Активация биосинтеза лизина у Streptococcus bovis

Активация биосинтеза лизина у Streptococcus bovis

Полученные в работе мутантные штаммы S. bovis, устойчивые к аналогу лизина S-2-аминоэтил-L-цистеину, характеризуются повышенной ферментативной активностью аспартаткиназы и диаминопимелатдекарбоксилазы, катализирующих первый и последний этапы биосинтеза лизина у микроорганизмов. Эти мутанты экскретир...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
Bibliographische Detailangaben
Datum:1991
Hauptverfasser: Шевченко, Т.Н., Кметь, В.В., Менделева, Н.В.
Format: Artikel
Sprache:Russian
Veröffentlicht: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1991
Schriftenreihe:Биополимеры и клетка
Schlagworte:
Генно-инженерная биотехнология
Online Zugang:https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153550
Tags: Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:Активация биосинтеза лизина у Streptococcus bovis / Т.Н. Шевченко, В.В. Кметь, Н.В. Менделева // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 3. — С. 103-106. — Бібліогр.: 9 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-153550
record_format dspace
spelling nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1535502025-02-23T19:14:43Z Активация биосинтеза лизина у Streptococcus bovis Активація біосинтезу лізину у Streptococcus bovis Lysine biosynthesis activation in Streptococcus bovis Шевченко, Т.Н. Кметь, В.В. Менделева, Н.В. Генно-инженерная биотехнология Полученные в работе мутантные штаммы S. bovis, устойчивые к аналогу лизина S-2-аминоэтил-L-цистеину, характеризуются повышенной ферментативной активностью аспартаткиназы и диаминопимелатдекарбоксилазы, катализирующих первый и последний этапы биосинтеза лизина у микроорганизмов. Эти мутанты экскретируют лизин в культуральную среду. Показана трансформация протопластов S. bovis с помощью рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей гены биосинтеза лизина Bacillus subtilis. Генетический анализ плазмидной ДНК подтвердил стабильное сохранение lys-генов В. subtilis в клетках гетерологичного хозяина. Одержані в роботі стійкі до аналогу лізину-8-2-аміноетил-L-цистсеїну– мутантні штами, S. bovis характеризуються більш високою ферментативною активністю аспартаткінази і діамінонімелатдекарбоксилази, що каталізують перший та останній етапи біосинтезу лізину у мікроорганізмів. Ці мутанти екскретують лізин в культуральну рідину. Показана трансформація протопластів S. bovis за допомогою рекомбінантної плазмідної ДНК, яка містить гени біосинтезу лізину Bacillus subtilis. Генетичний аналіз плазмідної ДНК підтвердив стабільне збереження lys-генів В. subtilis у клітинах гетерологічного хазяїна. S-2-aminoethyl-L-cysteine resistant S. bovis strains have been obtained. The high level of asparlokinase and diaminopirnlate decarboxylase activity as well as lysine biosynthesis activation have been shown in crude extracts of AEC mutants. B. subtilis lysine gene containing plasmid has been introduced into S. bovis protoplasts. The stability of recombinant plasmids in the cells has been confirmed. 1991 Article Активация биосинтеза лизина у Streptococcus bovis / Т.Н. Шевченко, В.В. Кметь, Н.В. Менделева // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 3. — С. 103-106. — Бібліогр.: 9 назв. — рос. 0233-7657 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153550 ru Биополимеры и клетка application/pdf Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
language Russian
topic Генно-инженерная биотехнология
Генно-инженерная биотехнология
spellingShingle Генно-инженерная биотехнология
Генно-инженерная биотехнология
Шевченко, Т.Н.
Кметь, В.В.
Менделева, Н.В.
Активация биосинтеза лизина у Streptococcus bovis
Биополимеры и клетка
description Полученные в работе мутантные штаммы S. bovis, устойчивые к аналогу лизина S-2-аминоэтил-L-цистеину, характеризуются повышенной ферментативной активностью аспартаткиназы и диаминопимелатдекарбоксилазы, катализирующих первый и последний этапы биосинтеза лизина у микроорганизмов. Эти мутанты экскретируют лизин в культуральную среду. Показана трансформация протопластов S. bovis с помощью рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей гены биосинтеза лизина Bacillus subtilis. Генетический анализ плазмидной ДНК подтвердил стабильное сохранение lys-генов В. subtilis в клетках гетерологичного хозяина.
format Article
author Шевченко, Т.Н.
Кметь, В.В.
Менделева, Н.В.
author_facet Шевченко, Т.Н.
Кметь, В.В.
Менделева, Н.В.
author_sort Шевченко, Т.Н.
title Активация биосинтеза лизина у Streptococcus bovis
title_short Активация биосинтеза лизина у Streptococcus bovis
title_full Активация биосинтеза лизина у Streptococcus bovis
title_fullStr Активация биосинтеза лизина у Streptococcus bovis
title_full_unstemmed Активация биосинтеза лизина у Streptococcus bovis
title_sort активация биосинтеза лизина у streptococcus bovis
publisher Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate 1991
topic_facet Генно-инженерная биотехнология
url https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153550
citation_txt Активация биосинтеза лизина у Streptococcus bovis / Т.Н. Шевченко, В.В. Кметь, Н.В. Менделева // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 3. — С. 103-106. — Бібліогр.: 9 назв. — рос.
series Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv AT ševčenkotn aktivaciâbiosintezalizinaustreptococcusbovis
AT kmetʹvv aktivaciâbiosintezalizinaustreptococcusbovis
AT mendelevanv aktivaciâbiosintezalizinaustreptococcusbovis
AT ševčenkotn aktivacíâbíosintezulízinuustreptococcusbovis
AT kmetʹvv aktivacíâbíosintezulízinuustreptococcusbovis
AT mendelevanv aktivacíâbíosintezulízinuustreptococcusbovis
AT ševčenkotn lysinebiosynthesisactivationinstreptococcusbovis
AT kmetʹvv lysinebiosynthesisactivationinstreptococcusbovis
AT mendelevanv lysinebiosynthesisactivationinstreptococcusbovis
first_indexed 2025-11-24T15:18:13Z
last_indexed 2025-11-24T15:18:13Z
_version_ 1849685435401371648
fulltext Генноинженерная биотехнология У Д К 575.24:576.861 Т. Н. Шевченко, В. В. Кметь, Н. В. Менделева АКТИВАЦИЯ БИОСИНТЕЗА ЛИЗИНА У STREPTOCOCCUS BOVIS Полученные в работе мутантные штаммы S. bovis, устойчивые к аналогу лизина S-2- аминоэтил-Ь-цистеину, характеризуются повышенной ферментативной активностью ас- партаткиназы и диаминопимелатдекарбоксилазы, катализирующих первый и послед- ний этапы биосинтеза лизина у микроорганизмов. Эти мутанты экскретируют лизин в культуральную среду. Показана трансформация протопластов S. bovis с помощью ре- комбинантной плазмидной ДНК, содержащей гены биосинтеза лизина Bacillus subtilis. Генетический анализ плазмидной ДНК подтвердил стабильное сохранение lys-генов В. subtilis в клетках гетерологичного хозяина. Введение. Микроорганизмы рода Streptococcus наряду со многими дру- гими видами представлены в рубце крупного рогатого скота. Интерес к этим бактериям определяется возможностью их использования в жи- вотноводстве в качестве биопрепаратов, так как они синтезируют фер- менты, в частности α-амилазу, и способствуют лучшему усвоению кор- мов. З а рубежом имеется опыт использования таких микроорганизмов в качестве биологической добавки в раннем возрасте животным с це- л ь ю ускоренного перехода на твердые корма, поскольку тем самым ускоряется создание в рубце популяции полезной микрофлоры [1]. В связи с этим перспективной является задача генетической модифи- кации этих микроорганизмов с целью интенсификации синтеза полез- ных веществ — витаминов, аминокислот. Исходя из вышеизложенного, мы поставили цель получить штаммы 5. bovis, продуцирующие лизин — незаменимую аминокислоту, недостаток которой наблюдается в рас- тительных кормах. Используя разработанные ранее подходы для по- лучения подобных мутантов В. subtilis [2], мы модифицировали штамм S. bovis и получили штаммы, экскретирующие лизин, обладающие по- вышенной активностью диаминопимелатдекарбоксилазы, последнего фермента пути биосинтеза лизина у микроорганизмов, а также аспар- токиназы — фермента, катализирующего первый этап биосинтеза лизина . Материалы и методы. В работе использовали штамм S. bovis А024/85, описанный в [1] , а т акже штаммы В. subtilis, ауксотрофные по лизину, Tch42 (lys42), Tch l3 (lys 13), полученные из коллекции Ле- нинградского института ядерной физики АН СССР (Гатчина) . Штамм Tch l4 (lys 13 гесЕ) ( р М С З ) , использованный для выделе- ния препарата Д Н К плазмиды рМСЗ, получен нами при трансформа- ции плазмидной Д Н К , описанной в работе [9]. Лизин-продуцирующие мутанты 5. bovis отбирали на чашках с LB-агаризованной средой, содержащей 1—10 мг /мл 5-2-аминоэтил-Ь- цистеина (АЭЦ). После высева на чашку ~ 1 0 8 клеток в центр ее по- мещали кружок фильтровальной бумаги, пропитанный раствором му- тагена NNG (500 м к г / м л ) . Далее клетки инкубировали 3—4 дня при φ Т. Н. ШЕВЧЕНКО, в . В. КМЕТЬ, Η. В. МЕНДЕЛЕВА, 1991 I S S N 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. JVb 3 1 0 3 37 °С, после чего вокруг кружка появлялись колонии микроорганизмов, устойчивые к аналогу лизина АЭЦ. Затем клетки повторно перееева- J H H a среду, содержащую АЭЦ, и анализировали. Концентрацию лизина в культуральной среде определяли по [3]. Активность диаминопимелатдекарбоксиназы — согласно [4]. Плазмидную Д Н К из В. subtilis и 5. bovls выделяли по методу [5]. Протопласты, полученные согласно [6], трансформировали пре- паратами Д Н К в концентрации 2 мкг/мл. Д л я отбора трансформаптов Активности аспартокиназ, ДАП-декарбоксилази и накопление лизина в штаммах S. bovis Aspartokinase, DAP-decarboxylase activity and lysine storage in S. bouis strains Штамм Суммарная актив- ность аспартокиназ, нМ· мин -"1 · мг"~1 белка Активность ДА Π-декарбоксила- зы, мкМ-мин 1X Xmi""1 белка Лизин, мкг/мл 24/85 0,5 8 аесіб 5 30 100 а сс 64 ЭО 100 250 ассЮб 44 180 500' после введения Д Н К клетки инкубировал:: предварительно с 0,05 мкг/мл эритромицина, а затем высевали на регенерирующую среду, содержа- щую эритромицин в концентрации 10 мкг/мл. Трансформацию В. subtilis осуществляли по методу [7]. Аспарто- киназную активность определяли по [8]. Результаты и обсуждение. В результате мутагенеза и селекции на- ми было получено несколько десятков мутантных штаммов 5. bovis,. способных расти в присутствии 1 —10 мг/мл АЭЦ. Как правило, такие мутанты могут нести нарушения либо в генах, кодирующих биосинтез лизгна , либо детерминирующих структуру клеточной стенки, что пре- пятствует проникновению АЭЦ в клетки. Д л я наших целей представ- ляют интерес мутанты первой группы, а именно: те, которые синтези- руют повышенные количества лизина и способны экскретировать эту аминокислоту. Д л я того чтобы отобрать такого рода колонии, мы ис- пользовали в качестве тест-системы штамм В. subtilis АТ42, ауксо- трофный по лизину. После высева на чашки с LB-средой и АЭЦ (1 мг /л) этот индикаторный штамм не проявляет признаков роста до тех пор, пока в среде не накапливается определенная концентрация лизина. Перекалывая колонии S. bovis АЭЦК на такие чашки, мы от- бирала те, вокруг которых наблюдается наибольший ореол подраста- ющих клеток В. subtilis через 24 ч. Таким образом, нами выделено не- сколько штаммов 5. bovis, продуцирующие лизин. Анализ этих му- тантов проводили по следующим параметрам: определяли активность ключевых ферментов пути биосинтеза лизина — аспарто-киназы и ди- аминопимелатдекарбоксилазы — первого и последнего этапов биосин- теза лизина. В таблице приведены результаты такого анализа, свиде- тельствующие о том, что АЭЦ^-фенотип ν S. bovis, так же как и В. subtilis Г2], обусловлен изменениями в регуляции синтеза лизина. Зна- чительное возрастание ферментативной активности ключевых фермен- тов пути синтеза лизина связано, вероятно, с дерепрессией синтеза этих ферментов. Одним из эффективных модифицирующих приемов для повышения синтеза метаболитов является введение плазмидных Д Н К , содержа- щих соответствующие генетические детерминанты. Поэтому интерес ні еде і ан, или изучение влияния введения плазмиды рМСЗ, содержа- щей репликативный сигнал S. piogenes и клонированные гены биосин- теза л и з і и а В. subtilis [9J. 104 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. JVb 3 104 В результате трансформационных экспериментов получены штам- мы bovis, устойчивые к эритромицину и АЭЦ, в которых определя- ли активность ДАГІ-декарбоксилазы и синтеза лизина. Оказалось, что при трансформации S. bovis аесіб наблюдается увеличение активнос- ти ДАП-ді карбоксил азы до 75 ед., а концентрация лизина в культу- ральной ереде повышается до 200 мкг/мл Такое небольшое измене- ние В биосиніези лизина может быть СВЯЗАНО C НИЗКОЙ КОПИЙНО'СТЬЮ плазмидной Д Н К в клетках 5'. bovis или же с низкой эффективностью экспрессии гетерологичных генов в S. bovis. Более глубокое исследо- вание трансформации lys-генов В. subtilis в клетках S. bovis, начатое нами, может способствовать решению этого вопроса. Д л я тою чтобы выяснить, сохраняется ли Д Н К плазм иды рМСЗ в клетках bovis без изменений, мы реэкстрагировали плазмидную Д Н К из трансформированных клеток и анализировали генетическими методами. Д л я этого трансформировали штаммы В. subtilis, ауксотрофпые по лизину, и изучали появление lys-независимых трансформантов. После трансформации штаммов, содержащих мутации в локусах lys21, lys42, lys9, lys3, мы выяснили, что плазмидная Д Н К не утратила lys-дет-ерминанты, так как все эти штаммы достаточно эф- фективно (1-Ю2 клеток на 1 мкг Д Н К ) трансформировались к лизин- независимости. В заключение следует отметить, что, несмотря на не столь суще- ственное увеличение синтеза лизина в клетках 5. bovis после введе- ния плазмидной Д Н К , содержащей гены биосинтеза лизина В. subti- lis, все же нельзя исключить возможности такого- рода модификации 5. bovis для биотехнологических целей. Показано, что в мутантах S. bovis, устойчивых к АЭЦ, наблюда- ется активизация синтеза ферментов биосинтеза л и з и н а — а с п а р т о к и - наз и ДАП-декарбоксилазы, а т акже повышение синтеза лизина, со- провождающееся экскрецией его в культуральную среду. Введение плазмидной Д Н К , содержащей гены биосинтеза лизина В. subtilisу приводит к некоторому увеличению синтеза лизина в трансформиро- ванных клетках. P е з ю м е Одержані в роботі стійкі до аналогу лізину—8-2-аміноетил-Ь-цистсїну— мутантні штами ,S. bovis характеризуються більш високою ферментативною активністю аспар- таткінази і діамінонімелатдекарбоксилази, що каталізують перший та останній етапи біосинтезу лізину у мікроорганізмів. Ці мутанти екскретують лізин в культуральну рі- дину. Показана трансформація протопластів 5. bovis за допомогою рекомбінантної плазмідної ДНК, яка містить гени біосинтезу лізину Bacillus subtilis. Генетичний ана- ліз плазмідної Д Н К підтвердив стабільне збереження lys-генів В. subtilis у клітинах гетерологічного хазяїна. S u m m а г у S-2-aminoethyNL-cystcine resistant 5. bovis strains have been obtained. The high level of aspartokinase and diaminopirnlate decarboxylase activity as well as lysine biosynthesis activation have been shown in crude extracts of AEC mutants. B. subtilis lysine gene con- taining plasmid has been introduced into S. bovis protoplasts. The stability of recombi- nant plasmids in the cells has been confirmed. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Pat. AO 260766 Czechoslovak. The strain of microorganism Streptococcus bovis AQ 24 /85 /V . K m e t . - P u b l . 1985. 2. Шевченко Т. H., Тимашова Ε. ОАлексиева 3. Μ. Мутанты Bacillus subtilis, устой- чивые к аналогу лизина 5-2-аминоэтил-Е-цистеину//Генетика.— 1989.— 25, № 11.—• С. 1937—1945. ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. JVb 3 105 3. Боздырева Η. M., Куцева JI. С. Спектрофотометрический метод определения лизина в культуральной жидкости Brevibacterium // Прикл. биохимия и микробиология. — 1974.— 10, № 5.—С. 756. 4. White Р. I. Diaminepimelate decarboxylase (Ε. coli) // Meth. Enzymol.— 1971.— 17.— P. 140. 5. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование.— М. : Мир, 1984.— 477 с. 6. Kmet V., Kuncova P., Yovorsky. Production and regeneration of Rumen Streptococ- cus bovis p ro top las t s / /B io log ia .— 1988.—43.—P. 977—982. 7. Spizizen J., Reilly B. E., Evans A. H. Requirements for t ransformation in Bacillus subtilis U Annu. Rev. Microbiol.— 1966.—20, N 1.—P. 341. 8. Кара-Мурза С. И., Ивановская JI. В., Жданова И. И. Влияние аминокислот на ак- тивность аспартокиназы Corynebacterium glutamicum штамма дикого типа и его му- тантов / /Прикл . биохимия и микробиология.— 1974.— 10, № 5 . — С. 756. 9. Изучение области 210° хромосомы Bacillus subtilis с помощью рекомбинантных плазмид / М. Л. Чикиндас, Е. В. Лукьянов, П. М. Рабинович, А. И. Степанов / / Молекуляр. генетика, микробиология и вирусология.— 1987.— № 3.— С. 20—24. Ин-т молекуляр. биологии и генетики АН УССР, Киев Получено 20.11.90 106 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. JVb 3 106

Ähnliche Einträge