Очистка и свойства двух форм лейцил-тРНК-синтетазы из миокарда свиньи
Описан метод выделения из миокарда свиньи свободной и ассоциированной с другими аминоацил-тРНК-синтетазами форм лейцил-тРНК-синтетазы и проведено сравнение ряда их физико-химических свойств. Установлено, что лейцил-тРНК-синтетазная активность в составе высокомолекулярного комплекса более устойчива к...
Gespeichert in:
| Veröffentlicht in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Datum: | 1986 |
| Hauptverfasser: | , , , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1986
|
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153170 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Очистка и свойства двух форм лейцил-тРНК-синтетазы из миокарда свиньи / Р.Р. Стапуленис, Л.Л. Иванов, Л.Ю. Лукошявичюс, В.В. Ярмоленко, А.К. Прашкявичюс // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 6. — С. 302-307. — Бібліогр.: 20 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-153170 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Стапуленис, Р.Р. Иванов, Л.Л. Лукошявичюс, Л.Ю. Ярмоленко, В.В. Прашкявичюс, А.К. 2019-06-13T15:14:37Z 2019-06-13T15:14:37Z 1986 Очистка и свойства двух форм лейцил-тРНК-синтетазы из миокарда свиньи / Р.Р. Стапуленис, Л.Л. Иванов, Л.Ю. Лукошявичюс, В.В. Ярмоленко, А.К. Прашкявичюс // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 6. — С. 302-307. — Бібліогр.: 20 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.0001C7 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153170 577.217.337.32 Описан метод выделения из миокарда свиньи свободной и ассоциированной с другими аминоацил-тРНК-синтетазами форм лейцил-тРНК-синтетазы и проведено сравнение ряда их физико-химических свойств. Установлено, что лейцил-тРНК-синтетазная активность в составе высокомолекулярного комплекса более устойчива к термоинактивации. Описано метод виділення з міокарда свині вільної і асоційованої з іншими аміноацил-тРНК-синтетазами форм лейцил-тРНК-синтетази та проведено порівняння низки їхніх фізико-хімічних властивостей. Встановлено, що лейцил-тРНК-синтетазна активність у складі високомолекулярного комплексу більш стійка до термоінактивації. A method for isolation and purification of two forms (E1 and E2) of leucyl-tRNA synthetase (LeuRS) from pig myocardium is described. E1 is a free enzyme with molecular weight of 158000. E2 is a complex of aminoacyl-tRNA synthetases with molecular weight of 840000. The values of sedimentation constants were 8S for E1 and 32S for E2. The effect of K⁺ and kinetic parameters of the aminoacylation reaction for the both forms of the enzyme are studied. The Km values of EI for ATP and leucine were greater and for tRNA were lower than those of E2. The evaluation of thermal conformatiotial transitions of two forms of LeuRS is carried out. According to the intrinsic protein fluorescence method, the midpoint of denaturation transition for E1 and E2 is in the temperature range between 4 and 44 °C. LeuRS activity of the high-molecular weight complex is more resistant to thermal inactivation than that of free enzyme. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Структура и функции биополимеров Очистка и свойства двух форм лейцил-тРНК-синтетазы из миокарда свиньи Очищення і властивості двох форм лейцил-тРНК-синтетази з міокарду свині Purification and properties of two forms of leucyl-tRNA synthetase from pig myocardium Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Очистка и свойства двух форм лейцил-тРНК-синтетазы из миокарда свиньи |
| spellingShingle |
Очистка и свойства двух форм лейцил-тРНК-синтетазы из миокарда свиньи Стапуленис, Р.Р. Иванов, Л.Л. Лукошявичюс, Л.Ю. Ярмоленко, В.В. Прашкявичюс, А.К. Структура и функции биополимеров |
| title_short |
Очистка и свойства двух форм лейцил-тРНК-синтетазы из миокарда свиньи |
| title_full |
Очистка и свойства двух форм лейцил-тРНК-синтетазы из миокарда свиньи |
| title_fullStr |
Очистка и свойства двух форм лейцил-тРНК-синтетазы из миокарда свиньи |
| title_full_unstemmed |
Очистка и свойства двух форм лейцил-тРНК-синтетазы из миокарда свиньи |
| title_sort |
очистка и свойства двух форм лейцил-трнк-синтетазы из миокарда свиньи |
| author |
Стапуленис, Р.Р. Иванов, Л.Л. Лукошявичюс, Л.Ю. Ярмоленко, В.В. Прашкявичюс, А.К. |
| author_facet |
Стапуленис, Р.Р. Иванов, Л.Л. Лукошявичюс, Л.Ю. Ярмоленко, В.В. Прашкявичюс, А.К. |
| topic |
Структура и функции биополимеров |
| topic_facet |
Структура и функции биополимеров |
| publishDate |
1986 |
| language |
Russian |
| container_title |
Биополимеры и клетка |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Очищення і властивості двох форм лейцил-тРНК-синтетази з міокарду свині Purification and properties of two forms of leucyl-tRNA synthetase from pig myocardium |
| description |
Описан метод выделения из миокарда свиньи свободной и ассоциированной с другими аминоацил-тРНК-синтетазами форм лейцил-тРНК-синтетазы и проведено сравнение ряда их физико-химических свойств. Установлено, что лейцил-тРНК-синтетазная активность в составе высокомолекулярного комплекса более устойчива к термоинактивации.
Описано метод виділення з міокарда свині вільної і асоційованої з іншими аміноацил-тРНК-синтетазами форм лейцил-тРНК-синтетази та проведено порівняння низки їхніх фізико-хімічних властивостей. Встановлено, що лейцил-тРНК-синтетазна активність у складі високомолекулярного комплексу більш стійка до термоінактивації.
A method for isolation and purification of two forms (E1 and E2) of leucyl-tRNA synthetase (LeuRS) from pig myocardium is described. E1 is a free enzyme with molecular weight of 158000. E2 is a complex of aminoacyl-tRNA synthetases with molecular weight of 840000. The values of sedimentation constants were 8S for E1 and 32S for E2. The effect of K⁺ and kinetic parameters of the aminoacylation reaction for the both forms of the enzyme are studied. The Km values of EI for ATP and leucine were greater and for tRNA were lower than those of E2. The evaluation of thermal conformatiotial transitions of two forms of LeuRS is carried out. According to the intrinsic protein fluorescence method, the midpoint of denaturation transition for E1 and E2 is in the temperature range between 4 and 44 °C. LeuRS activity of the high-molecular weight complex is more resistant to thermal inactivation than that of free enzyme.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153170 |
| citation_txt |
Очистка и свойства двух форм лейцил-тРНК-синтетазы из миокарда свиньи / Р.Р. Стапуленис, Л.Л. Иванов, Л.Ю. Лукошявичюс, В.В. Ярмоленко, А.К. Прашкявичюс // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 6. — С. 302-307. — Бібліогр.: 20 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT stapulenisrr očistkaisvoistvadvuhformleiciltrnksintetazyizmiokardasvinʹi AT ivanovll očistkaisvoistvadvuhformleiciltrnksintetazyizmiokardasvinʹi AT lukošâvičûslû očistkaisvoistvadvuhformleiciltrnksintetazyizmiokardasvinʹi AT ârmolenkovv očistkaisvoistvadvuhformleiciltrnksintetazyizmiokardasvinʹi AT praškâvičûsak očistkaisvoistvadvuhformleiciltrnksintetazyizmiokardasvinʹi AT stapulenisrr očiŝennâívlastivostídvohformleiciltrnksintetazizmíokardusviní AT ivanovll očiŝennâívlastivostídvohformleiciltrnksintetazizmíokardusviní AT lukošâvičûslû očiŝennâívlastivostídvohformleiciltrnksintetazizmíokardusviní AT ârmolenkovv očiŝennâívlastivostídvohformleiciltrnksintetazizmíokardusviní AT praškâvičûsak očiŝennâívlastivostídvohformleiciltrnksintetazizmíokardusviní AT stapulenisrr purificationandpropertiesoftwoformsofleucyltrnasynthetasefrompigmyocardium AT ivanovll purificationandpropertiesoftwoformsofleucyltrnasynthetasefrompigmyocardium AT lukošâvičûslû purificationandpropertiesoftwoformsofleucyltrnasynthetasefrompigmyocardium AT ârmolenkovv purificationandpropertiesoftwoformsofleucyltrnasynthetasefrompigmyocardium AT praškâvičûsak purificationandpropertiesoftwoformsofleucyltrnasynthetasefrompigmyocardium |
| first_indexed |
2025-11-27T04:31:55Z |
| last_indexed |
2025-11-27T04:31:55Z |
| _version_ |
1850800414810701824 |
| fulltext |
УДК 577.217.337.32
ОЧИСТКА И СВОЙСТВА ДВУХ ФОРМ
ЛЕЙЦИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗЫ ИЗ МИОКАРДА СВИНЬИ
Р. Р. Стапуленис, Л. Л. Иванов,
Л. Ю. Лукошявичюс, В. В. Ярмоленко, А. К. Прашкявичюс
Характерной особенностью эукариотических аминоацил-тРНК-синтетаз
(АРСаз) является их способность образовывать высокомолекулярные
комплексы [1]. Вопрос о функциональном значении надмолекулярной
организации АРСаз все еще далек от окончательного решения. Пред-
полагается [2], что одна из функций комплексов заключается в стаби-
лизации АРСазных активностей, однако есть данные [3], противореча-
щие этому предположению.
В данной работе описано разделение низкомолекулярной (свобод-
ной) и высокомолекулярной (ассоциированной в комплекс) форм лей-
цил-тРНК-синтетазы (лейРС, КФ 6.1.1.4) из миокарда свиньи и приве-
дены результаты сравнения их некоторых физико-химических свойств,
в том числе стабильности при термоинактивации.
Материалы и методы. Реактивы: трис — фирмы «Sigma» (США); глицерин —
фирмы «Serva» (ФРГ); АТР, сульфат аммония, хлорид аммония, оксиапатит, 2-меркап-
тоэтанол, фенилметилсульфонилфторид — фирмы «Мегск» (ФРГ); ДЭАЭ-целлюлоза —
фирмы «Whatman» (Англия); сефарозы 4В, 6В — фирмы «Pharmacia» (Швеция); саха-
роза, свободная от примесей рибонуклеаз — фирмы «BioRad» (США). 14С-лейцин (Че-
хословакия) имел удельную радиоактивность 8880 МБк/ммоль.
Сердца свиней немедленно после забоя животных замораживали при —70 °С. Сум-
марную тРНК из миокарда получали, как описано ранее [4].
Очистка лейцил-тРНК-синтетазы. Растворы, использованные при выделении фер-
мента: буфер А (0,01 Μ трис-НСІ, рН 8,2, 0,35 Μ сахароза, 0,01 Μ MgCl2, 0,02 Μ
NH4C1, 5 ·10- 5 Μ Na2 ЭДТА); буфер Б (0,01 Μ трис-НСІ, рН 8,2, 0,01 Μ MgCl2, 0,02 Μ
NH4C1); буфер В (0,03 Μ калий-фосфатный буфер, рН 6,8); буфер Г (0,02 Μ калий-
фосфатный буфер, рН 6,8); буфер Д (0,01 Μ трис-НСІ, рН 8,2, 0,01 Μ MgCl2). Для
стабилизации фермента все используемые растворы содержали 10 %-ный глицерин,
1 - Ю - 4 Μ фенилметилсульфонилфторид и 0,02 Μ 2-меркаптоэтанол.
700—800 г ткани миокарда свиньи гомогенизировали в 2,5 объемах буфера А и
центрифугировали 10 мин при 6000 об/мин, надосадочную жидкость ультрацентрифу-
гировали при 105000Xg в течение 1 ч. Белки надосадочной жидкости осаждали суль-
фатом аммония (65 % насыщения), осадок собирали центрифугированием, растворяли
в буфере Б и диализировали против того же буфера. Раствор белка после диализа
хроматографировали на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. Белок элюировали линейным гра-
диентом концентрации хлорида аммония (0,02—0,5 М) в буфере Б. Следующий этап
очистки лейРС проводили по методике, предложенной в работе [5]. Осажденный суль-
фатом аммония белок, содержащий лейцил-тРНК-синтетазную активность, смешивали с
сефарозой 4В и заполняли колонку. Белок элюировали линейным градиентом концент-
рации сульфата аммония (50—20 % насыщения) в буфере В. Фракции, содержащие
лейцил-тРНК-синтетазную активность, диализировали против буфера Г и фракциониро-
вали на колонке с оксиапатитом. Элюцию проводили линейным градиентом концентра-
ции калий-фосфатного буфера (0,02—0,5 М). Каждый пик лейцил-тРНК-синтетазной
активности дополнительно очищали на колонке с сефарозой 6В. Элюцию лейРС прово-
дили буфером Д.
Активность лейРС определяли по начальной скорости аминоацилирования тРНК
14С-лейцином. Реакционная смесь содержала в объеме 0,1 мл: 150 мМ трис-НС1,
рН 7,7, 15 мМ КС1, 5 мМ MgCl2, 10 мМ АТР, 0,05 мМ 14С-лейцин, 50 мкг суммарной
тРНК и 2—5 мкг фермента. Реакционную смесь инкубировали 5 мин при 25 °С, после
чего добавляли двойной объем 10 %-ной трихлоруксусной кислоты. Осадки промывали
на нитроцеллюлозных фильтрах и радиоактивность проб измеряли на сцинтилляцион-
ном счетчике «Delta-ЗОО» (Голландия).
Концентрацию лейРС определяли по методу Лоури [6], а в процессе очистки
фермента — по методу Варбурга [7].
302 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 6
Термоинактивацию лейРС изучали при 25, 30, 37 и 42 °С. Фермент инкубировали
в буфере Д, через определенные промежутки времени отбирали аликвоты и вносили их
в инкубационную смесь для проведения реакции аминоацилирования. Константы термо-
инактивации (Кг) рассчитывали, как описано ранее [8].
Седиментационный анализ лейРС проводили в ультрацентрифуге «Sorvall OTD-75»
(США), (ротор АН 650) при 4 °С. Константы седиментации определяли по мето-
дике [9].
Спектры флюоресценции регистрировали на спектрофлюориметре «Hitachi» модель
650—60 (Япония). Условия измерения: длина волны возбуждения 280 нм, спектральная
ширина щелей возбуждения и флюоресценции 2 нм, скорость сканирования 60 нм/мин,
режим отношения сигналов, схема измерения флюоресценции под углом 90°. Все спект-
ры корректировали в· автоматическом режиме. Термоденатурацию лейРС изучали в
диапазоне 10—60 °С.
Результаты и обсуждение. При хроматографии на оксиапатите
лейРС миокарда свиньи разделяется на две формы Ει И Е2. В преды-
дущих исследованиях [10] было показано, что Ει представляет собой
индивидуальный фермент с молекулярной массой 158000. Форма Е2 на-
ряду с лейцил-тРНК-синтетазной активностью содержит АРСазные ак-
тивности других аминокислотных специфичностей и представляет мак-
ромолекулярный комплекс этих ферментов с молекулярной массой
840000. Значения констант седиментации составляют 8S для ЕІ и
12,3 и 32S для Е2. Наличие двух пиков лейцил-тРНК-синтетазной ак-
тивности, различающихся по значениям констант седиментации, для
Е2 может быть связано с диссоциацией комплекса АРСаз в процессе
центрифугирования.
В дальнейших исследованиях было проведено сравнение свойств
лейРС в свободном и агрегированном состояниях. Известно, что на
активность АРСаз существенное влияние могут оказывать ионы К+ .
В работе [11] было показано, что активность аспартил-тРНК-синтета-
зы в составе высокомолекулярного комплекса, выделенного из щито-
видной железы свиньи, значительно стимулируется различными соля-
ми калия, в то время как активность свободного фермента этими же
солями ингибируется. Мы установили, что присутствие в реакционной
смеси 20 мМ КС1 (рис. 1) несколько увеличивает активность Ει
лейРС миокарда, в то время как указанная концентрация соли практи-
чески не влияет на лейцил-тРНК-синтетазную активность Е2. Увели-
чение концентрации КС1 ингибировало ферментативную активность обе-
их форм лейРС (рис. 1). Аналогичный эффект наблюдался и при до-
бавлении в реакционную смесь КН 2 Р0 4 . Таким образом, наши данные
противоречат предположению о возможности регуляции активности
АРСаз, входящих в состав высокомолекулярного комплекса, ионами
К + [11] .
Последующая серия экспериментов была посвящена исследованию
каталитических свойств лейРС. Данные обрабатывали методом двойных
обратных величин Лайнуивера—Берка [12]. Результаты кинетического
изучения двух форм лейРС представлены в таблице. Значения Km
для Ει и Е2 ПО всем субстратам реакции являются величинами одно-
го порядка. Однако для Е2 наблюдается некоторое увеличение Кш по
Кинетические параметры реакции аминоацилирования для лейцил-тРНК-синтетазы
миокарда свиньи
Kinetic parameters of the aminoacylation reaction for leucyl-tRNA synthetase from pig
myocardium
Km
Форма фермента ATP,
M-IO—3
Лейцин,
М - 1 0 - 5
τΡΗΚ.
M - I O - 6
Vмакс»
М-мин-І-мг-1 Kj, мин -1
ЕІ
E2
3,9
12,8
0,7
2,7
1,6
0,4
20,6-ΙΟ"6 0,106
0,087
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 6 303
АТР и лейцину и уменьшение по тРНК в сравнении с Ει. Увеличение
значений Кт по АТР и лейцину может быть связано с меньшей доступ-
ностью для субстратов лейРС, ассоциированной в высокомолекулярный
комплекс. Подобное явление было описано для глутамил- и глутами-
нил-тРН.К-синтетаз, входящих в состав высокомолекулярных комплек-
сов мозга быков [13]. С другой стороны, наблюдаемое уменьшение К ш
Рис. 1. Зависимость активности лейцил-тРНК-синтетазы от концентрации КС1.
Fig. 1. The effects of KC1 concentrations on the activity of leucyl-tRNA synthetase.
Рис. 2. Спектры флюоресценции двух форм лейцил-тРНК-синтетазы из миокарда
свиньи при разных температурах: 1, 2 — Ει при 20 и 40 °С соответственно; 3, 4 — то
же для Е2. λΒΟ36=280 нм, оптическая плотность 0,2; 0,1 Μ трис-НСІ (рН 8,2).
Fig. 2. Fluorescence spectra of two forms of leucyl-tRNA synthetase from pig myocardi-
um at different temperatures: 1, 2 — Ex at 20 and 40 °С, respectively; 3, 4 — the same
for E2. λβχ=280 nm, absorbance 0.2; 0.1 Μ tris-HCl (pH 8.2).
по тРНК, также обнаруженное рядом авторов [14, 15], не указывает
на наличие стерических препятствий для субстратов в высокомолеку-
лярном комплексе.
На рис. 2 приведены спектры флюоресценции двух форм лейРС при
рН 8,2. По положению и форме спектра не отмечено существенных раз-
личий спектров флюоресценции Ει и Е2. ОНИ представляют собой ши-
рокие бесструктурные полосы с максимумом флюоресценции (Хмакс)
335 и 333 нм и полушириной спектров (Δλ) 64 и 63 нм соответствен-
но. Несмотря на более высокие значения Δλ по сравнению с данными
авторов [16, 17], установленные параметры флюоресценции указывают
на то, что в белке и комплексе хромофоры локализованы как в обла-
стях, малодоступных растворителю, так и в местах возможного контак-
та с ним [16—18].
Для оценки стабильности структуры Ει и Е2 было проведено ис-
следование температурных зависимостей параметров флюоресценции в
диапазоне температур от 10 до 60 °С. Известно, что с повышением
температуры происходит падение квантового выхода флюоресценции
белков [16]. При температурах выше 35 °С для Ει и Е2 наблюдается не-
большой сдвиг спектра флюоресценции в длинноволновую область на
2 нм и уширение спектра. Такие изменения типичны для процесса де-
натурации белковой глобулы [16, 19]. Стабильность структуры двух
форм лейРС анализировали и по середине термоденатурационного пере-
хода, равного значению температуры, при котором параметры флюо-
ресценции достигают половины своего максимального изменения. При
незначительных изменениях положения и формы спектра величина мак-
симальной интенсивности спектра (/макс) может быть использована в
304 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 6
качестве меры завершенности перехода [16]. При анализе данных ис-
пользовали обратную величину интенсивности (1//макс)> зависящую от
температуры (Т, К) и вязкости раствора (η) [20].
Результаты проведенного анализа представлены на рис. 3. Кри-
вая между линейными участками зависимости отражает термоденатура-
ционные перестройки белка. Середина этого перехода как для Е ь так
и для Е2 лежит в диапазоне температур 40—44 °С. Таким образом,
следует заключить, что в зо-
не температур до 35 °С Ει и
Е2 нативны, а при темпера-
турах выше 45 °С дена-
турируют необратимо. На
рис. 3 обращает на себя вни-
мание разница поведения
кривых температурных зави-
симостей для Е] и Е2 при
температурах выше 45 °С,
что может быть отражением
Рис. 3. Температурные зависимости параметра 1 / / М а к с от Τ /η для Ε ι и Е2. Условия,
как на рис. 2.
Fig. 3. Temperature dependences of the parameter l / / m a x vs. Τ /η for Ei and E2. Condi-
tions as in Fig. 2.
Рис. 4. Термоинактивация лейцил-тРНК-синтетазной активности при 25 (А), 30 (В),
37 (В) и 42 °С (Г).
Fig. 4. Thermal inactivation of leucyl-tRNA synthetase activity at 25 (A), 30 (Б),
37 (B) and 42 °С (Г).
принципиального различия структур Ει и Ε2. Однозначно интерпретиро-
вать результаты изучения термоденатурации Ει и Е2 и сравнить их между
собой довольно сложно. Совокупность данных по флюоресценции свиде-
тельствует о том, что структурные перестройки Ει и Е2 представляют
собой сложные многостадийные процессы. Более того, для Е2 могут иметь
место не только мономолекулярные явления, как для Ει, но приобретают
значение и межмолекулярные взаимодействия.
Было проведено также сравнение степени термоинактивации обеих
форм лейРС по изменению ферментативной активности при различных
температурах. Полученные данные (таблица, рис. 4) свидетельствуют
о том, что Ει характеризуется более высоким значением Кг, чем Е2,
при температуре 42 °С. Форма Е2 более устойчива к термоинактивации,
чем Ει, также при температуре 25, 30 и 37 °С (рис. 4). Таким образом,
полученные данные свидетельствуют о том, что лейРС в составе высоко-
молекулярного комплекса миокарда свиньи более устойчива к термо-
инактивации, чем свободная форма фермента.
Результаты проведенных исследований указывают на то, что лейРС
в кардиомиоцитах свиньи присутствует в виде двух форм — свобод-
ной и ассоциированной в комплекс с другими АРСазами. Наличие сво-
бодной формы фермента может быть результатом эндогенного протеоли-
305 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 6
за комплекса, как в случае метионил-тРНК-синтетазы из гепатоцитов
крысы [15]. Для решения этого вопроса необходимо выделить лейРС из
состава высокомолекулярного комплекса и сравнить ее структурно-
функциональные свойства со свободным ферментом.
PURIFICATION AND PROPERTIES OF TWO FORMS
OF LEUCYL-tRNA SYNTHETASE FROM PIG MYOCARDIUM
R. R. Stapulionis, L. L. Ιυαηου, L. J. Lukosevicius,
V. V. Yarmolenko, A. K. Praskevicius
Medical Institute, Kaunas
S u m m a r y
A method for isolation and purification of two forms (Ei and E2) of leucyl-tRNA synthe-
tase (LeuRS) from pig myocardium is described. E! is a free enzyme with molecular
weight of 158000. E2 is a complex of aminoacyl-tRNA synthetases with molecular weight
of 840000. The values of sedimentation constants were 8S for Ei and 32S for E2.
The effect of K+ and kinetic parameters of the aminoacylation reaction for the both forms
of the enzyme are studied. The Km values of Ei for ATP and leucine were greater and
for tRNA were lower than those of E2. The evaluation of thermal conformational tran-
sitions of two forms of LeuRS is carried out. According to the intrinsic protein fluores-
cence method, the midpoint of denaturation transition for Ej and E2 is in the temperatu-
re range between 4 and 44 °С. LeuRS activity of the high-molecular weight complex is
more resistant to thermal inactivation than that of free enzyme.
1. Dang С. V., Johnson D. L., Yang D. С. H. High molecular mass aminoacyl-tRNA
synthetase complexes in eukaryotes / /FEBS Letters.— 1982.—142, N 1.— P. 1—6.
2. Dang С. V. High molecular weight complex formation of rat liver lysyl-tRNA synthe-
tase reduces enzyme lability to thermal inactivation//Biochem. and Biophys. Res.
Communs.— 1982,—106, N 1.—. P. 44—47.
3. Аминоацил-тРНК-синтетазы и их высокомолекулярные комплексы из регенерирую-
щей печени крыс/А. Д. Яремчук, Л. Э. Тарасявичене, Т. П. Кондратюк, А. В. Ель-
ская//Молекуляр. биология.— 1984.—18, № 5.—С. 1336—1341.
4. Изучение молекулярных основ нарушения биосинтеза белка при экспериментальном
инфаркте миокарда и аутолизе миокарда/М. И. Коваленко, Г. А. Родовичюс,
А. Й. Тамулявичюс и др. / /Молекуляр. биология.— 1984.— Вып. 37.— С. 18—21.
5. Gabius H.-J., υοη der Haar F., Cramer F. Purification by salting-out chromatography
and properties of phenylalanyl-tRNA synthetase from turkey liver / / Hoppe-Seyler's Z.
Physiol. Chem.— 1983.—364, N 1.—P. 71—81.
6. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O. Lowry, N. Rosenbrought,
N. Farr, R. Randoll / / J. Biol. Chem.— 1951.—193, N 1.—P. 265—275.
7. Warburg O., Christian Ψ. Isolierung uns Kristallisation des Garungsferments Enola-
se/ /Biochem. Z.— 1941.—310, N 2.—P. 384—421.
8. Chuang H. J. K., Bell F. E. Use of a thermal inactivation technique to obtain bin-
ding constants for the Escherichia coli valyl-tRNA synthetase/ /Arch. Biochem. and
Biophys.— 1972.—152, N 2.—P. 502—514.
9. Martin R. G., Ames B. N. A method for determining the sedimentation behaviour of
enzymes: applications to protein mix tu re s / / J . Biol. Chem.— 1961.—236, N 5.—
P. 1372—1379.
10. Иванов Л. JI., Стапуленис Р. Р., Лукошявичюс Л. Ю. Выделение и характеристика
лейцил-тРНК-синтетазы из тканей млекопитающих / / Биополимеры и клетка.—
1985,—1, № 3,—С. 154—156.
11. Vellekamp G. J., Kull F. J. Allotropism in aspartyl-tRNA synthetase from porcine
thy ro id / /Eur . J. Biochem.—1981.—118, N 2.—P. 261—269.
12. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики.— Μ. : Мир, 1979.—280 с.
13. Vadeboncoeur С., Lapointe J. Slow diffusion of glutamate and ATP-Mg into high-
molecular-weight complexes containing the glutamyl-tRNA synthetase from bovine
brain / / Eur. J. Biochem.— 1980,—109, N 2,—P. 581—587.
14. Johnson D. L., Dang С. V., Yang D. С. H. Purification and characterization of ly-
syl-tRNA synthetase after dissociation of the particulate aminoacyl-tRNA synthetases
from rat l i v e r / / J . Biol. Chem.— 1980—255, N 9.—P. 4362—4366.
15. Siddiqui F. Α., Yang D. С. H. Generation of multiple forms of methionyl-tRNA synthe-
tase from the multi-enzyme complex of mammalian aminoacyl-tRNA synthetases by
endogenous proteolysis//Biochim. et biophys. acta.— 1985—828, N 2 —P. 177—187.
16. Бурштейн Э. А. Собственная люминесценция белков (природа и применение).— М. :
ВИНИТИ, 1977.—Т. 7.— 189 с.
17. Спектральные характеристики мышечных аспартил- и валил-тРНК-синтетаз в нор-
ме и при экспериментальной модели полного и длительного голодания животных /
306 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 6
В. Η. Глушак, А. П. Демченко, Η. Η. Орловская, Μ. Φ. Гулый//Молекуляр. био-
логия.—1984.—18, № 5.—С. 1330—1335.
18. Корнелюк А. И., Мацука Г. X., Шилин В. В. Флуоресцентный анализ доступности
триптофановых остатков лейцил-тРНК-синтетазы в фермент субстратных комплек-
сах / / Биофизика.— 1980.—25, № 3.— С. 402—404.
19. Черницкий Е. А. Люминесценция и структурная лабильность белков в растворе и
клетке.— Минск : Наука и техника, 1972.—278 с.
20. Permyakov Ε. Α., Burstein Ε. A. Some aspects of studies of thermal transitions in
proteins by means of their intrinsic fluorescence//Biophys. Chem.— 1984.—19, N 2.—
P. 265—271.
Каунас, мед. ин-т Получено 28.10.85
УДК 547.963.3
ВЫДЕЛЕНИЕ ТРАНСЛЯЦИОННО АКТИВНОЙ
ПОЛИ (А) + И ПОЛИ(А)- мРНК ИЗ ЦИТОПЛАЗМЫ
ПРОРАСТАЮЩИХ ЗАРОДЫШЕЙ ПШЕНИЦЫ
Н. Г. Филимонов, А. О. Агашкин, О. Д. Саблина, М. А. Айтхожин
Введение. Проведенные нами ранее исследования дитоплазматических
мРНК в прорастающих зародышах пшеницы показали, что они локали-
зованы в составе полирибосом и свободных информосом [1, 2]. Свобод-
ные информосомы, очевидно, представляют запасную или временно
неактивную форму мРНК [3]. Было установлено, что в составе полири-
босом около 40 % мРНК полиаденилированы, в то время как в соста-
ве свободных информосом большинство мРНК не содержат полиадени-
ловых последовательностей [4]. Исследование метаболических взаимо-
отношений между этими популяциями поли (А) + и поли (А)- мРНК
представляет большой интерес для изучения биогенеза информационной
РНК- В настоящее время общепринятым методом выделения поли (А)+
мРНК является хроматография на олиго(сГГ) -целлюлозе, тогда как
очистка поли (А)- мРНК представляет значительные трудности.
В нашей работе из полирибосом и свободных цитоплазматических
информосом прорастающих зародышей пшеницы хроматографией на
олиго(сІТ) -целлюлозе и бензоилированной целлюлозе выделены препа-
раты поли(А)+ и поли ( А ) - мРНК. Проведено сравнительное исследова-
ние их молекулярно-весовых характеристик и трансляционной активно-
сти в бесклеточной белоксинтезирующей системе.
Материалы и методы. Эксперименты выполнены на зародышах пшеницы сорта
«Казахстанская-4». Зародыши выделяли из сухих семян и проращивали при 26 °С в те-
чение 20 ч, как описано ранее [5].
В ы д е л е н и е п о л и р и б о с о м и с в о б о д н ы х ц и т о п л а з м а т и ч е с к и х
и н ф о р м о с о м . Зародыши пшеницы после проращивания замораживали в жидком
азоте и гомогенизировали в буферном растворе: 0,01 Μ трис-HCl, рН 8,0, 0,05 Μ КС1,
0,005 Μ MgCl2, 0,25 Μ сахароза; 0,005 Μ 2-меркаптоэтанол (МЭ), 0,01 Μ ванадилрибо-
нуклеозидный ингибитор (VRC). Гомогенат центрифугировали при 3000 g для освобож-
дения от ядер и неразрушенных клеток, затем при 23000 g — от митохондрий и хлоро-
пластов. К постмитохондриальному клеточному экстракту добавляли тритон Х-100 до
конечной концентрации 0,5 % и наслаивали его на 10 мл 1,5 Μ сахарозы. Центрифуги-
рованием при 43000 об/мин и температуре 3°С в течение 3 ч в роторе Type-45-Ti по-
лирибосомы осаждали на дно пробирки.
Для выделения фракции внеполисомных мРНК-содержащих рибонуклеопротеидов
клеточный экстракт после осаждения полирибосом подвергали ультрацентрифугирова-
нию через 0,5 Μ сахарозу в течение 5 ч при 43000 об/мин в роторе Type-45-Ti, 3 °С.
Свободные цитоплазматические информосомы получали после дополнительной очистки
препарата в градиенте концентрации сахарозы 15—30 %.
В ы д е л е н и е ц и т о п л а з м а т и ч е с к и х Р Н К из полирибосом и внеполи-
сомных информосом проводили по методу Перри и др. [6].
307 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 6
|