Трансформация протопластов Streptomyces griseus хромосомной и плазмидной ДНК, заключенной в липосомы

Трансформация протопластов Streptomyces griseus хромосомной и плазмидной ДНК, заключенной в липосомы

Осуществлена трансформация протопластов Streptomyces griseus хромосомной и плазмидной ДНК, заключенной в липосомы. Частота трансформации по хромосомным маркерам прототрофности и плазмидным маркерам устойчивости к неомицину и образованию зон угнетения роста с помощью включенной в липосомы ДНК была на...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
Bibliographische Detailangaben
Veröffentlicht in:Биополимеры и клетка
Datum:1986
Hauptverfasser: Стенько, А.С., Мацелюх, Б.П., Дехтяренко, Т.Д., Стефанишин, Е.Е., Стефанов, А.В., Безкоровайная, Н.К., Полищук, Л.В., Машковский, Н.Н.
Format: Artikel
Sprache:Russian
Veröffentlicht: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1986
Schlagworte:
Генно-инженерная биотехнология
Online Zugang:https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153033
Tags: Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:Трансформация протопластов Streptomyces griseus хромосомной и плазмидной ДНК, заключенной в липосомы / А.С. Стенько, Б.П. Мацелюх, Т.Д. Дехтяренко, Е.Е. Стефанишин, А.В. Стефанов, Н.К. Безкоровайная, Л.В. Полищук, Н.Н. Машковский // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 5. — С. 270-274, 278. — Бібліогр.: 22 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-153033
record_format dspace
spelling Стенько, А.С.
Мацелюх, Б.П.
Дехтяренко, Т.Д.
Стефанишин, Е.Е.
Стефанов, А.В.
Безкоровайная, Н.К.
Полищук, Л.В.
Машковский, Н.Н.
2019-06-13T12:37:51Z
2019-06-13T12:37:51Z
1986
Трансформация протопластов Streptomyces griseus хромосомной и плазмидной ДНК, заключенной в липосомы / А.С. Стенько, Б.П. Мацелюх, Т.Д. Дехтяренко, Е.Е. Стефанишин, А.В. Стефанов, Н.К. Безкоровайная, Л.В. Полищук, Н.Н. Машковский // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 5. — С. 270-274, 278. — Бібліогр.: 22 назв. — рос.
0233-7657
DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.0001C2
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153033
575.24:577.352
Осуществлена трансформация протопластов Streptomyces griseus хромосомной и плазмидной ДНК, заключенной в липосомы. Частота трансформации по хромосомным маркерам прототрофности и плазмидным маркерам устойчивости к неомицину и образованию зон угнетения роста с помощью включенной в липосомы ДНК была на 2–3 порядка выше по сравнению с контрольной ДНК без липосом. У трансформантов выделяли плазмидную ДНК, которая стабильно сохранялась на протяжении 6–7 генераций при неизменности фенотипа в течение 12 генераций.
Здійснено трансформацію протопластів Streptomyces griseus хромосомної і плазмідної ДНК, укладеної в ліпосоми. Частота трансформації за хромосомними маркерами прототрофності і плазмідними маркерами стійкості до неоміцину і утворення зон пригнічення росту за допомогою включеної в ліпосоми ДНК були на 2–3 порядки вищими у порівнянні з контрольною ДНК без ліпосом. У трансформантів виділено плазмідну ДНК, яка стабільно зберігалася протягом 6–7 генерацій при незмінності фенотипу протягом 12 генерацій.
S. griseus protoplasts are transformed by chromosomal and plasmid DNA incapsulated in liposomes. The frequency of transformation by chromosomal markers of prototrophity and by plasmid markers of resistance to neomycin and the formation of growth inhibition zones by means of DNA incapsulated in liposomes was two-three orders higher in comparison with control DNA without liposomes. Plasmid DNA was isolated from transformants and remained stable for 6–7 generations, phenotype being unchanged for 12 generations.
ru
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
Биополимеры и клетка
Генно-инженерная биотехнология
Трансформация протопластов Streptomyces griseus хромосомной и плазмидной ДНК, заключенной в липосомы
Трансформація протопластів Streptomyces griseus хромосомної і плазмідної ДНК, вміщеної у ліпосоми
Transformation of Streptomyces griseus protoplasts by chromosomal and plasmid DNA incapsulated in lyposomes
Article
published earlier
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
title Трансформация протопластов Streptomyces griseus хромосомной и плазмидной ДНК, заключенной в липосомы
spellingShingle Трансформация протопластов Streptomyces griseus хромосомной и плазмидной ДНК, заключенной в липосомы
Стенько, А.С.
Мацелюх, Б.П.
Дехтяренко, Т.Д.
Стефанишин, Е.Е.
Стефанов, А.В.
Безкоровайная, Н.К.
Полищук, Л.В.
Машковский, Н.Н.
Генно-инженерная биотехнология
title_short Трансформация протопластов Streptomyces griseus хромосомной и плазмидной ДНК, заключенной в липосомы
title_full Трансформация протопластов Streptomyces griseus хромосомной и плазмидной ДНК, заключенной в липосомы
title_fullStr Трансформация протопластов Streptomyces griseus хромосомной и плазмидной ДНК, заключенной в липосомы
title_full_unstemmed Трансформация протопластов Streptomyces griseus хромосомной и плазмидной ДНК, заключенной в липосомы
title_sort трансформация протопластов streptomyces griseus хромосомной и плазмидной днк, заключенной в липосомы
author Стенько, А.С.
Мацелюх, Б.П.
Дехтяренко, Т.Д.
Стефанишин, Е.Е.
Стефанов, А.В.
Безкоровайная, Н.К.
Полищук, Л.В.
Машковский, Н.Н.
author_facet Стенько, А.С.
Мацелюх, Б.П.
Дехтяренко, Т.Д.
Стефанишин, Е.Е.
Стефанов, А.В.
Безкоровайная, Н.К.
Полищук, Л.В.
Машковский, Н.Н.
topic Генно-инженерная биотехнология
topic_facet Генно-инженерная биотехнология
publishDate 1986
language Russian
container_title Биополимеры и клетка
publisher Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
format Article
title_alt Трансформація протопластів Streptomyces griseus хромосомної і плазмідної ДНК, вміщеної у ліпосоми
Transformation of Streptomyces griseus protoplasts by chromosomal and plasmid DNA incapsulated in lyposomes
description Осуществлена трансформация протопластов Streptomyces griseus хромосомной и плазмидной ДНК, заключенной в липосомы. Частота трансформации по хромосомным маркерам прототрофности и плазмидным маркерам устойчивости к неомицину и образованию зон угнетения роста с помощью включенной в липосомы ДНК была на 2–3 порядка выше по сравнению с контрольной ДНК без липосом. У трансформантов выделяли плазмидную ДНК, которая стабильно сохранялась на протяжении 6–7 генераций при неизменности фенотипа в течение 12 генераций. Здійснено трансформацію протопластів Streptomyces griseus хромосомної і плазмідної ДНК, укладеної в ліпосоми. Частота трансформації за хромосомними маркерами прототрофності і плазмідними маркерами стійкості до неоміцину і утворення зон пригнічення росту за допомогою включеної в ліпосоми ДНК були на 2–3 порядки вищими у порівнянні з контрольною ДНК без ліпосом. У трансформантів виділено плазмідну ДНК, яка стабільно зберігалася протягом 6–7 генерацій при незмінності фенотипу протягом 12 генерацій. S. griseus protoplasts are transformed by chromosomal and plasmid DNA incapsulated in liposomes. The frequency of transformation by chromosomal markers of prototrophity and by plasmid markers of resistance to neomycin and the formation of growth inhibition zones by means of DNA incapsulated in liposomes was two-three orders higher in comparison with control DNA without liposomes. Plasmid DNA was isolated from transformants and remained stable for 6–7 generations, phenotype being unchanged for 12 generations.
issn 0233-7657
url https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153033
citation_txt Трансформация протопластов Streptomyces griseus хромосомной и плазмидной ДНК, заключенной в липосомы / А.С. Стенько, Б.П. Мацелюх, Т.Д. Дехтяренко, Е.Е. Стефанишин, А.В. Стефанов, Н.К. Безкоровайная, Л.В. Полищук, Н.Н. Машковский // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 5. — С. 270-274, 278. — Бібліогр.: 22 назв. — рос.
work_keys_str_mv AT stenʹkoas transformaciâprotoplastovstreptomycesgriseushromosomnoiiplazmidnoidnkzaklûčennoivliposomy
AT macelûhbp transformaciâprotoplastovstreptomycesgriseushromosomnoiiplazmidnoidnkzaklûčennoivliposomy
AT dehtârenkotd transformaciâprotoplastovstreptomycesgriseushromosomnoiiplazmidnoidnkzaklûčennoivliposomy
AT stefanišinee transformaciâprotoplastovstreptomycesgriseushromosomnoiiplazmidnoidnkzaklûčennoivliposomy
AT stefanovav transformaciâprotoplastovstreptomycesgriseushromosomnoiiplazmidnoidnkzaklûčennoivliposomy
AT bezkorovainaânk transformaciâprotoplastovstreptomycesgriseushromosomnoiiplazmidnoidnkzaklûčennoivliposomy
AT poliŝuklv transformaciâprotoplastovstreptomycesgriseushromosomnoiiplazmidnoidnkzaklûčennoivliposomy
AT maškovskiinn transformaciâprotoplastovstreptomycesgriseushromosomnoiiplazmidnoidnkzaklûčennoivliposomy
AT stenʹkoas transformacíâprotoplastívstreptomycesgriseushromosomnoííplazmídnoídnkvmíŝenoíulíposomi
AT macelûhbp transformacíâprotoplastívstreptomycesgriseushromosomnoííplazmídnoídnkvmíŝenoíulíposomi
AT dehtârenkotd transformacíâprotoplastívstreptomycesgriseushromosomnoííplazmídnoídnkvmíŝenoíulíposomi
AT stefanišinee transformacíâprotoplastívstreptomycesgriseushromosomnoííplazmídnoídnkvmíŝenoíulíposomi
AT stefanovav transformacíâprotoplastívstreptomycesgriseushromosomnoííplazmídnoídnkvmíŝenoíulíposomi
AT bezkorovainaânk transformacíâprotoplastívstreptomycesgriseushromosomnoííplazmídnoídnkvmíŝenoíulíposomi
AT poliŝuklv transformacíâprotoplastívstreptomycesgriseushromosomnoííplazmídnoídnkvmíŝenoíulíposomi
AT maškovskiinn transformacíâprotoplastívstreptomycesgriseushromosomnoííplazmídnoídnkvmíŝenoíulíposomi
AT stenʹkoas transformationofstreptomycesgriseusprotoplastsbychromosomalandplasmiddnaincapsulatedinlyposomes
AT macelûhbp transformationofstreptomycesgriseusprotoplastsbychromosomalandplasmiddnaincapsulatedinlyposomes
AT dehtârenkotd transformationofstreptomycesgriseusprotoplastsbychromosomalandplasmiddnaincapsulatedinlyposomes
AT stefanišinee transformationofstreptomycesgriseusprotoplastsbychromosomalandplasmiddnaincapsulatedinlyposomes
AT stefanovav transformationofstreptomycesgriseusprotoplastsbychromosomalandplasmiddnaincapsulatedinlyposomes
AT bezkorovainaânk transformationofstreptomycesgriseusprotoplastsbychromosomalandplasmiddnaincapsulatedinlyposomes
AT poliŝuklv transformationofstreptomycesgriseusprotoplastsbychromosomalandplasmiddnaincapsulatedinlyposomes
AT maškovskiinn transformationofstreptomycesgriseusprotoplastsbychromosomalandplasmiddnaincapsulatedinlyposomes
first_indexed 2025-11-25T23:46:48Z
last_indexed 2025-11-25T23:46:48Z
_version_ 1850584144988340224
fulltext Генноинженерная биотехнология У Д К 575.24:577.352 ТРАНСФОРМАЦИЯ ПРОТОПЛАСТОВ STREPTOMYCES GRTSEUS ХРОМОСОМНОЙ II ПЛАЗМИДНОЙ ДНК, ЗАКЛЮЧЕННОЙ В ЛИПОСОМЫ А. С. Стенько, Б. П. Мацелюх, Т. Д. Дехтяренко, Ε. Е. Стефанишин, А. В. Стефанов, II. К. Безкоровайная, Л. В. Полищук, Η. Н. Машковский Введение. В настоящее время липосомы широко применяются в биоло- гии и медицине для решения разных задач. В молекулярно-биологиче- ских и генетических исследованиях их начали применять для введения генетического материала (ДНК, РНК, отдельные хромосомы, клеточные ядра) в животные клетки, протопласты растений и микроорганизмов [1—7]. Исследования по трансформации микроорганизмов с примене- нием липосом малочисленны и представляют значительный интерес для генетической инженерии. Мейкинс и др. выполнили работу с исполь- зованием липосом на Streptomyces coelicolor и 5. clavuligerus [6, 7], Родфорд и др. — на Neurosporci crassa [8], Прозоров и др. — на Bacillus subiilis [9]. Полученные ими результаты свидетельствуют о высокой эф- фективности введения чужеродной Д Н К в протопласты и клетки микро- организмов с помощью липосом, обеспечивающих надежную защиту Д Н К от воздействия нуклеаз и полиостью сохраняющих ее биологиче- скую активность [10, 11]. Целью настоящей работы явилось выяснение возможности исполь- зования липосом при трансформации протопластов Sirepiomyces griseus хромосомной и плазмидной Д Н К . Материалы и методы. В р а б о т е использованы с л е д у ю щ и е ш т а м м ы стрептомицетов и бактерий : п р о т о т р о ф н ы й ш т а м м 773 S. griseus, б е с п л а з м и д н ы й ш т а м м 68-31 thi їси S. griseus, S. liuidans TC8, несущий гибридную п л а з м и д у pIJ2 Neor, полученный от Д . Х о п в у д а (Англия) , стрептомицет глобиспориновон группы 5 . species 1912, с о д е р ж а - щий п л а з м и д у pSG1912 Л п / + , д е т е р м и н и р у ю щ у ю о б р а з о в а н и е антибиотика неизвест- ной природы, который угнетает рост т е с т - ш т а м м а 165 и п р и н а д л е ж и т к той ж е группе стрептомицетов , полученный из музея к у л ь т у р отдела общей и почвенной микробиоло- гии Ин-та микробиологии и вирусологии им. Д . К. З а б о л о т н о г о А Н У С С Р . Ш т а м м Б. coli С600, с о д е р ж а щ и й п л а з м и д у pBR322, получен из И н - т а микробиологии А Н Ч С С Р . Х р о м о с о м н у ю Д Н К получали по м о д и ф и ц и р о в а н н о м у методу М а р м у р а [13] , п л а з м и д - гтую — по Б и р н б о й м у и Д о л и [14] , а т а к ж е методом равновесного ц е н т р и ф у г и р о в а н и я в г р а д и е н т е плотности CsCl — э т и д и я б р о м и д а ( Э Б ) по Кирби [15] . Д л я получения липосом и с п о л ь з о в а л и яичный лецитин, в ы д е л е н н ы й по мет од у Б е н г х е м а [16] . Ч и с т о т у лецитина к о н т р о л и р о в а л и посредстволі тонкослойной х р о м а т о - г р а ф и и па п л а с т и н к а х Silufol UV254 («Kava l ie r» , Ч С С Р ) в системе х л о р о ф о р м : мета- кол : в о д а ( 6 5 : 3 5 : 4 ) . В опытах использовали н е й т р а л ь н ы е л и п о с о м ы из яичного ле- цитина, п о л о ж и т е л ь н о з а р я ж е н н ы е липосомы, м е м б р а н а к о т о р ы х с о д е р ж а л а лецитин и с т е а р и л а м и н ( 7 : 1 , м о л ь / м о л ь ) , а т а к ж е отрицательно з а р я ж е н н ы е липосомы, состоя- щ и е из лецитина и д и ц е т и л ф о с ф а т а в соотношении 7 : 1 , м о л ь / м о л ь . Р а с т в о р л и п и д о в в х л о р о ф о р м е (20 м г / м л ) вносили в к р у г л о д о н н у ю к о л б у и в ы с у ш и в а л и при п о н и ж е н н о м д а в л е н и и в роторном испарителе . К о б р а з о в а в ш е й с я тонкой пленке л и п и д а д о б а в л я л и Д Н К в концентрации 14—52 м к г / м л и 185—370 к Б к 3 Н - Д Н К в б у ф е р н о м р а с т в о р е (среда Ρ д л я получения протопластов [ 1 7 ] ) . Д л я р а з р у ш е н и я невклгочившейся Д Н К к б 270 БИОПОЛИМЕРЫ II КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 5 суспензии лштосом д о б а в л я л и 50—100 м к г / м л Д Ы К а з ы и и н к у б и р о в а л и 30 мин при комнатной температуре . Д л я у д а л е н и я нуклеотидов суспензию липосом пропускали че- рез колонку ( 1 , 5 X 2 0 см) у л ь т р а г е л я АСА34, у р а в н о в е ш е н н о г о б у ф е р н ы м р а с т в о р о м . Включение Д Н К в липосомы оценивали по уровню р а д и о а к т и в н о й метки 3 Н - Д Н К на сцинтилляционпом счетчике R a c k - B e t a («LI \B», Ш в е ц и я ) , с использованием сцинтилля- т о р а Б р е я . Т р а н с ф о р м а ц и я п р о т о п л а с т о в х р о м о с о м н о й и п л а з м и д н о й Д Н К , в к л ю ч е н н о й в л и π о с о м ы. П р о т о п л а с т ы ш т а м м а S. griseus 68-31 ihi leu, устойчивого к 0,5 м к г / м л неомицнна, получали по м о д и ф и ц и р о в а н н о й методике О к а - ниши [17] . Т р а н с ф о р м а ц и о н н а я смесь состояла из р а в н ы х о б ъ е м о в (по 0,2 мл) про- т о п л а с т о в (10 s —10° клеток в 1 мл) и липосом, н а г р у ж е н н ы х Д Н К (Ю 1 0 в е зикул в ί м л ) , а т а к ж е двойного о б ъ е м а (0,8 мл) 20 %-ного полиэтиленгликоля ( П Э Г ) с мо- л е к у л я р н о й массой 1000. П о с л е инкубации в течение 3 мин при мя гком покачивании смесь р а з б а в л я л и средой Ρ до 4 мл, ц е н т р и ф у г и р о в а л и при 2000 о б / м и н в течение 15 мин и рассевали на полноценную среду регенерации R2 . Спустя 5—7 сут регенери- р о в а в ш и е колонии отсевали на полноценную среду т о т а л ь н о и в ы р а щ и в а л и д о получе- ния обильной споруляцин, а з а т е м проводили генетический анализ регенерантов . Д л я в ы д е л е н и я т р а н с ф о р м а н т о в по х р о м о с о м н ы м м а р к е р а м в среды д о б а в л я л и ф а к т о р ы роста тиамин и лейцин; клопы, т р а н с ф о р м и р о в а н н ы е рИ2, о тбирали на средах , содер- ж а щ и х 10 и 30 м к г / м л неомицина . Т р а н с ф о р м а н т ы , полученные с п о м о щ ь ю п л а з м и д н о й Д Н К pSG1912, и д е н т и ф и ц и р о в а л и среди колоний регенерантов на соевой среде пере- п е ч а т ы в а н и е м на газон со ш т а м м о м тест -культуры 165. Результаты и обсуждение. Меченная 3Н-ДНК pBR322 взята нами как модельная для изучения взаимодействия липосом с различным за- рядом и Д Н К . Установлено, что включение Д Н К зависит от заряда мембраны липосом. Наиболее высокий процент включения меченой Д И К отмечался в положительно заряженные липосомы и составлял 8 %, исходного количества Д Н К , тогда как в нейтральные липосомы вклю- чался 1,6 % Д Н К , а в отрицательно заряженные •— 0,8 %. Результаты трансформации хромосомной и плазмидной Д Н К , заключенной в липо- сомы, по маркерам /Л r1-, leu+, thi+leu+, Neor и по признаку угнетения роста тест-штамма (образование зон) представлены в таблице. Расчет частоты трансформации проводили по отношению полученных тран- сформантов к числу проверенных, тотально отсеянных колоний реге- нерантов в опытах с липосомами и включенной Д Н К . Ошибку вычисля- ли по Пуассону. Как видно из таблицы, трансформация протопластов хромосомной Д Н К , заключенной в липосомы, происходит с высокой частотой, которая на 2—3 порядка выше частоты трансформации с помощью Д Н К , ис- пользуемой без липосом. Частота образования одинарных и двойных трансформантов была одного порядка и практически не зависела от заряда мембраны липосом и концентрации Д Н К , используемой в наших исследованиях (1 мкг/мл и 0,1 мкг/мл). Частота трансформации прото- пластов с помощью Д Н К pSG19l2 и липосом по признаку угнетения роста тест-штамма 165 (рис. 1) составляла 2 - Ю - 1 на 1 мкг/мл Д Н К , тогда как при использовании плазмидной Д Н К без липосом она состав- ляла 3· Ю - 3 , что на два порядка ниже опытной. Всего выделено 439 кло- нов, 20 из которых были изучены биохимически для выявления плаз- миды pSG19l2. Все 20 проверенных клонов стабильно в течение 6—7 генераций сохраняли плазмидную Д Н К , которая по скорости движения в агарозном геле соответствовала характеристикам плазмиды pSG1912 (рис. 2). Необходимо отметить, что плазмидную Д Н К выделяли только по методу Бирнбойма и Доли, попытка выделить плазмиду методом равновесного центрифугирования в градиенте плотности CsCl — ЭБ была безуспешной. При хранении полученных клонов в течение 12 ге- нераций в лабораторных условиях у ряда трансформантов плазмиду выделить не удалось, хотя фенотип их сохранялся. Отбор неомицинустойчивых клонов, полученных при использовании Д Н К плазмиды pIJ2, осуществляли методом непрямой селекции с по- следующим отсевом на среды с неомицином в концентрации 10 и 271 БИОПОЛИМЕРЫ II КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 5 ЗО мкг/мл. Среди 1424 проверенных регенерантов было получено 232 клона, устойчивых к неомицину, т. е. частота появления неомицинре- зистентных клонов составляла 2· Ю - 1 на 1 мкг/мл Д Н К , тогда как в контроле без использования липосом она была 3 - Ю - 3 . Из указанных 232 Neor клонов 24 были отобраны для биохимической проверки на наличие плазмиды pIJ2. В результате проведенного скрининга плазмида pIJ2 обнаружена только у двух кло- нов. Наличие плазмиды pIJ2 под- тверждалось каждой из проверок в течение семи генераций (рис. 3). При дальнейшем хранении этих клонов в течение 11—12 генераций фенотип их сохранялся, но плазмиду выделить не удалось. Это, по-видимому, связано Рис. 1. Угнетение роста ш т а м м а 165 ш т а м м о м 1912 и т р а н с ф о р м а н т а м и . Газон ш т а м м а 165, на который н а л о ж е н ы а г а р о в ы е блоки с в ы р о с ш и м и к у л ь т у р а м и : справа — ш т а м м 1912; внизу — ш т а м м 165; в в е р х у — ш т а м м 68 ( б е с п л а з м и д н ы й ) ; в центре и слева — т р а н с ф о р м а н т ы . F i g . 1. Inh ib i t i on of s t r a i n 165 g r o w t h by s t r a i n 1912 and t r a n s f o r m a n t s . P l a t e wi th c u l t u r e of s t r a i n 165, w h e r e a g a r b locks wi th g r o w n c u l t u r e s a re s u p e r p o s e d : on the r i gh t — s t r a i n 1912, in the lower p a r t — s t r a i n 165, in the uppe r p a r t — s t r a i n 68 (with ' . - ' p l a s m i d ) , in the c e n t r e a n d on the le f t — t r a n s f o r m a n t s . Рис. 2. Э л е к т р о ф о р е з в а г а р о з н о м геле п р е п а р а т о в п л а з м и д н о й Д Н К , выделенной из ш т а м м а реципиента S. griseus 68-31, т р а н с ф о р м а н т о в 44, 40а, 34, 29, 23, 5, 1 [ 2 — 8 ] . F i g . 2. A g a r o s e gel e l e c t r o p h o r e s i s in the p r e p a r a t i o n s of p l a s m i d D N A iso la ted f r o m t r a n s f o r m a n t s : 1 — s t r a in - r ec ip i en t 5 . griseus 68-31; 2-8 — t r a n s f o r m a n t s 44, 40a, 34, 29 22, 5, 1. со встраиванием плазмиды в хромосому трансформанта, что и под- тверждается длительным сохранением маркера неомидинустойчи- вости, детерминированного плазмидой pIJ2. Высокая частота трансформации протопластов стрептомицетов с помощью хромосомной Д Н К , заключенной в липосомы, показана у S. coelicolor и S. clavulige- rus [6, 7]. В этих трансформационных системах ауксотрофные и прото- трофные штаммы поочередно служили и донорами, и реципиентами. Эффективность трансформации по маркерам прототрофности и анти- биотикорезистентности была одинаково высокой и составляла 10 тогда как по маркерам ауксотрофности экспрессировалось только 2— 4 % колоний. Возможно, такая высокая частота трансформации свя- зана с тем, что авторы для получения липосом использовали фосфоли- пиды, изолированные из клеточной стенки этих же стрептомицетов. Ис- пользование в наших исследованиях фосфолипидов другой природы позволило получить такой же высокий уровень трансформации, так что, по-видимому, природа фосфолипидов не играет такой важной роли в эффективности трансформации. Очевидно, определяющим здесь явля- 272 БИОПОЛИМЕРЫ II КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 5 юте я липосомы как инструмент для введения и защиты Д Н К . На пер- вых этапах работы с липосомами мы использовали смесь липосом и Д Н К (контроль 1), и частота трансформации в этом случае была на уровне частоты трансформации с помощью одной Д Н К без липосом (контроль 2). Липосомы при этом не влияли на регенерацию протопла- стов, и выживаемость после регенерации составляла в среднем от Чистота трансформации протопластов S. griseus 68-31 thi leu хромосомной и пла'лмидной ДИК Frequency of the transformation of protoplasts of S. griseus 68-31 thi leu by the chromosome and plasmid DXA П р и м е м a π и с. «-(-» - - с использованием липосом; «—-» — без них. Рис . 3. Э л е к т р о ф о р е з в а гарозном геле п р е п а р а т о в п л а з м и д н о й Д Н К : 1 — из S. lividans ТС8 (plJ2); 2 — из т р а н с ф о р м а н т а , ус- тойчивого к неомицину. F ig . 3. A g a r o s e gel e l ec t rophores i s of the p l a smid D N A p r e p a r a t i - ons : / — f r o m s t r a i n S. lividans TC8 (pIJ2) Neo r ; 2 — f r o m t r a n s f o r m s n t Neo r . 4·10Λ до 5—6·10Γ). При трансформации протопластов лизатом клеток как источником свободной Д Н К по хромосомным маркерам у 5. parvu- ius также получена высокая частота трансформации [19]. В наших ис- следованиях частота трансформации практически не отличалась при использовании положительно и отрицательно заряженных липосом, хотя ранее Ларквин [3, 20] при введении Д Н К плазмиды pBR322, меченной 3Н-тимидином, в протопласты листьев табака с помощью липосом пока- зал, что наиболее эффективными являются положительно заряженные липосомы. С одной стороны, они более эффективно защищают Д Н К от действия нуклеаз, а с другой — обладают более высокой ДНК-связыва- ющей способностью по сравнению с отрицательно заряженными липосо- мами, что позволяет использовать более низкие концентрации нуклеи- новых кислот и сводит к минимуму структурные и метаболические повреждения протопластов при взаимодействии с липосомами. Молеку- лярные механизмы поглощения Д Н К , заключенной в липосомы, изучены недостаточно, однако на основании высокой частоты трансформации, полученной в экспериментах с применением липосом, можно предполо- жить, что липосомы в данном случае функционируют как искусствен- ные протопласты, и здесь наблюдается процесс, аналогичный их слия- нию. Сначала происходит слияние мембран липосом и протопластов, а затем слияние и смешивание содержимого; при этом генетический ма- териал не подвергается разрушению из-за отсутствия нуклеаз периплаз- матического пространства клетки [21, 22]. Мейкинс [6] на основании собственных и литературных данных пришел к заключению, что в липосомы заключается Д Н К с молекуляр- ной массой 8—10-Ю6 в количестве, эквивалентном 3—5 копиям генома. 273 БИОПОЛИМЕРЫ II КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 5 Таким образом, с помощью хромосомной и плазмидной Д Н К , за- ключенной в липосомы, осуществлена трансформация протопластов 5. griseus, которая по эффективности была на 2—3 порядка выше конт- рольной без использования липосом. T R A N S F O R M A T I O N O F STREPTOMYCES GRISEUS P R O T O P L A S T S BY C H R O M O S O M A L A N D P L A S M I D D N A I N C A P S U L A T E D IN L Y P O S O M E S A. S. Stetiko, B. P. Matselyakh, T. D. Dekhtyarenko, Ε. E. Stephanishin, Α. V. Siefanov, N. K. Bezkorovainaya, Ε. V. Polishchuk, N. N. Mashkovsky D. K. Z a b o l o t n y I n s t i t u t e of M i c r o b i o l o g y a n d V i ro logy , A c a d e m y of Sc iences of the U k r a i n i a n S S R , Kiev S u m m a r y S. griseus p r o t o p l a s t s a re t r a n s f o r m e d by c h r o m o s o m a l and p l a s m i d D N A i n c a p s u l a t e d in l iposomes . The f r e q u e n c y of t r a n s f o r m a t i o n by c h r o m o s o m a l m a r k e r s of p r o t o t r o p h i t y and by p l a s m i d m a r k e r s of r e s i s t a n c e to n e o m y c i n a n d the f o r m a t i o n of g r o w t h inhib i t ion z o n e s by m e a n s of D N A i n c a p s u l a t e d in l i posomes w a s t w o - t h r e e o r d e r s h i g h e r in c o m p a - r i son wi th con t ro l D N A w i t h o u t l iposomes . P l a s m i d D N A w a s i so la ted f r o m t r a n s f o r m a n t s and r e m a i n e d s t a b l e for 6-7 g e n e r a - t ions , p h e n o t y p e b e i n g u n c h a n g e d for 12 g e n e r a t i o n s . 1. Ostro M. D., Giacomoni D., Drey S. I n c o r p o r a t i o n of h igh m o l e c u l a r w e i g h t R N A in to l a r g e a r t i f i c i a l lipid v e s i c l e s / ' / B i o c h e m . a n d B iophys . Res. C o m m u n s . — 1977.—76, N 3. — P . 836—842. 2. Dimitriadis G. E n t r a p m e n t of p l a s m i d D N A in l i p o s o m e s / / N u c l . Ac ids R e s . — 1979.— 6, N 6. — P. 2697—2705. 3. Eurguin P. F. B i n d i n g of p l a s m i d loaded l i posomes to p l a n t p r o t o p l a s t s va l i d i t y of b iochemica l m e t h o d s to e v a l u a t e the t r a n s f e r of e x o g e n o u s D N A / / P l a n t SciL L e t t . — 1981.—21, N 1. — P . 31—40. 4. Introduction of l i posome i n c a p s u l a t e d SV-40 D N A in to cel ls / R. F r a l e v , S. S u b r a m a - ry, P . Be rg , D. P a p a h a d j o p u o l o s / / J. Biol. Chem. — 1980.—265, N 21. — P . 10431 — 10435. 5. Eiposomc-mediaied a s s o c i a t i o n of D N A wi th p l a n t p r o t o p l a s t s : i n f l u e n c e of ves ic le lipid compos i t i on / F. Rollo, S. F r a n c e s c o , G. Rino, P . B r u n o / / P l a n t Cell . C u l t . — 1 9 8 0 . - 2, N 1. — P . 237—246. 6. Makins J., Ilolt G. L i p o s o m e - p r o t o p l a s t i n t e r a c t i o n of mic rob ia l p r o d u c t / / F E M S symp . on o v e r p r o d u c t i o n of microb ia l p roduc t . — I i r a d e c Kra love , 1981. — P. 236. 7. Makins F., Ilolt G. L iposome-med ia t ed t r a n s f o r m a t i o n of Streptomyces of app l i ed c h r o m o s o m a l D N A / / N a t u r e . — 1981 .—293, N 5834. — P . 671—673. 8. Eiposomc-mediaied gene t i c t r a n s f o r m a t i o n of Neurospora crassa / ' A . R o o d f o r d , A. S a z - ci, M. J. T r a r e r , II . P a r i s i / / M o l . and Gen . Gene t . — 1981,—184, N 3. — P . 567—671. 9. Глумова Ε. Φ., Прозоров А. А. Т р а н с ф о р м а ц и я компетентных клеток посредством хромосомной и п л а з м и д н о й Д Н К , заключенной в липосомы / / Г е н е т и к а . — 1983.— 19, № 1 2 . — С. 1958—1963. 10. Willson Т., Papahadjopuolos DTaber R. The i n t r o d u c t i o n of po l io -v i rus R N A in to cel ls via lipid ves ic les ( l iposomes) / / C e l l . — 1979.—17, N 1. — P . 77—84. 11. Fucuda /., Nagata ΤTanabe J. L i p o s o m e - m e d i a t e d in fec t ion of p l a n t p r o t o p l a s t s w i th tobacco m o s a i c v i ru s R N A / / V i r o l o g y . — 1 9 8 4 . - 113, N 2. — P. 752—-760. 12 .Изучение п л а з м и д стрептомицетов глобиспориновой г р у п п ы / Л . В. П о л и ш у к , Т. Д . Д е х т я р е п к о , Ε. Е. С т е ф а н и ш и н и д р . / / М и к р о б и о л . ж у р н . — 1985.—49, № 4 . — С. 83—88. 13. Marmur J. A p r o c e d u r e for the i so la t ion of dc soxy r ibonuc l e i c acid f r o m m i c r o o r g a - n i s m s / / J . Мої . Biol. — 1961.—3, N 2. — P. 208—218. 14. Birnboim IE, Dolt/ / . A rap id e x t r a c t i o n p r o c e d u r e fo r s c r e e n i n g r e c o m b i n a n t p l a s m i d D N A / / Nucl . Acids Res. — 1979.—7, N 6. — P . 1513—1523. 15. Kir hi/ R., Wot/on S. Res t r i c t i on s tud i e s on the SCP2 p l a s m i d of 5 . coclicolor / / F E M S Let t . — 1979,—6, N 5. — P . 321—323. 16. Bangham Л. D., Hill Μ. M., Miller N. J. A. P r e p a r a t i o n and use of l i posomes as mo- dels of b io log ica l m e m b r a n e s / / M e t h o d s in m e m b r a n e b io logy . — N e w York : P l e n u m press , 1974.— Vol . 1. — P . 1—68. 17. Стенько А. С., Безкоровайная II. I\. Получение и регенерация протопласт 5 . grise- us / / Микробиол . ж у р н . — 1983,—45, № 4. — С. 29—33. 18. Hopwood D. Α., Wright Η. Μ. Bac t e r i a l p r o t o p l a s t f u s i o n : r e c o m b i n a t i o n in fused pro- t o p l a s t s of 5 . coclicolor / j Alol. and Gen . Gene t . — 1978.—162, N 2. — P. 307—317. (Окончание см. на. с. 278). 274 БИОПОЛИМЕРЫ II КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 5 ge l s / I. D r e t g e n , M. Be l l a rd , P . S a s s o n e - C o r s i , P . C h a m b o n / / Ana l . B iochcm — 1981.— 112, N 2 . — P . 295—298. 7. Maniatis Т., Fritsch E. F., Sambrook J. M o l e c u l a r c l o n i n g — a l a b o r a t o r y m a n u a l . — N e w York : Cold S p r i n g H a r b o r , 1982.—545 p. 8. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной г е н е т и к е . — М . : Мир, 1 9 7 6 — 4 3 6 с. 9 Beck Ε link В. Nucleotide sequence and genome organization of filamentous bacte- r i o p h a g e s f l and fd / / Gene . — 1981.—16, N 1. — P . 35—58. 10 Collins J. De le t ions , i n se r t i ons and r e a r r a n g e m e n t s a f f e c t i n g rpoB g e n e e x p r e s s i o n / / Мої . and Gen . Gene t . — 1979.—173, N 1. — P. 217—220. Ин-т молекуляр . биологии и генетики А Н У С С Р , Получено 15.02.86 Киев Окончание. Начало см. на с. 270—274. 19. ОсЫ К. P r o t o p l a s t f u s i o n / / M o l e c u l a r b r e e d i n g and gene t i c s of app l ied m i c r o o r g a - n i s m s / E d s K. S a k a g u c h i , M. Okan i sh i . — N e w York : Acad , p ress , 1980 .— P. 88—94. 20. Lurquin P., Sheely R., Rao N. Q u a n t i t a t i v e a s p e c t s of nuc le ic acid s e q u e s t r a t i o n in l a r g e l i posomes and thei r e f f e c t s on p l a n t p r o t o p l a s t / / ' F E B S Let t . — 1981 —25 N 2 — P. 183—187. 21. Weisman O., Cohen С., Η off stein S. I n t r o d u c t i o n of e n z y m e s by m e a n s of l i posomes , i n to n o n - p h a g o c v t i c h u m a n cel ls in vitro / / Biochim. et b iophvs . ac ta — 1977—49δ ' N 2. — P . 375—385. 22. Маргулис JI. Б., Иейфах А. А. В з а и м о д е й с т в и е липосом с клетками . Л и п о с о м ы с ж и д к о к р и с т а л л и ч е с к о й мембраной / / Успехи соврем, б и о л о г и и . — 1982 —93 N° 2 — С. 211—229. Ин-т микробиологии и вирусологии Получено 22.07.85 им. Д . К. З а б о л о т н о г о А Н У С С Р , Киев 278 БИОПОЛИМЕРЫ II КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 5

Ähnliche Einträge