Роль тРНКПро в претрансферном редактировании аланина пролил-тРНК синтетазой
Цель. Охарактеризовать процесс тРНК-зависимого претрансферного редактирования аланина пролил-тРНК синтетазой бактерии Enterococcus faecalis (ПроРСEf). Методы. Скорость процессов редактирования in vitro определяли по гидролизу АТФ ПроРСEf. Пре- и посттрансферное редактирование разделены экспериментал...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Вiopolymers and Cell |
|---|---|
| Дата: | 2013 |
| Автори: | , , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Російська |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
2013
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153174 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Роль тРНКПро в претрансферном редактировании аланина пролил-тРНК синтетазой / К.С. Бояршин, А.Е. Присс, И.А. Крикливый, О.П. Коваленко, А.Д. Яремчук, М.А. Тукало // Вiopolymers and Cell. — 2013. — Т. 29, №. 5. — С. 382-388. — Бібліогр.: 21 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860010837400354816 |
|---|---|
| author | Бояршин, К.С. Присс, А.Е. Крикливый, И.А. Коваленко, О.П. Яремчук, А.Д. Тукало, М.А. |
| author_facet | Бояршин, К.С. Присс, А.Е. Крикливый, И.А. Коваленко, О.П. Яремчук, А.Д. Тукало, М.А. |
| citation_txt | Роль тРНКПро в претрансферном редактировании аланина пролил-тРНК синтетазой / К.С. Бояршин, А.Е. Присс, И.А. Крикливый, О.П. Коваленко, А.Д. Яремчук, М.А. Тукало // Вiopolymers and Cell. — 2013. — Т. 29, №. 5. — С. 382-388. — Бібліогр.: 21 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Вiopolymers and Cell |
| description | Цель. Охарактеризовать процесс тРНК-зависимого претрансферного редактирования аланина пролил-тРНК синтетазой бактерии Enterococcus faecalis (ПроРСEf). Методы. Скорость процессов редактирования in vitro определяли по гидролизу АТФ ПроРСEf. Пре- и посттрансферное редактирование разделены экспериментально сайт-направленным мутагенезом. Результаты. тРНК-зависимое претрансферное редактирование характеризуется втрое большей скоростью, чем тРНК-независимое. Эффективность процесса зависит от наличия 2'-гидроксильной группы А76 тРНКПро. В отсутствие тРНКПро параллельно с тРНК-независимым претрансферным редактированием происходит высвобождение аланил-АМФ из активного центра ПроРСEf с возможностью вторичного связывания и гидролиза. Выводы. тРНК-зависимое претрансферное редактирование аланина ПроРСEf является каталитическим механизмом, опосредованным 2'-гидроксильной группой А76 тРНКПро. В отсутствие тРНКПро действуют механизмы тРНК-независимого претрансферного редактирования и селективного высвобождения аланил-АМФ.
Мета. Охарактеризувати процес тРНК-залежного претрансферного редагування аланіну проліл-тРНК синтетазою бактерії Enterococcus faecalis (ПроРСEf). Методи. Швидкість процесів редагування in vitro визначали за гідролізом АТФ ПроРСEf. Пре- і посттрансферне редагування експериментально розділено сайт-спрямованим мутагенезом. Результати. тРНК-залежне претрансферне редагування характеризується втричі більшою швидкістю, ніж тРНК-незалежне. Ефективність процесу залежить від наявності 2'-гідроксильної групи А76 тРНКПро. За відсутності тРНКПро паралельно з тРНК-незалежним претрансферним редагуванням відбувається вивільнення з активного центра ПроРСEf аланіл-АМФ з можливістю вторинного зв’язування і гідролізу. Висновки. тРНК-залежне претрансферне редагування аланіну ПроРСEf є каталітичним механізмом, опосередкованим 2'-гідроксильною групою А76 тРНКПро. За відсутності тРНКПро діють механізми тРНК-незалежного претрансферного редагування і селективного вивільнення аланіл-АМФ.
Aim. To characterize the process of tRNA-dependent pretransfer edi- ting of alanine by prolyl-tRNA synthetase of bacteria Enterococcus faecalis (ProRSEf). Methods. Velocity of the editing processes in vitro was determined by ATP hydrolysis by ProRSEf. Pretransfer and posttransfer editing were experimentally separated by site-directed mutagenesis. Results. tRNA-dependent pretransfer editing is characterized by three-fold larger velocity then tRNA-independent editing. Effectivity of the process depends on the presence of 2'-hydroxyle group of A76 tRNAPro. In the absence of tRNAPro selective release of alanyl-AMP occurs simultaneously with tRNA-independent pretransfer editing. Released alanyl-AMP can be re-bound and hydrolyzed. Conclusions. tRNA-dependent pretransfer editing of alanine by ProRSEf is the catalytic mechanism, mediated by 2'-hydroxyl group of A76 tRNAPro. In the absence of tRNAPro tRNA-independent pretransfer editing and selective release of alanyl-AMP occur.
|
| first_indexed | 2025-12-07T16:42:04Z |
| format | Article |
| fulltext |
UDC 577.217.32
Ðîëü òÐÍÊÏðî â ïðåòðàíñôåðíîì ðåäàêòèðîâàíèè
àëàíèíà ïðîëèë-òÐÍÊ ñèíòåòàçîé
Ê. Ñ. Áîÿðøèí, À. Å. Ïðèññ, È. À. Êðèêëèâûé, Î. Ï. Êîâàëåíêî,
À. Ä. ßðåì÷óê, Ì. À. Òóêàëî
Ãîñóäàðñòâåííàÿ êëþ÷åâàÿ ëàáîðàòîðèÿ ìîëåêóëÿðíîé è êëåòî÷íîé áèîëîãèè,
Èíñòèòóò ìîëåêóëÿðíîé áèîëîãèè è ãåíåòèêè ÍÀÍ Óêðàèíû
Óë. Àêàäåìèêà Çàáîëîòíîãî, 150, Êèåâ, Óêðàèíà, 03680
kboyarshin@mail.ru
Öåëü. Îõàðàêòåðèçîâàòü ïðîöåññ òÐÍÊ-çàâèñèìîãî ïðåòðàíñôåðíîãî ðåäàêòèðîâàíèÿ àëàíèíà ïðî-
ëèë-òÐÍÊ ñèíòåòàçîé áàêòåðèè Enterococcus faecalis (ÏðîÐÑEf). Ìåòîäû. Ñêîðîñòü ïðîöåññîâ ðåäàê-
òèðîâàíèÿ in vitro îïðåäåëÿëè ïî ãèäðîëèçó ÀÒÔ ÏðîÐÑEf. Ïðå- è ïîñòòðàíñôåðíîå ðåäàêòèðîâàíèå
ðàçäåëåíû ýêñïåðèìåíòàëüíî ñàéò-íàïðàâëåííûì ìóòàãåíåçîì. Ðåçóëüòàòû. òÐÍÊ-çàâèñèìîå ïðå-
òðàíñôåðíîå ðåäàêòèðîâàíèå õàðàêòåðèçóåòñÿ âòðîå áîëüøåé ñêîðîñòüþ, ÷åì òÐÍÊ-íåçàâèñèìîå.
Ýôôåêòèâíîñòü ïðîöåññà çàâèñèò îò íàëè÷èÿ 2'-ãèäðîêñèëüíîé ãðóïïû À76 òÐÍÊ
Ïðî
. Â îòñóòñòâèå
òÐÍÊ
Ïðî
ïàðàëëåëüíî ñ òÐÍÊ-íåçàâèñèìûì ïðåòðàíñôåðíûì ðåäàêòèðîâàíèåì ïðîèñõîäèò âûñâîáîæ-
äåíèå àëàíèë-ÀÌÔ èç àêòèâíîãî öåíòðà ÏðîÐÑEf ñ âîçìîæíîñòüþ âòîðè÷íîãî ñâÿçûâàíèÿ è ãèäðîëèçà.
Âûâîäû. òÐÍÊ-çàâèñèìîå ïðåòðàíñôåðíîå ðåäàêòèðîâàíèå àëàíèíà ÏðîÐÑEf ÿâëÿåòñÿ êàòàëèòè÷åñ-
êèì ìåõàíèçìîì, îïîñðåäîâàííûì 2'-ãèäðîêñèëüíîé ãðóïïîé À76 òÐÍÊ
Ïðî
. Â îòñóòñòâèå òÐÍÊ
Ïðî
äåéñò-
âóþò ìåõàíèçìû òÐÍÊ-íåçàâèñèìîãî ïðåòðàíñôåðíîãî ðåäàêòèðîâàíèÿ è ñåëåêòèâíîãî âûñâîáîæäå-
íèÿ àëàíèë-ÀÌÔ.
Êëþ÷åâûå ñëîâà: ðåäàêòèðîâàíèå, ïðîëèë-òÐÍÊ ñèíòåòàçà, áèîñèíòåç áåëêà.
Ââåäåíèå. Àìèíîàöèë-òÐÍÊ ñèíòåòàçû (ÀÐÑàçû)
êàòàëèçèðóþò àêòèâàöèþ àìèíîêèñëîò ñ îáðàçîâà-
íèåì àìèíîàöèë-àäåíèëàòîâ è ïåðåíîñ àìèíîêèñ-
ëîòíûõ îñòàòêîâ íà òÐÍÊ. Îò òî÷íîñòè ñèíòåçà àìè-
íîàöèë-òÐÍÊ çàâèñèò òî÷íîñòü ñèíòåçà ïîëèïåï-
òèäíîé öåïè íà ðèáîñîìå [1]. Äîïóñòèìûé óðîâåíü
îøèáîê â ýòîì ïðîöåññå íå ïðåâûøàåò 10–3–10–4 [2,
3]. Ñòîëü âûñîêàÿ òî÷íîñòü íå âî âñåõ ñëó÷àÿõ ìî-
æåò îáåñïå÷èâàòüñÿ îäíèì ëèøü ñïåöèôè÷åñêèì
ñâÿçûâàíèåì àìèíîêèñëîòû â àêòèâíîì öåíòðå ôåð-
ìåíòà, òàê êàê ýíåðãèÿ ñâÿçûâàíèÿ ñòåðè÷åñêè è õè-
ìè÷åñêè ïîõîæèõ àìèíîêèñëîò ïî íåîáõîäèìîñòè
îêàçûâàåòñÿ áëèçêîé [4, 5].
 ðàáîòå [6] Ôåðøòîì ïðåäëîæåíà ìîäåëü «äâîé-
íîãî ñèòà», ïðåäóñìàòðèâàþùàÿ ïîñëåäîâàòåëüíîå
óçíàâàíèå ñóáñòðàòîâ â äâóõ àêòèâíûõ öåíòðàõ îä-
íîãî ôåðìåíòà. Àìèíîêèñëîòíûé îñòàòîê àìèíî-
àöèë-òÐÍÊ, ñèíòåçèðîâàííîé â ðåçóëüòàòå îøèáî÷-
íîãî óçíàâàíèÿ àìèíîêèñëîòû â àìèíîàöèëèðó-
þùåì àêòèâíîì öåíòðå, ñïåöèôè÷åñêè óçíàåòñÿ è
ãèäðîëèçóåòñÿ â îñîáîì, ðåäàêòèðóþùåì àêòèâíîì
öåíòðå. Òàêàÿ ìîäåëü íàøëà ýêñïåðèìåíòàëüíîå
ïîäòâåðæäåíèå äëÿ ðÿäà ÀÐÑàç [7–9]. Ñïåöèôè÷åñ-
êèé ãèäðîëèç îøèáî÷íûõ àìèíîàöèë-òÐÍÊ ÀÐÑà-
çàìè ïîëó÷èë íàçâàíèå ïîñòòðàíñôåðíîãî ðåäàêòè-
ðîâàíèÿ.
Îäíàêî îòñåèâàíèå îøèáî÷íî àêòèâèðîâàííûõ
àìèíîêèñëîòíûõ îñòàòêîâ âîçìîæíî è íà ýòàïå ïðî-
ìåæóòî÷íûõ ïðîäóêòîâ – àìèíîàöèë-àäåíèëàòîâ.
Ýòîò ïðîöåññ èçâåñòåí êàê ïðåòðàíñôåðíîå ðåäàê-
òèðîâàíèå [10, 11].  îòëè÷èå îò ïîñòòðàíñôåðíîãî
îí ìîæåò ïðîèñõîäèòü íåïîñðåäñòâåííî â àìèíî-
àöèëèðóþùåì àêòèâíîì öåíòðå, ÷òî íå óêëàäûâà-
åòñÿ â êëàññè÷åñêóþ ñõåìó «äâîéíîãî ñèòà».
382
ISSN 0233–7657. Biopolymers and Cell. 2013. Vol. 29. N 5. P. 382–388 doi: 10.7124/bc.00082D
� Institute of Molecular Biology and Genetics, NAS of Ukraine, 2013
Ïðîëèë-òÐÍÊ ñèíòåòàçû (ÏðîÐÑ) áàêòåðèàëü-
íîãî òèïà ñïîñîáíû îøèáî÷íî àêòèâèðîâàòü àëà-
íèí [12] è öèñòåèí [13, 14]. Ïðîäóêòû àêòèâàöèè
àëàíèíà ðåäàêòèðóþòñÿ èìè êàê ïîñò- , òàê è ïðå-
òðàíñôåðíî [12]. Öåëü íàøåé ðàáîòû ñîñòîÿëà â èç-
ó÷åíèè âëèÿíèÿ òÐÍÊ íà ïðîöåññû, ñâÿçàííûå ñ
ïðåòðàíñôåðíûì ðåäàêòèðîâàíèåì ÏðîÐÑ ýóáàêòå-
ðèè Enterococcus faecalis (ÏðîÐÑEf).
Íà ãîìîëîãè÷íîì ôåðìåíòå Escherichia coli ðà-
íåå ïîêàçàíî íàëè÷èå òðåõ íåçàâèñèìûõ ðåäàêòè-
ðóþùèõ ìåõàíèçìîâ. Ïåðâûé è îñíîâíîé – ýòî ïîñò-
òðàíñôåðíîå ðåäàêòèðîâàíèå â àêòèâíîì öåíòðå ðå-
äàêòèðóþùåãî äîìåíà (INS). Âòîðîé, íå òðåáóþ-
ùèé ó÷àñòèÿ òÐÍÊ,– ýòî ïðåòðàíñôåðíîå ðåäàêòè-
ðîâàíèå â àìèíîàöèëèðóþùåì àêòèâíîì öåíòðå
[12]. Òðåòèé, íàèìåíåå çíà÷èìûé, è íå òðåáóþùèé
ñïåöèàëüíîé êàòàëèòè÷åñêîé àêòèâíîñòè ôåðìåíòà, –
ýòî ñåëåêòèâíîå âûñâîáîæäåíèå àëàíèë-àäåíèëàòà
â ðàñòâîð, îáóñëîâëåííîå åãî ìåíüøèì ñðîäñòâîì ê
àìèíîàöèëèðóþùåìó àêòèâíîìó öåíòðó, ÷åì ó ïðî-
ëèë-àäåíèëàòà [15, 16].
Ïîñòòðàíñôåðíîå ðåäàêòèðîâàíèå èçó÷åíî íà-
ìè ðàíåå ïðè ïîìîùè òåñòà íà äåàöèëèðîâàíèå àëà-
íèë-òÐÍÊÏðîÀëà [17]. Äëÿ ýòîãî ïîäîáðàíà ìóòàíòíàÿ
ôîðìà ÏðîÐÑEf Ê279À, õàðàêòåðèçóþùàÿñÿ ïðàê-
òè÷åñêèì îòñóòñòâèåì ïîñòòðàíñôåðíîé ðåäàêòè-
ðóþùåé àêòèâíîñòè. Èñïîëüçîâàíèå òàêîé ìóòàíò-
íîé ôîðìû â òåñòå íà íàêîïëåíèå ÀÌÔ ïîçâîëèëî
íàì ýêñïåðèìåíòàëüíî ðàçäåëèòü ïîñòòðàíñôåðíîå
ðåäàêòèðîâàíèå è òÐÍÊ-çàâèñèìîå ïðåòðàíñôåðíîå
ðåäàêòèðîâàíèå [18]. Âëèÿíèå òÐÍÊ íà ïðåòðàíñ-
ôåðíîå ðåäàêòèðîâàíèå ÏðîÐÑEf ïîêàçàíî âïåðâûå
äëÿ ÀÐÑàçû âòîðîãî êëàññà, ÷åãî íå íàáëþäàëîñü
äëÿ ãîìîëîãè÷íîãî ôåðìåíòà E. coli [12, 16]. Ïðåä-
ñòàâëÿåìàÿ ñòàòüÿ ÿâëÿåòñÿ ðåçóëüòàòîì äàëüíåé-
øåãî èçó÷åíèÿ ýòîãî ôåíîìåíà.
Ìàòåðèàëû è ìåòîäû. Ìàòåðèàëû. Â ðàáîòå
èñïîëüçîâàëè 2'-äåçîêñèàäåíîçèí 5'-òðèôîñôàò, 3'-
äåçîêñèàäåíîçèí 5'-òðèôîñôàò, ôîñôîäèýñòåðàçó I
ÿäà Crotalus adamanteus («Sigma», ÑØÀ), ðàäèîàê-
òèâíî ìå÷åííûå âåùåñòâà («Amersham», ÑØÀ),
ñòåêëîâîëîêîííûå ôèëüòðû («Whatman», ÑØÀ) è
ÏÝÈ-öåëëþëîçíûå ïëàñòèíû äëÿ òîíêîñëîéíîé
õðîìàòîãðàôèè («Merck», ÑØÀ).
Ïîëó÷åíèå ïðåïàðàòîâ ìàêðîìîëåêóë. Ïðåïàðà-
òèâíîå âûäåëåíèå ÏðîÐÑEf, åå ìóòàíòíûõ ôîðì, à
òàêæå íàòèâíîé òÐÍÊÏðî Rhodopseudomonas palust-
ris ñ àíòèêîäîíîì CGG (òÐÍÊÏðîRp) îïèñàíî íàìè
ðàíåå [18]. Ïåïàðàòû òðàíñêðèïòà òÐÍÊÏðîEf ñ àíòè-
êîäîíîì UGG ãîòîâèëè, êàê îïèñàíî â [19].
Ïîëó÷åíèå ìîäèôèöèðîâàííûõ òÐÍÊÏðî. Ìåòî-
äèêà âêëþ÷àåò îòùåïëåíèå ÑÑÀ-êîíöà òÐÍÊÏðîRp
ïðè ïîìîùè ôîñôîäèýñòåðàçû ÿäà C. adamanteus è
äîñòðàèâàíèå ÑÑÀ-êîíöà ñ ñîîòâåòñòâóþùèì ïðî-
èçâîäíûì àäåíèíà ïðè ïîìîùè òåðìèíàëüíîé òÐÍÊ-
íóêëåîòèäèëòðàíñôåðàçû Bacillus stearothermophi-
lus. Ðåàêöèîííàÿ ñìåñü äëÿ îòùåïëåíèÿ ÑÑÀ-êîíöà
òÐÍÊ ñîäåðæàëà 50 ìÌ òðèñ-HCl, pH 8,0, 10 ìÌ
MgCl2, 0,32 ìã/ìë òÐÍÊ è 15 ìÌ ôîñôîäèýñòåðàçó.
Ïîñëå 15 ìèí èíêóáàöèè ïðè êîìíàòíîé òåìïåðà-
òóðå ñìåñü ýêñòðàãèðîâàëè ôåíîëîì è îáðàáîòàí-
íóþ òÐÍÊ îñàæäàëè ýòàíîëîì. Ñëåäîâûå êîëè÷åñ-
òâà íåîáðàáîòàííîé òÐÍÊ óäàëÿëè èîíîîáìåííîé
õðîìàòîãðàôèåé âûñîêîãî äàâëåíèÿ íà êîëîíêå VAX
1S ôèðìû «Dionex» (ÑØÀ). Î÷èùåííóþ òÐÍÊ ñ óäà-
ëåííûì ÑÑÀ-êîíöîì ðåíàòóðèðîâàëè ïëàâëåíèåì
è îòæèãîì â îáúåìå îñòûâàþùåé âîäû.
Ðåàêöèîííàÿ ñìåñü äëÿ äîñòðàèâàíèÿ ìîäèôèöè-
ðîâàííîãî ÑÑÀ-êîíöà òÐÍÊ ñîäåðæàëà 100 ìÌ ãëè-
öèí-NaOH, pH 9,0, 10 ìÌ MgCl2, 1 ìÌ ÄÒÒ, 15 ìêÌ
òÐÍÊ áåç ÑÑÀ, 100 ìêÌ ÑÒÐ, 2 ìÌ 2'd-ÀÒÐ èëè
2'F-ÀÒÐ, 5 ìêÌ òåðìèíàëüíóþ òÐÍÊ-íóêëåîòèäèë-
òðàíñôåðàçó. Ïîñëå 30 ìèí èíêóáàöèè ïðè òåìïåðà-
òóðå 60 îÑ îáðàáîòàííóþ òÐÍÊ îñàæäàëè ýòàíîëîì.
Äëÿ î÷èñòêè ìîäèôèöèðîâàííîé òÐÍÊ ïðåïà-
ðàò íàíîñèëè íà 8 %-é ÏÀÀÃ â ïðèñóòñòâèè 7 Ì ìî-
÷åâèíû è âûðåçàëè ïîëîñó ãåëÿ, ñîäåðæàùóþ òÐÍÊ,
ïîä óëüòðàôèîëåòîâûì îñâåùåíèåì. Çàòåì òÐÍÊ
ýêñòðàãèðîâàëè èç ãåëÿ òðåìÿ îáúåìàìè áóôåðíîãî
ðàñòâîðà, ñîäåðæàùåãî 0,5 Ì NH4Ac, pH 5,5, 0,1 ìÌ
ÝÄÒÀ, 0,1 % ÄÑÍ. ×àñòèöû ãåëÿ óäàëÿëè ïîâòîð-
íûì öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 6000 îá/ìèí â òå÷å-
íèå 15 ìèí, ìîäèôèöèðîâàííóþ òÐÍÊ èç îñâåòëåí-
íîãî ðàñòâîðà îñàæäàëè ýòàíîëîì.
Îïðåäåëåíèå íàêîïëåíèÿ ÀÌÔ. Ðåàêöèîííàÿ
ñìåñü ñîäåðæàëà 0,1 M HEPES, pH 7,5, 10 ìM MgCl2,
0,5 M àëàíèí, 2 ìM ÄTT, 1 ìM ATÔ, ñëåäîâûå êîëè-
÷åñòâà 32Ð-ATÔ èëè 14C-ATÔ. Òàêæå äîáàâëÿëè íà-
òèâíóþ òÐÍÊÏðîRp (CGG), 2'-d èëè 3'-d A76 ïðîèç-
âîäíûå íàòèâíîé òÐÍÊÏðîRp èëè òðàíñêðèïò òÐÍÊÏðî
Ef (UGG) â êîíöåíòðàöèè 15 ìêÌ, èëè îò 0,25 äî 80
ìêÌ òÐÍÊÏðîRp äëÿ èçó÷åíèÿ çàâèñèìîñòè ñêîðî-
383
ÐÎËÜ òÐÍÊ
Ïðî
 ÏÐÅÒÐÀÍÑÔÅÐÍÎÌ ÐÅÄÀÊÒÈÐÎÂÀÍÈÈ ÀËÀÍÈÍÀ ÏÐÎËÈË-òÐÍÊ ÑÈÍÒÅÒÀÇÎÉ
ñòè ðåäàêòèðîâàíèÿ îò êîíöåíòðàöèè òÐÍÊ. Ðåàê-
öèþ çàïóñêàëè äîáàâëåíèåì ÏðîÐÑEf äèêîãî òèïà
èëè ìóòàíòíîé ôîðìû ÏðîÐÑEf Ê279À â êîíöåí-
òðàöèè 2 ìêÌ. Äëÿ ñðàâíåíèÿ ñêîðîñòåé ïðåòðàíñ-
ôåðíîãî ðåäàêòèðîâàíèÿ â ïðèñóòñòâèè íàòèâíîé
òÐÍÊÏðîRp è åå 2'-d A76 ïðîèçâîäíîãî èõ ïðåïàðàòû
äîáàâëÿëè ê ñìåñÿì, ñîäåðæàùèì ÏðîÐÑEf Ê279À
â êîíöåíòðàöèè ñîîòâåòñòâåííî 0,5 è 20 ìêÌ. Cìåñü
èíêóáèðîâàëè ïðè òåìïåðàòóðå 37 îÑ è îòáèðàëè
àëèêâîòû ïî 2, 5 ìêë, íàíîñèëè èõ íà ÏÝÈ-öåëëþ-
ëîçó äëÿ ðàçäåëåíèÿ ÀÒÔ, ÀÌÔ è àëàíèë-àäåíèëà-
òà. Òîíêîñëîéíóþ õðîìàòîãðàôèþ ïðîâîäèëè â 200
ìÌ ÊÀñ (ðÍ 5,2). Ðåçóëüòàòû ðàçäåëåíèÿ âèçóàëè-
çèðîâàëè íà ôîñôîèìèäæåðå Pharos FX («BioRad»,
ÑØÀ).
Êîëè÷åñòâà ðàäèîàêòèâíî ìå÷åííûõ âåùåñòâ
îïðåäåëÿëè ïî êàëèáðîâî÷íûì ãðàôèêàì, ïîëó÷åí-
íûì ñ èñïîëüçîâàíèåì ñöèíòèëëÿöèîííîãî ñ÷åò÷è-
êà ðàäèîàêòèâíîñòè.
Àíàëèç ãèäðîëèçà àëàíèë-ÀÌÔ. Ôåðìåíòàòèâ-
íûé ãèäðîëèç àëàíèë-ÀÌÔ ÏðîÐÑEf â ïðèñóòñò-
âèè òÐÍÊÏðî èçó÷àëè ñëåäóþùèì îáðàçîì. Ðåàêöèîí-
íóþ ñìåñü, ñîäåðæàùóþ 0,1 M HEPES, pH 7,5, 10 ìM
MgCl2, 0,5 M àëàíèí, 2 ìM ÄTT, 0,16 ìÌ ÀÒÔ è
ñëåäîâûå êîëè÷åñòâà 32Ð-ATÔ, èíêóáèðîâàëè ïðè
òåìïåðàòóðå 37 îÑ â òå÷åíèå 10 ìèí ñ ÏðîÐÑEf äè-
êîãî òèïà èëè ñîîòâåòñòâóþùåé ìóòàíòíîé ôîðìîé
ôåðìåíòà äëÿ íàêîïëåíèÿ àëàíèë-àäåíèëàòà. Çàòåì
äîáàâëÿëè íàòèâíóþ òÐÍÊÏðîRp äî êîíöåíòðàöèè
11,5 ìêÌ, îòáèðàëè àëèêâîòû ïî âðåìåíè, ðàçäåëÿ-
ëè è àíàëèçèðîâàëè èõ, êàê óêàçàíî äëÿ òåñòà íà ãèä-
ðîëèç ÀÒÔ.
Äëÿ èçó÷åíèÿ íåôåðìåíòàòèâíîãî ãèäðîëèçà àëà-
íèë-ÀÌÔ ê ðåàêöèîííîé ñìåñè ïîñëå èíêóáàöèè â
òå÷åíèå 10 ìèí äîáàâëÿëè ïðîëèë-ñóëüôàìîèëàäå-
íèëàò äî êîíöåíòðàöèè 273 ìÌ äëÿ êîíêóðåíòíîãî
âûòåñíåíèÿ àëàíèë-ÀÌÔ èç àêòèâíûõ öåíòðîâ
ÏðîÐÑEf. Ïðîáû îòáèðàëè è àíàëèçèðîâàëè àíàëî-
ãè÷íûì îáðàçîì.
Àìèíîàöèëèðîâàíèå òÐÍÊÏðî. òÐÍÊÏðî àìèíîàöè-
ëèðîâàëè â ðåàêöèîííîé ñìåñè, ñîäåðæàùåé 0,1 M
HEPES, pH 7,5, 20 ìM MgCl2, 3 ìÌ ÀÒÔ, 70 ìêÌ
14Ñ-ïðîëèí, 20–30 ìêÌ òÐÍÊÏðî. Êîíöåíòðàöèÿ
ÏðîÐÑEf âàðüèðîâàëà îò 3 äî 15 íÌ. Ñìåñü èíêóáè-
ðîâàëè ïðè t = 37 îÑ è îòáèðàëè àëèêâîòû ïî 10 ìêë,
äîáàâëÿëè èõ â 200 ìêë 10 %-é ÒÕÓ äëÿ îñòàíîâêè
ðåàêöèè. Ñôîðìèðîâàâøèåñÿ îñàäêè 14Ñ-ïðîëèë-
òÐÍÊÏðî ïåðåíîñèëè íà ñòåêëîâîëîêîííûå ôèëüòðû
è èññëåäîâàëè íà ñöèíòèëëÿöèîííîì ñ÷åò÷èêå.
Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå. Õàðàêòåðèñòèêà
òÐÍÊ-çàâèñèìîãî ïðåòðàíñôåðíîãî ðåäàêòèðîâà-
íèÿ ÏðîÐÑEf.  ýêñïåðèìåíòàõ in vitro ðàñïàä è ïî-
âòîðíûé ñèíòåç ïðîäóêòîâ, ïîäëåæàùèõ ðåäàêòè-
ðîâàíèþ, ïðèâîäèò ê ïîñòîÿííîìó ðàñõîäó ÀÒÔ è
íàêîïëåíèþ ÀÌÔ â ðåàêöèîííîé ñìåñè íåçàâèñè-
ìî îò òîãî, êàêèì îáðàçîì ïðîèñõîäèò ðåäàêòèðî-
âàíèå [20]. Àìèíîêèñëîòà è òÐÍÊ ïðè ýòîì íå ðàñ-
õîäóþòñÿ, ïîçâîëÿÿ èçìåíÿòüñÿ êîíöåíòðàöèè òîëü-
êî îäíîãî èç ñóáñòðàòîâ. Ìåòîä, îñíîâàííûé íà íà-
êîïëåíèè ÀÌÔ, ïðèìåíåí íàìè äëÿ èçó÷åíèÿ ïó-
òåé ðåäàêòèðîâàíèÿ ÏðîÐÑEf ïðîäóêòîâ îøèáî÷-
íîãî óçíàâàíèÿ àëàíèíà.
384
ÁÎßÐØÈÍ Ê. Ñ. È ÄÐ.
kobs, c–1
Ñóììàðíîå ðåäàêòèðîâàíèå (äèêèé òèï
ÏðîÐÑ + òÐÍÊÏðî)
òÐÍÊ-çàâèñèìîå ïðåòðàíñôåðíîå
ðåäàêòèðîâàíèå (ÏðîÐÑ Ê279À +
òÐÍÊÏðî)
òÐÍÊ-íåçàâèñèìîå ïðåòðàíñôåðíîå
ðåäàêòèðîâàíèå (äèêèé òèï ÏðîÐÑ áåç
òÐÍÊ)
Íåôåðìåíòàòèâíûé ãèäðîëèç
àëàíèë-àäåíèëàòà
0,433 ± 0,065 0,131 ± 0,014 0,039 ± 0,013 (7,8 ± 1,7) � 10–4
Íàáëþäàåìûå êîíñòàíòû ñêîðîñòè íàêîïëåíèÿ ÀÌÔ â õîäå ðåäàêòèðîâàíèÿ ÏðîÐÑEf ïðîòèâ àëàíèíà
0 2 4 6 8 10 12
0
100
200
300
400
500
A
M
P
,
ì
êM
t, ìèí
2
1
3
4
Ðèñ. 1. Íàêîïëåíèå ÀÌÔ â ðåçóëüòàòå ïðîöåññîâ ðåäàêòèðîâàíèÿ:
òÐÍÊ-íåçàâèñèìîå ïðåòðàíñôåðíîå ðåäàêòèðîâàíèå â ïðèñó-
òñòâèè äèêîãî òèïà ÏðîÐÑ áåç òÐÍÊ (1) è ÏðîÐÑ Ê279À áåç òÐÍÊ
(2); òÐÍÊ-çàâèñèìîå ïðåòðàíñôåðíîå ðåäàêòèðîâàíèå â ïðèñó-
òñòâèè ÏðîÐÑ Ê279À è òÐÍÊÏðî
Rp (3); Ïðå- è ïîñòòðàíñôåðíîå ðå-
äàêòèðîâàíèå â ïðèñóòñòâèè äèêîãî òèïà ÏðîÐÑ è òÐÍÊÏðî
Rp (4)
 ïðèñóòñòâèè íàòèâíîé òÐÍÊÏðîRp è ìóòàíò-
íîé ôîðìû ÏðîÐÑ Åf Ê279À ñêîðîñòü íàêîïëåíèÿ
ÀÌÔ âòðîå áîëüøå, ÷åì â àíàëîãè÷íîé ñìåñè áåç
òÐÍÊ (ðèñ. 1, òàáëèöà). Â ïðèñóòñòâèè ôåðìåíòà
äèêîãî òèïà è íàòèâíîé òÐÍÊÏðî Rp ñêîðîñòü àêêó-
ìóëÿöèè ïðîäóêòà âîçðàñòàåò åùå âòðîå (òàáëèöà)
çà ñ÷åò ïîäêëþ÷åíèÿ ïîñòòðàíñôåðíîãî ðåäàêòèðî-
âàíèÿ, áëîêèðîâàííîãî â ìóòàíòíîé ôîðìå. Â òî æå
âðåìÿ òðàíñêðèïò òÐÍÊÏðîEf íå óñêîðÿåò íàêîïëå-
íèÿ ÀÌÔ ñêîëüêî-íèáóäü ñóùåñòâåííî êàê â ñëó-
÷àå ñ äèêèì òèïîì ôåðìåíòà, òàê è ñ ìóòàíòíîé ôîð-
ìîé (ðèñ. 2, a). Íà÷àëüíàÿ ñêîðîñòü àìèíîàöèëèðî-
âàíèÿ îáåèõ òÐÍÊ ïðè ýòîì ïðàêòè÷åñêè îäèíàêîâà
(ðèñ. 2, á).
Ñêîðîñòü íàêîïëåíèÿ ÀÌÔ â ïðèñóòñòâèè Ïðî
ÐÑ Ef Ê279À çàâèñèò îò êîíöåíòðàöèè íàòèâíîé
òÐÍÊÏðîRp, ïðèáëèæàþùåéñÿ ê íàñûùåíèþ â îáëà-
ñòè îêîëî 30 ìêÌ ïðè êîíöåíòðàöèè ôåðìåíòà 2 ìêÌ
(ðèñ. 3).
Ïîìèìî íàêîïëåíèÿ ÀÌÔ, â îòñóòñòâèå òÐÍÊ
(à òàêæå â ïðèñóòñòâèè òðàíñêðèïòà òÐÍÊÏðîEf) íà-
áëþäàåòñÿ àêêóìóëÿöèÿ àëàíèë-ÀÌÔ, ÷åãî íå ïðî-
èñõîäèò â ïðèñóòñòâèè íàòèâíîé òÐÍÊÏðîRp (ðèñ.
4). Äîáàâëåíèå íàòèâíîé òÐÍÊ â ðåàêöèîííóþ
ñìåñü âûçûâàåò ýêñïîíåíöèàëüíîå ïàäåíèå êîíöåí-
òðàöèè àëàíèë-ÀÌÔ. Äèêèé òèï ôåðìåíòà è ìóòàí-
òíûå ôîðìû Ê279À è Í366À, íåñóùèå ìóòàöèè â ðå-
äàêòèðóþùåì äîìåíå, âåäóò ñåáÿ â ýòîì ïðîöåññå ïî-
äîáíûì îáðàçîì (ðèñ. 5).
Ñðàâíåíèå íàáëþäàåìûõ êîíñòàíò ñêîðîñòè íà-
êîïëåíèÿ ÀÌÔ ñî ñêîðîñòüþ ñïîíòàííîãî ãèäðî-
ëèçà àëàíèë-àäåíèëàòà â àíàëîãè÷íîì ðàñòâîðå
(òàáëèöà) ïîêàçàëî, ÷òî êàê òÐÍÊ-çàâèñèìîå, òàê è
òÐÍÊ-íåçàâèñèìîå ðåäàêòèðîâàíèå ÏðîÐÑEf ÿâëÿ-
þòñÿ êàòàëèòè÷åñêèìè ïðîöåññàìè è íå ñâîäÿòñÿ ê
èçáèðàòåëüíîìó âûñâîáîæäåíèþ àëàíèë-àäåíèëà-
òà èç àêòèâíîãî öåíòðà ôåðìåíòà.
Ðîëü ãèäðîêñèëüíûõ ãðóïï À76 òÐÍÊÏðî â ïðå-
òðàíñôåðíîì ðåäàêòèðîâàíèè. Ðàíåå íàìè ïîêàçà-
íà íåñïîñîáíîñòü ê èíäóêöèè òÐÍÊ-çàâèñèìîãî ïðå-
òðàíñôåðíîãî ðåäàêòèðîâàíèÿ íàòèâíîé òÐÍÊÏðîRp,
îêèñëåííîé ïåðèîäàòîì íàòðèÿ [18]. Îáðàáîòêà ýòèì
ðåàãåíòîì ïðèâîäèò ê ðàçðûâó ïåíòîçíîãî êîëüöà
ðèáîçû À76 è âõîæäåíèþ êèñëîðîäîâ 2'- è 3'-ãèä-
ðîêñèëîâ â ñîñòàâ êàðáîêñèëüíûõ ãðóïï [21]. Äëÿ
ïðîâåðêè ðîëè ãèäðîêñèëüíûõ ãðóïï ðèáîçû À76
òÐÍÊÏðî â èíäóêöèè ðåäàêòèðîâàíèÿ íàìè ïîëó÷å-
íû 2'- è 3'-dÀ76 ïðîèçâîäíûå òÐÍÊÏðîRp, õàðàêòå-
ðèçóþùèåñÿ ìíîãîêðàòíî ñíèæåííîé ñïîñîáíîñòüþ
ê óñêîðåíèþ ãèäðîëèçà ÀÒÔ â ñîîòâåòñòâóþùåì òå-
ñòå. Ó ÏðîÐÑ, êàê è ó áîëüøèíñòâà ÀÐÑàç 2-ãî êëàñ-
385
ÐÎËÜ òÐÍÊ
Ïðî
 ÏÐÅÒÐÀÍÑÔÅÐÍÎÌ ÐÅÄÀÊÒÈÐÎÂÀÍÈÈ ÀËÀÍÈÍÀ ÏÐÎËÈË-òÐÍÊ ÑÈÍÒÅÒÀÇÎÉ
0
100
200
300
400
500
0 2 4 6 8
A
T
P
,
ì
ê
M
t, ìèí
0 1 2 3 4 5 6
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
Ï
ð
î
ëè
ë-
ò
Ð
Í
Ê
,
ì
ê
Ì
t, ìèí
à á
1
2
3
4
5
1
2
Ðèñ. 2. Áèîõèìè÷åñêèå ñâîéñòâà òðàíñêðèïòà òÐÍÊÏðî
E. faecalis: a – íàêîïëåíèå ÀÌÔ â ïðèñóòñòâèè äèêîãî òèïà ÏðîÐÑ è òÐÍÊÏðî
Rp
(1); ÏðîÐÑ Ê279À è òÐÍÊÏðî
Rp (2); äèêîãî òèïà ÏðîÐÑ è òÐÍÊÏðî
Ef (3); ÏðîÐÑ Ê279À è òÐÍÊÏðî
Ef (4); äèêîãî òèïà ÏðîÐÑ áåç òÐÍÊ (5);
á – àìèíîàöèëèðîâàíèå ïðîëèíîì òðàíñêðèïòà òÐÍÊÏðî
Ef (1) è òÐÍÊÏðî
Rp (2)
0 20 40 60 80
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
k o
b
s
,
c
�
1
òÐÍÊ
Ïðî
, ìêÌ
Ðèñ. 3. Çàâèñèìîñòü íàáëþäàåìîé êîíñòàíòû ñêîðîñòè íàêîïëåíèÿ
ÀÌÔ â õîäå òÐÍÊ-çàâèñèìîãî ïðåòðàíñôåðíîãî ðåäàêòèðîâàíèÿ
îò êîíöåíòðàöèè òÐÍÊÏðî
Rp
ñà, 2'-ãèäðîêñèëüíàÿ ãðóïïà À76 íå ó÷àñòâóåò íå-
ïîñðåäñòâåííî â ðåàêöèè àìèíîàöèëèðîâàíèÿ, ÷òî
ïîçâîëèëî íàì ïðîâåðèòü ñïåöèôè÷åñêóþ ðîëü ýòîé
ãðóïïû â ïðåòðàíñôåðíîì ðåäàêòèðîâàíèè, ñðàâ-
íèâ ïàäåíèå ñêîðîñòè àìèíîàöèëèðîâàíèÿ è ðåäàê-
òèðîâàíèÿ ïðè åå óäàëåíèè. Ñêîðîñòü ïðåòðàíñôåð-
íîãî ðåäàêòèðîâàíèÿ â ðåçóëüòàòå ìîäèôèêàöèè
òÐÍÊ óìåíüøàåòñÿ ïðèìåðíî â 90 ðàç (ðèñ. 6, a), à
ïðè ñíèæåíèè ñêîðîñòè àìèíîàöèëèðîâàíèÿ – â
3–4 ðàçà (ðèñ. 6, á).
òÐÍÊ-çàâèñèìîå ïðåòðàíñôåðíîå ðåäàêòèðîâà-
íèå ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé îòíîñèòåëüíî íåáîëüøîé,
íî ñòàòèñòè÷åñêè äîñòîâåðíûé ýôôåêò, ñàìîñòîÿ-
òåëüíûé ïî îòíîøåíèþ ê ïðîöåññàì àêòèâàöèè àìè-
íîêèñëîòû, åå ïåðåíîñà íà òÐÍÊ è ñåëåêòèâíîãî âû-
ñâîáîæäåíèÿ àëàíèë-àäåíèëàòà. Íàëè÷èå è âåëè÷è-
íà ýòîãî ýôôåêòà çàâèñÿò îò ñòðóêòóðíûõ îñîáåí-
íîñòåé áàêòåðèàëüíîé òÐÍÊÏðî: åå ïîñëåäîâàòåëü-
íîñòè [18] è, âîçìîæíî, ïîñòòðàíñêðèïöèîííûõ ìî-
äèôèêàöèé. Îáà ôàêòîðà çàòðàãèâàþò ïðîñòðàíñò-
âåííóþ ñòðóêòóðó òÐÍÊÏðî, ÷òî, â ñâîþ î÷åðåäü, ìî-
æåò ñêàçûâàòüñÿ íà ïîëîæåíèè åå 3'-êîíöà â àêòèâ-
íîì öåíòðå ôåðìåíòà. Â äàííîé ðàáîòå òðàíñêðèïò
òÐÍÊÏðîEf íå ïðîÿâèë ñïîñîáíîñòè ê èíäóêöèè ïðå-
òðàíñôåðíîãî ðåäàêòèðîâàíèÿ. Òàêèì îáðàçîì, îòñóò-
ñòâèå òÐÍÊ-çàâèñèìîãî ðåäàêòèðîâàíèÿ ó ÏðîÐÑ Åñ
â ïðèñóòñòâèè òðàíñêðèïòà òÐÍÊÏðîÅñ [12, 16] ñî-
ãëàñóåòñÿ ñ ïîëó÷åííûìè íàìè ðåçóëüòàòàìè. Òàê
èëè èíà÷å, âîïðîñ îá îñóùåñòâëåíèè áàêòåðèàëüíû-
ìè ÏðîÐÑ òÐÍÊ-çàâèñèìîãî ïðåòðàíñôåðíîãî ðå-
äàêòèðîâàíèÿ in vivo îñòàåòñÿ îòêðûòûì. Íàáëþäà-
åìûé ýôôåêò ìîæåò îòðàæàòü êàê àêòóàëüíûé ìå-
õàíèçì, ó÷àñòâóþùèé â îáåñïå÷åíèè òî÷íîñòè ñèí-
òåçà ïðîëèë-òÐÍÊÏðî, òàê è ðóäèìåíò ìåõàíèçìà,
èìåâøåãî çíà÷åíèå â æèâîé êëåòêå äî ïîÿâëåíèÿ ýô-
ôåêòèâíîãî ïîñòòðàíñôåðíîãî ðåäàêòèðîâàíèÿ.
È òÐÍÊ-çàâèñèìîå, è òÐÍÊ-íåçàâèñèìîå ïðå-
òðàíñôåðíîå ðåäàêòèðîâàíèå ÏðîÐÑEf ÿâëÿþòñÿ êà-
òàëèòè÷åñêèìè ïðîöåññàìè, ñêîðîñòü êîòîðûõ ìíî-
ãîêðàòíî ïðåâûøàåò òàêîâóþ íåôåðìåíòàòèâíîãî
ãèäðîëèçà àëàíèë-àäåíèëàòà â ðàñòâîðå (òàáëèöà).
Íåñìîòðÿ íà ýòî, ñåëåêòèâíîå âûñâîáîæäåíèå àëà-
íèë-àäåíèëàòà èìååò ìåñòî â îòñóòñòâèå òÐÍÊÏðî.
Ïàðàëëåëüíî ñ âûñâîáîæäåíèåì îøèáî÷íî ñèíòå-
çèðîâàííîãî ïðîäóêòà ïðîèñõîäèò åãî âòîðè÷íîå
ñâÿçûâàíèå è ãèäðîëèç â àêòèâíîì öåíòðå ôåðìåí-
òà. Ðàâíîâåñèå ìåæäó ýòèìè ïðîöåññàìè, à òàêæå
íåôåðìåíòàòèâíûì ãèäðîëèçîì àëàíèë-àäåíèëàòà
îïðåäåëÿåò ñòàáèëüíî íèçêóþ êîíöåíòðàöèþ ïî-
ñëåäíåãî â ðåàêöèîííîé ñìåñè. Â ïðèñóòñòâèè íà-
òèâíîé òÐÍÊÏðî íàêîïëåíèÿ àëàíèë-àäåíèëàòà â
ñìåñè íå ïðîèñõîäèò, è åãî êîíöåíòðàöèÿ íå ïðåâû-
øàåò òàêîâóþ àêòèâíûõ öåíòðîâ ôåðìåíòà (ðèñ. 4).
Ïðè äîáàâëåíèè òÐÍÊ â ðåàêöèîííóþ ñìåñü, ñî-
äåðæàùóþ àëàíèë-àäåíèëàò, êîíöåíòðàöèÿ ïîñëåä-
íåãî áûñòðî ïàäàåò, ÷òî îòðàæàåò óñêîðåíèå åãî ãèä-
ðîëèçà ÏðîÐÑEf (ðèñ. 5). Ýòîò ðåçóëüòàò ïðÿìî óêà-
çûâàåò íà ðîëü òÐÍÊÏðî â ãèäðîëèçå àëàíèë-àäåíèëà-
òà. Åãî êèíåòèêà â ïðèñóòñòâèè òÐÍÊÏðî ñõîäíà äëÿ
äèêîãî òèïà ÏðîÐÑ è ìóòàíòíûõ ôîðì, íåñóùèõ
ïîâðåæäåííûé ðåäàêòèðóþùèé àêòèâíûé öåíòð
INS-äîìåíà [17] (ðèñ. 5), ÷òî ñâèäåòåëüñòâóåò î íå-
ïðè÷àñòíîñòè ìåõàíèçìà ïîñòòðàíñôåðíîãî ðåäàê-
òèðîâàíèÿ ê ýòîìó ïðîöåññó.
386
ÁÎßÐØÈÍ Ê. Ñ. È ÄÐ.
À
ëà
í
è
ë-
À
Ì
Ô
,
ì
êM
t, ìèí
0 2 4 6 8 10 12
0
2
4
6
8
10
12
14
1
2
Ðèñ. 4. Ñåëåêòèâíîå âûñâîáîæäåíèå àëàíèë-ÀÌÔ èç àêòèâíîãî
öåíòðà ÏðîÐÑ â îòñóòñòâèå òÐÍÊ (1) è â ïðèñóòñòâèè íàòèâíîé
òÐÍÊÏðî
Rp (2)
0 2 4 6 8 10 12 14
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
À
ëà
í
è
ë-
A
M
Ô
,
ì
êM
t, ìèí
4
3
2
1
Ðèñ. 5. Ãèäðîëèç àëàíèë-ÀÌÔ ÏðîÐÑ Ef äèêèì òèïîì ÏðîÐÑ â ïðè-
ñóòñòâèè òÐÍÊÏðî
Rp (1); ÏðîÐÑ Í366À â ïðèñóòñòâèè òÐÍÊÏðî
Rp (2);
ÏðîÐÑ Ê279À â ïðèñóòñòâèè òÐÍÊÏðî
Rp (3); äèêèì òèïîì ÏðîÐÑ áåç
òÐÍÊ (4)
Ýôôåêòèâíàÿ èíäóêöèÿ ïðåòðàíñôåðíîãî ðåäàê-
òèðîâàíèÿ íåâîçìîæíà â îòñóòñòâèå 2'-ãèäðîêñèëü-
íîé ãðóïïû ðèáîçû À76 òÐÍÊÏðî. Åå óäàëåíèå îêà-
çûâàåò íà ïîðÿäîê áîëüøåå âëèÿíèå íà èíäóêöèþ
ðåäàêòèðîâàíèÿ, ÷åì íà ñêîðîñòü àìèíîàöèëèðîâà-
íèÿ ìîäèôèöèðîâàííîé òÐÍÊÏðî (ðèñ. 6, à, á). Ñëå-
äîâàòåëüíî, ðîëü 2'-ÎÍ íå ìîæåò îãðàíè÷èâàòüñÿ
ñâÿçûâàíèåì À76 â àêòèâíîì öåíòðå ÏðîÐÑEf èëè
èíäóêöèåé êîíôîðìàöèîííûõ èçìåíåíèé, îäèíàêî-
âî âàæíûõ äëÿ ðåäàêòèðîâàíèÿ è àìèíîàöèëèðîâà-
íèÿ. Òàêèì îáðàçîì, ñ áîëüøîé äîëåé óâåðåííîñòè
ìîæíî ïðåäïîëîæèòü, ÷òî ýòà õèìè÷åñêàÿ ãðóïïà
âûïîëíÿåò ôóíêöèþ çàïóñêà êàòàëèòè÷åñêîãî ìåõà-
íèçìà ãèäðîëèçà àëàíèë-àäåíèëàòà â õîäå òÐÍÊ-çà-
âèñèìîãî ïðåòðàíñôåðíîãî ðåäàêòèðîâàíèÿ.
Âûâîäû. òÐÍÊ-çàâèñèìîå ïðåòðàíñôåðíîå ðå-
äàêòèðîâàíèå àëàíèíà ÏðîÐÑEf ÿâëÿåòñÿ êàòàëè-
òè÷åñêèì ìåõàíèçìîì, îïîñðåäîâàííûì 2'-ãèäðî
êñèëüíîé ãðóïïîé À76 òÐÍÊÏðî. Â îòñóòñòâèå
òÐÍÊÏðî äåéñòâóþò ìåõàíèçìû òÐÍÊ-íåçàâèñèìîãî
ïðåòðàíñôåðíîãî ðåäàêòèðîâàíèÿ è ñåëåêòèâíîãî
âûñâîáîæäåíèÿ àëàíèë-ÀÌÔ.
K. S. Boyarshin, A. E. Priss, I. A. Kriklivyi, O. P. Kovalenko,
A. D. Yaremchuk, Ì. À. Tukalo
The role of tRNAPro in pretransfer editing of alanine by prolyl-tRNA
synthetase
State Key laboratory of Molecular and Cellular Biology
Institute of Molecular Biology and Genetics, NAS of Ukraine
150, Akademika Zabolotnoho Str., Kyiv, Ukraine, 03680
Summary
Aim. To characterize the process of tRNA-dependent pretransfer edi-
ting of alanine by prolyl-tRNA synthetase of bacteria Enterococcus
faecalis (ProRS Ef). Methods. Velocity of the editing processes in vitro
was determined by ATP hydrolysis by ProRS Ef. Pretransfer and post-
transfer editing were experimentally separated by site-directed muta-
genesis. Results. tRNA-dependent pretransfer editing is characterized
by three-fold higher velocity than tRNA-independent one. The efficien-
cy of the process depends on the presence of 2'-hydroxyl group of A76
tRNA
Pro
. In the absence of tRNA
Pro
selective release of alanyl-AMP oc-
curs simultaneously with tRNA-independent pretransfer editing. Relea-
sed alanyl-AMP can be re-bound and hydrolyzed. Conclusions. tRNA-
dependent pretransfer editing of alanine by ProRS Ef is the catalytic
mechanism mediated by 2'-hydroxyl group of A76 tRNA
Pro
. In the ab-
sence of tRNA
Pro
tRNA-independent pretransfer editing and selective
release of alanyl-AMP occurs.
Keywords: editing, prolyl-tRNA synthetase, protein synthesis.
Ê. Ñ. Áîÿðøèí, À. ª. Ïð³ññ, ². À. Êðèêëèâèé, Î. Ï. Êîâàëåíêî,
Ã. Ä. ßðåì÷óê, Ì. À. Òóêàëî
Ðîëü òÐÍÊÏðî ó ïðåòðàíñôåðíîìó ðåäàãóâàíí³ àëàí³íó
ïðîë³ë-òÐÍÊ ñèíòåòàçîþ
Ðåçþìå
Ìåòà. Îõàðàêòåðèçóâàòè ïðîöåñ òÐÍÊ-çàëåæíîãî ïðåòðàíñ-
ôåðíîãî ðåäàãóâàííÿ àëàí³íó ïðîë³ë-òÐÍÊ ñèíòåòàçîþ áàêòåð³¿
Enterococcus faecalis (ÏðîÐÑEf). Ìåòîäè. Øâèäê³ñòü ïðîöåñ³â
ðåäàãóâàííÿ in vitro âèçíà÷àëè çà ã³äðîë³çîì ÀÒÔ ÏðîÐÑEf. Ïðå- ³
ïîñòòðàíñôåðíå ðåäàãóâàííÿ åêñïåðèìåíòàëüíî ðîçä³ëåíî ñàéò-
ñïðÿìîâàíèì ìóòàãåíåçîì. Ðåçóëüòàòè. òÐÍÊ-çàëåæíå ïðå-
òðàíñôåðíå ðåäàãóâàííÿ õàðàêòåðèçóºòüñÿ âòðè÷³ á³ëüøîþ øâèä-
ê³ñòþ, í³æ òÐÍÊ-íåçàëåæíå. Åôåêòèâí³ñòü ïðîöåñó çàëåæèòü
â³ä íàÿâíîñò³ 2'-ã³äðîêñèëüíî¿ ãðóïè À76 òÐÍÊ
Ïðî
. Çà â³äñóòíîñò³
òÐÍÊ
Ïðî
ïàðàëåëüíî ç òÐÍÊ-íåçàëåæíèì ïðåòðàíñôåðíèì ðåäà-
ãóâàííÿì â³äáóâàºòüñÿ âèâ³ëüíåííÿ ç àêòèâíîãî öåíòðà ÏðîÐÑEf
àëàí³ë-ÀÌÔ ç ìîæëèâ³ñòþ âòîðèííîãî çâ’ÿçóâàííÿ ³ ã³äðîë³çó.
Âèñíîâêè. òÐÍÊ-çàëåæíå ïðåòðàíñôåðíå ðåäàãóâàííÿ àëàí³íó
ÏðîÐÑEf º êàòàë³òè÷íèì ìåõàí³çìîì, îïîñåðåäêîâàíèì 2'-ã³äðî-
êñèëüíîþ ãðóïîþ À76 òÐÍÊÏðî. Çà â³äñóòíîñò³ òÐÍÊÏðî ä³-
þòü ìåõàí³çìè òÐÍÊ-íåçàëåæíîãî ïðåòðàíñôåðíîãî ðåäàãóâàí-
íÿ ³ ñåëåêòèâíîãî âèâ³ëüíåííÿ àëàí³ë-ÀÌÔ.
Êëþ÷îâ³ ñëîâà: ðåäàãóâàííÿ, ïðîë³ë-òÐÍÊ ñèíòåòàçà, á³î-
ñèíòåç á³ëêà.
387
ÐÎËÜ òÐÍÊ
Ïðî
 ÏÐÅÒÐÀÍÑÔÅÐÍÎÌ ÐÅÄÀÊÒÈÐÎÂÀÍÈÈ ÀËÀÍÈÍÀ ÏÐÎËÈË-òÐÍÊ ÑÈÍÒÅÒÀÇÎÉ
0 1 2 3 4 5
0,0
1,0
2,0
3,0
3,5
Ï
ð
î
ëè
ë-
ò
Ð
Í
Ê
,
ì
ê
Ì
t, ìèí
200
400
600
800
1000
0 5 10 15 20
0
A
M
Ô
,
ì
ê
Ì
t, ìèí
1
2
3
4
1
2
3
à á
Ðèñ. 6. Áèîõèìè÷åñêèå ñâîéñòâà 2'-dÀ76 òÐÍÊÏðî
Rp: a – àìèíîàöèëèðîâàíèå òÐÍÊÏðî
Rp (1) è 2'-d òÐÍÊÏðî
Rp (2) ïðîëèíîì, êîíòðîëüíûé
ýêñïåðèìåíò áåç ÏðîÐÑ (3); á – íàêîïëåíèå ÀÌÔ â ïðèñóòñòâèè 0,5 ìêÌ ÏðîÐÑEf è òÐÍÊÏðî
Rp (1); 20 ìêÌ ÏðîÐÑEf è 2'-d òÐÍÊÏðî
Rp (2);
20 ìêÌ ÏðîÐÑEf è òÐÍÊÏðî
Rp áåç 74-ÑÑÀ-76 (3); 20 ìêÌ ÏðîÐÑEf áåç òÐÍÊ (4)
388
ÁÎßÐØÈÍ Ê. Ñ. È ÄÐ.
REFERENCES
1. Ibba M., Soll D. Aminoacyl-tRNA synthesis // Annu. Rev.
Biochem.–2000.–69.–P. 617–650.
2. Loftfield R. B., Vanderjagt D. The frequency of errors in protein
biosynthesis // Biochem. J.–1972.–128, N 5.–P. 1353–1356.
3. Jakubowski H. Goldman E. Editing of errors in selection of
amino acids for protein synthesis // Microbiol. Rev.–1992.–56,
N 3.–P. 412–429.
4. Pauling L. The probability of errors in the process of synthesis of
protein molecules.–Festschrift Arthur Stoll.–Basel: Birkhauser,
1957.–597 p.
5. Fersht A. R., Shindler J. S., Tsui W. C. Probing the limits of pro-
tein-amino acid side chain recognition with the aminoacyl-tRNA
synthetases. Discrimination against phenylalanine by tyrosyl-
tRNA synthetases // Biochemistry.–1980.–19, N 24.–P. 5520–
5524.
6. Fersht A. R. Editing mechanisms in protein synthesis. Rejection
of valine by the isoleucyl-tRNA synthetase // Biochemistry.–
1977.–16, N 5.–P. 1025–1030.
7. Lincecum T. L. Jr., Tukalo M., Yaremchuk A., Mursinna R. S.,
Williams A. M., Sproat B. S., Van Den Eynde W., Link A., Van
Calenbergh S., Grotli M., Martinis S. A., Cusack S. Structural
and mechanistic basis of pre- and posttransfer editing by leucyl-
tRNA synthetase // Mol. Cell.–2003.–11, N 4.–P. 951–963.
8. Dock-Bregeon A. C., Rees B., Torres-Larios A., Bey G., Caillet
J., Moras D. Achieving error-free translation; the mechanism of
proofreading of threonyl-tRNA synthetase at atomic resolution
// Mol. Cell.–2004.–16, N 3.–P. 375–386.
9. Ling J., Roy H., Ibba M. Mechanism of tRNA-dependent editing
in translational quality control // Proc. Natl Acad. Sci. USA.–
2007.–104, N 1.–P. 72–77.
10. Hopfield J. J. Kinetic proofreading: a new mechanism for redu-
cing errors in biosynthetic processes requiring high specificity //
Proc. Natl. Acad. Sci. USA.–1974.–71, N 10.–P. 4135–4139.
11. Ninio J. Kinetic amplification of enzyme discrimination // Bio-
chimie.–1975.–57, N 5.–P. 587–595.
12. Beuning P., Musier-Forsyth K. Hydrolytic editing by a class II
aminoacyl-tRNA synthetase // Proc. Natl Acad. Sci. USA.–
2000.–97, N 16.–P. 8916–8920.
13. Stathopoulos C., Li T., Longman R., Vothknecht U. C., Becker
H. D., Ibba M., Soll D. One polypeptide with two aminoacyl-
tRNA synthetase activities // Science.–2000.–287, N 5452.–
P. 479–482.
14. Ahel I., Stathopoulos C., Ambrogelly A., Sauerwald A., Toogood
H., Hartsch T., Soll D. Cysteine activation is an inherent in vitro
property of prolyl-tRNA synthetases // J. Biol. Chem.–2002.–
277, N 38.–P. 34743–34738.
15. Hati S., Ziervogel B., Sternjohn J., Wong F. C., Nagan M. C.,
Rosen A. E., Siliciano P. G., Chihade J. W., Musier-Forsyth K.
Pre-transfer editing by class II prolyl-tRNA synthetase: role of
aminoacylation active site in «selective release» of noncognate
amino acids // J. Biol. Chem.–2006.–281, N 38.–P. 27862–
27872.
16. Splan K. E., Ignatov M. E., Musier-Forsyth K. Transfer RNA
modulates the editing mechanism used by class II prolyl-tRNA
synthetase // J. Biol. Chem.–2008.–283, N 11.–P. 7128–7134.
17. Boyarshin K. S., Kriklivyi I. A., Rayevsky A. V., Himin A. A., Ya-
remchuk A. D., Tukalo M. A. Study on the putative active site of
Enterococcus faecalis prolyl- tRNA synthetase editing domain
by methods of site-directed mutagenesis // Biopolym. Cell.–
2009.–25, N 1.–P. 39–42.
18. Boiarshin K. S., Kriklivyi I. A., Tukalo M. A. tRNA-dependent edi-
ting of errors by prolyl-tRNA synthetase from bacteria Entero-
coccus faecalis // Ukr. Biokhim. Zh.–2008.–80, N 6.–P. 52–59.
19. Boyarshin K. S., Kriklivyi I. A., Yaremchuk A. D., Tukalo M. A.
Cloning, expression and purification of tRNAPro from bacteria
Enterococcus faecalis // Biopolym. Cell.–2009.–25, N 6.–
P. 445–450.
20. Splan K. E., Musier-Forsyth K., Boniecki M. T., Martinis S. A. In
vitro assays for the determination of aminoacyl-tRNA synthe-
tase editing activity // Methods.–2008.–44, N 2.–P. 119–128.
21. Easterbrook-Smith S. B., Wallace J. C., Keech D. B. Pyruvate car-
boxylase: affinity labelling of the magnesium adenosine triphos-
phate binding site // Eur. J. Biochem.–1976.–62, N 1.–P. 125–130.
Received 15.04.13
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-153174 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7657 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T16:42:04Z |
| publishDate | 2013 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Бояршин, К.С. Присс, А.Е. Крикливый, И.А. Коваленко, О.П. Яремчук, А.Д. Тукало, М.А. 2019-06-13T15:15:53Z 2019-06-13T15:15:53Z 2013 Роль тРНКПро в претрансферном редактировании аланина пролил-тРНК синтетазой / К.С. Бояршин, А.Е. Присс, И.А. Крикливый, О.П. Коваленко, А.Д. Яремчук, М.А. Тукало // Вiopolymers and Cell. — 2013. — Т. 29, №. 5. — С. 382-388. — Бібліогр.: 21 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00082D https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153174 577.217.32 Цель. Охарактеризовать процесс тРНК-зависимого претрансферного редактирования аланина пролил-тРНК синтетазой бактерии Enterococcus faecalis (ПроРСEf). Методы. Скорость процессов редактирования in vitro определяли по гидролизу АТФ ПроРСEf. Пре- и посттрансферное редактирование разделены экспериментально сайт-направленным мутагенезом. Результаты. тРНК-зависимое претрансферное редактирование характеризуется втрое большей скоростью, чем тРНК-независимое. Эффективность процесса зависит от наличия 2'-гидроксильной группы А76 тРНКПро. В отсутствие тРНКПро параллельно с тРНК-независимым претрансферным редактированием происходит высвобождение аланил-АМФ из активного центра ПроРСEf с возможностью вторичного связывания и гидролиза. Выводы. тРНК-зависимое претрансферное редактирование аланина ПроРСEf является каталитическим механизмом, опосредованным 2'-гидроксильной группой А76 тРНКПро. В отсутствие тРНКПро действуют механизмы тРНК-независимого претрансферного редактирования и селективного высвобождения аланил-АМФ. Мета. Охарактеризувати процес тРНК-залежного претрансферного редагування аланіну проліл-тРНК синтетазою бактерії Enterococcus faecalis (ПроРСEf). Методи. Швидкість процесів редагування in vitro визначали за гідролізом АТФ ПроРСEf. Пре- і посттрансферне редагування експериментально розділено сайт-спрямованим мутагенезом. Результати. тРНК-залежне претрансферне редагування характеризується втричі більшою швидкістю, ніж тРНК-незалежне. Ефективність процесу залежить від наявності 2'-гідроксильної групи А76 тРНКПро. За відсутності тРНКПро паралельно з тРНК-незалежним претрансферним редагуванням відбувається вивільнення з активного центра ПроРСEf аланіл-АМФ з можливістю вторинного зв’язування і гідролізу. Висновки. тРНК-залежне претрансферне редагування аланіну ПроРСEf є каталітичним механізмом, опосередкованим 2'-гідроксильною групою А76 тРНКПро. За відсутності тРНКПро діють механізми тРНК-незалежного претрансферного редагування і селективного вивільнення аланіл-АМФ. Aim. To characterize the process of tRNA-dependent pretransfer edi- ting of alanine by prolyl-tRNA synthetase of bacteria Enterococcus faecalis (ProRSEf). Methods. Velocity of the editing processes in vitro was determined by ATP hydrolysis by ProRSEf. Pretransfer and posttransfer editing were experimentally separated by site-directed mutagenesis. Results. tRNA-dependent pretransfer editing is characterized by three-fold larger velocity then tRNA-independent editing. Effectivity of the process depends on the presence of 2'-hydroxyle group of A76 tRNAPro. In the absence of tRNAPro selective release of alanyl-AMP occurs simultaneously with tRNA-independent pretransfer editing. Released alanyl-AMP can be re-bound and hydrolyzed. Conclusions. tRNA-dependent pretransfer editing of alanine by ProRSEf is the catalytic mechanism, mediated by 2'-hydroxyl group of A76 tRNAPro. In the absence of tRNAPro tRNA-independent pretransfer editing and selective release of alanyl-AMP occur. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Вiopolymers and Cell Structure and Function of Biopolymers Роль тРНКПро в претрансферном редактировании аланина пролил-тРНК синтетазой Роль тРНКПро у претрансферному редагуванні аланіну проліл-тРНК синтетазою Role of tRNAPro in pretransfer editing of alanine by prolyl-tRNA synthetase Article published earlier |
| spellingShingle | Роль тРНКПро в претрансферном редактировании аланина пролил-тРНК синтетазой Бояршин, К.С. Присс, А.Е. Крикливый, И.А. Коваленко, О.П. Яремчук, А.Д. Тукало, М.А. Structure and Function of Biopolymers |
| title | Роль тРНКПро в претрансферном редактировании аланина пролил-тРНК синтетазой |
| title_alt | Роль тРНКПро у претрансферному редагуванні аланіну проліл-тРНК синтетазою Role of tRNAPro in pretransfer editing of alanine by prolyl-tRNA synthetase |
| title_full | Роль тРНКПро в претрансферном редактировании аланина пролил-тРНК синтетазой |
| title_fullStr | Роль тРНКПро в претрансферном редактировании аланина пролил-тРНК синтетазой |
| title_full_unstemmed | Роль тРНКПро в претрансферном редактировании аланина пролил-тРНК синтетазой |
| title_short | Роль тРНКПро в претрансферном редактировании аланина пролил-тРНК синтетазой |
| title_sort | роль трнкпро в претрансферном редактировании аланина пролил-трнк синтетазой |
| topic | Structure and Function of Biopolymers |
| topic_facet | Structure and Function of Biopolymers |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153174 |
| work_keys_str_mv | AT boâršinks rolʹtrnkprovpretransfernomredaktirovaniialaninaproliltrnksintetazoi AT prissae rolʹtrnkprovpretransfernomredaktirovaniialaninaproliltrnksintetazoi AT kriklivyiia rolʹtrnkprovpretransfernomredaktirovaniialaninaproliltrnksintetazoi AT kovalenkoop rolʹtrnkprovpretransfernomredaktirovaniialaninaproliltrnksintetazoi AT âremčukad rolʹtrnkprovpretransfernomredaktirovaniialaninaproliltrnksintetazoi AT tukaloma rolʹtrnkprovpretransfernomredaktirovaniialaninaproliltrnksintetazoi AT boâršinks rolʹtrnkproupretransfernomuredaguvanníalanínuprolíltrnksintetazoû AT prissae rolʹtrnkproupretransfernomuredaguvanníalanínuprolíltrnksintetazoû AT kriklivyiia rolʹtrnkproupretransfernomuredaguvanníalanínuprolíltrnksintetazoû AT kovalenkoop rolʹtrnkproupretransfernomuredaguvanníalanínuprolíltrnksintetazoû AT âremčukad rolʹtrnkproupretransfernomuredaguvanníalanínuprolíltrnksintetazoû AT tukaloma rolʹtrnkproupretransfernomuredaguvanníalanínuprolíltrnksintetazoû AT boâršinks roleoftrnaproinpretransfereditingofalaninebyprolyltrnasynthetase AT prissae roleoftrnaproinpretransfereditingofalaninebyprolyltrnasynthetase AT kriklivyiia roleoftrnaproinpretransfereditingofalaninebyprolyltrnasynthetase AT kovalenkoop roleoftrnaproinpretransfereditingofalaninebyprolyltrnasynthetase AT âremčukad roleoftrnaproinpretransfereditingofalaninebyprolyltrnasynthetase AT tukaloma roleoftrnaproinpretransfereditingofalaninebyprolyltrnasynthetase |