
них кліти нах лю ди ни, які не суть ан ти сен сові век -
торні ко нструкції, є підста ва очіку ва ти, що за транс-
фузії та ких клітин хво ро му на СНІД во ни візьмуть
на се бе функції імун но го за хис ту організму. Мож -
на при пус ти ти та кож, що при за пов ненні кров ’я но -
го рус ла стійки ми до ВІЛ на щад ка ми транс план то -
ва них стов бу ро вих кро вот вор них клітин і клітин-
попе ред ників кров ре ципієнта бу де по сту по во звіль-
ня ти ся від збуд ни ка.
З огля ду на на явність у трансфіко ва них кліти нах
де я ко го вмісту вірус но го білка р24 (та не одмінно й
інших білків), а та кож слідо во го рівня по я ви зрілих
віріонів, мож на сподіва ти ся, що про тя гом та кого
кон троль о ва но го інфекційно го про це су в організмі
відбу ва ти меть ся на пра цю ван ня про тивірусних ан -
титіл, яке спри я ти ме фор му ван ню влас но го імунно го
захис ту. Якщо пе ре дба чені ефек ти ма ти муть місце в
організмі пацієнта, мож на очіку ва ти, що транс план-
тація стійких до ВІЛ ге мо по е тич них клітин про дов -
жить йо му жит тя або хо ча б по лег шить страж дан -
352
ШВЕД А. Д. , КУ ХА РЕН КО О. П.
ня. Підтвер ди ти (або спрос ту ва ти) вис лов лені ви ще
при пу щен ня мо жуть ре зуль та ти клінічних вип ро бу -
вань ство ре ної сис те ми для ген ної те рапії СНІДу.
Отже, ре зуль та том про ве де них досліджень є
роз роб ка сис те ми для ген ної те рапії СНІДу, яка яв -
ляє со бою ге мо по е тичні кліти ни лю ди ни з на бу тим
внутрішньоклітин ним імуніте том про ти ВІЛ. Осно-
вою та ко го імуніте ту є мо ле ку ляр на ге не тич на кон-
струкція, по бу до ва на з ви ко рис тан ням ААВ-век то -
ра, яка не се в собі похідну від LTR ВІЛ транс крип-
ційну оди ни цю, здат ну до інду ко ва но го син те зу в
клітині асРНК, спря мо ва них про ти клю чо вих генів
ВІЛ tat і rev. Інду ку ван ня син те зу ан ти сен со вих
транс криптів здійснюється ВІЛ-спе цифічни ми біл-
ка ми в ранній період після інтер венції збуд ни ка в
кліти ну. Ство ре ну ан ти сен со ву сис те му мож на ви -
ко рис та ти для про ве ден ня под аль ших доклінічних
вип ро бу вань.
Ре зуль та ти, одер жані при ви ко нанні пред став -
ле них досліджень, ста ли осно вою кан ди да тської і
док то рської дис ер тацій, висвітлені в шес ти публі-
каціях та пред став лені на трьох на уко вих фо ру мах.
A. D. Shved, O. P. Kukharenko
Development of the system for gene therapy of AIDS
on the basis of antisense RNAs
Institute of Molecular Biology and Genetics, NAS of Ukraine
150, Akademika Zabolotnoho Str., Kyiv, Ukraine, 03680
Summary
Based on adeno-associated virus derived plasmid construct that are ab-
le to synthesize in cells antisense RNAs directed against key genes of
HIV. Gematopoietic human cells carrying the created structure, acqui-
red resistance to HIV infection, as evidenced by the reduction in infec-
tious titer of HIV in cell culture. The resulting system of intracellular
resistance to retrovirus can be seen as a model of gene therapy of AIDS.
Keywords: HIV-AIDS, adeno-associated virus, antisense RNAs,
gene therapy, gematopoietic human cells.
А. Д. Швед, А. П. Ку ха рен ко
Соз да ние сис те мы ген ной те ра пии СПИДа на осно ве
ан тис мыс ло вых РНК
Ре зю ме
На базе аде но ас со ци и ро ван но го ви ру са по лу че на плаз мид ная конст-
рук ция, спо соб ная син те зи ро вать в клет ке ан тис мыс ло вые РНК,
на прав лен ные про тив клю че вых ге нов ВИЧ. Ге мо по е ти чес кие
клет ки че ло ве ка, не су щие со здан ную ко нструк цию, при об ре та -
ют устой чи вость к ВИЧ-ин фек ции, о чем сви де т ельству ет сни -
же ние ин фек ци он но го тит ра ВИЧ в куль ту ре кле ток. По лу чен-
ную сис те му внут рик ле точ ной ре зис тен тнос ти к рет ро ви ру су
мож на рас смат ри вать как мо дель ге но те ра пии СПИДа.
Клю че вые сло ва: СПИД-ВИЧ, аде но ас со ци и ро ван ный ви рус,
ан тис мыс ло вые РНК, ген ная те ра пия, ге мо по е ти чес кие клет ки
че ло ве ка.
REFERENCES
1. Baltimore D. Intracellular immunization // Nature.–1988.–335,
N 6189.–P. 395–396.
2. Colman A. Antisense strategies in cell and developmental biolo-
gy // J. Cell Sci.–1990.–97, Pt 3.–P. 399–409.
3. Yu M., Poeschla E., Wong-Staal F. Progress toward gene thera-
py for HIV infection // Gene Ther.–1994.–1, N 1.–P. 13–26.
4. Mosca J. D., Ritchey D. W, d’Arcy L. A., Burke D. S., The Henry
M. Jackson. Expression of anti-HIV compounds directed from
the HIV-LTR: a potential gene therapy for HIV infected indi-
viduals // 6th Int. AIDS Conf.–San Francisco, 1990.–P. 107.
5. Muzyczka N. Use of adeno-associated virus as a general transduc-
tion vector for mammalian cells // Curr. Top. Microbiol. Immu-
nol.–1992.–158.–P. 97–129.
6. Nahreini P., Woody M. J., Zhou S. Z., Srivastava A. Versatile ade-
no-associated virus 2-based vectors for constructing recombi-
nant virions // Gene.–1993.–124, N 2.–P. 257–262.
7. Sczakiel G., Oelze I., Rittner K. Microinjection: a technique to
study inhibition of HIV-1 replication mediated by antisense
RNA and parvovirus genes // Biotechnology applications of mic-
roinjection, microscopic imaging, and fluorescence / Eds P. H.
Bach et al.–New York: Plenum Press, 1993.–P. 1–10.
8. Antoni B. A., Rabson A. B., Miller I. L., Trempe J. P., Chejanovs-
ky N., Carter B. J. Adeno-associated virus Rep protein inhibits
human immunodeficiency virus type 1 production in human
cells // J. Virol.–1991.–65, N 1.–P. 396–404.
9. Sczakiel G., Oppenlander M., Rittner K., Pawlita M. Tat- and Rev-
directed antisense RNA expression inhibits and abolishes repli-
cation of human immunodeficiency virus type 1: a temporal ana-
lysis // J. Virol.–1992.–66, N 9.–P. 5576–5581.
10. Rittner K., Heilbronn R., Kleinschmidt J. A., Sczakiel G. Adeno-as-
sociated virus type 2-mediated inhibition of human immunodefi-
ciency virus type 1 (HIV-1) replication: involvement of p78rep/
p68rep and the HIV-1 long terminal repeat // J. Gen. Virol.–
1992.–73, Pt 11.–P. 2977–2981.
11. Sullenger B. A., Gallardo H. F., Ungers G. E., Gilboa E. Overex-
pression of TAR sequences renders cells resistant to human
immunodeficiency virus replication // Cell.–1990.–63, N 3.–
P. 601–608.
12. Graham G. J., Maio J. J. RNA transcripts of the human immu-
nodeficiency virus transactivation response element can inhibit
action of the viral transactivator // Proc. Natl Acad. Sci. USA.–
1990.–87, N 15.–P. 5817–5821.
Received 02.04.13
353
СТВО РЕН НЯ СИС ТЕ МИ ГЕН НОЇ ТЕ РАПІЇ СНІДУ НА ОСНОВІ АН ТИ СЕН СО ВИХ РНК
|