Получение асимметричных соматических гибридов в роде Medicago
Получены асимметричные соматические гибриды между различными видами люцерны (Medicago Sp.). Регенерированы растения в гибридной комбинации М. sativa + M. varia. Мезофильные канамицин-устойчивые протопласты M. varia облучали гамма-лучами в дозе 300 Гp. У них выявлен ген устойчивости к канамицину. Отб...
Saved in:
| Published in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Date: | 1991 |
| Main Authors: | , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1991
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153601 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Получение асимметричных соматических гибридов в роде Medicago / Н.В. Кучук, Л.М. Шаховский, В.В. Воронин, Ю.Ю. Глеба // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 4. — С. 54-60. — Бібліогр.: 20 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-153601 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Кучук, Н.В. Шаховский, Л.М. Воронин, В.В. Глеба, Ю.Ю. 2019-06-14T11:13:35Z 2019-06-14T11:13:35Z 1991 Получение асимметричных соматических гибридов в роде Medicago / Н.В. Кучук, Л.М. Шаховский, В.В. Воронин, Ю.Ю. Глеба // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 4. — С. 54-60. — Бібліогр.: 20 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0002E1 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153601 575.22 Получены асимметричные соматические гибриды между различными видами люцерны (Medicago Sp.). Регенерированы растения в гибридной комбинации М. sativa + M. varia. Мезофильные канамицин-устойчивые протопласты M. varia облучали гамма-лучами в дозе 300 Гp. У них выявлен ген устойчивости к канамицину. Отбор асимметричных соматических гибридов вели по устойчивости к канамицинсульфату. В комбинации М. borealis+M. Iupidina получены клеточные линии. Канамицинустойчивые каллусные протопласты М. Iitpulina облучали гамма-лучами в дозе 500 Fp. Одержані асиметричні соматичні гібриди між різними видами люцерни (Medicago sp.). Як донорів використовували канамінинстінкі протопласти М. varia і М. lupulina. У гібридній комбінації між M sativa та опроміненою (300 Гр) М. varia відібрано 13 канаміцинстійких клітинних клонів. У одного з них одержані рослини. Кількість хромосом гібриду складала 2n = 70–72, шо значно більше, ніж у обох батьків – 2n = 32. Зроблено припущення, що здатність до регенерації одержаних гібридів перейшла від опроміненого донора M. varia. У гібридній комбінації між М. borealis та опроміненою (500 Гр) М. lupulina відібрано вісім канаміцинстійких клітинних клонів. Аналіз активності неоміцинфоефотрансферази та рДНК за допомогою блот-гібридизації по Саузерну показав гібридну природу одержаних ліній в обох комбінаціях. Interspecific somatic hybrids of Medicago have been obtained by «gamma-fusion». Kanarnycin resistant plants of M. varia and kanamycin resistant callus line of M. lupulina were used as donors. M. sativa and Λί. borialis were used as recipients. After fusion of gamma-irradiated (300 Gy) mesophyll protoplasts of M. varia with those of M. sativa, 13 kanamycin resistant hybrid clones were selected. We could induce the formation plant regenerants from one of the clones. Chromosome number of regenerated plants was 70—72, thus differing from both the parents 2n = 32 and indicating asymmetric genome constitution. Since the recipient genotype of Af. sativa was deficient for shoot morphogenesis in culture, we think that transfer of the regeneration ability from M. varia to the hybrid takes place. After fusion of gamma-irradiated (500 Gy) callus protoplasts of AT. Iupulina with mesophyll ones of Af. borealis, 8 kanamycin resistant clones were selected. Biochemical analysis involved hybrids of both species combinations. Activity of NPTII is detectable in hybrid plants as well as callus clones. Analysis of ribosomal DNA of hybrids by Southern blot hybridization demonstrated the presence of speciesspecific rDNA fragments of both parents. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Клеточная биология Получение асимметричных соматических гибридов в роде Medicago Одержання асиметричних соматичних гібридів у роді Medicago Isolation of asymmetric somatic hybrids of medicago species Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Получение асимметричных соматических гибридов в роде Medicago |
| spellingShingle |
Получение асимметричных соматических гибридов в роде Medicago Кучук, Н.В. Шаховский, Л.М. Воронин, В.В. Глеба, Ю.Ю. Клеточная биология |
| title_short |
Получение асимметричных соматических гибридов в роде Medicago |
| title_full |
Получение асимметричных соматических гибридов в роде Medicago |
| title_fullStr |
Получение асимметричных соматических гибридов в роде Medicago |
| title_full_unstemmed |
Получение асимметричных соматических гибридов в роде Medicago |
| title_sort |
получение асимметричных соматических гибридов в роде medicago |
| author |
Кучук, Н.В. Шаховский, Л.М. Воронин, В.В. Глеба, Ю.Ю. |
| author_facet |
Кучук, Н.В. Шаховский, Л.М. Воронин, В.В. Глеба, Ю.Ю. |
| topic |
Клеточная биология |
| topic_facet |
Клеточная биология |
| publishDate |
1991 |
| language |
Russian |
| container_title |
Биополимеры и клетка |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Одержання асиметричних соматичних гібридів у роді Medicago Isolation of asymmetric somatic hybrids of medicago species |
| description |
Получены асимметричные соматические гибриды между различными видами люцерны (Medicago Sp.). Регенерированы растения в гибридной комбинации М. sativa + M. varia. Мезофильные канамицин-устойчивые протопласты M. varia облучали гамма-лучами в дозе 300 Гp. У них выявлен ген устойчивости к канамицину. Отбор асимметричных соматических гибридов вели по устойчивости к канамицинсульфату. В комбинации М. borealis+M. Iupidina получены клеточные линии. Канамицинустойчивые каллусные протопласты М. Iitpulina облучали гамма-лучами в дозе 500 Fp.
Одержані асиметричні соматичні гібриди між різними видами люцерни (Medicago sp.). Як донорів використовували канамінинстінкі протопласти М. varia і М. lupulina. У гібридній комбінації між M sativa та опроміненою (300 Гр) М. varia відібрано 13 канаміцинстійких клітинних клонів. У одного з них одержані рослини. Кількість хромосом гібриду складала 2n = 70–72, шо значно більше, ніж у обох батьків – 2n = 32. Зроблено припущення, що здатність до регенерації одержаних гібридів перейшла від опроміненого донора M. varia. У гібридній комбінації між М. borealis та опроміненою (500 Гр) М. lupulina відібрано вісім канаміцинстійких клітинних клонів. Аналіз активності неоміцинфоефотрансферази та рДНК за допомогою блот-гібридизації по Саузерну показав гібридну природу одержаних ліній в обох комбінаціях.
Interspecific somatic hybrids of Medicago have been obtained by «gamma-fusion». Kanarnycin resistant plants of M. varia and kanamycin resistant callus line of M. lupulina
were used as donors. M. sativa and Λί. borialis were used as recipients. After fusion of
gamma-irradiated (300 Gy) mesophyll protoplasts of M. varia with those of M. sativa,
13 kanamycin resistant hybrid clones were selected. We could induce the formation plant
regenerants from one of the clones. Chromosome number of regenerated plants was 70—72, thus differing from both the parents 2n = 32 and indicating asymmetric genome
constitution. Since the recipient genotype of Af. sativa was deficient for shoot morphogenesis in culture, we think that transfer of the regeneration ability from M. varia to
the hybrid takes place. After fusion of gamma-irradiated (500 Gy) callus protoplasts of
AT. Iupulina with mesophyll ones of Af. borealis, 8 kanamycin resistant clones were
selected. Biochemical analysis involved hybrids of both species combinations. Activity
of NPTII is detectable in hybrid plants as well as callus clones. Analysis of ribosomal
DNA of hybrids by Southern blot hybridization demonstrated the presence of speciesspecific rDNA fragments of both parents.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153601 |
| citation_txt |
Получение асимметричных соматических гибридов в роде Medicago / Н.В. Кучук, Л.М. Шаховский, В.В. Воронин, Ю.Ю. Глеба // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 4. — С. 54-60. — Бібліогр.: 20 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT kučuknv polučenieasimmetričnyhsomatičeskihgibridovvrodemedicago AT šahovskiilm polučenieasimmetričnyhsomatičeskihgibridovvrodemedicago AT voroninvv polučenieasimmetričnyhsomatičeskihgibridovvrodemedicago AT glebaûû polučenieasimmetričnyhsomatičeskihgibridovvrodemedicago AT kučuknv oderžannâasimetričnihsomatičnihgíbridívurodímedicago AT šahovskiilm oderžannâasimetričnihsomatičnihgíbridívurodímedicago AT voroninvv oderžannâasimetričnihsomatičnihgíbridívurodímedicago AT glebaûû oderžannâasimetričnihsomatičnihgíbridívurodímedicago AT kučuknv isolationofasymmetricsomatichybridsofmedicagospecies AT šahovskiilm isolationofasymmetricsomatichybridsofmedicagospecies AT voroninvv isolationofasymmetricsomatichybridsofmedicagospecies AT glebaûû isolationofasymmetricsomatichybridsofmedicagospecies |
| first_indexed |
2025-11-27T07:29:50Z |
| last_indexed |
2025-11-27T07:29:50Z |
| _version_ |
1850806489098223616 |
| fulltext |
3. Medeyesy F., Fejes E., Maliga P. Interspecif ic chloroplas t recombinat ion in a Ni co-
liana somat ic hybrids // Proc. Nat . Acad. Sci. VSA.- 1985,— 82, N 20 — P. 6960—6964.
1 Transmission genet ics of the somatic hybr idizat ion process in Nicotiana. I. Hybrid
and cvbrids a m o n g the regenera tes f rom cloned pro toplas t fus ion p roduc t s / Y. Y Glc-
ba, N. N. Kolesnik, I. V. Meshkene et a l . / / T h e o r . and Appl. Genet .— 1984 — 69
N l . - P . 1 2 1 - 1 2 8 .
5. Spangenberg //., Neuhaus G., Poirifkus I. Micromanipu la t ion of higher p lant cells //
P l a n t cell line selection / Ed. P. J. Dix — Meinherm: VCH 1990.—P 87—109
€. Koop H. U., Scfuz 'eiger H. G. Regenera t ion of p lan t s f rom individual ly cul t ivated
p ro top las t s u s ing an improved microcul ture s y s t e m / / J P l a n t Phvsiol .— 1986 — ί 21
N 3 — P. 245—257.
7 Kao K. N., MichayIuk M. R. Nutr i t ional requi rements for g rowth of Vieia hajaslcuui
CQlis and p ro top las t s at a verv low popula t ion dencitv in liquid m e d i a / / P l a n t a - - -
1975,— 126, N 2 — P. 105—110. '
Я. Cytoplast-protoplast fus ion for interspecific chloroplas t t r ans f e r in Nicotiana /
P. Mal iga , H. Loerz, G. Lazar , F. N a g y / / М о ї . and Gen. Genet — 1981.— 185, N 2
P. 211—215.
(; Transmission genet ics of the somatic hybridizat ion process in Nicotiana. Tl. P las ton ic
l ie terozvgotes / Yu. Gleba, I. I\. Komarni t sky , N. N. Kolesnik et al. // Ibid.— 1985,—
•98, N 3 — P. 476—481.
If) 'Villney-Bussett R. A. E. The control of plast id inheri tance in Pelargonium // Gewct.
Res.— 1970,— 16, N 1 .—P. 49—61.
Π - клеточ. биологии и генет. инженерии АН УССР, Получено 14.01.9 і
К; :·
Т( :і. ун-т (ΕΤΗ) , Цюрих
у;J. к ГІ75.22
И. В. Кучук, А. М. Шаховский В. В. Воронин, Ю. Ю. Глеба
П О Л У Ч Е Н И Е АСИММЕТРИЧНЫХ СОМАТИЧЕСКИХ ГИБРИДОВ
В РОДЕ MEDICAGO
Получены асимметричные соматические гибриды между различными видами люцерны
(M-Jicago у,р.). Регенерированы растения в гибридной комбинации М. sativa-\-M. varia.
Ме-и)фильные канамицин-устойчивые протопласты λί. varia облучали гамма-лучами в
()()•<:' 300 Fp. У ни:: выявлен ген устойчивости к канамицину. Отбор асимметричных со-
матических гибридое- вели по устойчивости к канамицинсульфату. В комбинации
М. borealis+M. Iupuiina получены клеточные линии. Канамицинустойчивые каллусные
протопласты М. Iupulina облучали гамма-лучами в дозе 500 Fp.
Введение. Клеточная инженерия растений за последнее время достиг-
ла больших успехов в расшифровке механизмов организации, функцио-
нирования и регулирования растительного генома, а также в констру-
ировании новых форм растений, обладающих целым рядом хозяйствен-
но ценных признаков. В перспективе развитие этих методов позволит
выйти на новые ступени в познании живой природы, а также сущест-
венно изменит и ускорит селекционный процесс по выведению высоко-
урожайных и устойчивых к неблагоприятным факторам среды сортов
культурных растений. В то же время подавляющее большинство экс-
периментов по клеточной инженерии растений проведено на видах из
семейств пасленовых и в меньшей степени — крестоцветных. Менее изу-
чены в этом отношении виды семейства бобовых, имеющие важное
значение для сельскохозяйственного производства. К настоящему вре-
мени существует относительно мало работ, описывающих получение
соматических гибридов между видами семейства бобовых, что в зна-
чительной степени связано с трудностями культивирования протопла-
C I f l B у этих видов.
Эксперименты но соматической гибридизации у видов из семейства
бобовых проводили, главным образом, с видами рода Medicago. Так,
авторы [1] сообщили о получении гибридных растений в результате
слияния протопластов М. sativa с протопластами М. falcata. В работе
с IL В. Кучук, Λ. М. Шахонский, В. В. Воронин, Ю. Ю. Глеба. 1991.
54 ISSN 0233-7l',57. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 4
не приведено никаких биохимических или цитологических доказательств
гибридности полученных растений, а также не описаны способы селек-
ции, с помощью которых они были отобраны. Авторы указали только
на их измененную морфологию, что могло быть результатом сомакло-
нальной изменчивости в результате культивирования протопластов
и образующихся из них клеточных линий. В дальнейшем было показа-
но [2], что у таких растений рестриктные спектры хлоропластных Д Н К
наследуются от обоих родителей, а спектры митохондриальной Д Н К
имеют характер, отличный от родительских. Доказательств гибридности
полученных растений по ядерным генам в данной работе также приве-
дено не было.
В экспериментах по слиянию протопластов М. sativa с протопласта-
ми М. falcata или Al. quasifalcata гетерокарионы отбирали по двойной
флюоресценции, используя меченные флюоресцентным красителем про-
топласты одного вида и мезофильные протопласты — другого. В резуль-
тате экспериментов получены зеленеющие клеточные линии, анализ изо-
ферментных спектров которых выявил их гибридность. Цитологический
анализ показал, что хромосомный набор у этих линий является суммой
хромосомных наборов обоих родителей [3].
Аналогичные результаты получены [4] после индукции слияния
протопластов Al. sativa с протопластами Ni. arborea с использованием
электрического поля. В итоге отобраны клеточные линии, гибридность
которых была доказана с помощью электрофореза белков. Так же, как
и в предыдущей работе, не сообщалось о выявлении регенерантов из
гибридных клеточных линий.
Авторы работы [5] сообщили о получении гибридных клеточных
линий после слияния мезофильных протопластов М. Variay устойчивых
к канамицинсульфату, с протопластами Al. sativa из клеточной суспен-
зии, устойчивой к фосфинотрицину. Гибридные клеточные линии, обла-
дающие устойчивостью как к канамицинсульфату, так и к фосфино-
трицину, оказались неспособными к регенерации. В то же время из про-
топластов М. varia удается получить нормальные растения. Авторы
предполагают, что связанная с устойчивостью к фосфинотрицину су-
перпродукция глутаминсинтетазы у исходной клеточной суспензии М.
sativa и у гибридных линий каким-то образом ингибирует регенераци-
онную способность. Опубликованные результаты являются первым
свидетельством возможности использования селективных признаков, в
том числе и гена устойчивости к канамицинсульфату, для отбора со-
матических гибридов у видов семейства бобовых.
С использованием генетической комплементации после слияния
протопластов из белых мутантных суспензионных культур М. sativa и
Al. borealis были получены зеленые гибридные клеточные линии [6].
Впервые в настоящей работе описано получение растений
асимметричных соматических гибридов между М. sativa и об-
лученной (300 Гр) М. varia, а также клеточных линий асимметричных
соматических гибридов между М. borealis и облученной (500 Гр)
AL lupulina.
Материалы и методы. Р а с τ и т е л ь н ы й м а т е р и а л . В работе
использовали следующие сорта и линии люцерны: люцерна посевная,
Al. sativa L., сорт «Веселоподолянская»; люцерна северная, М. borealis
L., линия 94, любезно предоставлена Μ. Н. Агафодоровой ( В Н И И кор-
мов им. В. Р. Вильямса, Московская обл.); люцерна хмелевидная, М.
lupulina L., линия 93, любезно предоставлена Μ. Н. Агафодоровой; лю-
церна изменчивая, M varia L., устойчивая к канамицинсульфату транс-
генная линия, получена из Сегедского Биологического Научного Цент-
ра (Сегед, ВНР) [7].
У вышеперечисленных видов после стерилизации семян 1 %-ным
раствором диацида в течение 8—10 мин и трехкратной отмывки сте-
рильной дистиллированной водой были получены стерильные растения.
Растения выращивали на безгормональной питательной среде MS [8]
пли В5 [9].
55 ISSN 0233-7l',57. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 4
Г е н е т и ч е с к а я т р а н с ф о р м а ц и я Μ. lupulina, о п о с р е -
д о в а н н а я Agrobacterium tumefaciens. Кусочки стеблей и листьев
люцерны длиной 0,4—0,6 см суспендировали в жидкой питательной сре-
де В5, содержащей 0,2 мг/л 2,4-Д и 0,5 мг/л кинетина или БАП, и до-
бавляли к ним ночную культуру A. tumefaciens pRiA4, pGA472 [10, 11].
Совместное культивирование продолжалось в течение 48 ч при посто-
янном перемешивании. Затем кусочки растительных тканей извлекали
из среды, высушивали стерильной фильтровальной бумагой и раскла-
дывали на плотную питательную среду В5 с 0,2 мг /л 2,4-Д, 0,5 м г / л
кинетина или БАП, содержащую 500 мг/л карбенициллина (ПО «Мос-
медпрепараты», СССР) и 500 мг/л цефотаксима («Calbiochem», США) .
Спустя две недели растительные ткани и образующиеся клеточные ли-
нии переносили на питательную среду того ж е состава с 200 мг/л кар-
бенициллина, 200 мг/л цефотаксима и 50 мг/л канамицинсульфата
(СССР) . Отобранные клеточные клоны М. Iupulinay устойчивые к кана-
мицинсульфату, в дальнейшем пассировали на питательной среде того
же состава.
В ы д е л е н и е и к у л ь т и в и р о в а н и е п р о т о п л а с т о в
люцерны и клевера, а также полученных продуктов слияния осуществ-
ляли по разработанной нами методике [12].
С л и я н и е п р о т о п л а с т о в и о т б о р а с и м м е т р и ч н ы х
с о м а т и ч е с к и х г и б р и д о в . Протопласты одного из партнеров
предварительно облучали на установке «Исследователь», используя в
качестве облучателя Со60 с удельной активностью 22 Р/с. Слияние про-
топластов проводили по методу, предложенному для слияния мезо-
фильных протопластов растений [13].
Протопласты двух партнеров смешивали в растворе W5 в соотно-
шении 1 : 1 и наносили в виде капли на дно пластиковой чашки Петри.
Спустя 10 мин к капле добавляли раствор, состоящий из 40 %-ного
полиэтиленгликоля-4000, 0,4 M маннитола, 0,1 M CaCh, рН 10,5, при-
мерно в равном объеме. Через 30 мин инкубации сливающиеся прото-
пласты отмывали раствором W5. Затем раствор W5 отбирали пастеров-
ской пипеткой, а к оставшимся на дне чашки Петри протопластам до-
бавляли модифицированную питательную среду КМ8р [12]. Асиммет-
ричные соматические гибриды отбирали на питательной среде В5, со-
держащей 50 мг/л канамицинсульфата в качестве селективного агента,
а также 1 мг/л кинетина или БАП.
А к т и в н о с т ь неомицинфосфотрансферазы (NPTII) анализиро-
вали по способу [14].
Д Н К - Д Н К г и б р и д и з а ц и я п о С а у з е р н у [15]. Расти-
тельные Д Н К выделяли, как описано в работе [16]. Д Н К - Д Н К гибри-
дизацию по Саузерну осуществляли по методу, изложенному в методи-
ческом руководстве фирмы «Amersham» (Англия).
Результаты и обсуждение. Предварительные эксперименты по вы-
живаемости протопластов М. varia, облученных дозой 250 Гр, показа-
ли, что только у 1 % протопластов наблюдается первое, а иногда и
второе деление, но затем дальнейшее их развитие прекращается. Та-
ким образом, доза 250 Гр является летальной для мезофильных про-
топластов М. varia.
Выживаемость протопластов после слияния составляла 20—30 %,
а количество наблюдаемых гетерокарионов достигало 5—10 % от числа
выживших протопластов. После слияния протопластов M. sativa с про-
топластами М. varia, облученными дозой 250 Гр, были отобраны девять
клеточных линий, устойчивых к канамицинсульфату, а после слияния
с протопластами М. Variaf облученными дозой 300 Гр,— 13 клеточных
линий, устойчивых к этому препарату.
Отобранные канамицинустойчивые клеточные линии интенсивно
зеленели на свету, в то время как клеточные линии, полученные у M.
sativa, сорт «Веселоподолянская», обычно росли в виде светло-зеленых
колоний при исходных условиях культивирования.
На рис. 1 приведены данные по определению активности N P T I I у
56 ISSN 0233-7l',57. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 4
асимметричных соматических гибридов М. sativa-\-M. varia (1 — конт-
рольное растение М. sativa; 2—5 — канамицинустойчивые гибридные
клоны). Анализ показал присутствие активности этого фермента у по-
лученных клеточных линий. Затем последние пассировали в течение
года на различных питательных средах. У линий 1, 3, 5 и 9, возникших
после слияния с облученными протопластами донора (300 Гр) , были
индуцированы эмбриоподобные структуры (на питательной среде В5 с
Рис. 2
монстрировало, что полосы гибридизации у родительских форм имеют
одинаковую молекулярную массу. Однако у гибридной линии 3, кроме
обычной для обоих родителей полосы гибридизации, появляется допол-
нительная полоса. На рис. 4 представлен анализ р Д Н К у асимметрич-
ных соматических гибридов: а — EcoRV-перевар Д Н К (1 — родитель-
ская линия М. varia; 2 — гибридное растение [5] М. sativa с облучен-
ной в дозе 300 Гр М. varia; 3 — гибридная клеточная линия [3] Λί.
sativa с облученной в дозе 300 Гр М. varia; 4 — родительская линия
М. sativa; 5 — родительская линия М. borealis 94; 6 — гибридная кле-
точная линия М. borealis с облученной в дозе 500 Гр М. Iupulina; 7 —
родительская линия М. Iupulina); б — EcoRI-перевар Д Н К . В качестве
зонда использовали 18S р Д Н К ; маркеров молекулярных масс — EeoRI-
перевар Д Н К фага лямбда.
Асимметричные соматические гибриды также были получены после
слияния мезофильных протопластов M. borealis с протопластами Λί,
Iupulinay полученными из канамицинустойчивых клеточных клонов,
трансформированных A. tumefaciens pRiA4, pGA472. Протопласты Λί.
Iupulina были облучены в дозе 500 Гр. В результате проведенных опы-
тов получены восемь клеточных линий, зеленеющих на свету в присут-
ствии 50 мг/л канамицинсульфата. Эти клеточные клоны не образовы-
вали побегов на испытанных питательных средах. В то ж е время они
также не образовывали и корней, хотя у исходного генотипа Λί. Iupu-
Hna в подобных условиях наблюдается активный ризогенез. На рис. 5
ISSN 0233-7667. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 4 57
0,5 мг /л кинетина, 40 мг /л аденинсульфата
в присутствии 50 мг/л канамицинсульфа-
та ) . После пассирования этих эмбриоподоб-
ных структур на безгормональных пита-
тельных средах у линии 5 образовывались
побеги, которые в дальнейшем укореня-
лись (рис. 2: а — регенерация растений;
б — р а с т у щ и е в асептических условиях со-
матические гибриды М. sativa+M. varia).
Количество хромосом (2 /г=70—72) у полученного растения было зна«
чительно выше, чем у обоих исходных форм ( 2 / г = 3 2 ) . Это подтверж-
дается данными рис. 3, где изображен хромосомный набор соматиче-
ского гибрида М. sativa+M. varia (2п=70—72).
Изучение рибосомных генов у родительских форм и гибридных ли-
ний 3 и 5 при помощи Д Н К - Д Н К гибридизации по Саузерну проде-
приведены данные по определению NPTII у асимметричных соматиче-
ских гибридов М. borealis-\-M. Iupiilina (1—6 — канамицинустойчивые
гибридные клоны).
Исследование рибосомных генов у родительских генотипов и гиб-
ридной линии 7 показало, что гибрид наследовал рибосомные гены от
обоих родителей (см. рис. 4) .
После слияния мезофильных протопластов М. saliva, сорт «Весе-
лоподолянская», с облученными мезофильными протопластами Μ. va-
ria, несущими ген устойчивости к канамицинсульфату, были отобраны
гибридные клеточные кло-
ны, которые, кроме устойчи-
вости к канамицинсульфату,
проявляли также способ-
ность к регенерации. У не-
которых из этих клонов уда-
лось индуцировать образо-
вание эмбриоподобных
структур, а у одного из кло-
нов (№ 5) были получены
нормализованные растения.
Можно предположить, что
Рис. 3 Рис. 4
гибридные клоны содержат в своем геноме гены М. varia, определя-
ющие регенерационную способность. Ранее аналогичные результаты по
переносу регенерационной способности были получены для асимметрич-
ных соматических гибридов томатов [17]. Проведенный хромосомный
анализ показал, что такой гибрид несет октоплоидный набор с некото-
рым числом дополнительных хромосом. К сожалению, у люцерны труд-
но дифференцировать хромосомы родителей, однако имеющиеся ре-
зультаты по асимметричной соматической гибридизации у видов рода
Nicotiana, а также между Nicotiana и Atropa [18, 19] демонстрируют
преимущественный отбор в таких комбинациях гибридов с удвоенным
набором хромосом реципиента и некоторым числом хромосом донора.
В наших экспериментах использовали родительские виды с тетраплоид-
ным числом хромосом 2п=32, что привело к получению гибрида с ок-
топлоидным набором с добавочным количеством хромосом донора. Его
морфология существенно отличается от обоих родителей. Так, большин-
ство листьев ненормальной редуцированной формы, сильно укорочен-
ные междоузлия, затрудненное корнеобразование в культуре in vitro.
Такой фенотип может являться результатом как определенной несовме-
стимости геномов реципиента и облученного донора, так, возможно, и
следствием длительного культивирования гибридных клеточных куль-
тур прежде чем удалось индуцировать регенерационные события.
С практической стороны более интересна вторая гибридная комби-
нация, полученная нами. Люцерна хмелевидная (М. Iupulina) способ-
на к самоопылению, что является очень полезным признаком с точки
зрения селекции люцерны на повышенную семенную продуктивность.
В то же время она совершенно не способна к скрещиванию с окульту-
58 ISSN 0233-7l',57. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 4
р е п н ы м и в и д а м и л ю ц е р н ы . Н а м у д а л о с ь в г и б р и д н о й к о м б и н а ц и и п о о
ле с л и я н и я м е з о ф и л ь н ы х п р о т о п л а с т о в M. borealis, л и н и я 9 4 , с о б л у -
ч е н н ы м и п р о т о п л а с т а м и М. lupulina, н е с у щ и м и г е н у с т о й ч и в о с т и к к а -
н а м и ц и н с у л ь ф а т у , о т о б р а т ь к л е т о ч н ы е л и н и и . Н е о б х о д и м о о т м е т и т ь ,
ч т о м о р ф о л о г и я п о л у ч а е м ы х к л о н о в б ы л а б о л е е п о х о ж а н а м о р ф о л о -
гию к л е т о ч н ы х л и н и й М. borealis. А с и м м е т р и ч н ы е с о м а т и ч е с к и е г и б -
р и д ы р а з в и в а л и с ь в в и д е з е л е н ы х к л е т о ч н ы х л и н и й б е з в с я к и х п р и з н а -
ков к о р н е о б р а з о в а н и я , ч т о х а р а к т е р н о д л я к л е т о ч н ы х л и н и й д о н о р а ,
т р а н с ф о р м и р о в а н н ы х pRiA4 с п л а з м и д о й pGA472. К с о ж а л е н и ю , р е г е -
н е р и р о в а т ь р а с т е н и я и з т а к и х г и б р и д н ы х
клеточных линий пока не удалось. , » f * г 3 $ $ &
Исследование рибосомных генов у
родительских фоом и полученных гиб-
] ^ J , . ( 'Xv
рндных клеточных линии между М. bo-
realis и М. lupulina показало, что эти ге- ...,:·..
ны наследуются от обоих партнеров у Р и с 5
асимметричных соматических гибридов.
Наши результаты подтверждают ранее
полученные данные о наследовании рибосомных генов у асимметричных
соматических гибридов между Ν. ρIumbaginifоIia и Atropa belladonna
[19] и N. plumbaginifolia и Λ\ sylvestris [18]. Появление новых полос
гибридизации рибосомных генов у асимметричных соматических г и б р и -
дов между М. sativa и М. varia может быть объяснено возникновением
новых классов рибосомных повторов у соматических гибридов. Это уже
отмечалось ранее у соматических гибридов между N. plumbaginifolia
и A. belladonna [20] .
Таким образом, нами разработаны м е т о д ы слияния п р о т о п л а с т о в
у рода Medicago с применением инактивации о д н о г о из п а р т н е р о в п р и
помощи гамма-облучения. Кроме того, п о л у ч е н н ы е н а м и р е г е н е р а н т ы
после слияния протопластов М. sativa и М. varia я в л я ю т с я п е р в ы м и
регенерировавшими асимметричными м е ж в и д о в ы м и с о м а т и ч е с к и м и
гибридами в р о д е Medicago.
Н а ш и р е з у л ь т а т ы п о а с и м м е т р и ч н о й с о м а т и ч е с к о й г и б р и д и з а ц и и
у в и д о в р о д а Medieago о т к р ы в а ю т н о в ы е в о з м о ж н о с т и в с е л е к ц и и э т и х
в а ж н ы х с е л ь с к о х о з я й с т в е н н ы х к у л ь т у р , п о з в о л я ю т п о л у ч а т ь НОВЫЙ ИС-
ХОДНЫЙ с е л е к ц и о н н ы й м а т е р и а л с п о л е з н ы м и г е н а м и , п е р е н е с е н н ы м и
из р о д о в и видов, у которых обычное с к р е щ и в а н и е о г р а н и ч е н н о и л и
вообще невозможно.
Р Е З Ю М Е
Одержані асиметричні соматичні гібриди між різними видами люцерни (Medicago sp.).
Як донорів використовували канамінинстінкі протопласти М. varia і М. lupulina.
У гібридній комбінації між M sativa та опроміненою (300 Гр) М. varia відібрано
13 канаміцинстійких клітинних клонів. У одного з них одержані рослини. Кількість
хромосом гібриду складала 2п = 70—72, шо значно більше, ніж у обох батьків — 2п =
= 32. Зроблено припущення, що здатність до регенерації одержаних гібридів перейшла
від опроміненого донора Λί. varia. У гібридній комбінації між М. borealis та опромі-
неною (500 Гр) М. lupulina відібрано вісім канаміцинстійких клітинних клонів. Аналіз
активності неоміцинфоефотрансферази та р Д Н К за допомогою блот-гібридизації по
Саузерну показав гібридну природу одержаних ліній в обох комбінаціях.
S u m m a r y
Interspecif ic somatic hybrids of Medicago have been obtained by «gamma-fus ion» . Ka-
narnycin res is tant p lan t s of M. varia and kanamycin res is tan t cal lus line of M. lupulina
were used as donors. M. sativa and Λί. borialis were used as recipients. Af ter fus ion of
gamma- i r rad ia ted (300 Gy) mesophyll p ro top las t s of M. varia with those of M. sativa,
13 kanamycin res is tant hybrid clones were selected. We could induce the format ion p lant
r egeneran t s f rom one of the clones. Chromosome number of regenera ted p lan t s w a s
ISSN 02.44-7057. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛР.ТКД. 1991. Т. 7. №> 4 59
70—72, thus differing from both the parents 2n = 32 and indicating asymmetric genome
constitution. Since the recipient genotype of Af. sativa was deficient for shoot morpho-
genesis in culture, we think that transfer of the regeneration ability from M. varia to
the hybrid takes place. After fusion of gamma-irradiated (500 Gy) callus protoplasts of
AT. Iupulina with mesophyll ones of Af. borealis, 8 kanamycin resistant clones were
selected. Biochemical analysis involved hybrids of both species combinations. Activity
of NPTII is detectable in hybrid plants as well as callus clones. Analysis of ribosomal
DNA of hybrids by Southern blot hybridization demonstrated the presence of species-
specific rDNA fragments of both parents.
СПИСОК Л И Т Е Р А Т У Р Ы
1. Teoule^ E., Daffee Y. Recherche d'une methode fiable de culture de protoplasten,
d'hybridisation somatique et de regeneration chez Meclicago / / Agronomie.— 1987 —
7, N 8.— P. 575—584.
2. Mitochondrial and chloroplast DNA analysis of interspecific somatic hybrids of a
Leguminosae: Medicago (alfalfa) / A. D'Hont, F. Quetier, E. Teoule, Y D a f f e e / /
Plant S c i . - 1987.—53, N 3 . — P . 237—242.
3. Gilmour D. M., Davey M. R., Cocking E. C. Isolation and culture of hete/okaryons
fo l lowing fusion of protoplasts from sexually compatible and sexually incompatible
Medicago s p e c i e s / / I b i d . — P . 263—270.
4. Damiani F., Pezzotti M., Arcioni S. Electric field mediated fusion of protoplasts of
Medicago sativa L. and Medicago arborea LJ/ J. Plant Physiol .— 1988.— 132, N 4.—
P. 474—479.
5. Dominant expression of a gene amplification-related herbicide resistance in Medicago
cell h y b r i d s / M . Deak, G. Donn, A. Feher, D. Dudits / / Plant Cell Rept.— 1988.—7,
N 3 . — P . 158—161.
6. Gilmour D., Davey M., Cocking E. C. Production of somatic hybrid tissues fo l lowing
chemical and electrical fusion of protoplasts from albino cell suspensions of Medica-
go sativa and Medicago borealis Ц Ibid.— 1989.—8, N 1.— P. 29—32.
7. Transformation of Medicago by Agrobacterium mediated gene t r a n s f e r / M . Deak,
J. B. Kiss, C. Koncz, D. Dudits.// Ibid.— 1986.— 5, N 1 .—P. 97—100.
8. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue culture // Physiol. Plant.— 1962.— 15, N 3 . — P . 473—497.
9. Gamborg O. L., Miller R. A., Ojima K. Nutrient requirements of suspension cultures
of soybean root c e l l s / / E x p . Cell. Res.— 1968.—50, N 1 .—P. 151—158.
10. New cloning vehicles for transformation of higher plants / G. An., B. D. Watson r
S. Stachel et a l . / / E M B O J.— 1985.—4, N 2 . — P . 277—284.
11. Free auxin level and inheritance of introduced markers in tobacco transformed by
binary vector based on A4Ri p l a s m i d / M . Ondrej, J. Eder, M. Hrouda et al. / / B i o l .
Plant.— 1989.—31, N 4 . — P . 286—291.
12. Кучу κ Η. В. Выделение и культивирование протопластов пяти видов семейства бо-
бовых/ / Физиология растений — 1989 — 36, № 4 — С . 821—824.
13. Fusion of plant protoplasts: A study using auxotrophic mutants of Nicotiana plumba-
ginifolia / I. Negrutiu, D. de Brouwer, S. W. Watts et a l . / /Theor . and Appl. Genet.—
1986.—- 72, N 2 , — P . 279—289.
14. The use of nuclear-encoded sequences to direct the light regulated synthesis and
transport of a foreign protein into plant chloroplasts / P. H. Schreier, E. A. Seftor,
J. Schell, H. J. B o h n e r t / / E M B O J.— 1985.—4, N 1 .—P. 25—32.
15. Southern Ε. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by
gel e lectrophoresis / /J . Мої. Biol.— 1975.—98, N 3 . — P . 503—517.
16. Dellaporta S. L., Wood /., Hicks J. B. A plant DNA minipreparation. Version I I / /
Plant Мої. Biol. Rept.— 1983.— 1, N 4 . — P . 19—21.
17. Wigbrandi G., Vos G. G.-MKorneef H. Transfer of regeneration capacity from
Lycopersicon peruvianum to Lycopersicon esculentum by protoplast fusion // Plant
Cell, Tissue and Organ. Culture.— 1988.— 12, N 2 . — P . 193—196.
18. Intrageneric asymmetric hybrids between Nicotiana plumbaginifolia and Nicotiana
sylvestris obtained by «gamma-fusion» /1 . Famelaer, Y. Y. Gleba, V. A. Sidorov et
a l . / / P l a n t S c i . - 1989.—61, N 2 . — P . 105—117.
19. Intergeneric asymmetric hybrids between Nicotiana plumbaginifolia and Atropa bel-
ladonna obtained, by «gamma-fusion» / Y. Y. Gleba, S. Hinnisdaels, V. A. Sidorov et
al. / / Theor. and Appl. Genet.— 1988.—76, N 3 , — P . 760—766.
20. Borisyuk N. V., Momot V. P., Gleba Υ. Y. Novel c lass of rDNA repeat units in soma-
tic hybrids between Nicotiana and Atropa // Ibid.— N 1 — P . 108—112.
Ин-т клеточ. биологии и генет. инженерии АН УССР, Получено 14.01.91
Киев
60 ISSN 0233-7l',57. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 4
|