Изучение экспрессии экзогенного гена инсулина человека, находящегося под контролем регуляторной области гена hsp70 дрозофилы, в фибробластах человека
Сконструирован вектор, в котором ген инсулина человека находится под контролем регуляторной области гена hsp70 дрозофилы. Изучена экспрессия данного гена в фибробластах человека под действием теплового шока. Показано, что в ответ на тепловой шок наблюдается 4-кратное увеличение экспрессии гена инсул...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Дата: | 1990 |
| Автори: | , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1990
|
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153049 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Изучение экспрессии экзогенного гена инсулина человека, находящегося под контролем регуляторной области гена hsp70 дрозофилы, в фибробластах человека / Л.Н. Неборачко, Л.Л. Лукаш, И.С. Варзанова, В.А. Кордюм // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 1. — С. 88-90,106. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-153049 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Неборачко, Л.Н. Лукаш, Л.Л. Варзанова, И.С. Кордюм, В.А. 2019-06-13T13:06:55Z 2019-06-13T13:06:55Z 1990 Изучение экспрессии экзогенного гена инсулина человека, находящегося под контролем регуляторной области гена hsp70 дрозофилы, в фибробластах человека / Л.Н. Неборачко, Л.Л. Лукаш, И.С. Варзанова, В.А. Кордюм // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 1. — С. 88-90,106. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00024D https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153049 577.21:579.25.15 Сконструирован вектор, в котором ген инсулина человека находится под контролем регуляторной области гена hsp70 дрозофилы. Изучена экспрессия данного гена в фибробластах человека под действием теплового шока. Показано, что в ответ на тепловой шок наблюдается 4-кратное увеличение экспрессии гена инсулина человека. Сконструйований вектор, у якому ген інсуліну людини знаходиться під контролем регуляторної області гена hsp70 дрозофіли. Вивчено експресію даного гена у фібробластах людини під дією теплового шоку. Показано, що у відповідь на тепловий шок спостерігається чотириразове підвищення експресії гена інсуліну людини. A vehicle has been constructed where the human insulin gene is under control of the regulatory region of hspJO Dr. melanogaster gene. The expression of this gene in human fibroblasts under the effect of heat shock has been studied. It is shown that four-fold increase in the expression of the human insulin gene is observed in response to heat shock. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Изучение экспрессии экзогенного гена инсулина человека, находящегося под контролем регуляторной области гена hsp70 дрозофилы, в фибробластах человека Вивчення експресії екзогенного гена інсуліну людини, що знаходиться під контролем регуляторної області гена hsp70 дрозофіли, в фібробластах людини Studies in expression of human exogenous insulin gene under control of regulatory region of hsp70 dr. melanogaster gene in human fibroblasts Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Изучение экспрессии экзогенного гена инсулина человека, находящегося под контролем регуляторной области гена hsp70 дрозофилы, в фибробластах человека |
| spellingShingle |
Изучение экспрессии экзогенного гена инсулина человека, находящегося под контролем регуляторной области гена hsp70 дрозофилы, в фибробластах человека Неборачко, Л.Н. Лукаш, Л.Л. Варзанова, И.С. Кордюм, В.А. |
| title_short |
Изучение экспрессии экзогенного гена инсулина человека, находящегося под контролем регуляторной области гена hsp70 дрозофилы, в фибробластах человека |
| title_full |
Изучение экспрессии экзогенного гена инсулина человека, находящегося под контролем регуляторной области гена hsp70 дрозофилы, в фибробластах человека |
| title_fullStr |
Изучение экспрессии экзогенного гена инсулина человека, находящегося под контролем регуляторной области гена hsp70 дрозофилы, в фибробластах человека |
| title_full_unstemmed |
Изучение экспрессии экзогенного гена инсулина человека, находящегося под контролем регуляторной области гена hsp70 дрозофилы, в фибробластах человека |
| title_sort |
изучение экспрессии экзогенного гена инсулина человека, находящегося под контролем регуляторной области гена hsp70 дрозофилы, в фибробластах человека |
| author |
Неборачко, Л.Н. Лукаш, Л.Л. Варзанова, И.С. Кордюм, В.А. |
| author_facet |
Неборачко, Л.Н. Лукаш, Л.Л. Варзанова, И.С. Кордюм, В.А. |
| publishDate |
1990 |
| language |
Russian |
| container_title |
Биополимеры и клетка |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Вивчення експресії екзогенного гена інсуліну людини, що знаходиться під контролем регуляторної області гена hsp70 дрозофіли, в фібробластах людини Studies in expression of human exogenous insulin gene under control of regulatory region of hsp70 dr. melanogaster gene in human fibroblasts |
| description |
Сконструирован вектор, в котором ген инсулина человека находится под контролем регуляторной области гена hsp70 дрозофилы. Изучена экспрессия данного гена в фибробластах человека под действием теплового шока. Показано, что в ответ на тепловой шок наблюдается 4-кратное увеличение экспрессии гена инсулина человека.
Сконструйований вектор, у якому ген інсуліну людини знаходиться під контролем регуляторної області гена hsp70 дрозофіли. Вивчено експресію даного гена у фібробластах людини під дією теплового шоку. Показано, що у відповідь на тепловий шок спостерігається чотириразове підвищення експресії гена інсуліну людини.
A vehicle has been constructed where the human insulin gene is under control of the regulatory region of hspJO Dr. melanogaster gene. The expression of this gene in human fibroblasts under the effect of heat shock has been studied. It is shown that four-fold increase in the expression of the human insulin gene is observed in response to heat shock.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153049 |
| citation_txt |
Изучение экспрессии экзогенного гена инсулина человека, находящегося под контролем регуляторной области гена hsp70 дрозофилы, в фибробластах человека / Л.Н. Неборачко, Л.Л. Лукаш, И.С. Варзанова, В.А. Кордюм // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 1. — С. 88-90,106. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT neboračkoln izučenieékspressiiékzogennogogenainsulinačelovekanahodâŝegosâpodkontrolemregulâtornoioblastigenahsp70drozofilyvfibroblastahčeloveka AT lukašll izučenieékspressiiékzogennogogenainsulinačelovekanahodâŝegosâpodkontrolemregulâtornoioblastigenahsp70drozofilyvfibroblastahčeloveka AT varzanovais izučenieékspressiiékzogennogogenainsulinačelovekanahodâŝegosâpodkontrolemregulâtornoioblastigenahsp70drozofilyvfibroblastahčeloveka AT kordûmva izučenieékspressiiékzogennogogenainsulinačelovekanahodâŝegosâpodkontrolemregulâtornoioblastigenahsp70drozofilyvfibroblastahčeloveka AT neboračkoln vivčennâekspresííekzogennogogenaínsulínulûdiniŝoznahoditʹsâpídkontrolemregulâtornoíoblastígenahsp70drozofílivfíbroblastahlûdini AT lukašll vivčennâekspresííekzogennogogenaínsulínulûdiniŝoznahoditʹsâpídkontrolemregulâtornoíoblastígenahsp70drozofílivfíbroblastahlûdini AT varzanovais vivčennâekspresííekzogennogogenaínsulínulûdiniŝoznahoditʹsâpídkontrolemregulâtornoíoblastígenahsp70drozofílivfíbroblastahlûdini AT kordûmva vivčennâekspresííekzogennogogenaínsulínulûdiniŝoznahoditʹsâpídkontrolemregulâtornoíoblastígenahsp70drozofílivfíbroblastahlûdini AT neboračkoln studiesinexpressionofhumanexogenousinsulingeneundercontrolofregulatoryregionofhsp70drmelanogastergeneinhumanfibroblasts AT lukašll studiesinexpressionofhumanexogenousinsulingeneundercontrolofregulatoryregionofhsp70drmelanogastergeneinhumanfibroblasts AT varzanovais studiesinexpressionofhumanexogenousinsulingeneundercontrolofregulatoryregionofhsp70drmelanogastergeneinhumanfibroblasts AT kordûmva studiesinexpressionofhumanexogenousinsulingeneundercontrolofregulatoryregionofhsp70drmelanogastergeneinhumanfibroblasts |
| first_indexed |
2025-11-24T06:33:18Z |
| last_indexed |
2025-11-24T06:33:18Z |
| _version_ |
1850843084247531520 |
| fulltext |
УДК 577.(21:579.25.15
Л. Η. Неборачко, Л. Л. Лукаш, И. С. Варзанова, В. А. Кордюм
ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ЭКЗОГЕННОГО ГЕНА ИНСУЛИНА
ЧЕЛОВЕКА, НАХОДЯЩЕГОСЯ ПОД КОНТРОЛЕМ
РЕГУЛЯТОРНОЙ ОБЛАСТИ ГЕНА hsp70 ДРОЗОФИЛЫ,
В ФИБРОБЛАСТАХ ЧЕЛОВЕКА
Сконструирован вектор, в котором ген инсулина человека находится под контролем ре-
гуляторноїй области гена hsp70 дрозофилы. Изучена экспрессия данного гена в фиб-
робластах человека под действием теплового шока. Показано, что в ответ на тепловой
шок наблюдается 4-кратное увеличение экспрессии гена инсулина человека.
Одной из актуальных проблем генной терапии является регуляция экс-
прессии чужеродных генов. Данную проблему в определенной мере
можно будет разрешить, используя регуляторные области индуцибель-
ных генов, таких как гены теплового шока, металлотионеиновые гены,
гены, регулируемые гормонами, и т. д. Весьма перспективны в этом
отношении гены теплового шока. Они индуцируются не только тепло-
вым воздействием, но и некоторыми химическими агентами, различны-
ми вирусами, ионами тяжелых металлов.
Гены теплового шока консервативны. Наибольшей степенью кон-
сервативности обладает ген hsp70 дрозофилы. Нуклеотидные последо-
вательности 70К генов дрожжей и других грибов, насекомых, цыплят,
обезьян, человека гомологичны на 68—70 % [1]. Ген hsp70 дрозофилы
гомологичен аналогичному гену теплового шока человека на 73 %.
Этот ген клонирован и секвенирован [2, 3]. Определена нуклеотидная
последовательность б'-фланкирующего района, обусловливающая ответ
на тепловой шок [4]. Все эти данные позволяют использовать регуля-
рне. 1. Схема конструирования вектора, в котором ген инсулина человека находится
под контролем регуляторної! области гена hsp70 дрозофилы
Fig. 1. Scheme for cons t ruc t ion of a vehicle where the h u m a n insulin gene is under con-
trol of r egu la to ry region of hsp70 Dr. melanogaster gene
торную область гена hsp70 дрозофилы для осуществления индукции
экспрессии генов. Авторы работы [5] сконструировали рекомбинантную
Д Н К , в которой ген гормона роста человека, лишенный собственного
промотора, находится под контролем регуляторной области гена hsp70
дрозофилы, и наблюдали 1000-кратное увеличение синтеза этого гормо-
на в клетках CHO хомяка и COS-1-клетках обезьяны в ответ на тепло-
вой шок. В другой работе показано также 100- и 1000-кратное увели-
88 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И К Л Е Т К А . 1990. Т. 6. Λ» 1
чение синтеза β-интерферона человека в клетках почек обезьяны, хомя-
ков и эпителия человека в ответ на подобное воздействие при транс-
фекции этих клеток молекулярной конструкцией, в которой ген β-интер-
ферона контролируется регуляторной областью hsp70 дрозофилы [6].
Ранее нами было показано, что в фибробластах человека и мыши
происходит конститутивный синтез белка — продукта гена инсулина
Рис. 2. Синтез проинсулина/инсулина (результаты двух опытов) фибробластами чело-
века (содержание в 1 мл культуралыюй среды), трансфицирозанными Д Н К плазмиды
pGA307 (hs- ins) , после теплового шока (120 мин, 42 °С). Штрих-пунктирной линией
отмечен уровень синтеза проинсулина/инсулина фибробластами в отсутствие тепло-
вого шока
Fig. 2. Synthes is of p ro insu l in / insu l in by h u m a n f ibroblas t s t r ans fcc tcd by p lasmid
pGA307 (hs-ins) DNA a f t e r heat shock (120 min, 42 °С). Level of p ro insu l in / insu l in syn-
thesis by f ibroblas t s in the absence of heat shock is des igna ted by dot ted line
сохранившего собственный промотор [7]. В данной работе приводится
конструирование рекомбинантной Д Н К , в которой ген инсулина чело-
века находится под контролем регуляторной области гена hsp70 дро-
зофилы, и изучение его экспрессии в фибробластах мыши. Схема кон-
струирования приведена на рис. 1. Регуляторная область гена hsp70
получена из Д Н К плазмиды 123, предоставленной нам А. Д. Мирзабе-
ковым. Данная плазмида представляет собой pBR322, в EcoRI-сайт
которой клонированы один полный ген hsp70 дрозофилы и неполный
ген в обратной ориентации без регуляторной области [2J. Обработка
Д Н К плазмиды одновременно двумя рестриктазами BamHI и SalGJ
дала нам возможность получить фрагмент этой плазмиды размером
500 тысяч пар нуклеотидов (т. п. н.), включающий регуляторную об-
ласть hsp70 гена дрозофилы.
Источником Д Н К , содержащей ген инсулина человека, служила
плазмида pBR322-ins. Она описана нами в [7]. При совместном гидро-
лизе Д Н К этой плазмиды рестриктазами EcoRI и SalGI образуются
два фрагмента: 4200 и 2700 т. п. н. Последний содержит ген инсулина
человека. BamHI-SalGI-фрагмент Д Н К плазмиды 123, несущий регу-
ляторную область гена hsp70 дрозофилы, лигировали по липким SalGI-
концам с фрагментом Д Н К , содержащим ген инсулина человека. В ка-
честве вектора использовали Д Н К плазмиды pGA307, полученной от
д-ра Л. Симиновича (Канада) . Данная плазмида содержит слитые ге-
ны IufB-IacZ без промотора для эукариотических клеток. В плазмиде
pGA307 имеется ранний промотор вируса SV40, однако он ориентиро-
ван в противоположном направлении по отношению к генам tufB-lacZ
и не способен обеспечить их экспрессию в эукариотических клетках.
Плазмида pGA307 содержит также точку начала репликации вируса
SV40, сигнал полиаденилирования и промежуточную последователь-
88 I S S N 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И К Л Е Т К А . 1990. Т. 6. Λ» 1
ность для ранних транскриптов SV40, а также маркер антибиотикоре-
зистентности для клеток Escherichia colt: Amp r . Перед слитыми генами
tufB-lacZ находится уникальный BamHI-сайт, удобный для встраива-
ния промотороподобных последовательностей. Данная плазмида пред-
назначена для их поиска. Совместным неполным гидролизом рестрик-
тазами BamHI и EcoRI мы удалили из ДНК! плазмиды pGA307 фраг-
мент, несущий гены tufB-lacZ, и на их место по BamHI- и EcoRI-сайтам
встроили ген инсулина человека под контролем регуляторной области
гена hsp70 дрозофилы.
Полученной плазмидой трансфицировали фибробласты человека.
В опытах использовали диплоидный штамм ЛЭЧ, полученный нами из
коллекции Нн-та вирусологии АМН СССР им. Д. И. Ивановского. На-
чиная с 3-х сут после трансфекции клетки ежесуточно подвергали теп-
ловому шоку (42 °С) в течение различного времени: 60, 120 и 180 мин,
после чего их продолжали выращивать при 37 °С. Концентрацию про-
инсулина/инсулина в культуральной среде определяли спустя 15—20 ч
после теплового шока конкурентным твердофазным иммунофермент-
ным анализом. Способ определения описан ранее [7]. Наши экспери-
менты показали, что продукция проинсулина/инсулина фибробластами
человека зависит от длительности теплового шока. Тепловой шок в те-
чение 60 мин при 42 °С не приводил к значительному увеличению про-
дукции проинсулина/инсулина клетками Л Э Ч ; в течение 180 мин —-
вызвал резкое падение выживаемости клеток. Самым эффективным
был признан режим: 120 мин, 42 °С. Наибольший выход проинсулина/
инсулина при такой тепловой обработке отмечен на 3-й сут после транс-
фекции (рис. 2) . Он достигал приблизительно 250 иг/мл. Начиная с
4-х и вплоть до 6-х сут наблюдалось снижение синтеза проинсулина/ин-
сулина после ежесуточного теплового шока и далее снова следовал
подъем. На 9-е сут после трансфекции выход белка-продукта равнялся
125 нг/мл. В отсутствие теплового шока происходил конститутивный
синтез проинсулина/инсулина фибробластами. Он достигал приблизи-
тельно 60 нг /мл белка-продукта. Поскольку уровень экспрессии в та-
ком режиме совпадал с таковым, наблюдаемым при трансфекции фиб-
робластов Д Н К плазмиды, где ген инсулина человека находился под
собственным промотором, то мы предположили, что и в данном случае
транскрипция гена проинсулина/инсулина происходит с собственного
промотора.
Таким образом, в клетках Л Э Ч под действием теплового шока на-
блюдается приблизительно 4-кратное увеличение экспрессии гена ин-
сулина человека, находящегося под контролем регуляторной области
гена hsp70 дрозофилы, по отношению к уровню, обеспечиваемому его
собственным промотором, т. е. имеет место индукция экспрессии дан-
ного гена. Это открывает интересную перспективу — организацию тре-
буемого базового уровня синтеза целевого продукта и при необходи-
мости увеличение его количества по команде извне.
S T U D I E S IN E X P R E S S I O N O F H U M A N E X O G E N O U S I N S U L I N G E N E
U N D E R C O N T R O L O F REGULATORY R E G I O N O F hsp70
DR. MELANOGASTER G E N E IN H U M A N F I B R O B L A S T S
L. N. Neborachko, L. L. L u k a s h , I- S. Varzanova, V. A. Kordium
Ins t i tu te of Molecular Biology and Genetics,
Academy of Sciences of the Ukra in ian SSR, Kiev
S u m m a r y
A vehicle has been const ructed where the h u m a n insulin gene is under control of the
r e g u l a t o r y region of hsp70 Dr. melanogaster gene. The express ion of this gene in human
f ib rob las t s under the effect of hea t shock has been s tudied. It is shown tha t four-fold
increase in the express ion of the h u m a n insulin gene is observed in response to hea t
shock.
Окончание см. на с. 106.
88 I S S N 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И К Л Е Т К А . 1990. Т. 6. Λ» 1
2. Соловьян, В. Т., Костенюк И. А., Кунах В. А. Изменения генома культивируемых in
vitro клеток раувольфии з м е и н о й / / Г е н е т и к а . — 1987.— 23, № 7 .—С. 1200—1208.
3. Nucleic acid hybridization. A practical approach / Eds В. D. Hames, S. J. Higgins .—
New York : LRL press, 1986.—225 p.
4. Маниатис Т., Фрич 3., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование.— М. : Мир, 1984.—
480 с.
Ин-т молекуляр. биологии и генетики АН УССР, Киев Получено 05.06.89
Окончание. Начало см. на с. 88—90.
С П И С О К Л И Т Е Р А Т У Р Ы
1. Schlesinger М. J., Kelly P. M., Miperti G. Proper t ies of three ma jo r heat shock proteins
and their a n t i b o d i e s / / H e a t shock from bacteria to m a n . — N e w York : Cold Spr ing
Harbor Lab., 19'82.— P. 243—246.
2. Goldschmidt-Clermont Μ. E. Two genes for the ma jo r heat shock proteins of Droso-
phila melanogaster a r ranged as inverted r e p e a t / / N u c l . Acids Res.— 1980.— 8, N 2.—
P. 235—252.
3. Craig E. A., McCarthy B. /., Wadsworth S. C. Sequence organiza t ion of two recombi-
nan t p lasmids conta in ing genes for the ma jo r heat shock induced protein of Drosophi-
Ia melanogaster 11 Cell.— 1979.—60, N 2 , — P . 575—581.
4. Pelham H. R. B. A regula tory ups t ream promoter element in Drosophila H s p 7 0 + h e a t
shock g e n e / / I b i d . — 1982.—30, N 2 . — P . 517—528.
5. High-level heat- regulated synthesis of proteins in eukaryotic c e l l s / M . Dreano, J. Bro-
chot, A. Myers et al. / / Gene.— 1 9 8 6 . - 4 9 , N 1.— P. 1—8.
6. Interferon production under the control of heterologous inducible enhancers and pro-
m o t e r s / A . Masahite, N. Hitoshi, I. Yoichiro et a l . / / M i c r o b i o l , and I m m u n o l — 1988.—
32, N 6,— P. 589—596.
7. Исследование возможности экспрессии экзогенного гена инсулина человека в культи-
вируемых фибробластах млекопитающих / Л. Н. Неборачко, Л. Л. Лукаш, Б. М. Тро-
яновский и д р . / / Б и о п о л и м е р ы и клетка.— 1989.— 5, № 2.— С. 58—61.
8. An G., Hidaka К., Siminovitch L. Expression of bacterial β-galac tos idase in animal
c e l l s / / М о ї . and Cell. Biol.— 1982.— 2, -N 12.—P. 1628—1632.
Ин-т молекуляр. биологии и генетики АН УССР, Киев Получено 24.07.89
88 I S S N 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И К Л Е Т К А . 1990. Т. 6. Λ» 1
|