Клеточная инженерия в биотехнологии растений-продуцентов из семейства кутровых (Apocynaceae)
Описаны результаты экспериментов по соматической гибридизации в следующих комбинациях: Rauwolfia serpentina+Vinca minor, R. serpentina+Catharanthus roseus, R. serpentina+Rhazya stricta, С. roseus+V. minor. Представлены данные о селективных системах отбора гибридов, гибридность каллусных линий продем...
Saved in:
| Published in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Date: | 1991 |
| Main Authors: | , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1991
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153593 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Клеточная инженерия в биотехнологии растений-продуцентов из семейства кутровых (Apocynaceae) / И.А. Костенюк, О.Ф. Любарец, В.В. Воронин, Ю.Ю. Глеба // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 4. — С. 26-34. — Бібліогр.: 22 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-153593 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Костенюк, И.А. Любарец, О.Ф. Воронин, В.В. Глеба, Ю.Ю. 2019-06-14T11:09:28Z 2019-06-14T11:09:28Z 1991 Клеточная инженерия в биотехнологии растений-продуцентов из семейства кутровых (Apocynaceae) / И.А. Костенюк, О.Ф. Любарец, В.В. Воронин, Ю.Ю. Глеба // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 4. — С. 26-34. — Бібліогр.: 22 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0002DC https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153593 578.085 Описаны результаты экспериментов по соматической гибридизации в следующих комбинациях: Rauwolfia serpentina+Vinca minor, R. serpentina+Catharanthus roseus, R. serpentina+Rhazya stricta, С. roseus+V. minor. Представлены данные о селективных системах отбора гибридов, гибридность каллусных линий продемонстрирована с помощью анализа изозимных спектров аспартатаминотрансферазы, цитогенетического анализа и блот-гибридизации рестриктных фрагментов ядерной ДНК гибридных клонов с рДНК. Гибридные клеточные линии исследованы в течение 20 месяцев культивирования в условиях неорганизованного клеточного роста in vitro, показана их относительная стабильность. Розроблені умови ізолювання та культивування протопластів чотирьох видів рослин-продуцентів із родини Aросуnасеае. Описано одержання гібридних клітинних ліній методом злиття протопластів у різних комбінаціях. Вивчені ізозимні спектри естерази та трансферази цих гібридних калусних ліній, проаналізовані результати блот-гібридизації рестриктних фрагментів ядерної ДНК з рДНК лимону, приведені дані цитогенетичного аналізу. Продемонстрована відносно висока стабільність гібридних клонів цапротязі 20 місяців культивування in vitro. Protoplast culture and fusion techniques have been developed for four Apocynaceae species in different combinations. Hybrid cell lines obtained were studied with respect to esterase and transferase isozyme analysis, blot hybridization analysis using lemon rDNA as a probe, and results of cytogenetic analysis. Relative genetic stability of hybrid cell lines during 20 months of culture in unorganized growth conditions has been demonstrated. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Клеточная биология Клеточная инженерия в биотехнологии растений-продуцентов из семейства кутровых (Apocynaceae) Клітинна інженерія у біотехнології рослин-продуцентів з родини кутрових (Apocynaceae) Cell engineering developed for apocynaceae plant biotechnology Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Клеточная инженерия в биотехнологии растений-продуцентов из семейства кутровых (Apocynaceae) |
| spellingShingle |
Клеточная инженерия в биотехнологии растений-продуцентов из семейства кутровых (Apocynaceae) Костенюк, И.А. Любарец, О.Ф. Воронин, В.В. Глеба, Ю.Ю. Клеточная биология |
| title_short |
Клеточная инженерия в биотехнологии растений-продуцентов из семейства кутровых (Apocynaceae) |
| title_full |
Клеточная инженерия в биотехнологии растений-продуцентов из семейства кутровых (Apocynaceae) |
| title_fullStr |
Клеточная инженерия в биотехнологии растений-продуцентов из семейства кутровых (Apocynaceae) |
| title_full_unstemmed |
Клеточная инженерия в биотехнологии растений-продуцентов из семейства кутровых (Apocynaceae) |
| title_sort |
клеточная инженерия в биотехнологии растений-продуцентов из семейства кутровых (apocynaceae) |
| author |
Костенюк, И.А. Любарец, О.Ф. Воронин, В.В. Глеба, Ю.Ю. |
| author_facet |
Костенюк, И.А. Любарец, О.Ф. Воронин, В.В. Глеба, Ю.Ю. |
| topic |
Клеточная биология |
| topic_facet |
Клеточная биология |
| publishDate |
1991 |
| language |
Russian |
| container_title |
Биополимеры и клетка |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Клітинна інженерія у біотехнології рослин-продуцентів з родини кутрових (Apocynaceae) Cell engineering developed for apocynaceae plant biotechnology |
| description |
Описаны результаты экспериментов по соматической гибридизации в следующих комбинациях: Rauwolfia serpentina+Vinca minor, R. serpentina+Catharanthus roseus, R. serpentina+Rhazya stricta, С. roseus+V. minor. Представлены данные о селективных системах отбора гибридов, гибридность каллусных линий продемонстрирована с помощью анализа изозимных спектров аспартатаминотрансферазы, цитогенетического анализа и блот-гибридизации рестриктных фрагментов ядерной ДНК гибридных клонов с рДНК. Гибридные клеточные линии исследованы в течение 20 месяцев культивирования в условиях неорганизованного клеточного роста in vitro, показана их относительная стабильность.
Розроблені умови ізолювання та культивування протопластів чотирьох видів рослин-продуцентів із родини Aросуnасеае. Описано одержання гібридних клітинних ліній методом злиття протопластів у різних комбінаціях. Вивчені ізозимні спектри естерази та трансферази цих гібридних калусних ліній, проаналізовані результати блот-гібридизації рестриктних фрагментів ядерної ДНК з рДНК лимону, приведені дані цитогенетичного аналізу. Продемонстрована відносно висока стабільність гібридних клонів цапротязі 20 місяців культивування in vitro.
Protoplast culture and fusion techniques have been developed for four Apocynaceae species in different combinations. Hybrid cell lines obtained were studied with respect to esterase and transferase isozyme analysis, blot hybridization analysis using lemon rDNA as a probe, and results of cytogenetic analysis. Relative genetic stability of hybrid cell lines during 20 months of culture in unorganized growth conditions has been demonstrated.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153593 |
| citation_txt |
Клеточная инженерия в биотехнологии растений-продуцентов из семейства кутровых (Apocynaceae) / И.А. Костенюк, О.Ф. Любарец, В.В. Воронин, Ю.Ю. Глеба // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 4. — С. 26-34. — Бібліогр.: 22 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT kostenûkia kletočnaâinženeriâvbiotehnologiirasteniiproducentovizsemeistvakutrovyhapocynaceae AT lûbarecof kletočnaâinženeriâvbiotehnologiirasteniiproducentovizsemeistvakutrovyhapocynaceae AT voroninvv kletočnaâinženeriâvbiotehnologiirasteniiproducentovizsemeistvakutrovyhapocynaceae AT glebaûû kletočnaâinženeriâvbiotehnologiirasteniiproducentovizsemeistvakutrovyhapocynaceae AT kostenûkia klítinnaínženeríâubíotehnologííroslinproducentívzrodinikutrovihapocynaceae AT lûbarecof klítinnaínženeríâubíotehnologííroslinproducentívzrodinikutrovihapocynaceae AT voroninvv klítinnaínženeríâubíotehnologííroslinproducentívzrodinikutrovihapocynaceae AT glebaûû klítinnaínženeríâubíotehnologííroslinproducentívzrodinikutrovihapocynaceae AT kostenûkia cellengineeringdevelopedforapocynaceaeplantbiotechnology AT lûbarecof cellengineeringdevelopedforapocynaceaeplantbiotechnology AT voroninvv cellengineeringdevelopedforapocynaceaeplantbiotechnology AT glebaûû cellengineeringdevelopedforapocynaceaeplantbiotechnology |
| first_indexed |
2025-11-25T23:28:45Z |
| last_indexed |
2025-11-25T23:28:45Z |
| _version_ |
1850581523650052096 |
| fulltext |
11. Vasil I. кVasil V., Redway F. Plant regeneration from embryogenic protoplasts of
Triticum aestivum L. (whea t ) / / 7 - th Int. congr. on plant tissue and cell culture·
Abstrs.— Amsterdam, 1990.—- P. 3.
12. Tilton V. R., Russell S. H. Microinjection of plant cells. II. Cell isolation, prepara-
tion and initial c u l t u r e / / P l a n t Physiol.— 1983.— 12, N 1 P . 9.
13. Пастернак T. П., Мельников П. В. Генетическая трансформация высших растений
с помощью микроинъекций Д Н К / / Биология культивируемых клеток и биотехно-
логия : Материалы междунар. конф — Новосибирск, 1988.—С. 187—188.
14. Transgenic rapsed plants obtained by the microinjection of DNA into microspore-de-
rived embryo ids /G . Neuhaus, G. Spadenberg, 0 . Mittelstein-Scheid, H.-G. Schweiger/ /
Theor. and AppI. Genet.— 1987.—75, N 1,—P. 30—36.
15. Wei M., Kyo M., Harada H. Callus formation and plant regeneration through direct
culture of isolated pollen grains of H. vulgare, cv. Sabarlis // Ibid — 1986 — 72,
N 2,— P. 252—255.
16. Transient expression of chloramphenicolacetyltransferase (CAT) gene in barley cell
cultures and immature embryos through microprojective bombardment / K K. Kartha,
R. N. Chibbar, F. Georges et a l . / / P l a n t Cell. Rep.—1989 —8, N 3,—P. 429—432.
17. Plant cell t ransformation using high velocity microparticles / R. H. Vallejos, M. Lo-
pez, L. Orsaria et a l . / /7 - th Int. cong. on plant tissue and cell culture: A b s t r s -
Amsterdam, 1990,—P. 80.
18. Transformation of cereal cell cultures bv microprojective bombardment / Chen D.,
Batty N., Evans J., P. D a l e / / I b i d . — P . 50."
19. Gene t ransfer to b a r l e y / R . R. Mendel, E. Claus, J. Schulze et a l . / / Ib id — P. 44.
20. Картель Η. А. Эффекты экзогенной Д Н К у высших растений.— Минск : Наука и
техника, 1981.— 143 с.
21. Transfer of bacterial and human genes to germinating Arabidopsis thaliana / L. Le-
doux, L. Diels, R. Huart et a l . / /Arabidopsis inform, service.— 1985.— 22, P. 1—12.
22. Uptake and transient expression of chimeric genes in seed-derived embryos / R. Top-
fer, B. Gronenborn, J. Schell, H. S te inb i s s / /P lan t Cell.— 1989.— 1, N 1.—P. 133—
139.
23. De la Pena A., Lorz H., Schell J. Transgenic rye plants obtained by injection of DNA
into young tillers // Nature.— 1987.—-325, N 6071.—P. 274—276.
24. Hess D. Pollen-based techniques in genetic manipulation // Int. Rev. Cytology.—
1987,— 107 — P. 367—395.
25. De Wet J. M., Bergqust R., Harlan J. Exogenous gene transfer in maize using DNA-
treated po l l en /Exp . manipulation of ovule tissues / Ed. P. Charman.— New York,
1985.—P. 197—209.
26. Ohta Y. High efficiency genetic t ransformation of maize by a mixture of pollen and
exogenous DNA // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.— 1986,—83, N 3 ,—P. 715—719.
27. Чесноков Ю. В., Виконская Η. Α., Король Α. Б. Генетическая трансформация ку-
курузы/ /7 -й Всесоюз. симпоз. «Молекулярные механизмы генетических процес-
сов» : Тез. докл.— M., 1990.— С. 183.
28. Booy G., Krens FHuizing Н. Attempted pollen mediated transformation of maize / /
J. Plant Physiol.— 1989.—135, N 3,—P. 319—324.
29. Luo Z., Wu R. A simple method for the transformation of rice via*the pollen tube
p a t h w a y / / P l a n t Мої. Biol. Rep.—1988.—6, N 3,—P. 165—174.
30. Растения ячменя с введенным геном канамицинустойчивости / Н. А. Картель,
К. И. Забенькова, Т. В. Манешина, С. Е. Аблов // Докл. АН БССР,— 1990.—34,
№ 3,—С. 261—263.
31. Flavell R., Mathias R. Prospects for t ransforming monocot crop plants // Nature —
1984.-307, N 5947.—P. 108—109.
32. Пастернак Т. П. Введение чужеродных генов в растения злаков / /11-й Всесоюз.
съезд Всесоюз. о-ва физиологов растений : Тез. докл.— Минск, 1990.— С. 72.
Ин-т клеточ. биологии и генет. инженерии АН УССР, Получено 14.0Ik$l
Киев
УДК 578.085
И. А. Костенюк, О. Ф. Любарец, В. В. Воронин, Ю. Ю. Глеба
КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ
В БИОТЕХНОЛОГИИ РАСТЕНИЙ-ПРОДУЦЕНТОВ
ИЗ СЕМЕЙСТВА КУТРОВЫХ (A POCYNACEAE)
Описаны результаты экспериментов по соматической гибридизации в следующих ком-
бинациях: Rauwolfia serpentina+Vinca minor, R. serpentina-\-Catharanthus roseus,
R. serpentina-^-Rhazya stricta, C. roseus+V. minor. Представлены данные о селектив-
© И. А. Костенюк, О. Ф. Любарец, В. В. Воронин, Ю. Ю. Глеба, 1991.
2 6 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. No. 4
ных системах отбора гибридов, гибридность каллусных линий продемонстрирована с
помощью анализа изозимных спектров аспартатаминотрансферазы, цитогенетического
анализа и блот-гибридизации рестриктных фрагментов ядерной ДНК гибридных кло-
нов с рДНК. Гибридные клеточные линии исследованы в течение 20 месяцев культиви-
рования в условиях неорганизованного клеточного роста in vitro, показана их отно-
сительная стабильность.
Введение. Исследование возможностей получения продуктов вторичного
синтеза в культуре ткани — одно из интенсивно развивающихся направ-
лений современной биотехнологии высших растений. Японской компа-
нии Mitsui Petrochemical Industr ies Ltd. [1] удалось получить высоко-
продуктивные штаммы культуры ткани воробейника ( L y t h o s p e r u m
erythrorhizon L.) для крупномасштабного производства шиконина —
ценного исходного сырья для ряда продуктов в фармацевтике и парфю-
мерии. Определенные успехи в этой области имеют и другие зарубеж-
ные фирмы: Nitto Denki, Nat te rman, Boehringer Mannheim, Kanebo [2].
Семейство Аросупасеае, в состав которого входят более 2 000 видов,
принадлежащих к 200 родам [4], изобилует лекарственными растени-
ями-продуцентами. Некоторые виды традиционно используются в ка-
честве сырья для изготовления высокоэффективных препаратов гипо-
тензивного и цитостатического действия (Rauwolfia — источник резер-
пина и аймалина, Catharanthus и Vinca — винкристина, винбластина,
винина, пубесцина и т. п.) [5]. Ряд растений, произрастающих в труд-
нодоступных регионах планеты (Rhazya strieta, Stemmadenia tomentosa),
активно используется местным населением в рецептах народной меди-
цины, в то же время они до сих пор остаются малоизученными совре-
менной наукой [6]. Особенности ареалов произрастания кутровых (в
подавляющем большинстве — тропическая и субтропическая зоны, ис-
ключение составляет род Vinca), а также высокая коммерческая цен-
ность некоторых из продуцируемых ими метаболитов (индольные алка-
лоиды и др.) обусловили значительное внимание к изучению этих
объектов в культуре in vitro; однако достаточно полные работы выпол-
нены лишь в отношении немногих наиболее известных видов этого
семейства [7, 8].
Несмотря на интенсивное развитие в последнее время техники куль-
тивирования протопластов и соматической гибридизации [9], следует
отметить ограниченность сведений о подобного рода исследованиях
семейства Аросупасеае [10, 11]. В то же время современные методы
клеточных технологий, в частности, конструирование новых гибридных
геномов в результате слияния протопластов различных видов этого
семейства могли бы предоставить достаточно интересный материал для
анализа особенностей вторичного синтеза в гибридных клетках. Не ис-
ключено, что подобное искусственное объединение различных метаболи-
ческих путей приведет к появлению новых продуктов вторичного син-
теза, что определило бы как теоретическую, так, вероятно, и практиче-
скую ценность таких гибридов. В качестве первого этапа работы нам
представлялось необходимым изучение возможности изолирования жиз-
неспособных протопластов некоторых видов семейства Аросупасеае, их
культивирования и получения соматических гибридов между этими
видами в нескольких комбинациях.
Материалы и методы. В качестве источника протопластов исполь-
зовали каллусные культуры трех видов семейства Аросупасеае, а имен-
но: R. serpentina, R. strieta, С. roseus, а также стерилизованные листья
1—3-го порядков интактных растений V. minor. Каллусные линии куль-
тивировали в темноте при температуре 26 °С на питательной среде
Ax (мг /л) [12]: 1-нафтилуксусная кислота ( Н У К ) — 0 , 5 ; 1-индолилук-
сусная кислота (ИУК) — 0,5; 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота
(2,4-Д) — 2 ; кинетин — 0,2. Д л я ферментации отбирали ткань, начиная
с 5-х сут после пересадки. Растения барвинка малого выращивали в
теплице при 16-4 режиме освещения. Д л я изолирования протопластов
R. serpentina и С. roseus использовали ферментную смесь следующего
27 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. No. 4
состава: Onozuka R-IO («Serva», ФРГ) — 0 , 1 5 % , Driselase («Sigma»,.
С Ш А ) — 0 , 2 0 % , Macerozyme R-IO («Serva») — 0,10 %, сахароза
(0,45 Μ) — 5 0 мл, среда W5 [13] — 5 0 мл. Протопласты R. strieta выде-
ляли в ферментном растворе такого состава: Onozuka R-IO — 0,75 %,
Cellulysin («Serva») — 0,35 %, Macerozyme R-10 — 0 , 2 5 % , Macerase
(«Serva») — 0,25 %, сахароза — 1 % , среда W5 — до 100 мл. Ткань
инкубировали в течение 18 ч, затем протопласты трижды отмывали в
среде W5, после чего переносили в питательную среду. Листья барвинка
после стерилизации вы-
держивали на питатель-
ной среде Мурасиге —
Скуга (сахароза — 20 г/л,
кинетин—0,1 мг/л) в тем-
ноте или на свету (2 000—
3 000 лк, 16-4 световой
день) в течение 1—5 сут,
затем инкубировали в
растворе цел л политиче-
ских ферментов 14—18 ч,
мезофильные протоплас-
ты трижды отмывали сре-
дой W5.
Цитогенети ч е с к и й
анализ гибридных кле-
точных линий и роди-
тельского материала про-
водили с помощью мето-
да давленых препаратов.
Ткань выдерживали в
0,05 %-ном растворе кол-
хицина («Fluka», Швей-
цария) в течение 2 ч,
фиксировали в смеси эта-
нол — ледяная уксусная
кислота ( 3 : 1 ) в течение
б—8 ч, окрашивали материал в 1,5 %-ном растворе уксуснокислого ор-
сеина («Мегск», Ф Р Г ) .
Анализ спектров множественных молекулярных форм эстеразы и
аспартатаминотрансферазы проводили с помощью ПААГ-электрофо-
реза по [14].
Суммарную Д Н К из листьев родительских видов и каллусных тка-
ней гибридных клонов выделяли по методике Шуэ и др. [15]. Очищен-
ную Д Н К (2—3 мкг) расщепляли рестриктазами EcoRV-\-BarnH/,
фрагменты разделяли электрофорезом в 0,8 %-ном агарозном геле,
переносили на капроновый фильтр и гибридизовали с меченой р Д Н К
плазмиды pUL7y содержащей фрагмент гена 26S р Р Н К лимона [16] .
Результаты и обсуждение. На предварительном этапе исследований
были разработаны условия изолирования жизнеспособных протопластов
четырех видов семейства Аросупасеае, а также подобраны соответству-
ющие питательные среды для их культивирования.
Протопласты R. serpentina культивировали на модифицированных
питательных средах Tol (I) и То2 (II) Кабоша [17], а т а к ж е
Ax ( III) [12], дополненных 0,5 M маннитом. На питательной среде I в
единственном случае наблюдались клеточные деления с довольно высо-
кой частотой (10 %) на 2-е сут после инициации культуры протопластов
(рис. 1: первое деление в культуре протопластов раувольфии змеиной
(об. 6,2; ок. 20). Образовавшиеся клеточные микроколонии разбавляли
средой II через 15—20 сут, а еще через месяц переносили их на агари-
зованную среду III. На среде III частота деления протопластов рауволь-
фии была значительно ниже и составляла 0,01—0,05 %, первые деления
28 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. No. 4
наблюдались на 20—22-е сут, в то же время воспроизводимость куль-
тивирования была значительно выше, чем на среде I.
Д л я культивирования протопластов катарантуса апробировали
семь вариантов питательных сред: среду 1, три модификации питатель-
ной среды Kao и Михайлюка (IVa, IV6 и IVB), среду Нича и Охиямы
(V) [18], среду Харады (VI) [18], среду Шепарда и Тоттена
(VII) [18]. На среде III первые деления начинались на 17—20-е сут,
частота делений составила приблизительно 2—4 %, сформировавшиеся
клеточные колонии переносили на агаризованную среду 4х через 27—
30 сут. Остальные среды оказались непригодными для эффективного
культивирования протопластов катарантуса розового.
Д л я культивирования протопластов R. stricta испытали пять раз-
личных питательных сред (I, IVa, V, VI, VII ) , лучшими результаты ока-
зались на средах I и VII, частота делений на них была приблизительно
одинаковой и составила 0,05—0,50 %, однако первые клеточные деле-
ния на среде VII были зафиксированы на 10—12-е сут, а на среде I —
лишь на 17—19-е. Полученные клеточные микроколонии переносили
на агаризованную питательную среду III через 40—50 сут.
Мезофильные протопласты V. minor отмывали средой W5 и пере-
носили в дополненную 0,5 M маннитом модифицированную питательную
среду Шенка — Хильдебрандта (VIII ) , в которой они синтезировали
клеточную стенку на 3—4-е сут, а первые деления наблюдались на
17—25-е сут культивирования. Д л я протопластов этого вида были
характерны низкая частота делений (0,1 — 1 %) , медленный рост обра-
зовавшихся клеточных микроколоний, некроз клеток в процессе культи-
вирования, плохая переносимость добавлений свежих порций пита-
тельной среды, несмотря на значительное количество апробированных
сред (более 20 основных сред и их модификаций). Развившиеся микро-
колонии из 10—20 клеток разбавляли на 40—50-е сут порциями свежей
среды того же состава с пониженным осмотическим давлением (0,3 M
маннита) , через 30—35 сут клеточные колонии переносили на агаризо-
ванную питательную среду, культивировали на свету или в темноте.
Сформировавшиеся каллусные линии имели склонность к спонтанному
ризогенезу (чаще на свету) как на эмбриогенных средах (среда VII Ia
с добавлением БАП в концентрации 0,1—2,0 мг/л) , так и на стандарт-
ной каллусогенной среде (VIII ) , причем образующиеся из каллуса кор-
ни зеленели на свету и по ходу своего роста давали очаги каллуса;
получить побеги и полноценные регенеранты нам не удалось.
На следующем этапе работы были получены соматические гиб-
риды в таких комбинациях: R. serpentina-\-V. minor (1); R. serpen-
tina— С. roseus (2); R. serpentina-\-R. stricta (3); V. minor-{-С, ro-
seus (4). Следует отметить, что в комбинациях 1—3 гибриды относятся
к межтрибным (партнеры принадлежали к трибам Rauwolfieae и Plu-
merieae [7]) , а в 4-й — к межродовым (триба Plumerieae).
В экспериментах по соматической гибридизации изолированные
протопласты партнеров переносили в среду W5 и смешивали в соотно-
шении примерно 1 : (1,5—2). Слияние осуществляли по Менцелю [19]
в каплях при высоком значении рН в присутствии ионов Ca2+, в каче-
стве фьюзогена применяли полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной
массой 4 000—6 000.
Д л я культивирования продуктов слияния в комбинации Rauwol-
Jia + Vinca использовали модифицированную питательную среду Шенка
и Хильдебрандта (VIII ) , дополненную маннитолом (0,4—0,5 М) .
Гибридные продукты отбирали с помощью системы физиологической
селекции: на этой питательной среде частота делений протопластов
раувольфии близка к нулю, для элиминации мезофильных протопластов
Vinca их обрабатывали ПЭГ во время слияния в «жестких» условиях.
Первые деления наблюдали на 8—12-е сут после слияния. На стадии
образования клеточных микроколоний из 10—15 клеток культуру раз-
бавляли порциями свежей питательной среды того же состава. Через
4 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. No. 4
25—53 сут клеточные колонии переносили на жидкую среду VIII с пони-
женным осмотическим давлением (маннитол — 0,2—0,3 М) или на ага-
ризованную питательную среду того же состава, на которой их в даль-
нейшем и культивировали. Были получены более 5 ООО клеточных
линий, отличавшихся разнообразием морфологических и физиологиче-
ских свойств. Д л я детекции гибридного материала был проведен скри-
нинг клеточных линий по изозимным спектрам эстеразы и аспартатами-
нотрансферазы. Наиболее подходящими в данном случае оказались
изозимные спектры аспартатаминотрансферазы (небольшое число и
выраженность видоспецифичных маркерных полос) (рис. 2: изозимные
спектры эстеразы (а) и трансферазы (б): Vm — барвинок малый (ли-
стья); Rs— раувольфия змеиная (каллус) ; здесь и далее цифры обо-
значают гибридные клеточные линии).
Были проанализированы 200 клеточных линий, из них 52,3 % могли
быть безусловно отнесены к гибридным по этому признаку. Интересно
отметить, что в контрольной культуре протопластов раувольфии на той
ж е среде, на которой культивировали продукты слияния, клеточные
деления и образование клеточных колоний не были отмечены, тем не
менее 26,8 % проанализированных клеточных линий имели изозимные
спектры трансферазы, сходные с раувольфией. Это могло быть резуль-
татом либо интенсивной элиминации хромосом одного из родителей
(в данном случае — Vinca) в гибридных продуктах, либо индукции
клеточной пролиферации родительских клеток раувольфии про-
цедурой слияния. РТзозимные спектры, характерные для листьев и
каллуса V. minor, продемонстрировали 4,8 % проанализированных
клонов.
Анализ метафазных пластинок апикальной корневой меристемы
30 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. No. 4
барвинка малого, каллусного штамма раувольфии и гибридных каллус-
ных линий показал, что для каллусной ткани раувольфии характерна
поли- и миксоплоидия, модальный класс составляют околотриплоидные
клетки, у 10 изученных гибридных каллусных линий также обнаружива-
ется явление миксоплоидии, количество хромосом у разных клеток
варьирует в значительной степени (от 30 до 140), достигая в отдельных
случаях 200. На рис. 3 приведены данные по распределению культи-
вируемых клеток гибридного клона RV27 (Rauwolf ia-\-Vinca) по коли-
Рис. З Рис. 4
честву метафазных хромосом. Различия в размерах хромосом (у бар-
винка малого — «точечные», 2м = 46; у раувольфии — в 3—4 раза более
крупные) позволяют предположить наличие в гибридных клетках хро-
мосом обоих родителей с количественным преобладанием хромосом
раувольфии.
При гидролизе рестриктазами EeoRV и BamHI Д Н К Vinea и Rau-
wolfia и гибридизации с зондом pUL7, содержащим фрагмент р Д Н К
лимона, на радиоавтографе выявляются специфичные для каждого вида
наборы фрагментов р Д Н К . В четырех из шести проанализированных
клеточных линий, отселектированных после слияния протопластов бар-
винка и раувольфии, также выявляются р Д Н К обоих родительских
видов (рис. 4: блот-гибридизация ядерных Д Н К Vmj Rs и гибридных
клеточных линий, гидролизованных рестриктазами EeoRV и BamHIf с
зондом pUL7, специфичным к р Д Н К (здесь и далее размеры фрагмен-
тов даны в тыс. п. н . ) ) . В линии 76, кроме фрагментов, характерных
для родительских видов, обнаруживается фрагмент р Д Н К длиной
3,3 тыс. п. н., отсутствующий в геномах и раувольфии, и барвинка.
Новые варианты повтора р Д Н К по сравнению с родительскими лини-
ями были выявлены ранее у соматических гибридов Nieoliana Iaba-
еит + Atropa belladonna [20]. По-видимому, возникновение новых
їзариантов рибосомных повторов связано с повышенным уровнем реком-
бинаций в гибридных клетках.
Хотя ткань некоторых гибридных клонов на свету зеленела и в
отдельных случаях наблюдался спонтанный или индуцированный ризо-
генез, полноценные побеги все же не формировались.
Скрининг полученного материала по изозимным спектрам был
проведен через 8—10 месяцев после экспериментов по соматической
гибридизации. Спустя еще 12 месяцев были повторно проанализиро-
ваны 60 клонов из числа отселектированных и исследованных ранее,
продемонстрировавших высокую стабильность гибридных каллусных
линий по этому признаку.
Перед слиянием в комбинациях R. serpentina + С. roseus и R. ser-
pentina+R. stricta каллусные протопласты Catharanthus и Rhazya
31 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. No. 4
обрабатывали монойодацетатсж (МИА) или йодацетамидом (ИАА).
Д о слияния протопласты одного из партнеров инкубировали при 26 °С
в течение 15—20 мин в смеси следующего состава: МИА или ЙАА —
18—20 мг, среда W5 — 20 мл. Д а л е е их отмывали средой W5, часть
протопластов отбирали для контрольной культуры. Продукты сомати-
ческой гибридизации культивировали на питательной среде 4х, допол-
ненной 0,45 M маннитолом, на которой протопласты раувольфии были
неспособны к делению либо делились с низкой частотой (0,01—0,02 % ) ,
что позволяло надеяться на достаточно высокую вероятность идентифи-
кации гибридов в популя-
циях развившихся в этих
условиях клеточных
клонов.
В комбинации С. го-
seus-{-V. minor было по-
лучено около 100 клеточ-
ных линий, в комбинаци-
ях R. serpentina-\-C. ro-
seus и R. serpentina-\-R.
strieta — соответственно
200 и 80.
Д л я отбора гибрид-
ных клонов проведен скрининг полученного материала по изозимным
спектрам аспартатаминотрансферазы. Во всех перечисленных комбина-
циях были идентифицированы гибридные клеточные линии (рис. 5:
изозимные спектры аспартатаминотрансферазы: Cr — катарантус розо-
вый, остальные обозначения см. на рис. 2) . В каждой из исследован-
ных комбинаций обнаружено несколько типов спектров множественных
молекулярных форм трансферазы. В комбинации С. roseus-\-V. minor
было идентифицировано 27 % гибридов (от общего числа изученных
клеточных линий), R. serpentina-\-C. roseus — 4 6 % и Rauwolfia+Rha-
zya — 5 % .
При совместном гидролизе ядерной Д Н К рестриктазами EeoRV и
BatnHI родительских видов, использованных в экспериментах по сома-
тической гибридизации, и гибридизации их с Д Н К плазмиды pUL7,
содержащей фрагмент р Д Н К лимона, выявляются специфичные для
каждого вида наборы фрагментов р Д Н К . В проанализированных во
всех комбинациях гибридных клеточных линиях, отселектированных
после слияния, наблюдаются специфичные для обоих родительских
видов рестриктные фрагменты р Д Н К (рис. 6: блот-гибридизация ядер-
ных Д Н К Cr, Vm и гибридной клеточной линии 115, гидролизованных
рестриктазами EeoRV и BamHI, с зондом pUL7, специфичным к р Д Н К ;
рис. 7 : блот-гибридизация ядерных Д Н К Rsf Rhazya strieta (RR) и
гибридных клеточных линий, гидролизованных рестриктазами EeoRV и
BamHI с зондом pUL7t специфичным к р Д Н К ) .
Гибридный материал культивировали в виде каллусных штаммов
в темноте при 26 °С и/или на свету (3000—4000 лк) при 16-ч световом
дне. Попытки получить растения-регенеранты не имели успеха.
Как и в первой комбинации ( R a u w o l f i a + Vinea), отселектирован-
ные клеточные линии были исследованы по критерию «гибридность»
(анализ изозимных спектров, блот-гибридизация гидролизованной
рестриктазами Д Н К с зондом, содержащим фрагмент р Д Н К лимона)
через 10—11 месяцев после первой серии анализов. Во всех комбина-
циях клеточные линии, первоначально идентифицированные как гибрид-
ные, сохраняли признаки гибридности и по результатам повторной
серии анализов, что весьма существенно, поскольку общеизвестны фак-
ты, свидетельствующие о высоком уровне генетической и физиологиче-
ской изменчивости как культивируемых растительных клеток вообще
[21], так и соматических гибридов, в частности [12].
Таким образом, нами разработаны и испытаны условия изолиро-
Рис. 5
32 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. No. 4
впния жизнеспособных протопластов четырех видов растений-продуцен-
тов из семейства Apocynaceae j подобраны и модифицированы питатель-
т л е среды для их культивирования. Гибридные клеточные линии полу-
чены в следующих комбинациях: Rauwolfia-\-Vinca; Rauwolfia-\-Catha-
ranihus; Rauwolf ia-\-Rhazya\ CatharanthusArVinea, статус гибридного
состояния которых сохраняется в течение двух лет культивирования в
\словиях неорганизованного клеточного роста. Полученные гибридные
клоны представляют определенный интерес для исследований особен-
ностей их вторичного синтеза, поскольку объединение в гибридной клет-
кс различных родительских геномов и происходящих в них метаболи-
ческих процессов может приводить к глубоким качественным и коли-
чественным сдвигам в структуре вторичного метаболизма, в частности,
ι появлению новых, не свойственных родительским видам, метабо-
л и т о в [ 2 2 ] .
Р е з ю м е
Розроблені умови ізолювання та культивування протопластів чотирьох видів рослин-
тфодуцентів із родини Лросупасеае. Описано одержання гібридних клітинних ліній
методом злиття протопластів у різних комбінаціях. Вивчені ізозимні спектри естерази
та трансферази цих гібридних калусних ліній, проаналізовані результати блот-гібриди-
зації рестриктних фрагментів ядерної Д Н К з ρ ДНК лимону, приведені дані цитогене-
тичного аналізу. Продемонстрована відносно висока стабільність гібридних клонів
цапротязі 20 місяців культивування in vitro.
S u m m a r y
Protoplast culture and fusion techniques have been developed for four Лросупасеае
vpecies in different combinations. Hybrid cell lines obtained were studied with respect
to esterase and transferase isozyme analysis, blot hybridization analysis using lemon
rDNA as a probe, and results of cytogenetic analysis. Relative genetic stability of hybrid
cell lines during 20 months of culture in unorganized growth conditions has been de-
monstrated.
SN 0233-71)57. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Τ. 7. № 4 З — 1-284 33
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Yamada Y., Hashimoto Т. Possibilities for improving yields of secondary metabolites
in plant cell c u l t u r e s / / P r o g r . in plant cell, and mol. biol.: Proc. VII Int. congr. plant
tissue and cell cult. (Amsterdam, 24—29 June 1990) / Eds H. J. J. Nijkamp et al —
Dordrecht : Kluwer Acad, publ., 1990.—P. 547—556.
2. Eunice A., Fowler M. Biologically active plant secondary metabolites — perspectives
for the f u t u r e / / C h e m . I n d . - 1985.— 17.—P. 408—410.
3. Fontanel A., Tabata M. Production of secondary metabolites by plant tissue and cell
cultures. Present aspects and prospec ts / /Nes t le Res. News 1986/87 — Vevey : Nestec
Ltd., 1987.—P. 93—103.
4. Жизнь растений. Цветковые растения.— Μ. : Просвещение, 1981.—Т. 5, ч. 2.— 512 с.
5. Справочник по лекарственным растениям / А. М. Задорожный, А. Г. Кошкин,
С. Я. Соколов и д р . — М . : Лесн. пром-сть, 1988 — 415 с.
6. Pawelka К-H., Stockigt J. Major indole alkaloids in cell suspension cultures of Rha-
zya strieta Decaisne // Z. Naturforsch — 1986.—41C.—P. 385—390.
7. Balseuich J. Monoterpene indole alkaloids from Аросупасеае other then Catharanthus
roseus H Cell culture and somatic cell genetics of plants / E d s F. Constabel, I. K. Va-
sil.— San Diego: Acad, press, 1988 — Vol. 5 .—P. 371—383.
8. DeLuca VKurz W. G. W. Monoterpene indole alkaloids (Catharanthus alkaloids) //
Ibid.—P. 385—401.
9. Сидоров В. А. Биотехнология растений. Клеточная селекция.— Киев : Наук, думка,
1990.—280 с.
10. Bapat V. A., Rao P. S., Heble М. R. Immobilization of cells and protoplasts of
Catharanthus roseus // Proc. Indian Acad. S c i . - 1986 — 96, N 5 .—P. 413—418.
11. Takeuchi Y., Komamine A. Glucans in the cell walls regenerated from Vinca rosea
p r o t o p l a s t s / / P l a n t Cell Physiol.— 1981,—22, N 11.—P. 1585—1594.
12. Соматическая гибридизация пасленовых / В. А. Сидоров, Η. Μ. Пивень, Ю. Ю. Гле-
ба, К. М. Сытник.— Киев : Наук, думка, 1985.— 130 с.
13. Medgyesy P., Menczel L., Maliga P. The use of cytoplasmic streptomycin resistance:
chloroplast t ransfer from Nicotiana tabacum into Nicotiana sylvestris, and isolation
of their somatic hybr id / /Мої . and Gen. Genet — 1980.— 179, N 3 .—P. 693—698.
14. Биохимический анализ в клеточной инженерии растений.— Киев, 198<8.— 49 с.—
(Препринт/АН УССР. Ин-т ботаники; № 88.1).
15. Shure M., Wessler S., Fedoroff N. Molecular indentification and isolation of the
Waxy locus in maize / /Cel l .— 1983.—35, N 3 .—P. 225—233.
16. Колоша В. О., Фодор И. И. Структурная гетерогенность ρ Д Н К Citrus limonj I Mo-
лекуляр. биология — 1986.—20, № 3 — С. 656—659.
17. Caboche М. Nutritional requirements of protoplast-derived haploid tobacco cell grown
at low densities in liquid m e d i u m / / P l a n t a — 1980.— 149, N 1.—P. 7—18.
18. Калинин Φ. JI., Сарнацкая В. ВПолищук В. Е. Методы культуры тканей в физио-
логии и биохимии растений.— Киев : Наук, думка, 1980.— 487 с.
19. Menczel L., Kiss Z. R., Maliga P. Streptomycin resistant and sensitive somatic hyb-
rids of Nicotiana tabacum+Nicotiana knightiana : Correlation of resistance to N. ta-
bacum plastids // Theor. and Appl. Genet.— 1981.—59, N 2 — P . 191—195.
20. Borisyuk Ν. V., Momot V. P., Gleba Y. Novel class of rDNA repeat units in somatic
hybrids between Nicotiana and Atropa // Ibid — 1988.— 76, N 1—P. 108—112.
21. Larkin P. JScowcroft W. R. Somaclonal variation. A novel source of variability
from cell cu l tures / / Ib id .— 1981.— 60, N 2 .—P. 197—214..
22. Waller G. R., Nowacki Ε. K. Genetic control of alkaloid product ion/ /Alkaloid Biol,
and Metabol. in P lan ts / Eds G. R. Waller, E. K. Novacki— New York; London : Ple-
num press, 1978—P. 49—84.
Ин-т клеточ. биологии и генет. инженерии АН УССР, Получено 14.01.91
Киев
УДК 575.1
Η. Н. Колесник, И. К. Комарницкий, JI. Р. Шлумуков, А. С. Самойлов
АНАЛИЗ МИТОТИЧЕСКОЙ СЕГРЕГАЦИИ ПЛАЗМАГЕНОВ
В СОМАТИЧЕСКИХ ГИБРИДАХ NICOTI ANA,
ПОЛУЧЕННЫХ КЛОНИРОВАНИЕМ
ГЕТЕРОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ ПРОДУКТОВ СЛИЯНИЯ
Изучено наследование шести кодируемых плазмагенами признаков у гибридных форм
Nicotiana, регенерированных из гибридных клеток независимого происхождения.
В качестве родительских форм использовали каллусные протопласты пластомно-
го хлорофиллдефектного мутанта N. tabacum и мезофильные протопласты одного из
© н . Н. Колесник, И. к . Комарницкий, Л. Р. Шлумуков, А. С. Самойлов, 1901.
34 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. No. 4
|