Экспрессивный бакуловирусный вектор на основе вируса ядерного полиэдроза кольчатого шелкопряда Malacosoma neustria
Ген β-галактозидазы Escherichia coli встроен в рамке считывания в ген полиэдрина вируса ядерного полиэдроза (ВЯП) кольчатого шелкопряда. Котрансфекцией рекомбинантной плазмиды pMPEA-β-gal с ДНК ВЯП M. neustria дикого типа связанный ген был встроен в геном ВЯП M. neustria. Инфицирование культуры клет...
Saved in:
| Published in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Date: | 1990 |
| Main Authors: | , , , , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1990
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153430 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Экспрессивный бакуловирусный вектор на основе вируса ядерного полиэдроза кольчатого шелкопряда Malacosoma neustria / Л.И. Строковская, И.М. Кихно, О.В. Веселовский, И.Н. Скуратовская, Н.Ю. Мирюта, А.И. Петренко, А.П. Соломко // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 3. — С. 84-89. — Бібліогр.: 14 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-153430 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Строковская, Л.И. Кихно, И.М. Веселовский, О.В. Скуратовская, И.Н. Мирюта, Н.Ю. Петренко, А.И. Соломко, А.П. 2019-06-14T10:17:12Z 2019-06-14T10:17:12Z 1990 Экспрессивный бакуловирусный вектор на основе вируса ядерного полиэдроза кольчатого шелкопряда Malacosoma neustria / Л.И. Строковская, И.М. Кихно, О.В. Веселовский, И.Н. Скуратовская, Н.Ю. Мирюта, А.И. Петренко, А.П. Соломко // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 3. — С. 84-89. — Бібліогр.: 14 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000273 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153430 Ген β-галактозидазы Escherichia coli встроен в рамке считывания в ген полиэдрина вируса ядерного полиэдроза (ВЯП) кольчатого шелкопряда. Котрансфекцией рекомбинантной плазмиды pMPEA-β-gal с ДНК ВЯП M. neustria дикого типа связанный ген был встроен в геном ВЯП M. neustria. Инфицирование культуры клеток тутового шелкопряда Anteraea pemi (MCAp-I) полученным рекомбинантным ВЯП М. neusiria-gal3 выявило высокий уровень экспрессии связанного белка полиэдрин-β-галактозидаза. Синтеза полиэдрина в этих клетках не обнаружено. Ген β-галактозидази Escherichia coli вбудовано в рамці зчитування у ген поліедрину вірусу ядерного поліедрозу (ВЯП) кільчастого шовкопряда. Котрансфекцією рекомбінантної плазміди pMPEA-β-gal з ДНК ВЯП M. neustria дикого типу зв’язаний ген було вбудовано в геном ВЯП M. neustria. Інфікування культури клітин тутового шовкопряда Anteraea pemi (MCAp-I) отриманим рекомбінантним ВЯП М. neusiria-gal3 виявило високий рівень експресії зв’язаного білка поліедрин-β-галактозидаза. Синтезу поліедрину у цих клітинах не виявлено. The β-galactosidase gene of E. coli was inserted in phase with coding sequence of the Malacoscma neustria nuclear polyhedrosis virus (MnNPV) polyhedrin gene. The fusion gene was inserted into the MnNPV genome by cotransfection of recombinant plasmid pMPEA-3 gal and wild-type MnNPV DNA. Infection of Antheraea pernyi cells (MCAp-1) by the resulting recombinant MnNPV gal 3 has shown high level of expression of polyhedrin-β-galactosidase fusion protein, no synthesis of polyhedrin being revealed. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Генно-инженерная биотехнология Экспрессивный бакуловирусный вектор на основе вируса ядерного полиэдроза кольчатого шелкопряда Malacosoma neustria Експресивний бакуловірусної вектор на основі вірусу ядерного поліедроза кільчастого шовкопряда Malacosoma neustria Malacosoma neustria nuclear polyhedrosis virus expression vector Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Экспрессивный бакуловирусный вектор на основе вируса ядерного полиэдроза кольчатого шелкопряда Malacosoma neustria |
| spellingShingle |
Экспрессивный бакуловирусный вектор на основе вируса ядерного полиэдроза кольчатого шелкопряда Malacosoma neustria Строковская, Л.И. Кихно, И.М. Веселовский, О.В. Скуратовская, И.Н. Мирюта, Н.Ю. Петренко, А.И. Соломко, А.П. Генно-инженерная биотехнология |
| title_short |
Экспрессивный бакуловирусный вектор на основе вируса ядерного полиэдроза кольчатого шелкопряда Malacosoma neustria |
| title_full |
Экспрессивный бакуловирусный вектор на основе вируса ядерного полиэдроза кольчатого шелкопряда Malacosoma neustria |
| title_fullStr |
Экспрессивный бакуловирусный вектор на основе вируса ядерного полиэдроза кольчатого шелкопряда Malacosoma neustria |
| title_full_unstemmed |
Экспрессивный бакуловирусный вектор на основе вируса ядерного полиэдроза кольчатого шелкопряда Malacosoma neustria |
| title_sort |
экспрессивный бакуловирусный вектор на основе вируса ядерного полиэдроза кольчатого шелкопряда malacosoma neustria |
| author |
Строковская, Л.И. Кихно, И.М. Веселовский, О.В. Скуратовская, И.Н. Мирюта, Н.Ю. Петренко, А.И. Соломко, А.П. |
| author_facet |
Строковская, Л.И. Кихно, И.М. Веселовский, О.В. Скуратовская, И.Н. Мирюта, Н.Ю. Петренко, А.И. Соломко, А.П. |
| topic |
Генно-инженерная биотехнология |
| topic_facet |
Генно-инженерная биотехнология |
| publishDate |
1990 |
| language |
Russian |
| container_title |
Биополимеры и клетка |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Експресивний бакуловірусної вектор на основі вірусу ядерного поліедроза кільчастого шовкопряда Malacosoma neustria Malacosoma neustria nuclear polyhedrosis virus expression vector |
| description |
Ген β-галактозидазы Escherichia coli встроен в рамке считывания в ген полиэдрина вируса ядерного полиэдроза (ВЯП) кольчатого шелкопряда. Котрансфекцией рекомбинантной плазмиды pMPEA-β-gal с ДНК ВЯП M. neustria дикого типа связанный ген был встроен в геном ВЯП M. neustria. Инфицирование культуры клеток тутового шелкопряда Anteraea pemi (MCAp-I) полученным рекомбинантным ВЯП М. neusiria-gal3 выявило высокий уровень экспрессии связанного белка полиэдрин-β-галактозидаза. Синтеза полиэдрина в этих клетках не обнаружено.
Ген β-галактозидази Escherichia coli вбудовано в рамці зчитування у ген поліедрину вірусу ядерного поліедрозу (ВЯП) кільчастого шовкопряда. Котрансфекцією рекомбінантної плазміди pMPEA-β-gal з ДНК ВЯП M. neustria дикого типу зв’язаний ген було вбудовано в геном ВЯП M. neustria. Інфікування культури клітин тутового шовкопряда Anteraea pemi (MCAp-I) отриманим рекомбінантним ВЯП М. neusiria-gal3 виявило високий рівень експресії зв’язаного білка поліедрин-β-галактозидаза. Синтезу поліедрину у цих клітинах не виявлено.
The β-galactosidase gene of E. coli was inserted in phase with coding sequence of the Malacoscma neustria nuclear polyhedrosis virus (MnNPV) polyhedrin gene. The fusion gene was inserted into the MnNPV genome by cotransfection of recombinant plasmid pMPEA-3 gal and wild-type MnNPV DNA. Infection of Antheraea pernyi cells (MCAp-1) by the resulting recombinant MnNPV gal 3 has shown high level of expression of polyhedrin-β-galactosidase fusion protein, no synthesis of polyhedrin being revealed.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153430 |
| citation_txt |
Экспрессивный бакуловирусный вектор на основе вируса ядерного полиэдроза кольчатого шелкопряда Malacosoma neustria / Л.И. Строковская, И.М. Кихно, О.В. Веселовский, И.Н. Скуратовская, Н.Ю. Мирюта, А.И. Петренко, А.П. Соломко // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 3. — С. 84-89. — Бібліогр.: 14 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT strokovskaâli ékspressivnyibakulovirusnyivektornaosnovevirusaâdernogopoliédrozakolʹčatogošelkoprâdamalacosomaneustria AT kihnoim ékspressivnyibakulovirusnyivektornaosnovevirusaâdernogopoliédrozakolʹčatogošelkoprâdamalacosomaneustria AT veselovskiiov ékspressivnyibakulovirusnyivektornaosnovevirusaâdernogopoliédrozakolʹčatogošelkoprâdamalacosomaneustria AT skuratovskaâin ékspressivnyibakulovirusnyivektornaosnovevirusaâdernogopoliédrozakolʹčatogošelkoprâdamalacosomaneustria AT mirûtanû ékspressivnyibakulovirusnyivektornaosnovevirusaâdernogopoliédrozakolʹčatogošelkoprâdamalacosomaneustria AT petrenkoai ékspressivnyibakulovirusnyivektornaosnovevirusaâdernogopoliédrozakolʹčatogošelkoprâdamalacosomaneustria AT solomkoap ékspressivnyibakulovirusnyivektornaosnovevirusaâdernogopoliédrozakolʹčatogošelkoprâdamalacosomaneustria AT strokovskaâli ekspresivniibakulovírusnoívektornaosnovívírusuâdernogopolíedrozakílʹčastogošovkoprâdamalacosomaneustria AT kihnoim ekspresivniibakulovírusnoívektornaosnovívírusuâdernogopolíedrozakílʹčastogošovkoprâdamalacosomaneustria AT veselovskiiov ekspresivniibakulovírusnoívektornaosnovívírusuâdernogopolíedrozakílʹčastogošovkoprâdamalacosomaneustria AT skuratovskaâin ekspresivniibakulovírusnoívektornaosnovívírusuâdernogopolíedrozakílʹčastogošovkoprâdamalacosomaneustria AT mirûtanû ekspresivniibakulovírusnoívektornaosnovívírusuâdernogopolíedrozakílʹčastogošovkoprâdamalacosomaneustria AT petrenkoai ekspresivniibakulovírusnoívektornaosnovívírusuâdernogopolíedrozakílʹčastogošovkoprâdamalacosomaneustria AT solomkoap ekspresivniibakulovírusnoívektornaosnovívírusuâdernogopolíedrozakílʹčastogošovkoprâdamalacosomaneustria AT strokovskaâli malacosomaneustrianuclearpolyhedrosisvirusexpressionvector AT kihnoim malacosomaneustrianuclearpolyhedrosisvirusexpressionvector AT veselovskiiov malacosomaneustrianuclearpolyhedrosisvirusexpressionvector AT skuratovskaâin malacosomaneustrianuclearpolyhedrosisvirusexpressionvector AT mirûtanû malacosomaneustrianuclearpolyhedrosisvirusexpressionvector AT petrenkoai malacosomaneustrianuclearpolyhedrosisvirusexpressionvector AT solomkoap malacosomaneustrianuclearpolyhedrosisvirusexpressionvector |
| first_indexed |
2025-11-25T23:08:43Z |
| last_indexed |
2025-11-25T23:08:43Z |
| _version_ |
1850581518672461824 |
| fulltext |
3. Smith С. E., Summers Μ. D., Fraser Al. J. P roduct ion of human beta interferon in in-
sect cells infected wi th baculovi rus expression v e c t o r / / М о ї . and Cell. B i o l - - 1983.-—
3, N 12 .—P. 2156—2165.
4. Pruduciion of h u m a n a lpha- in te r fe ron in s i lkworm us ing a baculovi rus v e c t o r /
S. M a e d a , T. K a w a i l M. O b i n a t a et a 1 . / / N a t u r e - 1 9 8 5 - 3 1 5 , N 6 0 2 0 , - P. 5 9 2 - 5 9 4 .
5. Кок И. П., Скуратовская И. H., Строковская Л. И. Молекулярные основы репродук-
ции бакуловирусов.— Киев : Наук, думка, 1980 — 175 с.
6. Структура и функционирование генома вируса ядерного полиэдроза кольчатого
шелкопряда / И. Н. Скуратовская , Л. И. Строковская, С. В. Комиссаренко,
Н. В. М е н д е л е в а / / Ц и т о л о г и я и генетика,— 1986,— 20, № 1 — С. 31—33.
7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. — М. : Мир,
1984,— 478 с.
8. Identification, c loning and R-Ioop m a p p i n g of the polyhedrin gene f rom the mult i -
capsid nuclear polyhedros is virus of Orgyia pseudotsugata / G. F. Rohrman , D. I. Lei-
sv, K.-C. Chow et al. // Virology.— 1982,— 121, N 1 . — P . 51—60.
9. Rohrmann G. F. Po lyhedr in s t ruc ture / / J. Gen. Virol.— 1986.—67, N 5 . — P . 1499—
1513.
10. Smith G. E., Summers M. D. DNA homology a m o n g subgroup A, B and C baculovi-
r u s e s / / V i r o l o g y . — 1982,— 123, N 1.— P. 393—406.
Ї IH-T молехулчр. биологии и генетики АН УССР, К11 е π Получено 21.09.89
УДК .17.VS41:577.21
® Л. И. Строковская, И. М. Кихно, О. В. Веселовский,
И. П. Скуратовская, Н. Ю. Мирюта, А. И. Петренко, Α. II. Соломко, 1990
ЭКСПРЕССИВНЫЙ БАКУЛОВИРУСНЫЙ ВЕКТОР
HА ОСНОВЕ ВИРУСА ЯДЕРНОГО ПОЛИЭДРОЗА
КОЛЬЧАТОГО ШЕЛКОПРЯДА MALACOSOMA NEUSTRIA
Ген β-галиктозидизы Escherichia coli встроен в рамке считывания в ген полиэдрина ви-
руса ж)ерного полиэдроза (ВЯП) кольчатого шелкопряда. Котрансфекцией рекомби-
HUHTHOii плазмиды pMPEA-$-gal с ДНК ВЯП Al. neustria дикого типа связанный ген
был встроен в геном ВЯП Al neustria. Инфицирование культуры клеток ()убового шел-
копряда Anteraea pemi (MCAp-I) полученным рекомбинантным ВЯП М. neusiria-galS
выявило высокий уровень экспрессии связанного белка полиэдрин-\-)-галикт():;и<)аза.
Синтези полиэдрина в этих клетках не обнаружено.
Введение. Бакуловирусы 6 лет назад впервые начали исполь.човаться
в качестве экспрессивных векторов для получения белков и пептидов
различного происхождения [1]. В настоящее время с этими векторами
работают более чем в 150 лабораториях мира. Все используемые векто-
ры сконструированы на основе двух вирусов: ВЯП Autographa cali-
Jonuca и ВЯГІ Bombyx mori [2]. Мы получили новый бакуловпруспый
экспрессивный вектор на основе ВЯП кольчатого шелкопряда М. netisf-
ria. Ранее было показано, что геном этого вируса представляет собой
ковалентиозамкнутую молекулу Д Н К с молекулярной массой около
90 000 (примерно 130 т. п. п.) [3]. Ген полиэдрина этого вируса был
локализован и вместе с прилегающими участками вирусной Д П К кло-
нирован в плазмидах pBR325 и pUC18 (плазмиды рМЕА и рМРЕЛ) [4].
В настоящей работе приведены данные по конструированию транс-
портного вектора с геном бактериальной β-галактозидазы, получение
рекомбинантного вируса ВЯП М. neustria-ga\3 и изучение экспрессии
β-галактозидазы в клетках насекомых, инфицированных рекомбинант-
ным бакуловирусом.
Материалы и методы. В и р у с и к л е т к и . В работе для конструировании ре-
комбинаптпои Д Н К использован В Я П Al. neustria, штамм Wl [4].
Д л я накопления вируса, трансфекции и получения бляшек использовали культуру
клеток дубового шелкопряда MCAp-I [5]. Процедура получения бляшек при окраши-
вании нейтральным красным, а т а к ж е получение голубых бляшек в присутствии β-га-
лактозидазного индикатора 5-бром-4-х лор-3-й и долил-р- / ) -галактопиранозида (X-gal)
для выявления экспрессии β -галактозидазы описаны в [6].
84 ISSN 0233-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1990. Т. G. № 3
Ii ο .ι у ч е и її е п р е п а р а т о в Д Н К . Плазмидные Д Н К получали но методу
[7]. ДН1\ ВЯП Al. neusiria выделяли, используя свободные вирионы и внрионы, вклю-
ченные в полиэдры. Свободные вирионы осаждали из культуральной среды при
20 000 об/мин в течение 40 мин. Полиэдры в клетках обрабатывали ультразвуком 40 с
па льду и пропускали через 5 0 % - н ы й раствор сахарозы при 20 000 об /мин в течение
40 мин. Обработанные полиэдры объединяли со свободными вирионами. Д Н К выделя-
ли, как описано в [8] с модификациями.
К суспензии полиэдров и вирионов добавляли спермидин до концентрации
50 мМ, раствор бромистого этидия — до 400 м к г / м л и 1 п. N a O H — до ρH 11,0. Сус-
пензию очень мягко π тщательно перемешивали и через 5 мин 1 п. HCl доводили рН
до 7,0, затем добавляли DS-Na до концентрации 1 %, нротемназу К — до 500 мкг /мл.
Полученную смесь инкубировали при 37 0C в течение 16 ч. Д а л е е обрабатывали фе-
нолом, феполхлороформом и осаждали этанолом. Полученную Д Н К растворяли в
0,01 M трис-HCl, р Н 7,2.
О π ρ с д е л е H и е H у к л е О T и д н о и п о с л е д о в a τ е л Ь H О С T II N-K O H ц е-
в о г о у ч а с т к а г е н а π о л и э д ρ и н а ВЯП Al. neusiria. 5с / / / -5я / / -фрагмент раз-
мером 3 т. п. н. был вырезан из плазмиды рМРЕЛ и клонирован в pUC18 {р AlEASE).
Сиквсппровлпие меченных 3 2 P по З ' -концам рестрикциопных фрагментов проводили ме-
тодом Максама и Гилберта [9] в модификации [10].
К о π с τ ρ у и ρ о в а и и е τ ρ а н с π о ρ τ н о г о в е к τ о ρ а рМРЕА-β-ga l . ІІсноль-
зовали плазмиду рМРЕА, содержащую ген полиэдрипа В Я П AL neusiria |4] и ген
р-галактозпдазы, полученный из плазмиды \)Ac360-$-ga\ [11] при обработке последней
BarnHl ф -£а1-фрагмент) . Этот ген лигировали с плазмидой рМРЕА, обработанной
BamIif, и трансформировали клетки JAl101. На чашках со средой, содержащей ампи-
циллин, X-gal и И П Т Г (изоиропил-р-£)-тиогалактозид), были отобраны голубые коло-
нии. ДН1\ анализировали с помощью рестриктазы BamllI. Плазмиды, содержащие β-
gal-фрагмепт, представляют собой транспортный бакуловирусный вектор —
ρΜΡΕΑ-$-χ al.
Π о л у ч е η и е ρ е к о м б и н а π τ н о г о В Я П М. neustriu-ga\. В этом случае про-
водили котрапсфекцию культуры клеток смесыо вирусной Д Н К В Я П Al. neusiria Wl
и Д Н К плазмиды pAlPEA-$-ga\ (соотношение 1 : 2 ) в соответствии с руководством
[11]. Рекомбинантпый вирус выявляли по появлению голубых бляшек в присутствии
X-gal Д л я очистки от примеси дикого вируса рекомбинантпый вирус 3—4 раза про-
водили через бляшки [11]. Препараты Д Н К , полученные из рекомбинантного вируса,
обрабатывали рестриктазами BamHI, EcoRI и BamHI-\-EeoRl и анализировали блот-
ги бр 11 д 11:; а п. и с и с 3 - P - β - ga 1 - φ ρ а г ментом.
О π ρ е д е л е и и е у ρ о в π я β-г а л а к τ о з и д а з ы. Уровень β -галакто.шдазы оп-
ределяли в реакции с о-нитрофенил-р-£)-галактопиранозидом ( О Н П Г ) по методу, опи-
санному в [()]. Клетки з а р а ж а л и рекомбинантпым вирусом с множественностью 1 BOfi
на клетку. После адсорбции в течение 1 ч вирусную суспензию замещали средой и
клетки инкубировали при 27 °С. Через определенные промежутки времени клетки отби-
рали и обрабатывали, как описано [6]. Специфическую активность определяли в соот-
ветствии с методом Миллера [12] и выражали как количество разрушенного О Н П 1
за 1 мин на 1 мг белка; количество белка — по Брэдфорду [13]. Стандартная кривая
построена па разведениях бычьего сывороточного альбумина.
Э л е к τ ρ о φ о ρ е τ и ч е с к о е р а з д е л е н и е б е л к о в . Д л я анализа вирус-
индуцированных белков в инфицированной культуре клетки через разные сроки после
заражения осаждали, промывали, суспендировали в фосфатном буфере, содержащем
0,1 н. NaON, и добавляли лизирующий буфер (1 % DS-Na, 5 % β-меркаптоэтанол,
0,01 M трис, 0,001 M ЭДТА, 10 % глицерин). После прогрева в течение 10 мин при
IOO0C центрифугировали и супернатант анализировали электрофорезом в DS-Na-no-
л и а к ρ 11 л а м и дно м геле [ 6 ].
Результаты и обсуждение. T ρ а н с π о ρ τ н ы и б а к у л о в и ρ у с-
н ы й в е к т о р . Д л я создания транспортного вектора использовали
плазмиду рМРЕАу содержащую фрагмент Д Н К ВЯП М. neusiria раз-
мером 9,3 т. п. н. с геном полиэдрина, локализованным в области 4,2—
5,5 (рис. ] ,&). Картирование показало, что в этой области находятся
сайты для рестриктаз BglII, BamHI, H i n d I I I , KpnI. Д л я ориентации
гена полиэдрина и локализации промоторной области проведен сиквепс
участка с геном полиэдрина. Д л я сиквенса рестриктазой SalI был вы-
ISSN 0233-71,Г)7. Б І Ї О П О Л И М П Р Ы И КЛЕТКА. 1990. Т. 6. Л« 3 85
резан участок размером 3 т. п. н. и субклопирован в pUC18 — плазми-
да pMEASE (рис. 1, б) . На рис. 2 приведена нуклеотидная последо-
вательность участка BglII-BamHI1 содержащая 5'-нетранслируемую
область гена полиэдрина и область, кодирующую N-концевую' часть
белка. Участок начала транскрипции по аналогии с генами полиэдри-
нов других бакуловирусов [14] находится в положении —45—49 (по-
следовательность—ATAAG—). При сравнении участка от начала транс-
крипции до инициирующего кодона AUG с соответствующей областью
гена полиэдрина ВЯП A. Califor-
nia обнаружено 62 % гомоло-
гии. Хотя полная последователь-
ность белка полиэдрина ВЯП М.
neustria пока не определена, ис-
ходя из представленной нуклео-
тидной последовательности мож-
но сделать вывод, что N-конце-
Рис . 1. Рестрикционные к а р т ы рекомби-
нантных п л а з м и д рМРЕЛ (а) и pMEASE
(б), с о д е р ж а щ и х ген полиэдрина (за-
ш т р и х о в а н н а я о б л а с т ь ) : а — PstI-EcoRI-
ф р а г м е н т Д Н К В Я П М. neustria раз -
мером 9,3 т. п. н. (из п л а з м и д ы р М Е Л
[4] ) встроен в п л а з м и д у pUC18\ б —
З а / / - 5 а / / - ф р а г м е н т п л а з м и д ы рМРЕ раз-
мером 3,0 т. п. н. встроен в pUC18
Fig . 1. Res t r i c t i on m a p s of r e c o m b i n a n t
p l a s m i d pMPEA (a) and p M P A s e (6)
c o n t a i n i n g p o l y h e d r i n g e n e (ha tched re-
gion') . a — a 9.3 kb PstI-EcoRI f r a g m e n t
of M n N P V D N A ( f r o m p M E A p l a s m i d
/ 4 / ) w a s inse r t ed in to pUC18; 6 - а
3.0 kb SalI-SalI f r a g m e n t of pMPEA
p l a s m i d inse r t ed in to pUC18 .
Рис. 2. Н у к л е о т и д н а я π
а м и н о к и с л о т н а я последо-
вательность области ге-
на полиэдрина , с о д е р ж а -
щ а я б ' -нетранслируемыи
участок и область , коди-
р у ю щ у ю N-концевую
часть белка полиэдрина
Fig 2. Nuc leo t ide a n d ami -
no sequence of a s e g m e n t
of the p o l y h e d r i n g e n e
c o n t a i n i n g the 5' f l a n k i n g
r e g i o n a n d the N- te rmi -
na l c o d i n g r eg ion
вой участок полиэдрина ВЯП Af. neustria на 80—82 % гомологичен
аналогичным участкам полиэдринов других ВЯП [14], что подтверж-
дает консервативность строения полиэдринов.
BamHI-сайт в положении + 1 5 5 был выбран местом для встройки
гена β-галактозидазы. Рестрикционный анализ плазмидных Д Н К из
голубых колоний, полученных при трансформации клеток I M l O l ли-
газной смесью плазмиды рМРЕА и P-gal-фрагмента, показал, что
86 ISSN 0233-7G57. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1990. Т. G. № 3
P-gal-фрагмент встроился в плазмиду рМРЕА. Н а рис. 3 представлена
структура транспортного бакуловирусного вектора с геном β-галактози-
дазы — плазмида рМРЕА-$-gal .
П о л у ч е н и е и а н а л и з э к с п р е с с и в н о г о в е к т о р а .
После котрансфекции монослоя клеток смесью Д Н К ВЯП М. neustria
Wl и плазмиды pMPEA-$-g&\ (1 : 2) экспрессию β-галактозидазы опре-
деляли по появлению синих бляшек в присутствии X-gal. Сравнение
монослоя клеток, окрашенного нейтральным красным, и монослоя в
присутствии X-gal свидетельствует, что примерно 0,1 % бляшек экс-
прессирует β-галактозидазу.
Блот-гибридизация рестрицированной Д Н К , полученной из реком-
бинантного вируса (клон 3), проведенного через бляшки 3 раза, по-
казывает, что P-gal-фрагмент встроился в Д Н К ВЯП М. neustria
Рис. 3. Рсстрикционная карта плазмиды / ?AfP£4-p-ga l , содержащей полиэдрии-р-га-
л а к то з и д а з а - с в я з а і ш ы й г е н
Fiir. 3. Restr ic t ion map of pMPEA-^-gal plasmid con ta in ing a ,polyhedr in /P-galac tos i -
dase fus ion gene.
Рис. 4. Анализ голубых бляшек В Я П Μ. neustria-ga\3 блот-гибридизацией: Д Н К рес-
трицирована BamHI ( / ) , BamHI+EcoRl (2) и EcoRI (5) и гибридизована с 3 2 P-P-ga l -
фрагмептом (4)
Fig. 4. Analys is of the blue MnNlPV ga l3 by b lo t -hybr id iza t ion: DNA were digested
with either BatnHI [I) or EcoRI-\-BamHl (2) or EcoRI (3) res t r ic t ion endonuc lease and
were hybridized with 3 2 P-P-ga l f r a g m e n t (4)
(рис. 4), т. е. произошло замещение гена полиэдрина дикого типа на ген
полиэдрина с встроенным чужеродным геном — геном β-галактозидазы.
Р е г у л я ц и я э к с п р е с с и и β - г а л а к т о з и д а з ы . Чтобы
выяснить, находится ли экспрессия гена β-галактозидазы под таким же
временным контролем, как и экспрессия полиэдрина, определяли спе-
цифическую активность β-галактозидазы в клетках, зараженных ре-
комбинантным ВЯП М. neustria-ga\3, через разное время после за-
ражения. Активность β-галактозидазы обнаруживается уже через 24 ч,
затем нарастает и к 120-му ч составляет 13-Ю3 ед. акт. (рис. 5) .
В данном опыте мы не наблюдали снижения активности β-галактози-
дазы, возможно, из-за низкой множественности заражения. Активность
β-галактозидазы для нашего вектора несколько выше (примерно в 1,5
раза) , чем для вектора ВЯП A. californica L IGP-ga l3 [6].
87 ISSN 0233-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1990. Т. G. № 3
При анализе в DS-Na-полиакриламидном геле (рис. 6) было об-
наружено, что в клетках, инфицированных ВЯП М. neusiria-g<\\'ty
линия, соответствующая β-галактозидазе, появляется через 24 ч ι Γ и н -
тенсивность ее нарастает до 96—120 ч после заражения клеток виру-
сом. Линии, соответствующей полиэдрину, в этих клетках не выявлено
Рис. 5. Временная регуляция экспрес-
сии полиэдрин-Р-галактозидаза-свя-
заиного гена при инфицировании рс-
комбинантным вирусом ВЯП М. netis-
tria-ga[3. Клетки дубового шелкопряда
инфицированы вирусом дикого тина
wi ВЯП М. neusiria (J) или ВЯП
Al neustria-gа13 (2) при множест-
венности зараження 1 BOI- м л . (Спе-
цифическая активность |)-га лактози-
дазы определена в различное время
после заражения и выражена как ко-
личество (им) ОНГІГ, разрушенного
за 1 мин, на 1 мг белка
Fig. 5. Temporal regula t ion of polyhedr in/P-galactos ida se liision gene expression alter
infection with MnNPV-ga\3. Antheraea pernei cells were infected with wt MtiNPV (1) or
MnNPV-gal3 Antheraea pernei cells were infected with wt MnNPV (1) or MnNPV-^nlS
(2) at the imiltuplieity of infection 1. The specific activity of p-galactosidase in the infec-
ted cells was determined at var ious times p. i. and was reported as nanomoles of O N P G
cleaved for a minute per a mil l igram of protein
В клетках, инфицированных ВЯП Μ. neustria Wl, полиэдрин обнару-
живается через 24 ч и количество его нарастает до 120 ч, т. е. экспрес-
сия β-галактозидазы и полиэдрина находится под одинаковым вре-
менным контролем.
Количество β-галактозидазы через 120 ч составляет 18,3 % общего
белка, окрашиваемого кумасси, а количество полиэдрина через 120 ч
а . .
(a) or
72 h, 4
Рис. 6. DS-Na-полиакрпла-
мидные кумасси-окрашенные
профили белков из клеток
дубового шелкопряда, ин-
фицированных wt ВЯП Л/.
neustria (а) или рскомби-
нантным вирусом ВЯП л>»
nc4istria-ga\3 (б) , в различ-
ное время после заражения:
/ — 24; 2 — 48; 3— 72; 4 —
96; 5 — 1 2 0 ч. Стрелками
обозначено месторасположе-
ние полиэдрина и β-галак-
тозидазы
Fig. 6. SDS-polvacrylamide
coomassic blue-stained elect-
rophoresis profiles of pro-
teins from Antherea pernei
cells infected with wt MnNPV
(a) or recombinant virus MnNPV-gal3 (6) at var ious time p. i.: / — 24 h, 2 —4·8 h, 3 —
72 h, 4 — 95 h, 5 — 120 h. Arrows indicate the position of polyhedrin and β-galac tos idasc
после заражения составляет около 7 3 % . Таким образом, на основе
ВЯП М. neustria получен новый экспрессивный бакуловируспыи век-
тор. Возможно, модифицируя этот вектор, можно будет повысить экс-
прессию встроенного чужеродного гена до уровня экспрессии неповре-
жденного гена полиэдрина.
Мы предполагаем в дальнейшем использовать рекомбипантный
ВЯП Af. neustria-gal3 в качестве основы для создания рекомбинантных
бакуловирусов, несущих другие чужеродные гены, что значительно уп-
ростит их обнаружение.
ISSN 0233-71357. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1990. Т. G Λ» 3
MALACOSOMA NEUSTRIA NUCLEAR POLYHEDROSIS VIRUS
E X P R E S S I O N VECTOR
L. L Strokovskaya, I. M. Kikhno, О. V. Vese lov sky , I. N. S k u r a i o v s k a y a ,
N. Yu. Miryuta, A. I. Petrenko, A. P. Solomko
Inst i tute of Molecular Biology and Genetics,
Academy of Sciences of the Ukrainian SSR, Kiev
S u m m a r y
The β-galactos idase gene of E. coli was inserted in phase with coding sequence of the
Malacoscma neustria nuclear polyhidros is virus (Mn iNPV) polyhedrin gene. The fusion
gene w a s inserted into the M n N P V genome by cotransfect ion of recombinant plasmid
ρΜΡΕΑ-β gal and wild-type M n N P V DNA. Infection of Antheraea pernyi cells (MCAp-I)
by the resul t ing recombinant M n N P V gal 3 has shown high level of expression of po-
lyhedrin-p-galactosidase fusion protein, no synthesis of polyhedrin being revealed.
С П И С О К Л И Т Е Р А Т У Р Ы
1. Smith G. E., Summers M. D., Fraser M. J. Product ion of human beta interferon in
insect cells infected with a baculovirus expression v e c t o r / / М о ї . and Cel. Biol.—
1983.— 3, N 12.—P. 2156—2165.
2. Luscow V. A., Summers M. D. Trends in the development of baculovirus expression
vectors / / Biotechnology.— Г988.— 6, N 1 .—P. 47—55.
3. Структура и функционирование генома вируса ядерного полиэдроза кольчатого
шелкопряда / И. Н. Скуратовская, Л. И. Строковская, С. В. Комиссаренко,
Н. В. Менделева / / Цитология и генетика.— 1986.— 20, № 1.— С. 31—33.
4. Клонирование гена полиэдрина кольчатого шелкопряда / Л. И. Строковская,
О. В. Веселовский, И. М. Кихно, Н. Ю. Мирюта / / Биополимеры и клетка. —
1990.— 6, № 3 .—С. 81—84.
5. Сухорада Е. M., Канюка В. Ю., Милосердова В. Д. Размножение вируса ядерного
полиэдроза кольчатого шелкопряда при длительном пассировании в клетках пере-
виваемых линий насекомых / / Энтомопатоген. вирусы и их практ. значение.- Ки-
ев : Наук, думка, 1981.— С. 44—50.
6. Pennoek G. D., Shoemaker Ch., Miller L. К. S t rong and regulated expression of
Escherichia coli β-galactos idase in insect cells with a baculovirus v e c t o r / / М о ї . and
Cel. Biol.— 1984,—4, N 3 . — P . 399—406.
7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. — М. : Мир.
1984.—478 с.
8. Черепенко Е. И., Мартыненко Е. П. Простой метод получения Д Н К бакуловиру-
с о в / / М о л е к у л я р . биология.— 1985.— 19, № 6 .—С. 1519—1524.
9. Maxam A. M., Gilbert W. A new method for sequencing D N A / / P r o c . Nat. Acad. Sci.
USA.— 1977,—74, N 2 . — P . 560—564.
10. Чу впило С. Α., Кравченко В. В. Твердофазный метод определения нуклеотидной
последовательности Д Н К / / Биоорг. химия.— 1983. — 9, № 12. — С. 1634—1637.
11. Summers Μ. D., Smith G. Ε. A manua l of methods for baculovirus vectors and in-
sect cell culture procedures.— Texas: Col. Stat. , 1987.— 56 p.
12. Миллер Док. Эксперименты в молекулярной генетике.— М. : Мир, 1976.— 436 с.
13. Bradford Μ. Μ. A rapid and sensitive method for the quant i ta t ion of microgram qu-
anti t ies of protein uti l izing the principle of protein-dye b i n d i n g / / A n a l . Biochcm.—
1976 — 72, N 2 , — P . 248—254.
14. Rochrmann G. F. Polyhedrin s t r u c t u r e / / J . Gen. Virol.— 1986.— 67, N 5 . - 1499—
1513.
Ин-т молекуляр. биологии и генетики АН УССР, Киев Получено 13.11.89
6 ISSN 0233-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1990. Т. G. № 3
|