Некоторые ультраструктурные аспекты прямой инъекции липосом, содержащих плазмидную ДНК, в печень мыши

Методом просвечивающей электронной микроскопии исследована реакция клеток печени на прямое введение в составе липосом бактериальной плазмиды, кодирующей синтез β-галактозидазы. Через сутки после инъекции в гепатоцитах отмечены гипертрофия элементов аппарата Гольджи и структурные изменения митохондри...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	1990
Hauptverfasser:	Билич, К.М., Иродов, Д.М., Кордюм, В.А.
Format:	Artikel
Sprache:	Russian
Veröffentlicht:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1990
Schriftenreihe:	Биополимеры и клетка
Online Zugang:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153020
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Некоторые ультраструктурные аспекты прямой инъекции липосом, содержащих плазмидную ДНК, в печень мыши / К.М. Билич, Д.М. Иродов, В.А. Кордюм // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 1. — С. 73-82. — Бібліогр.: 14 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-153020
record_format	dspace
spelling	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1530202025-02-09T22:54:26Z Некоторые ультраструктурные аспекты прямой инъекции липосом, содержащих плазмидную ДНК, в печень мыши Деякі ультраструктурні аспекти прямий ін'єкції ліпосом, що містять плазмідну ДНК, в печінку миші Some ultrastructural aspects of direct injection of liposomes with inclosed plasmid DNA into mice liver Билич, К.М. Иродов, Д.М. Кордюм, В.А. Методом просвечивающей электронной микроскопии исследована реакция клеток печени на прямое введение в составе липосом бактериальной плазмиды, кодирующей синтез β-галактозидазы. Через сутки после инъекции в гепатоцитах отмечены гипертрофия элементов аппарата Гольджи и структурные изменения митохондрии часть из которых носит обратимый характер. С помощью методики, оптимально выявляющей фосфолипиды, предпринята попытка исследовать ультратонкое строение вводимых липосом, а также их распределение в печени. Через 5 мин после инъекции /липосомы располагались у ядер гепатоцитов – вблизи поровых комплексов и в перинуклеарном пространстве. Эта локализация отмечалась и через сутки. Выявление липсом в ткани, богатой эндогенными липидами, сопряжено с рядом трудностей, которые обсуждаются. Методом просвічувальної електронної мікроскопії досліджено реакцію клітин печінки на пряме введення у складі ліпосом бактерійної плазміди, що кодує синтез β-галактозидази. Через добу після ін'єкції у гепатоцитах відмічено гіпертрофію елементів апарату Гольджі та структурні зміни мітохондрії, частина з яких є оборотною. За допомогою методики, що оптимально виявляє фосфоліпіди, зроблено спробу дослідити ультратонку будову введених ліпосом, а також їхній розподіл у печінці. Через 5 хв після ін'єкції ліпосоми розташовувалися поблизу ядер гепатоцитів – поблизу порових комплексів і в перинуклеарному просторі. Таку локалізацію реєстрували і через 1 добу. Виявлення ліпосом у тканині, багатій на ендогенні ліпіди, пов'язане з низкою труднощів, які наразі обговорюються. After direct injection of liposomes with inclosed bacterial b-galactosidase gene into mice liver the main ultrastructural changes have been observed in mitochondria and Goldgi region. Liposomes themselves were investigated by transmission electron microscopy of ultrathin sections. An attempt was made to elucidate their distributon in mice liver after direct injection. Авторы выражают благодарность Н. В. Белицер и сотрудникам руководимой ею лаборатории за методическую и консультативную помощь. 1990 Article Некоторые ультраструктурные аспекты прямой инъекции липосом, содержащих плазмидную ДНК, в печень мыши / К.М. Билич, Д.М. Иродов, В.А. Кордюм // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 1. — С. 73-82. — Бібліогр.: 14 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00024B https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153020 577.352.27:57.086.3 ru Биополимеры и клетка application/pdf Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
description	Методом просвечивающей электронной микроскопии исследована реакция клеток печени на прямое введение в составе липосом бактериальной плазмиды, кодирующей синтез β-галактозидазы. Через сутки после инъекции в гепатоцитах отмечены гипертрофия элементов аппарата Гольджи и структурные изменения митохондрии часть из которых носит обратимый характер. С помощью методики, оптимально выявляющей фосфолипиды, предпринята попытка исследовать ультратонкое строение вводимых липосом, а также их распределение в печени. Через 5 мин после инъекции /липосомы располагались у ядер гепатоцитов – вблизи поровых комплексов и в перинуклеарном пространстве. Эта локализация отмечалась и через сутки. Выявление липсом в ткани, богатой эндогенными липидами, сопряжено с рядом трудностей, которые обсуждаются.
format	Article
author	Билич, К.М. Иродов, Д.М. Кордюм, В.А.
spellingShingle	Билич, К.М. Иродов, Д.М. Кордюм, В.А. Некоторые ультраструктурные аспекты прямой инъекции липосом, содержащих плазмидную ДНК, в печень мыши Биополимеры и клетка
author_facet	Билич, К.М. Иродов, Д.М. Кордюм, В.А.
author_sort	Билич, К.М.
title	Некоторые ультраструктурные аспекты прямой инъекции липосом, содержащих плазмидную ДНК, в печень мыши
title_short	Некоторые ультраструктурные аспекты прямой инъекции липосом, содержащих плазмидную ДНК, в печень мыши
title_full	Некоторые ультраструктурные аспекты прямой инъекции липосом, содержащих плазмидную ДНК, в печень мыши
title_fullStr	Некоторые ультраструктурные аспекты прямой инъекции липосом, содержащих плазмидную ДНК, в печень мыши
title_full_unstemmed	Некоторые ультраструктурные аспекты прямой инъекции липосом, содержащих плазмидную ДНК, в печень мыши
title_sort	некоторые ультраструктурные аспекты прямой инъекции липосом, содержащих плазмидную днк, в печень мыши
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1990
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153020
citation_txt	Некоторые ультраструктурные аспекты прямой инъекции липосом, содержащих плазмидную ДНК, в печень мыши / К.М. Билич, Д.М. Иродов, В.А. Кордюм // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 1. — С. 73-82. — Бібліогр.: 14 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT biličkm nekotoryeulʹtrastrukturnyeaspektyprâmoiinʺekciiliposomsoderžaŝihplazmidnuûdnkvpečenʹmyši AT irodovdm nekotoryeulʹtrastrukturnyeaspektyprâmoiinʺekciiliposomsoderžaŝihplazmidnuûdnkvpečenʹmyši AT kordûmva nekotoryeulʹtrastrukturnyeaspektyprâmoiinʺekciiliposomsoderžaŝihplazmidnuûdnkvpečenʹmyši AT biličkm deâkíulʹtrastrukturníaspektiprâmiiínêkcíílíposomŝomístâtʹplazmídnudnkvpečínkumiší AT irodovdm deâkíulʹtrastrukturníaspektiprâmiiínêkcíílíposomŝomístâtʹplazmídnudnkvpečínkumiší AT kordûmva deâkíulʹtrastrukturníaspektiprâmiiínêkcíílíposomŝomístâtʹplazmídnudnkvpečínkumiší AT biličkm someultrastructuralaspectsofdirectinjectionofliposomeswithinclosedplasmiddnaintomiceliver AT irodovdm someultrastructuralaspectsofdirectinjectionofliposomeswithinclosedplasmiddnaintomiceliver AT kordûmva someultrastructuralaspectsofdirectinjectionofliposomeswithinclosedplasmiddnaintomiceliver
first_indexed	2025-12-01T13:59:16Z
last_indexed	2025-12-01T13:59:16Z
_version_	1850314652148301824
fulltext	5. Vannice J. L., Levinson A. D. P roper t i es of the h u m a n hepat i t i s B v i rus enhancer : posi t ion ef fec ts and cell- type nonspecif ic i ty // J. Virol.— 1988,— 62, N 4 — P . 1305— 1313. 6. Козловская Т. Л1, Пумпен П. П. Структура и экспрессия гена поверхностного ан- тигена вируса гепатита В ч е л о в е к а / / М о л е к у л я р . биология.— 1986.— № 4.—• С. 884—901. 7. Shahid J., Aleetn S. The h u m a n hepat i t i s В v i rus enhancer requires t r a n s - a c t i n g cellu- lar f ac to r ( s ) for a c t i v i t y / / М о ї . and Cell. Biol.— 1986 — 6, N 2 , — P . 710—715. Ин-т молекуляр. биологии и генетики АН УССР, Киев Получено 24.07.89 УДК 577.352.27:57.086.3 К. М. Билич, Д. М. Иродов, В. А. Кордюм НЕКОТОРЫЕ УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ АСПЕКТЫ ПРЯМОЙ ИНЪЕКЦИИ ЛИПОСОМ, СОДЕРЖАЩИХ ПЛАЗМИДНУЮ ДНК, В ПЕЧЕНЬ МЫШИ Методом просвечивающей электронной микроскопии исследована реакция клеток пе- чени на прямое введение в составе липосом бактериальной плазмиды.. кодирующей синтез β-галактозидазы. Через сутки после инъекции в гепатоцитах отмгчты гипер- трофия элементов аппарата Гольджи и структурные изменения митохондрии часть из которых носит обратимый характер. С помощью методики, оптимально выявляющей фосфолипиды, предпринята попытка исследовать ультратонкое строение вводимых ли- посом, а также их распределение в печени. Через 5 мин после инъекции /шпосомы располагались у ядер гепатоцитов — вблизи поровых комплексов и в tie рину клеарном пространстве. Эта локализация отмечалась и через сутки. Выявление лип ^ ом в ткани, богатой эндогенными липидами, сопряжено с рядом трудностей, которые обсуоісдаются. Введение. Ограниченная проницаемость фосфолипидпых мембран по- зволяет использовать липосомы в качестве носителей физиологически активных веществ, обеспечивающих дозированное поступление послед- них в определенный орган. Варьируя состав липосом, можно направ- ленно влиять на избирательность их накопления в определенных клет- ках печени [1]. Ранее было высказано предположение [2], что прямая инъекция липосомной суспензии в печень предпочтительнее внутривен- ной, так как в этом случае липосомы непосредственно контактируют с гепатоцитами, обеспечивая доставку экзогенной Д Н К в эти клетки. Механизмы взаимодействия липосом с клетками к настоящему времени изучены достаточно полно [3, 4]. Следует, однако, заметить, что реже других для выяснения этих механизмов применялся метод просвечивающей электронной микроскопии. Такое обстоятельство объ- ясняется, с одной стороны, методической сложностью стабилизации хрупких липосом в ходе проводки и заливки [5, 9], с другой — суще- ственной трудностью в дальнейшем наблюдении за липосомами в тка- нях с активным эндоцитозом. В обход второго затруднения ряд иссле- дователей предпочитает работать со сравнительно простыми модель- ными системами [5—7]. Однако на подступах к геннотерапевтическим исследованиям [8] становится все более очевидной необходимость электронно-микроскопического контроля качества вводимых липосом, их распределения в ткани животных и возможных реакций различных ультраструктур клетки на вводимый генетический материал. Целью настоящей работы явилось изучение ультратонкой орга- низации липосом, приготовленных методом Са-ЭДТА, их распределе- ния в ткани печени при прямом введении, а также реакции ультра- структур на плазмидную Д Н К , инъецируемую в составе липосом. Материалы и методы. В работе использовали Д Н К плазмиды pGA293, содержа- щей IacZ- ген Escherichia colt, кодирующий синтез бактериальной β -галактозидазы. ГІлазмиду заключали в липосомы следующего состава ( % ) : лецитин-—70, холесте- р и н — 20, д е ц и т и л - ф о с ф а т — 9 , фосфатидил-этаноламин — 1. Основной способ приго- т о в л е н и я — к а л ь ц и е в а я плавка с последующей обработкой ЭДТА. Был т а к ж е апроби- 73 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1990. Т. 6. ΛΊ> 1 ровам метод детергентного д и а л и з а и ряд других способов приготовлении липосо.м. Контролем с л у ж и л и липосомы, не с о д е р ж а щ и е Д Н К п л а з м и д ы («пустые»1!. Л и п о с о м ы віл я и ля ли методом негативного контрастирования ф о с ф о р н о в о л ь ф р а м а - і ()м калин (рН 6,8) , а т а к ж е по методике [5, 9] , оптимально с о х р а н я ю щ е й и в ы я в л я ю - щем фосфолппиды. В течение 10 мин липосомы префикспровалп в 0,2 % -ном P Л С T поре г л у т а р о в о г о альдегида («Serva» , Ф Р Г ) (исходный раствор разводили до концентрации 0,2';; , взвесью л и носом) . После этого препарат смешивали в объемном отношении 1:1 с теплым раствором легкоплавкой а г а р о з ы («Віо-Rad», С Ш А ) , приготовленном на 0,1 M п а т р и й - к а к о д и л а т н о м буфере ( К Б ) . Полученные пластинки застывшей агарозы с иммо- билизованными лииосомами измельчали до кусочков рабочего объема . Фиксировали в 2,5 %-пом растворе г л у г а р а л ь д е г и д а в 0,1 M К Б (рН 7,4) с добавлением 0,2 % ί а 11 π и по во 11 кислоты (TK) при комнатной т е м п е р а т у р е в течение 4 ч. После серии о т м ы в о к в буфере о б р а з ц ы постфиксировали в растворе , с о д е р ж а щ е м 1 % O s O i и 1 ,5% К;{ [ F e ( C N ) r , ] на 0,1 M К Б (окончательный р Н раствора 7,7) , в течение 4 ч при 0 ° С . Снова т щ а т е л ь н о п р о м ы в а л и буфером, в течение 2 ч о б р а б а т ы в а л и 2 %-ным ра- створом TK (в темноте при комнатной температуре ) и промывали холодной дистил- лированной водой. П о с л е о б е з в о ж и в а н и я в серии холодных р а с т в о р о в этанола возра- стающей концентрации и обработки иропиленоксидом образцы з а л и в а л и в эпон-арал- дит. У л ь т р а т о н к и е срезы с блоков и з г о т а в л и в а л и на у л ь т р а т о м е LKB-I I I («LKB», Ш в е ц и я ) , к о н т р а с т и р о в а л и у р а н и л а ц е т а г о м и ц и т р а т о м свинца, п р о с м а т р и в а л и на электронном микроскопе «JEM-7A» при у с к о р я ю щ е м н а п р я ж е н и и 80 кВ. Л и п о с о м ы , с о д е р ж а щ и е плазмиду , инъецировали двухмесячным м ы ш а м линии BALBIQ в крупную н и ж н ю ю д о л ю печени. Л о к а л и з а ц и ю н у ж н о й доли у с т а н а в л и в а л и через р а з р е з н а р у ж н о г о покрова на уровне органа . О б ъ е м вводимого м а т е р и а л а всегда с о с т а в л я л 60 мкл на особь, в случае инъеци ров а н ия п л а з м и д ы вводимый м а т е р и а л со- д е р ж а л 300 мкг липидов и 10 мкг Д Н К . Контролем с л у ж и л и животные , которым вво- дили «пустые» липосомы, а т а к ж е интактные ж и в о т н ы е . На в а р и а н т опыта в ы д е л я л и группу ж и в о т н ы х из четырех особей. М ы ш е й з а б и в а л и через 5 мин, 24 ч и 30 сут после инъекции. Д л я приготовления п р е п а р а т о в ткань иссекали из участков печени, в который вво- дили материал . Кусочки ткани о б р а б а т ы в а л и но той ж е методике , что и липосомы, исключая н е н у ж н ы е в случае ткани этапы префиксации и заливки в уплотнитель . Кро- ме того, ткань о б р а б а т ы в а л и и по с т а н д а р т н о й электронно-микроскопической методи- ке ( г л у г а р о в ы й а л ь д е г и д — ч е т ы р е х о к и с ь осмия с з а л и в к о й в эпон) . Р е а к ц и ю ткани печени на введение плазмидной Д Н К исследовали через 24 ч и 30 сут у тех мышей, где продукт экспрессии был з а р а н е е тестирован методом имму- нофлюоресцентного а н а л и з а [2] . После предварительного просмотра полутонких сре- зов д л я д а л ь н е й ш е й обработки выбирали периферические зоны долек , отличающиеся наименьшей гетерогенностью у л ь т р а с т р у к т у р [10] . А н а л и з и р о в а л и по три блока с жи- вотного, с о б л ю д а я принцип р а н д о м и з а ц и и срезов [10.] Приготовление срезов, коні расти- рование и п а р а м е т р ы просмотра были аналогичны т а к о в ы м при исследовании липосом. Результаты и обсуждение. С т р о е н и е л и π о с о м. Считается, что кальциевая плавка осуществляется в мягких физиологических ус- ловиях и приготовленные этим способом липосомы можно с успехом использовать для захвата лабильных биополимеров [3]. Необходимый для осуществления кальциевой плавки отрицательный заряд привно- сится децитил-фосфатом. Некоторую избыточность этого отрицательно- го заряда с успехом снимает микродобавка фосфатидил-этаноламина. Негативное контрастирование позволило оценить препарат как достаточно гомогенный, без крупных агрегатов, с разхмером везикул от 150 до 250 нм. Малый процент везикул с окрашенной водной полостью разрешает сделать косвенное заключение о первоначальной целостно- сти мембран в большинстве липосом, получаемых данным способом (рис. 1, а). Анализ ультратонких срезов дает представление о внутренней ламеллярной организации и о рабочем объеме липосом. Процесс об- разования липосом протекает, вероятно, в две стадии. Сперва под влиянием кальция исходные озвученные липосомы агрегируют с об- разованием складчатых мультиламеллярных структур (рис. 1, б) . При обработке ЭДТА эти структуры переходят в большие одно-, дву- и 74 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И К Л Е Т К А . 1990. Т. 6. ΛΊ> 1 мультиламеллярные везикулы диаметром 150—250 им (рис. 1, в). Про- с л е ж и в а е т е четкая тенденция л и х везикул собираться в своеобраз- ные тандемы (рис. 1, с\ •:)). Чи:ло везикул в тандеме не превышает Рис. 1. Фракция липосом, приготовленных методами Са-ЭДТА (а — с)) и детергент- ного диализа (е); а — негативное контрастирование, Х 3 2 ООО, масштаб 0,3 мкм; б •— е — срезы липосом, иммобилизованных в агарозе и зафиксированных по методике «таннпновая кислота — ферроцианид осмия»; б — липосомы после обработки Ca, Х 8 6 000, масштаб 0,12 мкм; в — то же, Са-ЭДТА, Х 2 2 ООО, масштаб 0,22 мкм; г — липосомный тандем, Х 7 1 000, масштаб 0,15 мкм; с) — то же, Х 1 5 8 0 0 0 , масштаб 0,05 мкм; е — χ 102 000, масштаб 0,1 мкм Fig. 1. Fract ion of l iposomes produced by Ca-EDTA methods (a-d) and de te rgen t dialysis method (e, χ 102000, bar —0.1 μιτι); a — nega t ive cont ras t , X32000, bar — 0 . 3 μ ι η ; 6-е: sect ions of l iposomes immobilized in aga rose and fixed by tann ic - fe r rocyanide OsO 4 me- thod; б — liposomes af te r Ca^ +- t rea tment , χ8-6000, bar — 0,12 μηι; в — l iposomes a f te r Ca-EDTA t rea tment , X22000, bar — 0.22 μηι; г — «tandems» of l iposomes, X71000, bar — 0 . 1 5 μιη; β — the same — X Ю2000, bar — 0 . 1 μπι трех. На срезе полость одной или двух липосом, составляющих тандем, оказывается вскрытой, тогда как одна—две другие — заполнены муль- тиламеллярной намоткой. Очевидно, такая картина отражает прохож- дение плоскости среза. Хотя толщина среза и средний диаметр липо- сомы — величины сопоставимые, тем не менее каждая везикула сре- зается в 2—4 приема. Этим, очевидно, объясняется наличие на пре- паратах определенного процента «горбушек», т. е. верхушечных срезов. Что же касается тандемов, то, не исключая агрегирования, предполо- жительнее было бы считать их продуктом «сшивки», сопровождаемой обобществлением мембран. ISSN 023.3-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1990. Т. 6. № I 75 Рис. 2. Распределение электронноплотных мультиламеллярных структур в :ЄП л о ц и т а х интактных (а — г) и инъецированных (д ·—з) мышей: для сравнения: а и ж—в про- свете канальцев эндоплазматического ретикулума, а — Х 5 6 ООО, масштаб 0,2 мкм; ж — · Х 1 2 0 000, масштаб 0,16 мкм; б и д, е — у наружной и внутренней мембран митохонд- рий, б — X l 11 ООО, масштаб 0,1 мкм; д — Х 2 9 ООО, масштаб 0,17 мкм; е — Х 6 9 ООО, масштаб 0,15 мкм; в, г и з — окаймляющие эндогенную липидную глобулу, в — Х 2 5 0 0 0 , масштаб 0,2 мкм; г — X l l l 000, масштаб 0,1 мкм, з — Х 6 3 0 0 0 , масштаб 0,15 мкм. Длительность всех опытов 5 мин после прямой инъекции липосом Fig . 2. Dis t r ibut ion of e lect ron-dense mul t i l amel la r s t ruc tures in the hepa tocy tes of in- tac t (а-г) and injected (0-з) mice. (Fixat ion accord ing to t ann ic - fe r rocyanid OsO 4 me thod ) . To compare : a and ж — in the lumen of endoplasmic re t iculum; б arid O1 e — 76 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1990. Т. 6. ΛΊ> 1 Наши данные несколько расходятся со сводкой [3], где получаемые этим способом липосомы характеризуются как большие одноламелляр- ные: в получаемых нами образцах количество ламелл варьирует. Три других апробированных нами способа не дали положитель- ных результатов. Так, например, при детергентном диализе получает- ся достаточно стабильный препарат мультиламеллярных липосом, ли- шенных внутренней полости (рис. \ , е ) . Р а с п р е д е л е н и е л и п о с о м в т к а н и . Двухступенчатая обработка танниновой кислотой в сочетании с фиксацией в OsFeCN придает ламеллярным фосфолипидным структурам повышенную эле- ктронную плотность, что позволяет легко идентифицировать их при любом уровне контрастирования ткани в срезе. При анализе образцов печени интактных мышей, которым липо- сом не вводили, были получены достаточно неожиданные результаты. В гепатоцитах этих мышей встречались электронноплотные олигола- меллярные везикулы, локализованные в просветах расширенных ка- нальцев гладкого эндоплазматического ретикулума (рис. 2, а ) , в ци- топлазме вблизи митохондрий и в матриксе митохондрий (рис. 2, б) . Размеры этих структур, периодичность укладки ламелл, электронная плотность были настолько сходны с соответствующими параметрами липосом, что это дало нам повод назвать их псевдолипосомами ( П Л ) . Кроме того, в цитоплазме интактных мышей эндогенные липидные глобулы нередко окаймлены электронноплотными мультиламеллярны- ми тяжами (рис. 2, в). Плотность укладки мембран здесь такая же, как в липосомах и в П Л (рис. 2, г), но протяженность тяжей больше. У подопытных животных, которым инъецировали липосомы («пу- стые» и содержащие плазмиду), на всех сроках исследования в ге- патоцитах наблюдались олиголамеллярные везикулы вышеописанной формы, ультраструктурной организации и локализации (рис. 2, д — з). Размеры этих структур соответствовали ранее описанным разме- рам липосом, не превышая 250 нм (за исключением ламеллярных тя- жей вокруг липидных глобул). Разница между опытом и чистым контролем состояла в том, что при экспозиции ткани с липосомами в течение 5 мин случаи контакта везикул с митохондриями (рис. 2, (3) и их включения в матрикс (рис. 2, е) наблюдались значительно чаще. В то же время в гепато- цитах интактных мышей была очевидней структурная связь П Л с ми- тохондриальной мембраной (рис. 2, б) . Ни в опыте, ни в контроле не отмечалось случаев включения электронноплотных везикул в цитоплазматические вакуоли, вторичные лизосомы или их объединения с эндоцитозными пузырьками. Через 5 мин после инъекции липосом электронноплотные олиго- ламеллярные везикулы прослеживались вблизи ядер гепатоцитов — у ядерных пор и в расширениях перинуклеарного пространства (рис. 3, а). Через сутки после инъекции липосом частота встречаемости везикул у ядер гепатоцитов еще достаточно велика (рис. 3, в), мно- жественные скопления прослеживаются между микроворсинками желч- ных канальцев (рис. 3, б), а также вблизи эндотелиальной выстилки пространства Диссе. К 30-тым сут после инъекции везикулы у ядер не обнаружены. Структуры, локализованные у ядра, всегда уплощены, вытянуты, свойственные липосомам просвет и первоначальные сферические очер- тания частично или полностью утрачены (рис. 3, а), но во всех слу- чаях сохраняются высокая электронная плотность и периодичность ламеллярной намотки (рис. 3, г, д). Нередко в липосомах у ядер про- слеживается тандемность (рис. 3, г). В нуклеоплазме везикулы не бы- near the outer and inner m e m b r a n e s of mi tochondr ia ; в, г and з — borde r ing the endo- genic lipid droplet, a — X56000 , bar 0.2 μηι, б ~ χ ΐ 11000, bar 0.1 μιη, в — Х25000 , 0.2 μπι; г — χ ΐ 11000, bar 0.1 μπι; д — Х29000, bar 0.17 μπι; e — Χ69000 , bar 0.15 μιη; ж — Х120000, bar 0.16 μπι; з — Χ63000, bar 0.15 μπι. The experiment in all the cases is 5 minu tes a f t e r direct inject ion of l iposomes into t i ssue 77 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1990. Т. 6. ΛΊ> 1 Рис. 3. Мультиламеллярные везикулы в гепатоцитах мышей, инъецированных липосо- мами, содержащими плазмидную ДНК: а — вблизи ядерного порового комплекса и в расширении перинуклеарного пространства, Х 8 3 ООО, масштаб 0,12 мкм; б — в про- свете желчного канальца , Х 7 3 ООО, масштаб 0,12 мкм; в — в расширении перинуклеар- ного пространства, Х З З ООО, масштаб 0,15 мкм; <?, д — увеличенные фрагменты и \ г — Х 8 6 ООО, масштаб — 0,12 мкм; д — Х 1 9 5 000, масштаб 0,12 мкм; а — 5 мин после инъекции; б — () — 24 ч после инъекции Fig. 3. Mul t i l amel la r vesicles in hepatocytes a f t e r injection of l iposomes with enclosed plasmid DNA: a — in the vicinity of pore complex and in per inuclear space, 5 minu tes a f t e r inject ion, X83000, bar 0.12 μηι; б — in the luminae of bile canal icula : X73000 , bar 0.12 μηι; в — in per inuclear space: ХЗЗООО, bar 0.15 μηι; г, д — the en la rged f r ag - m e n t s of Fig. З, в : г — X86000 , bar 0.12 μιη; d — X 1 9 5 0 0 0 , bar 0.12 μηι; б-д — 24 hours a f t e r inject ion ли отмечены ни разу, так же, как ни разу их околоядерное расположе- ние не было сопряжено с каким-либо изменением ядерной мембраны. Когда же везикулы располагались в просветах перинуклеарного про- странства, то степень расширения последнего не была значительной, разрывов ядерной оболочки и обобществления мембран не наблюдали. 78 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1990. Т. 6. ΛΊ> 1 При сравнении мышей, получавши:: плазмиду, с мышами, инъе- цированными «пустыми» липосомамп, не наблюдалось какой-либо существенной разницы в локализации и распределении описываемых околоядерных структур. Факт обнаружения олиголамеллярных везикул в ткани интакт- ных животных требует особой осторожности при оценке результатов опыта. Вероятнее всего, к истинным липосомам можно отнести лишь везикулы, локализованные у ядер гепатоцитов, поскольку в чистом контроле они не встречались. Появление липосом (и «пустых» и «на- груженных») у ядер за столь короткий с момента инъекции промежу- ток времени хорошо согласуется с наблюдениями авторов работы [12]. Методом электронно-микроскопической радиоавтографии эти ис- следователи показали, что уже через 3 мин после внутривенной инъ- екции мышам липосом, содержавших Д Н К , последняя обнаруживалась в ядрах. Характерно, что самих липосом вблизи ядер авторам выявить не удалось, ибо при радиоавтографической обработке нестабилизиро- ванные фосфолипиды вымывались из клеток. Поэтому никаких пред- положении о механизме попадания Д Н К из липосом в ядра ими не высказано. В цикле работ [11 —13] достоверно продемонстрировано, что внутривенно вводимые мышам липосомы уже через 20 мин после инъекции ассоциированы с митохондриями, и эта связь прослеживается вплоть до 4 ч после инъекции. Однако в работе [11] липосомы всегда оказывались заключенными в соответствующие цитоплазматпческие ва- куоли и только такие конгломераты интернализовались в матрикс ор- ганелл. Отсутствие вакуолей вокруг липосом в нашем опыте объяснить трудно, так же, впрочем, как и наличие в чистом контроле определен- ного количества ПЛ. Нельзя сказать, что подобные картины ранее не наблюдались и не оговаривались исследователями. Появление так на- зываемых миелиновых фигур в связи с частичным разрушением клеточ- ных липопротеидных мембран при альдегидной фиксации — факт общеизвестный [14]. Однако в работе [ И ] подчеркнуто явное отличие миелиновых фигур от липосом — и по размерам, и по степени перио- дичности укладки ламелл, чего мы подтвердить не можем. ПЛ, наблю- давшиеся нами, порою неотличимы от истинных. Более всего они на- поминали липосомы на промежуточной стадии их приготовления, до об- работки ЭДТА (сравнить рис. 2, а с рис. 1, б) . Что же касается упло- щения везикул, потери ими просвета полости и сферических очертаний, то эти же особенности отмечали Белицер и др. [5, 6] и, очевидно, они возникают при любом взаимодействии фосфолипидных глобул с клетками. По всей вероятности, методика [9], оптимально выявляющая ис- кусственно синтезированные фосфолипидные глобулы, не является вполне адекватной при их выявлении в тканях, богатых эндогенными липидами. В пользу этого свидетельствуют нередкие случаи выяв- ления как в опыте, так и в чистом контроле электронноплотных муль- тиламеллярных тяжей, опоясывающих внутриклеточные липидныс гло- булы (сравнить рис. 2, в, г и 2, з ) . Конфигурация таких тяжей явно отличается от липосомной, и их эндогенное происхождение очевидно. Р е а к ц и я у л ь т р а с т р у к т у р н а в в е д е н и е п л а з м и - д ы . Через сутки после инъекции в печень липосом, содержавших плаз- миду, во многих гепатоцитах прослеживались нарушения ультраструк- туры митохондрий: набухание ряда органелл с просветлением матрик- са и умеренной фрагментацией крист (рис. 4, а ) , частичная потеря двуконтурности митохондриальных мембран (рис. 4, в) . В отдельных органеллах наблюдалась очаговая вакуолизация и миелинизация (рис. 4, б) . При инъецировании «пустых» липосом все перечисленные нарушения встречались с меньшей частотой и, вероятно, укладывались в рамки общей неспецифической реакции органелл на стресс после прямой инъекции. К 30-тым сут после инъекции липосом, содержавших плазмиду, структура органелл в большинстве проанализированных клеток вос- ISSN ()1Ш-7(іГ>7. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1 iJtJO. Т. G. № 1 79 Рис. 4. Ультраструктурные изменения в гепатоцитах мыши после прямого введения липосом, содержащих плазмидную ДНК. Изменения в митохондриях: а — в — 24 ч после введения плазмидной Д Н К ( X 1 0 ООО; Х 2 3 000; Х 1 9 000 соответственно); г, д — то ж е через 30 сут ( Х 2 0 000); гипертрофия аппарата Гольджи: е — через 24 ч ( Х 4 6 000); ж — 30 'сут после инъекции (Х42 ООО) Fig. 4. Ul t ras t ruc tu ra l changes in mice hepatocytes af ter direct injection of liposomes with enclosed plasmid DNA: different changes in mitochondria: а-в — 24 hours af ter inject ion of plasmid DNA (ХЮ000; X23000, X19000, respectively); г, д — 30 days af- ter injection (X20000) ; Goldgi region hvperthrophy: e — 24 hours af ter injection (X46000) ; ж — 30 days af ter injection (X42000) 80 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1990. Т. 6. ΛΊ> 1 станавливалась, процент набухших митохондрий был меньше, случаи фрагментации крист встречались реже. Однако случаи вакуолизации и миелинизации (рис. 4, г, д) , оставаясь, по-видимому, необратимыми, встречались с прежней частотой. У интактных животных миелинизи- рованные митохондрии встречались редко, степень миелинизации была незначительной. Не исключено, что в митохондриях с определенными нарушениями мембран интенсивнее протекают процессы миелинизации, и такие имен- но органеллы обладают повышенным сродством к поступающему извне фосфолипидному материалу. Но в таком случае действительно очень трудно отделить причину от следствия, т. е. дифференцировать в опыте истинные липосомы, включившиеся в матрикс, от ПЛ, формирующихся при нарушении целостности митохондриальных мембран из их же (мембран) фосфолипидного содержимого. В гепатоцитах мышей, получивших плазмиду, через сутки после инъекции отмечалась значительная гипертрофия элементов комплекса Гольджи: резкое вздутие секреторных пузырьков с высвобождением в цитоплазму секреторных гранул (рис. 4, е ) . Напряженность этой орга- неллы к 30-тым сут после инъекции оставалась высокой (рис. 4, ж ) . У животных, которым инъецировали «пустые» липосомы, строение комплекса Гольджи оставалось в пределах нормы. Функциональное напряжение комплекса Гольджи, вероятнее всего, связано с экспрес- сией плазмидного гена. Представляется перспективным провести ги- стохимическое выявление β-галактозидазы и сопоставить ультраструк- турное распределение фермента с реакцией данной органеллы. В ядрах гепатоцитов никаких существенных нарушений при вве- дении липосом с плазмидой обнаружено не было. Некоторое расшире- ние перинуклеарного пространства и незначительное увеличение числа интерхроматиновых гранул отражали, по-видимому, общее повыше- ние функциональной нагрузки в клетках, активно продуцирующих фермент. «Ревизия» других органелл не выявила каких-либо существенных изменений по сравнению с печенью интактных животных. Авторы выражают благодарность Н. В. Белицер и сотрудникам руководимой ею лаборатории за методическую и консультативную помощь. S O M E U L T R A S T R U C T U R A L A S P E C T S O F D I R E C T I N J E C T I O N O F L I P O S O M E S W I T H I N C L O S E D P L A S M I D DNA INTO M I C E LIVER K. M Bilich, D. M Irotlov, V. A. Kordium Ins t i tu te of Molecular Biology and Genetics, Academy of Sciences of the Ukra in ian SSR, Kiev S u m m a r у Af te r direct inject ion of l iposomes wi th inclosed bacterial β -ga lac tos idase gene into mice liver the main u l t r a s t ruc tu ra l changes have been observed in mi tochondr ia and Goldgi region. Liposomes themselves were inves t iga ted by t r ansmiss ion electron microscopy of ul t ra thin sections. An a t t empt w a s m a d e to e lucidate their d is t r ibuton in mice liver af- ter direct injection. С П И С О К Л И Т Е Р А Т У Р Ы 1. Intrahepatic d is t r ibut ion of small un i lamel la r l iposomes as a funct ion of l iposomal lipid composi t ion / Η. H. Span je r , Μ. V. Galen, F. N. Roerdink et a l . / / B i o c h i m . et biophys. acta .— 1986.—863, N 2 . — P . 224—230. 2. Экспрессия β -галактозидазы Escherichia coli в гепатоцитах мыши / И. Ε. Костец- кий, С. П. Шпилевая, JL И. Лихачева и д р . / / Б и о п о л и м е р ы и клетка.— 1989 — 5. № о — С. 51—58. ISSN' 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1990. Т. 6. № I 6 — 9-759 81 3. Марголис JI. В., Брейгельсон JI. Д. Липосомы и их взаимодействие с клетками.— М. : Наука , 1986.—240 с. 4. Марголис JI. Б. Механизмы взаимодействия липосом с клетками: перспективы и ограничения применения липосом в науке и практике / / Биол. мембраны.— 1987.— 4, № 5.— С. 453—467. 5. Взаимодействие отрицательно заряженных лецитиновых липосом с эритроцитами человека: исследование методом трансмиссионной электронной микроскопии ультра- тонких срезов / Н. В. Белицер, В. И. Чернышов, М. Г. Анищук и д р . / / Д о к л . АН СССР.— 1984.— 277, № 1.— С. 210—213. 6. Interaction of posi t ively charged l iposomes wi th ery throcyte membrane . An u l t ra - s t ruc tu ra l s t u d y / N . V. Bclitser, M. G. Anischuk, V. I. Chernishov, T. R. I y o z l o v a / / Cell. Biol. Int . Rep.— 1986,— 10, N 5 , — P . 331—338. 7. Чернышов В. И., Козлова T. Р., Соколов Ю. В. Адсорбция и слияние положительно заряженных липосом с мембраной эритроцита человека. Электронная микроскопия ультратонких с р е з о в / / Б и о л . мембраны.— 1987.— 4, № 1.— С. 90—95. 8. Кордюм В. А. З а д а ч и и проблемы генной терапии / / Биополимеры и клетка.— 1989,— 5, № 2 , — С . 5—15. 9. Takahashi G. Tann in - fe r rocyan ide OsO 4 method for t r ansmiss ion and s cann ing elec- t ron microscopy / / Proc. XI Int . Congr . on electron microscopy.— Kyoto, 1986.— 345 p. 10. Loud Α. V. A quan t i t a t ive s tereological descript ion of the u l t r a s t ruc tu re of no rma l ra t liver pa rench imal cell / / J . Cell Biol.— 1968.—37, N 1 . — P . 27—46. 11. Liposomes injected in t ravenous ly into mice associa te with liver m i t o c h o n d r i a / A. Cudd, H. Lable. M. Gervais , C. N i c o l a u / / B i o c h i m . et biophys. acta .— 1984 — 774, N 3 . — P . 169—180. 12. Cudd A., Nicolau C. In tercel lu lar f a t e of l iposome-encapsula ted DNA in mouse liver. Ana lys i s u s ing electron microscope a u t o r a d i o g r a p h y and subcel lular f rac t iona t ion / / Ibid.— 1985.—845, N 4 . — P . 477—491. 13. Cudcl A., Nicolau C. In terac t ion of in t r avenous ly injected l iposomes wi th liver mito- chondr ia . A f luorescence and electron microscopy s t u d y / / I b i d . — 1986.— <860, N 2.— P. 201—214. 14. Гайер Г. Электронная гистохимия.— Μ. : Мир, 1974.— 488 с. Hii -T молекуляр. биологии и генетики АН УССР, Киев Получено 23.06.89 У Д К 577.21:579.25.5 JI. JI. Лукаш, JI. Н. Неборачко, Ε. Μ. Сухорада, Ε. В. Уеенко, И. С. Варзанова, С. В. Подольская, Т. И. Бужиевская, В. А. Кордюм ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ IIоказано, что фибробласты человека и мыши, в которые введена рекомбинантния плазмида, содержащая ген инсулина человека под собственным промотором при от- сутствии гена-помощника и сильных вирусных промоторов, секретируют в кул (куриль- ную среду специфический белок-продукт. Установлена сходная зависимость секреции белка — продукта гена инсулина от времени для фибробластов человека и мыши. Введение. Разработка методов лечения сахарного диабета, являю- щегося одним из наиболее распространенных заболеваний ,—одна из первоочередных задач биотехнологии в медицине. Биотехнология в западных странах добилась значительных успехов в производстве ин- сулина человека генноинженерными методами. В будущем лечение этого заболевания, возможно, будет производиться с помощью генной терапии: введение в капсулах или иным путем в организм больного клеток, продуцирующих инсулин, а также прямое введение нормаль- ного гена инсулина в такой молекулярной конструкции, которая обес- печит его экспрессию в клетках больных, в том числе в неспециали- зированных клетках. Д л я разработки новых способов лечения важно изучить экспрессию введенного гена инсулина в клетках млекопитаю- щих различного происхождения. Задачи настоящего исследования следующие: изучение особен- ностей экспрессии геномного гена инсулина человека в культивируе- мых фибробластах человека и мыши и выяснение возможности селек- ции клеток, трансформированных по гену инсулина. 82 ISSN 0233-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы И К Л Е Т К А . 1990. Т. 6. № 1

Некоторые ультраструктурные аспекты прямой инъекции липосом, содержащих плазмидную ДНК, в печень мыши

Institution

Ähnliche Einträge