Конформационные изменения липопротеинов высокой плотности в процессе насыщения холестерином

Методом оптического смешения измеряли изменение размеров липопротеинов высокой плотности (ЛПВП3) плазмы крови человека в зависимости от времени инкубации их с эритроцитами в присутствии ингибитора лецитин-холестерин-ацилтрансферазы (ЛХАТ) и без него. Показано, что в присутствии ОТМВ кинетика обмена...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	1986
Автори:	Носкин, В.А., Шмелев, Г.Е., Ломакин, А.В., Петрова-Маслакова, Л.Г., Парфенова, Н.С., Белова, Е.В., Климов, А.Н.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1986
Назва видання:	Биополимеры и клетка
Теми:	Структура и функции биополимеров
Онлайн доступ:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153168
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Конформационные изменения липопротеинов высокой плотности в процессе насыщения холестерином / В.А. Носкин, Г.Е. Шмелев, А.В. Ломакин, Л.Г. Петрова-Маслакова, Н.С. Парфенова, Е.В. Белова, А.Н. Климов // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 6. — С. 293-301. — Бібліогр.: 18 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-153168
record_format	dspace
spelling	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1531682025-02-23T18:26:20Z Конформационные изменения липопротеинов высокой плотности в процессе насыщения холестерином Конформаційні зміни ліпопротеїнів високої щільності у процесі насичення холестерином High density lipoprotein conformation changes in the process of saturation by cholesterol Носкин, В.А. Шмелев, Г.Е. Ломакин, А.В. Петрова-Маслакова, Л.Г. Парфенова, Н.С. Белова, Е.В. Климов, А.Н. Структура и функции биополимеров Методом оптического смешения измеряли изменение размеров липопротеинов высокой плотности (ЛПВП3) плазмы крови человека в зависимости от времени инкубации их с эритроцитами в присутствии ингибитора лецитин-холестерин-ацилтрансферазы (ЛХАТ) и без него. Показано, что в присутствии ОТМВ кинетика обмена холестерином между ЛПВП3 и мембранами эритроцитов удовлетворяет уравнению скорости реакции первого порядка. Показано, что постоянная скорости обмена холестерином пропорциональна концентрации мембран, что говорит в пользу того, что перенос холестерина происходит при непосредственном контакте липопротеинов с эритроцитами. В случае отсутствия ОТМВ кинетика обмена холестерином имеет более сложный характер. Обсуждаются механизмы изменения среднего размера ЛПВП3 при накоплении холестерина как в присутствии ингибитора ЛХАТ, так и без него. Методом оптичного змішування вимірювали зміну розмірів ліпопротеїнів високої щільності (ЛПВЩ3) плазми крові людини залежно від часу інкубації їх з еритроцитами за присутності інгібітора лецитин-холестерин-ацилтрансферази (ЛХАТ) і без нього. Показано, що за присутності ОТМВ кінетика обміну холестерином між ЛПВЩ3 і мембранами еритроцитів задовольняє рівнянню швидкості реакції першого порядку. Показано, що постійна швидкості обміну холестерином пропорційна концентрації мембран, що свідчить на користь того, що перенесення холестерину відбувається за безпосереднього контакту ліпопротеїнів з еритроцитами. У разі відсутності ОТМВ кінетика обміну холестерином має складніший характер. Обговорюються механізми зміни середнього розміру ЛПВЩ3 при накопиченні холестерину як за присутності інгібітора ЛХАТ, так і без нього. By means of quasielastic light scattering the size of human high density lipoproteins (HDL3) has been determined depending on the time of their incubation with erythrocytes both in the presence of the lecitin-cholesterol-acyltransferase inhibitor (DTNB) and without it. It has been shown that in the presence of DTNB the exchange of cholesterol between HDL3 and membranes of erythrocytes is a first-order reaction. From the temperature dependence of rate constant the activation energy of cholesterol exchange Ea = 6.5 ± 0.2 kkal/mol has been calculated. The reaction rate appears to be proportional to membrane concentration, which evidences in favour of contact transfer of cholesterol. In the absence of DTNB the cholesterol exchange has a more complicated kinetics. An attempt has been made to explain the behaviour of HDL3 average size during incubation with erythrocytes both in the presence of DTNB and without it. 1986 Article Конформационные изменения липопротеинов высокой плотности в процессе насыщения холестерином / В.А. Носкин, Г.Е. Шмелев, А.В. Ломакин, Л.Г. Петрова-Маслакова, Н.С. Парфенова, Е.В. Белова, А.Н. Климов // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 6. — С. 293-301. — Бібліогр.: 18 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0001C6 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153168 532.72.097 ru Биополимеры и клетка application/pdf Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров
spellingShingle	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров Носкин, В.А. Шмелев, Г.Е. Ломакин, А.В. Петрова-Маслакова, Л.Г. Парфенова, Н.С. Белова, Е.В. Климов, А.Н. Конформационные изменения липопротеинов высокой плотности в процессе насыщения холестерином Биополимеры и клетка
description	Методом оптического смешения измеряли изменение размеров липопротеинов высокой плотности (ЛПВП3) плазмы крови человека в зависимости от времени инкубации их с эритроцитами в присутствии ингибитора лецитин-холестерин-ацилтрансферазы (ЛХАТ) и без него. Показано, что в присутствии ОТМВ кинетика обмена холестерином между ЛПВП3 и мембранами эритроцитов удовлетворяет уравнению скорости реакции первого порядка. Показано, что постоянная скорости обмена холестерином пропорциональна концентрации мембран, что говорит в пользу того, что перенос холестерина происходит при непосредственном контакте липопротеинов с эритроцитами. В случае отсутствия ОТМВ кинетика обмена холестерином имеет более сложный характер. Обсуждаются механизмы изменения среднего размера ЛПВП3 при накоплении холестерина как в присутствии ингибитора ЛХАТ, так и без него.
format	Article
author	Носкин, В.А. Шмелев, Г.Е. Ломакин, А.В. Петрова-Маслакова, Л.Г. Парфенова, Н.С. Белова, Е.В. Климов, А.Н.
author_facet	Носкин, В.А. Шмелев, Г.Е. Ломакин, А.В. Петрова-Маслакова, Л.Г. Парфенова, Н.С. Белова, Е.В. Климов, А.Н.
author_sort	Носкин, В.А.
title	Конформационные изменения липопротеинов высокой плотности в процессе насыщения холестерином
title_short	Конформационные изменения липопротеинов высокой плотности в процессе насыщения холестерином
title_full	Конформационные изменения липопротеинов высокой плотности в процессе насыщения холестерином
title_fullStr	Конформационные изменения липопротеинов высокой плотности в процессе насыщения холестерином
title_full_unstemmed	Конформационные изменения липопротеинов высокой плотности в процессе насыщения холестерином
title_sort	конформационные изменения липопротеинов высокой плотности в процессе насыщения холестерином
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1986
topic_facet	Структура и функции биополимеров
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153168
citation_txt	Конформационные изменения липопротеинов высокой плотности в процессе насыщения холестерином / В.А. Носкин, Г.Е. Шмелев, А.В. Ломакин, Л.Г. Петрова-Маслакова, Н.С. Парфенова, Е.В. Белова, А.Н. Климов // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 6. — С. 293-301. — Бібліогр.: 18 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT noskinva konformacionnyeizmeneniâlipoproteinovvysokojplotnostivprocessenasyŝeniâholesterinom AT šmelevge konformacionnyeizmeneniâlipoproteinovvysokojplotnostivprocessenasyŝeniâholesterinom AT lomakinav konformacionnyeizmeneniâlipoproteinovvysokojplotnostivprocessenasyŝeniâholesterinom AT petrovamaslakovalg konformacionnyeizmeneniâlipoproteinovvysokojplotnostivprocessenasyŝeniâholesterinom AT parfenovans konformacionnyeizmeneniâlipoproteinovvysokojplotnostivprocessenasyŝeniâholesterinom AT belovaev konformacionnyeizmeneniâlipoproteinovvysokojplotnostivprocessenasyŝeniâholesterinom AT klimovan konformacionnyeizmeneniâlipoproteinovvysokojplotnostivprocessenasyŝeniâholesterinom AT noskinva konformacíjnízmínilípoproteínívvisokoíŝílʹnostíuprocesínasičennâholesterinom AT šmelevge konformacíjnízmínilípoproteínívvisokoíŝílʹnostíuprocesínasičennâholesterinom AT lomakinav konformacíjnízmínilípoproteínívvisokoíŝílʹnostíuprocesínasičennâholesterinom AT petrovamaslakovalg konformacíjnízmínilípoproteínívvisokoíŝílʹnostíuprocesínasičennâholesterinom AT parfenovans konformacíjnízmínilípoproteínívvisokoíŝílʹnostíuprocesínasičennâholesterinom AT belovaev konformacíjnízmínilípoproteínívvisokoíŝílʹnostíuprocesínasičennâholesterinom AT klimovan konformacíjnízmínilípoproteínívvisokoíŝílʹnostíuprocesínasičennâholesterinom AT noskinva highdensitylipoproteinconformationchangesintheprocessofsaturationbycholesterol AT šmelevge highdensitylipoproteinconformationchangesintheprocessofsaturationbycholesterol AT lomakinav highdensitylipoproteinconformationchangesintheprocessofsaturationbycholesterol AT petrovamaslakovalg highdensitylipoproteinconformationchangesintheprocessofsaturationbycholesterol AT parfenovans highdensitylipoproteinconformationchangesintheprocessofsaturationbycholesterol AT belovaev highdensitylipoproteinconformationchangesintheprocessofsaturationbycholesterol AT klimovan highdensitylipoproteinconformationchangesintheprocessofsaturationbycholesterol
first_indexed	2025-11-24T10:00:50Z
last_indexed	2025-11-24T10:00:50Z
_version_	1849665467542667264
fulltext	Структура и функция биополимеров УДК 532.72.097 КОНФОРМАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ЛИПОПРОТЕИНОВ ВЫСОКОЙ ПЛОТНОСТИ В ПРОЦЕССЕ НАСЫЩЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИНОМ В. А. Носкин, Г. Е. Шмелев, А. В. Ломакин, Л. Г. Петрова-Маслакова, II. С. Парфенова, Е. В. Белова, А. Н. Климов Введение. Известно, что липопротеины и клеточные мембраны могут об- мениваться неэстерифицированным холестерином. В ранних работах, по- священных исследованию этого вопроса, высказывались предположения о механизме такого обмена и предлагались теории, основанные на не- достаточных доказательствах. Так, в работе [1] рассматривалось суще- ствование водорастворимого промежуточного вещества, способного пере- носить холестерин между эритроцитами и плазменными липопротеина- ми. С другой стороны, наличие у липопротеинов специфических белков (апопротеинов) привело к предположению, что эти белки инициируют обмен [2]. Был предложен и другой механизм обмена — образование комплекса между эритроцитами и липопротеином, в пределах которо- го происходит обмен холестерином [3]. Немного позже, в работе [4], исследовали вероятность того, что молекулы холестерина, высвобожда- ясь из мембран или липопротеинов в среду, могут обмениваться друг с другом без образования такого комплекса. Однако в последующих ра- ботах [5, 6] получены результаты, которые можно объяснить, предпо- ложив, что перенос холестерина осуществляется только при соприкосно- вении липопротеинов с клеточными мембранами. За последнее время транспорт холестерина в системе клеточная мембрана — липопротеин изучали различными экспериментальными ме- тодами, основным из которых является радиоактивное мечение клеток. Надо отметить, что использование меченого холестерина далеко не всегда отражает истинный транспорт (net t ransport) холестерина между липопротеиновой частицей и мембраной эритроцита. Авторы [1], исполь- зуя меченные по холестерину липопротеины, еще в 1951 г. показали, что возможен обмен неэстерифицированным холестерином между липо- протеинами плазмы и мембраной эритроцитов без каких-либо измене- ний содержания холестерина в последних. Этот обмен протекал до тех пор, пока удельная радиоактивность неэстерифицированного холестери- на мембраны эритроцитов и плазменных липопротеинов не уравнове- шивалась. Внедрение холестерина изменяет физические свойства фосфолипид- ного слоя [7, 8]. В частности, как показали наши предыдущие исследо- вания [9], средний размер липопротеинов меняется в зависимости от содержания в них холестерина. Таким образом, определение функции распределения липопротеинов по размерам в зависимости от времени инкубации последних с холестеринсодержащими мембранами позволяет изучать кинетику обмена холестерином и получить информацию о струк- турных изменениях липопротеинов. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 6 3 — 6-696 293 Мы использовали метод оптического смешения [10] для исследо- вания кинетики обмена холестерином между липопротеинами высокой плотности (ЛПВП) и мембранами эритроцитов. Достоинство такого метода заключается в том, что, не внося никаких возмущений в иссле- дуемую среду, можно достаточно быстро и с хорошей точностью полу- чить информацию как о среднем гидродинамическом размере изучаемых частиц, так и о ширине их распределения по размерам. В предвари- тельных экспериментах было обнаружено, что при инкубации Л П В П с эритроцитами наиболее заметное изменение размеров происходит во фракции ЛПВП 3 и поэтому мы сосредоточили свое внимание именно на этой фракции. Как известно [11], роль ЛПВП 3 как акцептора холестерина обу- словлена низким относительным содержанием неэстерифицированного холестерина в оболочке этого подкласса Л П В П и наличием в нем ле- цитин-холестерин-ацилтрансферазы (ЛХАТ), эстерифицирующей холе- стерин и обеспечивающей тем самым накопление эфиров холестерина в сердцевине частицы ЛПВП 3 . По этой причине представлялось интерес- ным провести исследование кинетики обмена холестерином также и в присутствии 5,5-дитио-бис-2-нитро-бензойной кислоты (DTNB — ин- гибитор ЛХАТ реакции). В последнем случае можно ожидать встраи- вания молекул холестерина во внешний слой липопротеинов, в то время как в отсутствие ингибитора временная зависимость среднего размера липопротеинов имеет более сложный характер, обусловленный как соб- ственно обменом холестерином между ЛПВПз и мембранами, так и кинетикой эстерификации холестерина и переносом образующегося эфира холестерина в центральную область липопротеина. Материалы и методы. П р и г о т о в л е н и е о б р а з ц о в . ЛПВП 3 выделяли из донорской плазмы методом препаративного ультрацентрифугирования на центрифуге Spinco L2-65B, ротор 50.3 в диапазоне плотности раствора NaBr 1,125—1,210 (45000 об/мин, 24 ч, 18°С). Полученную фракцию ЛПВП 3 диализовали против 0 ,9% NaCl при 4 °С. Эритроциты выделяли из крови другого донора. Отмывку эритроцитов производили 3-кратно буферным раствором (0,05 Μ трис-HCl, рН 7,4, 150 мМ NaCl) при 1500 об/мин в течение 20 мин. Эритроцитарную взвесь готовили, добавляя к осад- ку эритроцитов объем буферного раствора, равный объему удаленной плазмы. Для ин- кубации брали 2 мл эритроцитарной взвеси и небольшой объем раствора ЛПВП3 , со- держащий 5 мг белка. Общий объем инкубационной смеси доводили трис-HCl буфер- ным раствором до 3 мл. Инкубацию проб проводили в течение 1—4 и 24 ч при 37 °С с медленным покачиванием. В некоторых опытах инкубацию вели с добавлением в про- бы DTNB — ингибитора ЛХАТ (К.Ф.2.3Л.43). После инкубации пробы сразу же помещали в ледяную баню и затем центрифугировали при 1500 об/мин в течение 15 мин при 4 °С. Плотность полученного супернатанта доводили сухим NaBr до 1,21 и центрифугировали при указанных выше условиях. Выделенные ЛПВП 3 подвергали диализу против 0,9 % NaCl и использовали для оптических измерений. О п т и ч е с к и е и з м е р е н и я . Спектр света, рассеянного раствором ЛПВП с функцией распределения по размерам N(R) , может быть записан в виде [12] 294 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2. № 6 где Г = Dq2, D = KBT/6nt\R — коэффициент диффузии; q —переданный волновой вектор. Так как частицы ЛПВП достаточно малы 1), формфактор M(R) пропорциона- лен массе липопротеина, т. е. M(R) ~R3. Функция N(R) может быть выражена через А (Г) следующим образом С помощью метода регуляризации [13] по экспериментально измеренному спектру / (ω) можно восстановить «сглаженную» функцию А(Г) и, используя формулу (2), функцию распределения частиц по размерам N(R). Чем выше точность измерений / ( ω ) , тем более детально может быть восстановлена функция распределения. Спектры света, рассеянного раствором липопротеинов, измеряли с помощью 200-канального анализатора спектра, работающего в реальном масштабе времени. Методика измерений описана нами ранее [14]. Погрешность измерения спектров не превышала 0,5 %. Для исключения влияния посторонних примесей на измерение спект- ров образцы тщательно фильтровали через фильтры «Synpor» (ЧССР) диаметром 170 нм непосредственно перед измерением. Измерения проводили при комнатной тем- пературе. Концентрация липопротеинов в растворе составляла 2 мг/мл. Результаты исследования. На рис. 1 показана зависимость сред- него размера ЛПВП 3 от времени инкубации их с эритроцитами как в присутствии DTNB (кривая 1)у так и без него (кривая 2). На этом же рисунке приведен контроль — зависимость среднего размера ЛПВП 3 от времени инкубации их в буферном растворе в отсутствие эритроцитов их с мембранами эритроцитов: 1 — в присутствии DTNB; 2— без DTNB; 3—инкуба- ция ЛПВПз в буфере. Ги = 37 °С. Fig. 1. Dependence of an average HDL3 radius upon incubation time: 1 — in the pre- sence of DTNB; 2 — without DTNB; 3 — in a buffer. 7 , i n c u b = 37 °С. Рис. 2. Зависимость от времени I n ( R ( t ) — R o o ) / (R(0)—Roo) для ЛПВП3 в при- сутствии DTNB. ΤИ = 37°С. Fig. 2. I n ( R ( t ) — R o o ) / (R(0)—Roo) versus time of incubation in the presence of DTNB. r i n c u b = 37°C. (кривая 3). Данные контрольных экспериментов показывают, что на- блюдаемое увеличение размеров (кривые 1 и 2) связано, по всей ве- роятности, с переносом холестерина с мембран эритроцитов на ЛПВП 3 , а не является следствием возможных агрегационных процессов. Стандартной формой изучения кинетики химических процессов яв- ляется анализ зависимости концентрации реагентов, участвующих в нем, от времени. Таким образом, казалось бы, мы лишены возможности провести такой анализ, не выбрав какой-либо модели, описывающей зависимость радиуса ЛПВП 3 от концентрации холестерина в них. Одна- ко в присутствии DTNB, как видно из рис. 1, размер ЛПВП 3 со вре- менем стремится к некоторому равновесному значению Roo. Это позво- ляет считать, что по крайней мере вблизи равновесия справедливо приближение: Б И О П О Л И М Е Р Ы И К Л Е Т К А , 1986, т. 2, № б 295 активационной энергии без дополнительных предположений о виде функции R(C). На рис. 2 приведена зависимость от времени величины \n(Roo—R(t))/(Roo—R(0)) для ЛПВПз в присутствии DTNB (в качест- ве Roo брали значение радиуса ЛПВП 3 при времени инкубации, равном 24 ч). Линейную зависимость, естественно, можно объяснить тем, что перенос холестерина в этом случае описывается реакцией первого по- рядка и соотношение (3) выполняется во всем диапазоне изменения Отсюда следует, что наклон К зависимости In (Roo — R (С)) от времени равен постоянной скорости переноса холестерина, т. е., если считать, что слабо зависит от температуры 7\ мы можем провести расчет размеров. Интерпретация зависимости в отсутствие DTNB сложнее. В этом случае одновременно происходит ряд процессов — перенос холестерина из мембран эритроцитов на липопротеины, эстерификация холестерина и перенос эфиров холестерина внутрь липопротеинов. По- этому, С ОДНОЙ стороны, этот процесс особенно вдали от равновесия вряд ли описывается реакцией первого порядка, а с другой стороны, так как размеры липопротеинов определяются конкуренцией несколь- ких механизмов, трудно ожидать повсеместного выполнения соотноше- ния (3). Учитывая это обстоятельство, мы ограничились исследованием Рис. 3. Зависимость от времени In(R(t)—Roo) / (R(0)—Roo) для ЛПВП3 в при- сутствии DTNB при различных температурах: 1—40; 2—37; 3—30; 4—20 °С. Fig. 3. l n ( R ( t ) —Roo) / (R(0) —Roo) versus time of incubation with DTNB at diffe- rent temperatures. Рис. 4. Зависимость постоянной скорости обмена холестерином от обратной темпера- туры. Fig. 4. Temperature dependence of cholesterol exchange rate constant. Рис. 5. Зависимость от времени 1η(R(t) — R o o ) / (R(0) — R o o ) при различных объе- мах эритроцитарной взвеси в инкубационной среде (3 мл): 1—3; 2—2; 3—1; 4—0,5 мл. Ти —37 °С. Fig. 5. l n ( R ( t ) — R o o ) / (R(0)—Roo) versus time at different amounts of erythrocyte suspension added in an incubation volume (3 ml). Гіncub = 37 °С. температурной зависимости скорости переноса холестерина только в условиях ингибирования ЛХАТ. На рис. 3 показаны зависимости \n(Roo—R(t))/(Roo—R(0)) при различных температурных условиях в присутствии DTNB, а на рис. 4 — зависимость соответствующих накло- нов от обратной температуры. Линейность зависимости К(1/Т) сви- детельствует об активационном характере процесса переноса молекул холестерина. Ее наклон дает значение энергии активации Е а = 6,5=Ь ± 0 , 2 ккал/моль. Мы провели также исследование зависимости скорости переноса холестерина от концентрации эритроцитов в инкубационной среде. На рис. 5 показана зависимость ln(Roo—R(t ) ) / (Roo—R(0)) от времени при четырех различных концентрациях эритроцитов в присутствии DTNB. По этим данным построена зависимость К(СЭ) на рис. 6, показывающая, что скорость переноса холестерина пропорциональна концентрации эри- троцитов. Обсуждение результатов. Начнем с обсуждения кинетики обмена холестерином между Л П В П 3 и мембранами эритроцитов в присутствии ингибитора ЛХАТ. Рис. 1 демонстрирует установление в течение не- скольких часов равновесного значения среднего гидродинамического ра- диуса Rоо = 5,5 нм. Естественно считать, что это отражает установление равновесной объемной концентрации холестерина Сс0 во внешнем слое липопротеина, т. е. (4, где См — объемная концентрация холестерина в мембранах эритроци- тов, а μ^ и μΛ — химические потенциалы холестерина в мембране и ли- попротеине соответственно. Как известно [15], из-за структурных огра- 296 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2. № 6 где С м — объемная концентрация холестерина в мембранах эритроци- тов, а μм и μΛ — химические потенциалы холестерина в мембране и ли- попротеине соответственно. Как известно [15], из-за структурных огра- ничений, возникающих вследствие того, что поверхность липопротеина должна быть покрыта гидрофильными участками молекул внешнего слоя, существует предельная концентрация холестерина С т а х . Действи- тельно, так как у молекул холестерина площадь гидрофильной головки меньше отношения объема гидрофобного хвоста к его длине, свободный холестерин не может сам по себе формировать монослой [16]. Будем считать, что μ^ слабо зависит от концентрации холестерина при С<С «С Стах и резко возрастает при С-^С т а х . Таким образом, при обсуж- дении кинетики обмена холестерином следует различать области концентраций вблизи и вдали от С т а х . Если предполо- Рис. 6. Зависимость постоянной скорости обмена холестерином от количества эритроцитов в инкуба- ционной среде. Ги = 37 °С. Fig. 6. Rate constant К versus erythrocyte con- centration at 37 °С. жить, что Coo близка к Cm a x , следует ожидать сильной зависимости ско- рости обмена холестерином от его концентрации в липопротеинах. При этом наблюдаемый в эксперименте (рис. 2) одноэкспоненциальный ха- рактер приближения радиуса липопротеина R к равновесному значению Roo придется интерпретировать как результат случайной компенсации быстрого замедления скорости обмена и резкого нарастания радиуса ли- попротеина по мере приближения КОНЦеНТраЦИИ холестерина К Стах· Такая возможность представляется маловероятной. Более того, так как нет оснований считать, что химические потенциалы холестерина в липо- протеинах и мембранах эритроцитов сильно различаются, предположе- ние о близости Соо К Стах означает, что концентрация холестерина в мембранах эритроцитов близка к предельной, что также представляется маловероятным. Таким образом, естественно предположить, что СооСС т а х , и счи- тать Δμ = μΛ—μ^ константой. Как видно из рис. 1, полное изменение среднего размера липопротеинов относительно невелико — около 30 %. Так как при Coo<cCmax R(C) — плавно меняющаяся функция, малое полное изменение R позволяет считать разложение (3) справедливым во всей области наблюдения. Тогда, согласно рис. 2, константа ско- рости не меняется, и следовательно, размер Roo и концентрация С определяются просто достижением равновесия между концентрациями холестерина в мембранах эритроцитов и липопротеинах без существен- ных изменений физико-химических свойств последних. Другими слова- ми, предположение о том, что конечная концентрация холестерина в липопротеинах меньше предельной, оказывается самосогласованным. Сделанные предположения позволяют оценить разность химических потенциалов холестерина в мембране эритроцитов и липопротеина Δμ по данным температурной зависимости равновесного размера липопро- теина Roo, приведенным ниже. Т, °С . . . 20 30 37 40 Rоо, нм . . 5,30 5,37 5,52 5,50 Действительно, подставив (3) и (4) в соотношение получим: Отсюда, пользуясь данными по температурной зависимости равно- весного размера липопротеина Roo и полагая С(0)<сСоо, получаем БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 6 3 — 6-696 297 Действительно, подставив (3) и (4) в соотношение оценку сверху для Δμ : Δ μ < 1 ккал/моль. Хотя предположение о не- зависимости Δμ от температуры позволяет по соотношению (3) полу- чить и само значение разности химических потенциалов, точность изме- рения размеров ( ~ 0 , 5 %) для этого недостаточна ввиду малости вели- чины Δμ. В приведенных рассуждениях игнорируется зависимость Δμ от температуры, так как трудно ожидать существенных изменений свойств липопротеинов вблизи физиологических температур (имеется в виду, в частности, фазовый переход жидкость—жидкий кристалл [16]). Мы не обнаружили каких-либо указаний на такого рода явления и не будем их обсуждать. Отметим также, что зависимость размера липо- протеина от температуры для нас несущественна, так как при различ- ных температурах вели лишь инкубацию липопротеинов с мембранами, а измерения проводили в стационарных условиях. По температурной зависимости скорости реакции (рис. 3) полу- чено значение активационной энергии Еа = 6,54=0,2 ккал/моль. Это су- щественно меньше энергии гидрофобного взаимодействия молекулы холестерина ( ~ 1 3 ккал/моль) и, следовательно, передача холестерина происходит при непосредственном контакте липопротеина с мембраной эритроцита, а не путем выхода холестерина в раствор. Этот факт под- тверждается и пропорциональностью постоянной скорости обмена холе- стерином К содержанию мембран (рис. 4). Действительно, если бы обмен происходил путем выхода холестерина из мембран в раствор и последующим встраиванием в липопротеины, скорость изменения раз- мера последних была бы пропорциональна концентрации холестерина в растворе, которая при избытке мембран, естественно, определяется концентрацией холестерина в мембранах, а не полным количеством мембран. Интересно сравнить полученное нами значение активационной энер- гии с литературными данными по активационной энергии для обмена холестерина между везикулами и липопротеинами (17 ккал/моль) [6] и кинетикой насыщения холестерином клеточных мембран Acholeplasma laidlawii (6 ккал/моль) [17]. Липопротеины обмениваются холестери- ном с мембранами намного легче, чем с везикулами, что, возможно, яв- ляется отражением физиологической роли липопротеинов в организме. Интерпретация кинетики изменения среднего размера ЛПВП 3 в от- сутствие DTNB (рис. 1, кривая 2) менее однозначна. Ситуация еще более осложняется тем, что в процессе накопления эфиров холестерина в центральной области и свободного холестерина во внешнем слое липопротеиновой частицы может меняться форма последней. Мы же с помощью метода оптического смешения определяем гидродинамический размер частицы, т. е. радиус сферы, имеющей такой же коэффициент трансляционной диффузии, как и исследуемые частицы. Поэтому, если исходные ЛПВПз имеют дискообразную форму [18], которая становится все более сферической по мере накопления во внутренней области эфи- ров холестерина, заметного изменения R может не происходить. Наобо- рот, встраивание свободного холестерина во внешний слой увеличивает поверхность липопротеина, слабо меняя его объем. При этом возможно дальнейшее сплющивание липопротеина и, как следствие, быстрое на- растание наблюдаемого гидродинамического размера. Эти рассуждения объясняют более медленное нарастание размера при отсутствии ингиби- тора ЛХАТ. Эстерификация холестерина и его поступление во внутрен- нюю область липопротеина должны, в конце концов, прекратиться из-за невозможности дальнейшего увеличения площади поверхности, которая достигает своего предельного значения либо при приближении концент- рации свободного холестерина в липопротеине к С т а х , либо к такой концентрации С'оо, при которой изменение свободной энергии при эстерификации холестерина AF компенсируется дополнительным энтро- пийным вкладом, связанным с переходом холестерина внутрь липопроте- ина, равным КBТ In (С'оо/С оо). Так как в отсутствие DTNB конечный размер липопротеинов больше, то Δ F < 0 . Качественно это связано с тем, что при Δ F < 0 эфиры холестерина эффективно «накачивают» 298 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2. № 6 Л П В П з , в результате чего его внешняя оболочка растягивается, делая внедрение свободного холестерина более выгодным. Как уже отмечалось, количественное обсуждение временной кине- тики гидродинамического размера возможно лишь в рамках конкретной модели, позволяющей выяснить зависимость R(C). Вся совокупность наших данных получает естественное объяснение на основе следующих предположений. 1. В начальном состоянии ЛПВП 3 представляют собой слегка сплющенные эллипсоиды. 2. Объем V и площадь S липопроте- инов определяются соотношениями: V = V 0 + N v +N1V1 S = S 0 + Να, (g) где Ν — число молекул свободного холестерина; Νι — число моле- кул эфиров холестерина; а и ν — площадь гидрофильной головки и объем гидрофобного хвоста холестерина соответственно; νι — объем эфиров холестерина. 3. Эстерификация холестерина происходит быст- ро, т. е. до достижения сферической формы весь поступающий холесте- рин, а после этого — часть холестерина, определяемая соотношениями (6), мгновенно эстерифицируется и перемещается во внутреннюю часть липопротеина. 4. С ' 0о и С о о < С С т а х . Обсудим эти предположения. Первое предположение необходимо для объяснения увеличения скорости нарастания размера липопротеи- нов на начальной стадии обмена в отсутствие DTNB (рис. 1). Такое нестандартное поведение системы по мере приближения к равновесию свидетельствует о «переключении» механизма нарастания R. Сплющен- ность Л П В П з в начальном состоянии естественным образом объясня- ет такое «переключение». На первой стадии до тех пор, пока Л П В П 3 не примет сферическую форму, холестерин, в основном, эстерифицирует- ся и поступает внутрь, а на второй стадии происходит рост сфериче- ской частицы. Такое предположение представляется вполне оправдан- ным с точки зрения установленной эволюции липопротеинов в организ- ме [18]: Л П В П выделяются печенью в кровяное русло в виде сплющен- ных дисков (насцентные частицы), которые принимают все более сфери- ческую форму по мере заполнения их объема эфирами холестерина. Таким образом, выделенная из организма фракция Л П В П 3 должна пред- ставлять собой частицы с разным содержанием эфиров холестерина, в том числе, возможно, и эллипсоидные. Второе предположение означает наличие жестких стерических ог- раничений, которые и определяют форму липопротеина. Эти представ- ления в настоящее время общеприняты [16]. Третье предположение мы вводим для простоты, тем более, что, по крайней мере, вблизи рав- новесия, когда скорость поступления холестерина из мембран эритро- цитов мала, оно заведомо выполняется. Вопрос о выполнении этого условия на начальной стадии обмена в отсутствие DTNB мы обсудим ниже. Наконец, четвертое предположение позволяет считать, что кон- станта скорости К передачи свободного холестерина от эритроцитар- ной мембраны к липопротеину не зависит от концентрации холестери- на, т. е. N + N t = K ( N 0 0 - N ) , (7) где Noo — равновесное количество молекул свободного холестерина во внешнем слое липопротеина (разное в присутствии и отсутствие DTNB). Пользуясь сделанными предположениями и учитывая, что полное изменение размера невелико, можно получить уравнения, описывающие изменения во времени. В присутствии DTNB Λ/Γ1 = const и R = = (Noo-N)ttK(Roo-R), (8) т. е. наблюдаемый размер экспоненциально приближается к равновесно- му значению /?оо. Этот рост происходит как за счет роста поверхности БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 6 3 — 6-696 299 т. е. наблюдаемый размер экспоненциально приближается к равновесно- му значению /?оо. Этот рост происходит как за счет роста поверхности липопротеина, так и за счет его постепенного сплющивания, причем, пользуясь выражением для гидродинамического размера эллипсоида, можно показать, что, если в начальном состоянии липопротеины прак- тически сферические, 30 %-ное увеличение размера происходит при 30%-ном увеличении (примерно) площади поверхности, При этом от· ношение осей получившегося эллипсоида около 1 : 2. В отсутствие DTNB на первой стадии, как уже упоминалось, липо- протеин должен принимать сферическую форму без изменения поверх- ности. Однако, что можно доказать, при этом должно наблюдаться уменьшение гидродинамического размера, противоречащее данным рис. 1. Это противоречие легко устраняется, если в начальном состоянии часть липопротеинов уже имеет сферическую форму и не проходит пер- вой стадии, и, определяя средний по распределению гидродинамический размер, можно наблюдать его медленный рост. При этом определенным образом должна меняться дисперсия распределения по размерам. К сожалению, точность определения дисперсии, составляющей примерно 2 0 % среднего R, недостаточна (относительная погрешность ~ 1 0 % . ) для того, чтобы подтвердить или опровергнуть эту возможность. Дру- гое объяснение состоит в возможной несправедливости предположения 3 на начальной стадии обмена. Тогда поступающий свободный холе- стерин не успевает полностью перерабатываться, и наряду с «накачи- ванием» ЛПВП 3 происходит рост его поверхности. Медленное нараста- ние гидродинамического радиуса связано с суммарным действием этих двух тенденций, дающих противоположный вклад. На второй стадии, после того как все липопротеины приняли сфе- рические размеры, изменение числа молекул свободного и эстерифици- рованного холестерина AN и ΑΝι связаны между собой соотношениями (7), из которых легко получить, что т. е. эффективная скорость нарастания R примерно в два раза мень- ше, чем в присутствии DTNB. Этот результат хорошо согласуется с данными, приведенными на рис. 1. В заключение отметим, что для проверки и уточнения выдвинутых предположений чрезвычайно полезным было бы непосредственное опре- деление концентрации свободного холестерина и эфиров холестерина в липопротеинах. К сожалению, полученные нами к настоящему времени результаты таких измерений недостаточно точны и, хотя они не про- тиворечат сделанным выводам, мы не можем считать это веским свиде- тельством справедливости изложенной картины эволюции размеров и формы липопротеинов в процессе обмена холестерином. HIGH DENSITY LIPOPROTEIN CONFORMATION CHANGES IN THE PROCESS OF SATURATION BY CHOLESTEROL V. A. Noskin, G. E. Shmelev, Α. V. Lomakin, L. G. Petrova-Maslakova, N. S. Parfenova, Ε. V. Belova, A. N. Klimov B. P. Konstantinov Institute of Nuclear Physics, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad Research Institute of Experimental Medicine, Academy of Medical Sciences of the USSR, Leningrad S u m m a r y By means of quasielastic light scattering the size of human high density lipoproteins (HDL3) has been determined depending on the time of their incubation with erythro- 300 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № б cytes both in the presence of the lecitin-cholesterol-acyltransferase inhibitor (DTNB) and without it. It has been shown that in the presence of DTNB the exchange of cho- lesterol between HDL3 and membranes of erythrocytes is a first-order reaction. From the temperature dependence of rate constant the activation energy of cholesterol exchan- ge £ a = 6.5±0.2 ккаl/mol has been calculated. The reaction rate appears to be proporti- onal to membrane concentration, which evidences in favour of contact transfer of cho- lesterol. In the absence of DTNB the cholesterol exchange has a more complicated kine- tics. An attempt has been made to explain the behaviour of HDL3 average size during incubation with erythrocytes both in the presence of DTNB and without it. 1. Hagerman /. S., Gould R. G. The in vitro interchange of cholesterol between plasma and red cells / / P r o c . Soc. Exp. Biol, and Med.— 1951,—78, N 3.—P. 329—339. 2. Scanu A. M., Hugher W. L. Recombining capacity toward lipids of the protein moie- ty of human serum l ipoprotein/ /J . Biol. Chem.—I960.—235, N 10.—P. 2876—2883. 3. Gurd F. R. N. Some naturally occurring lipoprotein sys tems/ /Lipid Chem. / Ed. D. J. Hanahan.—New York: Willey, 1960 — P . 283. 4. Yandenheuvel F. A. Lipid-protein interaction and cohesional forces in the lipoprote- in systems of membranes / / J . Amer. Oil Chem. Soc.—1966.—43, N 2.—P. 258— 264. 5. Giraud F., Claret M. A study of cholesterol transfer between erythrocytes and lipid ves ic les / /FEBS Letters.—1979,—103, N 2 — P. 186—191. 6. Jonas Α., Maine G. T. Kinetics and mechanism of phosphatidyl-choline and choleste- rol exchange between single bilayer vesicles and bovine serum high-density lipo- protein//Biochemistry.—1979.—18, N 8,—P. 1722—1728. 7. Johanson S. M. The effect of charge and cholesterol on the size and thickness of sonicated phospholipid vesicles//Biochim. et biophys. acta.— 1973.—307, N 1.— P. 27—33. 8. Ломакин А. В., Носкин Β. Α., Шмелев Г. Ε. Термодинамика двух компонентных систем. Расслоение везикул и липопротеинов, содержащих холестерин.— Л., 1981.— С. 249—255.— (Препринт/АН СССР. Ин-т ядер, физики; № 719). 9. Измерение распределения по размерам липопротеинов плазмы крови человека / А. Н. Климов, Г. Е. Шмелев, В. А. Носкин и др./ /Биофизика.— 1982.—.27, № 4.— С. 458—461. 10. Dubin S. В., Lunacek J. Η., Benedek G. В. Observation of the spectrum of light scattered by solutions of biological macromolecules / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.— 1967.—57, N 5.—P. 1164—1179. 11. Albers /. /., Cheung M. C. High density lipoprotein particle distribution: characteri- zation of H, L subclasses/ /The first lipoprotein symp. USSR-USA: Abstracts.— Le- ningrad, 1981.—P. 35—36. 12. Selser /. C., Yen Y., Baskin R. J. A light-scattering characterization of membrane vesicles//Biophys. J.— 1976.—16, N 3.—P. 337—342. 13. Гурари Μ. JI., Рукман Г. И., Толпина С. П. О решении уравнения Фредгольма 1-го рода с лоренцевским ядром в задачах доплеровской спектроскопии//Метроло- гия.— 1977.—№ 7.—С. 26—30. 14. Клюбин В. В., Носкин В. А. Анализ релеевских спектров света, рассеянного раство- рами макромолекул методом оптического смешения.— Л., 1979.—35 с.— (Пре- принт/АН СССР. Ин-т ядер, физики; № 485). 15. Atkinson D., Small D. Μ., Shipley Α. X-ray and neutron scattering studies of plasma l ipoproteins//Ann. N. Y. Acad. Sci. USA.— 1980.—348,— Ρ 284—298. 16. Tanford G. The hydrophobic effects.—New York: Willey, 1973—385 p. 17. Gershfeld N. L., Wormser M., Razin S. Cholesterol in mycoplasma membranes. 1. Kinetics and equilibrium studies of cholesterol uptake bv the cell membrane of Acholeplasma laidlawii / / Biochim. et biophys. acta.— 1974.—352, N4.— P. 371 — 378. 18. Discoidal bilayer structure of nascent high density lipoproteins from perfused rat li v e r / R . L. Hamilton, M. C. Williams, G. J. Fielding, R. J. H a v e l / / J . Clin. Invest.— 1976,—583, N 5,—P. 667—680. Ленингр. ин-т ядер, физики Получено 10.10.85 им. Б. П. Константинова АН СССР НИИ эксперим. медицины АМН СССР, Ленинград БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 6 3 — 6-696 301

Конформационные изменения липопротеинов высокой плотности в процессе насыщения холестерином

Репозитарії

Схожі ресурси