RecE-независимая нестабильность у Bacillus subtilis
Продолжено изучение необычной транспозируемой мутации сенной палочки, нестабильность которой проявляется в сочетании крайне высокой ревертабельности по аланину с частым возникновением мутаций в нескольких новых позициях. Введение с помощью трансформации в геном исследуемого мутанта маркера recE4 не...
Saved in:
| Date: | 1991 |
|---|---|
| Main Authors: | , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1991
|
| Series: | Биополимеры и клетка |
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153463 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | RecE-независимая нестабильность у Bacillus subtilis / И.С. Карпова, О.В. Пидпала // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 2. — С. 15-19. — Бібліогр.: 16 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-153463 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1534632025-02-09T21:18:09Z RecE-независимая нестабильность у Bacillus subtilis RecE-незалежна нестабільність у Bacillus subtilis RecE-independent instability in Bacillus subtilis Карпова, И.С. Пидпала, О.В. Генно-инженерная биотехнология Продолжено изучение необычной транспозируемой мутации сенной палочки, нестабильность которой проявляется в сочетании крайне высокой ревертабельности по аланину с частым возникновением мутаций в нескольких новых позициях. Введение с помощью трансформации в геном исследуемого мутанта маркера recE4 не привело к снижению его мутабильности. Очевидно, реализация нестабильности не зависит от системы общей рекомбинации. Продовжено вивчення незвичайної транспозованої мутації сінної палички, нестабільність якої виявляється в сполученні надзвичайно високої ревертабельності по аланіну з частим виникненням прямих мутацій в кількох нових позиціях. Введення за допомогою трансформації у геном досліджуваного мутанта маркера recE не привело до зниження його мутабільності. Очевидно, реалізація нестабільності не залежить від системи загальної рекомбінації. The mutant of Bac. subtilis has stable requirement for tryptophan but is highly unstable in its requirement for alanine combined with frequently forward auxotrophic mutations. The introduction of recE marker by transformation has no effect on properties of the mutant under study. Авторы приносят глубокую благодарность Г. В. Савченко за консультативную помощь и обсуждение работы. 1991 Article RecE-независимая нестабильность у Bacillus subtilis / И.С. Карпова, О.В. Пидпала // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 2. — С. 15-19. — Бібліогр.: 16 назв. — рос. 0233-7657 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153463 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0002BD 575.24.576.851 ru Биополимеры и клетка application/pdf Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Генно-инженерная биотехнология Генно-инженерная биотехнология |
| spellingShingle |
Генно-инженерная биотехнология Генно-инженерная биотехнология Карпова, И.С. Пидпала, О.В. RecE-независимая нестабильность у Bacillus subtilis Биополимеры и клетка |
| description |
Продолжено изучение необычной транспозируемой мутации сенной палочки, нестабильность которой проявляется в сочетании крайне высокой ревертабельности по аланину с частым возникновением мутаций в нескольких новых позициях. Введение с помощью трансформации в геном исследуемого мутанта маркера recE4 не привело к снижению его мутабильности. Очевидно, реализация нестабильности не зависит от системы общей рекомбинации. |
| format |
Article |
| author |
Карпова, И.С. Пидпала, О.В. |
| author_facet |
Карпова, И.С. Пидпала, О.В. |
| author_sort |
Карпова, И.С. |
| title |
RecE-независимая нестабильность у Bacillus subtilis |
| title_short |
RecE-независимая нестабильность у Bacillus subtilis |
| title_full |
RecE-независимая нестабильность у Bacillus subtilis |
| title_fullStr |
RecE-независимая нестабильность у Bacillus subtilis |
| title_full_unstemmed |
RecE-независимая нестабильность у Bacillus subtilis |
| title_sort |
rece-независимая нестабильность у bacillus subtilis |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1991 |
| topic_facet |
Генно-инженерная биотехнология |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153463 |
| citation_txt |
RecE-независимая нестабильность у Bacillus subtilis / И.С. Карпова, О.В. Пидпала // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 2. — С. 15-19. — Бібліогр.: 16 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT karpovais recenezavisimaânestabilʹnostʹubacillussubtilis AT pidpalaov recenezavisimaânestabilʹnostʹubacillussubtilis AT karpovais recenezaležnanestabílʹnístʹubacillussubtilis AT pidpalaov recenezaležnanestabílʹnístʹubacillussubtilis AT karpovais receindependentinstabilityinbacillussubtilis AT pidpalaov receindependentinstabilityinbacillussubtilis |
| first_indexed |
2025-11-30T22:08:00Z |
| last_indexed |
2025-11-30T22:08:00Z |
| _version_ |
1850254802985943040 |
| fulltext |
Генноинженерная
биотехнология
УДК 575.24.576.851
И. С. Карпова, О. В. Пидпала
RecE-НЕЗАВИСИМАЯ НЕСТАБИЛЬНОСТЬ
У BACILLUS SUBTILIS
Продолжено изучение необычной транспозируемой мутации сенной палочки, нестабиль-
ность которой проявляется в сочетании крайне высокой ревертабельности по аланину
с частым возникновением мутаций в нескольких новых позициях. Введение с помощью
трансформации в геном исследуемого мутанта маркера гесЕ4 не привело к снижению
его мутабильности. Очевидно, реализация нестабильности не зависит от системы общей
рекомбинации.
Введение. Предшествующими работами было показано, что добавление
эукариотической Д Н К (сельди) в компетентную культуру сенной па-
лочки приводит к возникновению многочисленных мутаций. У ряда
мутантов наблюдалась продленная генетическая нестабильность, час-
тые (до 50 %) реверсии, а также транспозиции, стимулируемые повы-
шенной температурой [1—3]. Необычные свойства мутантов напоми-
нали примеры природной генетической нестабильности, вызываемой
мобильными элементами генома [4—6]. Описаны случаи, когда генети-
ческая нестабильность у бактерий была следствием дупликации опре-
деленного сегмента хромосомы и последовавших за этим рекомбинаци-
онных событий между двумя гомологичными участками Д Н К [7, 8].
Вместе с тем перемещение мобильных генетических элементов происхо-
дит по механизмам, независимым от системы общей рекомбинации,
основанной на взаимодействии гомологичных нуклеотидных последова-
тельностей [9—12].
Главная особенность исследуемой нами нестабильной системы
(изучено подробно на примере ревертабельной ауксотрофной мутации
по лейцину Leu5-3) состоит в ее способности «эволюционировать» в
сторону изменения и усложнения проявлений нестабильности [3, 13].
Это может свидетельствовать о внутренней реорганизации наследствен-
ного материала, в частности о возникновении дупликаций. С другой
стороны, транспозитивность мутации Leu5-3 косвенно указывает на при-
сутствие транспозоноподобного элемента.
Для выяснения природы найденного явления нестабильности
представлялось принципиальным решить вопрос о зависимости свойств
данной системы генетической нестабильности от функционирования
основного гена, ответственного за рекомбинационные процессы у сен-
ной палочки — гена гесЕ [14]. Продукт этого гена у сенной палочки
является аналогом ЯесА-белка кишечной палочки [14].
Поскольку невозможна прямая селекция г£с-мутации, проявляю-
щейся по чувствительности к антибиотику митоцину С (mit s) , в геном
штамма BD224 дополнительно ввели селектируемый маркер, обуслов-
ливающий устойчивость к нейтральному в отношении процессов реком-
бинации антибиотику — рифампицину (rif r) . С этой целью неразведен-
ную взвесь клеток высеяли на чашку с полноценной средой, содержа-
щей градиент концентрации рифампицина, и отобрали несколько
колоний, устойчивых к антибиотику (3 мкг/мл). Из рифампицинустой-
© и . С. КАРПОВА, О. В. ПИДПАЛА, 1991
ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 2. 2 — 0-852 15
чивого варианта штамма BD224 выделили ДНК, трансформировали
штамм Π-1 по признаку устойчивости к рифампицину, трансформантов
пересеяли параллельно на среду с рифампицином и такую же среду
с добавлением митомицина С. Двойные трансформаны, получившие
маркер гесЕ4, не росли на среде с митомицином (0,05 мкг/мл) и были
отобраны для дальнейшей работы. При изучении нестабильности ис-
пользовали только клоны, стойко сохраняющие маркер гесЕ4 в серии
последовательных пересевов.
Материалы и методы. Первичный нестабилньый лейцинзависимый
ауксотроф Leu5-3 (lys~ Ieu -) получен нами из штамма Lys42 (Iys -)
(коллекция ЛИЯФ АН СССР) с помощью низкополимерной Д Н К сель-
ди («Fluka», Швейцария) [15]. Производный от него ауксотроф по
алапипу П-1 (trp~ ala~) выделен в потомстве одного из нестабильных
триптофанзависимых ауксотрофов, возникших в результате прогрева-
ния штамма Leu5-3 [2]. (Буквой Π обозначен пигментный вариант
штамма.)
Полноценной средой был агар Хоттингера. В отличие от общепри-
нятого использовали полутвердую (1 % агара) минимальную среду,
содержащую соли, Спицайзена [16], на которой колонии достигают
видимых размеров через 24 ч инкубации при 37 °С.
Маркер гесЕ4 ввели в геном мутанта П-1 с помощью трансформации.
При изучении ревертабельности придерживались следующей схе-
мы: колонию мутанта изолировали с полноценной среды, гомогенизи-
ровали в буфере и высевали ε конечном разведении на минимальную
среду без ауксотрофной добавки, с ауксотрофной добавкой и полноцен-
ную среду.
Колонии ревертантов учитывали через 24, 48, 72 и 96 ч. Уровень
ревертабельности определяли как процентное отношение числа коло-
ний, выросших на среде без соответствующей ауксотрофной добавки,
к таковому па полноценной среде. Проявления нестабильности в усло-
виях полноценной среды характеризовали с помощью клонального ана-
лиза. Вторично измененные клоны отбирали методом отпечатков на
селективной среде. Для идентификации питательных потребностей аук-
сотрофов использовали 36 компонентов — азотистых оснований, амино-
кислот, водорастворимых витаминов.
Результаты и обсуждение. Сравнение ревертабельности родитель-
ского нестабильного мутанта Leu5-3 и его производных П-1 и
П-1 (гесЕ4) выявило у них сходство проявлений нестабильности в се-
лективных условиях (рисунок). На минимальной среде без ауксотроф-
ной добавки формирование колоний ревертантов носит продленный
характер. Большинство ревертантов возникает с задержкой на вторые
и третьи сутки инкубации, причем их общее число может достигать
значений, сравнимых с числом колоний на полноценной среде. Размеры
колоний ревертантов у всех сравниваемых штаммов значительно варьи-
ровали— от едва заметных микроколоний до крупных, сравнимых с
диким типом. Складывается впечатление, что ревертанты не предшест-
вуют в культуре, а возникают на селективной среде в ходе остаточных
клеточных делений. Сходно ведут себя мутанты и при внесении ауксо-
трофной добавки. В отличие от обычных ауксотрофов, где добавление
требуемого вещества однозначно стимулирует рост, исследуемые штам-
мы обнаруживают гетерогенность. Часть колоний в присутствии добав-
ки растет быстрее, чем и а селективной среде; есть колонии, рост кото-
рых не зависит от добавления соответствующего вещества; от 5 до 40 %
клеток пе выживают на среде с ауксотрофной добавкой. Количествен-
ные характеристики нестабильности в селективных условиях у трех
исследуемых штаммов значительно варьировали от клона к клопу.
Ранее мы отмечали, что на полноценной среде Хоттингера неста-
бильность штамма Leu5-3 не проявлялась. Средняя частота вновь воз-
никающих ауксотрофов первоначально была несколько выше, чем у
исходного штамма Lys42, составляя 0,01 —2,80 % против 0,03 — 0,30 %
[2]. В настоящее время после многолетнего хранения и пересевов час-
16 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 2. 2 — 0-852 16
тота прямого мутирования штамма Leu5-3 снизилась до спонтанного
уровня и не превышает 0,10 %. В отличие от этого штамм П-1 пред-
ставляет собой пример одновременного сочетания двух разнонаправ-
ленных компонентов нестабильности —• высокой ревертабельности и
способности к частому прямому мутированию с образованием ауксо-
трофпых и видимых мутантов, в том числе вариантов с различной сте-
пенью развития пигментации. Введение в геном штамма П-1 мутации
гесЕ4 не привело к его стабилизации в условиях полноценной среды
(таблица). Среди 1785 субклонов — потомков шести отдельных клонов
Ревертабельность родственных нестабильных штаммов до и после введения маркера
recE4: А — нестабильный штамм Leu 5-3 (Leu - A); Б — производный от него штамм П-1
( L e u + T r p - A l a - A ) ; В—штамм П-1 после введения маркера гесЕ4 (а — на селективной
среде (CC); б — на CC с добавлением соответствующей аминокислоты (50 мкг/мл) :
лейцина (Л), аланина {Б, В)). Цифры 1—5 обозначают номера клонов
Revertability of relative unstable strains before and after the recE4 mutation introduction:
A — unstable strain Leu 5-3 (Leu-A); 5—-i t s derivative П-1 ( L e u + T r p - A l a - A ) ; B — strain
П-1 after the recE4 marker introduction; f — frequency of revertants, percentage of colo-
nies on supplemented media; t — time of incubation, h; a — o n minimal medium (MM);
б — on MM supplement with leucine (Л) or alanine (Б, В). Figures 1-5 designate clone
numbers
ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 2. 2 — 0-852 17
штамма П-1 (гесЕ4) —мутанты составляют 5,2 %, что в 50 раз превы-
шает спонтанный уровень и несколько выше (в 1,4 раза) , чем в случае
тес+ штамма П-1. Из 17 идентифицированных ауксотрофов 1 нуждал-
ся в добавлении аргинина, 1—гистидипа, 2 — метиоиина, 1 — изолей-
ципа, 3—треонина, 1—тирозина и 7 штаммов требовали для роста
Частота прямых ауксотрофных мутаций в потомстве нестабильного штамма до и после
введения маркера гесЕ4
Frequency of forward auxotrophic mutants in progeny of unstable strain before and after
the recE4 marker introduction
Штамм
П-1 ( г е е + ) П-1 (гесЕ4)
Клон
Исследовано Число Частота Исследовано Число Частота
Клон субклонов мутантов мутантов, % Клон субклонов мутантов мутантов, %
1 1368 170 12,4 1 345 21 6 ,1
2 103 1 1 , 0 2 287 1 0 ,4
3 621 5 0 ,8 3 1191 34 2 ,9
4 878 38 4 , 3 4 936 2 0 ,2
5 830 15 1,8 5 1687 51 3 ,0
6 3669 37 1,0 6 98 19 19,2
Средняя частота мутантов 3 ,6 5 ,2
одновременного добавления нескольких аминокислот группы глутами-
новой кислоты (аргинина, пролина, аспарагиновой и глутаминовой кис-
лот). Шесть вновь возникших ауксотрофов отличались крайне высокой
ревертабелыюстью по новому маркеру, причем все они сохранили чув-
ствительность к митомицину С и, следовательно, несли мутацию гесЕ4.
Таким образом, введение в геном одного из крайне нестабильных
мутантов сенной палочки мутации гесЕ4 не привело к снижению уровня
его двунаправленной мутабильности как в отношении возникновения
реверсий, так и в отношении прямого мутирования. Очевидно, реализа-
ция нестабильности не связана прямо с активностью гена гесЕ4у про-
дукт которого у сенной палочки аналогичен RecA-белку кишечной па-
лочки и необходим для осуществления гомологичной рекомбинации.
Авторы приносят глубокую благодарность Г. В. Савченко за кон-
сультативную помощь и обсуждение работы.
Р е з ю м е
Продовжено вивчення незвичайної транспозованої мутації сінної палички, нестабіль-
ність якої виявляється в сполученні надзвичайно високої ревертабельності по аланіну
з частим виникненням прямих мутацій в кількох нових позиціях. Введення за допомо-
гою трансформації у геном досліджуваного мутанта маркера гесЕ не привело до зни-
ження його мутабільності. Очевидно, реалізація нестабільності не залежить від системи
загальної рекомбінації.
S u m m a r y
The mutant of Вас. subtitis has stable requirement for tryptophan but is highly unstable
in its requirement for alanine combined with frequently forward auxotrophic mutations.
The introduction of recE marker by transformation has no effect on properties of the mu-
tant under study.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гершензон С. M., Карпова И. С. Нестабильность и транспозиции мутаций, вызван-
ных экзогенной Д Н К у дрозофилы и сенной палочки / / Тез. докл. 8-го двусторон.
симпоз. СССР —Франция (Москва, 9—12 июня, 1986).—M., 1986 — С . 10.
18 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 2. 2 — 0-852 18
2. Карпова И. С., Пидпала О. В. Проявление нестабильности у лейцинзависимого аук-
сотрофа Bacillus subtilis, полученного с помощью Д Н К сельди / / Цитология и ге-
нетика.— 1986.—20, JSlb 1.—С. 40—46.
3. Пидпала О. В., Карпова И. С. Транспозиция нестабильной мутации сенной палочки,
полученной с помощью чужеродной Д Н К / / Д о к л . АН УССР. Сер. Б.— 1989.—
№ 9.— С. 78—80.
4. Хесин Р. Б. Непостоянство генома.— М. : Наука, 1984.— 472 с.
5. Mobile genetic e l emen t s /Ed . J. A. Shapiro.—New York: Acad, press, 1983 — 688 p.
6. Kleckner N. Transposable elements in p roka ryo tes / /Ann . Rev. Genet.—1981.—15.—
p. 341—404.
7. Murray G. E., Smith-Keary P. A recombination dependent replicating instability in
Salmonella typhimurium / / Mutat. Res.— 1976 . -36 , N 2.—P. 283—290.
8. Trowsdale /., Anagnostopoulas C. Difference in the genetic structure of Bacillus sub-
tilis strains carrying the trpE2 6 mutation and strain 1 6 8 / / J . Bacteriol.— 1976.— 126,
N 2.—P. 609—618.
9. Site-specific recombination in transposition and plasmid s t ab i l i t y /D . Sherratt, P. Dy-
son, M. Boocock et al. / / Recombination at the DNA level / / Cold Spring Harbor
Symp. Quant. B u o l . - 1984.—49.—P. 227—235.
10. Replicative and conservative transpositional recombination of the insertion sequen-
c e s / T . A. Weinert, K. Derbyshire, F. M. Hughson et a l . / / Ibid.—P. 251—261.
11. Molecular mechanisms of general genetic recombination: The DNA-binding sites of
the RecA p r o t e i n / P . Howard-Flanders, S. C. West, J. R. Rusche et a l . / / I b i d . —
P. 571—581.
12. Smith G. R. Homologous recombination in E. coli: multiple pathways for multiple rea-
sons / / Cell.— 1989.— 58, N 5.— P. 807—809.
13. Карпова И. С. Характер наследования состояния нестабильности у лейцинзависи-
мого ауксотрофа Bacillus subtilis, индуцированного с помощью Д Н К сельди / / Докл.
АН УССР. Сер. Б.— 1985.— JMb 3.—С. 69—72.
14. Барабанщиков Б. И. Механизмы репарации, рекомбинации и мутагенеза бактерий.—
Казань : Изд-во Казан, ун-та, 1984.— 117 с.
15. Карпова И. С. Получение мутаций у Bacillus subtilis с помощью чужеродной
Д Н К / / М о л е к у л я р . биология.— 1979.—Вып. 23.—С. 61—72.
16. Карпова И. С. Нестабильные мутанты Bacillus subtilis, индуцированные с помощью
Д Н К сельди / / Д о к л . АН УССР. Сер. Б.— 1983.— JMb 6.—С. 66—70.
Ин-т молекуляр. биологии и генетики АН УССР, Киев Получено 21.09.90
УДК 577.152.34:579.852.11
Т. В. Сорочинская, С. И. Черных, В. А. Кордюм
ОПТИМИЗАЦИЯ СИСТЕМЫ ФАГОЗАВИСИМОГО СИНТЕЗА
β-JIАКТAMАЗЫ ТЕМІ В КЛЕТКАХ ESCHERICHIA COLI
На примере гена β-лактамазы разработана система амплификации гена. Использован-
ная система позволяет получить до 6,0-IO5 единиц активности $-лактамазы в 1 мл куль-
туральной жидкости и имеет то преимущество, что весь фермент находится в легкодо-
ступной форме.
Введение. Развитие методов генной инженерии позволило практи-
чески любой ценный ген вводить в чужеродный организм. Для дости-
жения высокоэффективной продукции клонированного гена используют
несколько путей. Один из них — это увеличение числа копий гена в
клетке, или амплификация гена. Для амплификации гена и соответст-
венно получения увеличенного количества продукта, за синтез кото-
рого отвечает этот ген, используют, как правило, умеренные плазмиды
или фаги.
Возможность амплификации генов на плазмидах основана на том,
что ряд плазмид имеет релаксированный контроль репликации, т. е.
количество их в клетке может составлять от нескольких копий до не-
скольких тысяч [1]. Наибольшее распространение получили плазмиды
© Т. В. СОРОЧИНСКАЯ, С. И. ЧЕРНЫХ, В. А. КОРДЮМ, 1991
ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 2. 2 — 0-852 19
|