Структурные характеристики областей интеграции ДНК вируса ядерного полиэдроза и днк клетки-хозяина в геноме большой вощинной моли

Структурные характеристики областей интеграции ДНК вируса ядерного полиэдроза и днк клетки-хозяина в геноме большой вощинной моли

Исследованы некоторые структурные характеристики мест связывания клеточных и вирусных последовательностей в ДНК большой вощинной моли (БВМ) пражской линии и в геноме вируса ядерного полиэдроза (ВЯН) БВМ. Показана возможность ковалентной связи генома вируса с геномом БВМ. Исследование кинетических и...

Full description

Saved in:
Bibliographic Details
Published in:Биополимеры и клетка
Date:1990
Main Authors: Мирюта, Н.Ю., Строковская, Л.И., Скуратовская, И.Н.
Format: Article
Language:Russian
Published: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1990
Subjects:
Структура и функции биополимеров
Online Access:https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153612
Tags: Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:Структурные характеристики областей интеграции ДНК вируса ядерного полиэдроза и днк клетки-хозяина в геноме большой вощинной моли / Н.Ю. Мирюта, Л.И. Строковская, И.Н. Скуратовская // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 4. — С. 51-59. — Бібліогр.: 16 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-153612
record_format dspace
spelling Мирюта, Н.Ю.
Строковская, Л.И.
Скуратовская, И.Н.
2019-06-14T11:23:37Z
2019-06-14T11:23:37Z
1990
Структурные характеристики областей интеграции ДНК вируса ядерного полиэдроза и днк клетки-хозяина в геноме большой вощинной моли / Н.Ю. Мирюта, Л.И. Строковская, И.Н. Скуратовская // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 4. — С. 51-59. — Бібліогр.: 16 назв. — рос.
0233-7657
DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00027D
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153612
578.841:577.113:578.23
Исследованы некоторые структурные характеристики мест связывания клеточных и вирусных последовательностей в ДНК большой вощинной моли (БВМ) пражской линии и в геноме вируса ядерного полиэдроза (ВЯН) БВМ. Показана возможность ковалентной связи генома вируса с геномом БВМ. Исследование кинетических и термических фракций ДНК БВМ пражской линии с различными молекулярными массами методами молекулярной гибридизации позволило локализовать области, содержащие участки гомологии вирусной и клеточной ДНК в вирусном геноме и исследовать области вирусной ДНК, прилегающие к клеточной. На основании проведенных исследований предложена модель интеграции геномов ВЯЛ БВМ и БВМ пражской линии.
Досліджено деякі структурні характеристики місць зв’язування клітинних і вірусних послідовностей у ДНК великої вощинної молі (БВМ) празької лінії і в геномі вірусу ядерного поліедрозу (ВЯП) БВМ. Показана можливість ковалентного зв’язку геному вірусу з геномом БВМ. Дослідження кінетичних і термічних фракцій ДНК БВМ празької лінії з різними молекулярними масами методами молекулярної гібридизації дозволило локалізувати області, що містять ділянки гомології вірусної і клітинної ДНК у вірусному геномі і досліджувати області вірусної ДНК, прилеглі до клітинної. На підставі проведених досліджень запропоновано модель інтеграції геномів ВЯП БВМ і БВМ празької лінії.
The physical state of the viral genome in the cell and certain structural characteristics of binding sites of virus and cell sequences in Gallerla mellonella DNA and NPV DNA have been investigated. The possibility of covalent bond between genome DNAs of virus and cell is shown. The studies of kinetic and thermal fractions obtained from G. mellonella larvae of the Prague stock for DNA with different weights have permitted localizing NPV DNA regions containing homology regions, showing linkage between virus and cell DNA in the cell genome, investigating virus DNA regions adjacent to cell DNA. This DNA proved to contain homology regions and neighbouring virus DNA fragments. A model of integration of NPV genome with G. mellonella larvae genome has been suggested.
ru
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
Биополимеры и клетка
Структура и функции биополимеров
Структурные характеристики областей интеграции ДНК вируса ядерного полиэдроза и днк клетки-хозяина в геноме большой вощинной моли
Структурні характеристики областей інтеграції ДНК вірусу ядерного поліедрозу і ДНК клітини-хазяїна в геномі великий вощинної молі
Structural characteristics of the integration regions of NPV DNA and host cell in the Galleria mellonella genome
Article
published earlier
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
title Структурные характеристики областей интеграции ДНК вируса ядерного полиэдроза и днк клетки-хозяина в геноме большой вощинной моли
spellingShingle Структурные характеристики областей интеграции ДНК вируса ядерного полиэдроза и днк клетки-хозяина в геноме большой вощинной моли
Мирюта, Н.Ю.
Строковская, Л.И.
Скуратовская, И.Н.
Структура и функции биополимеров
title_short Структурные характеристики областей интеграции ДНК вируса ядерного полиэдроза и днк клетки-хозяина в геноме большой вощинной моли
title_full Структурные характеристики областей интеграции ДНК вируса ядерного полиэдроза и днк клетки-хозяина в геноме большой вощинной моли
title_fullStr Структурные характеристики областей интеграции ДНК вируса ядерного полиэдроза и днк клетки-хозяина в геноме большой вощинной моли
title_full_unstemmed Структурные характеристики областей интеграции ДНК вируса ядерного полиэдроза и днк клетки-хозяина в геноме большой вощинной моли
title_sort структурные характеристики областей интеграции днк вируса ядерного полиэдроза и днк клетки-хозяина в геноме большой вощинной моли
author Мирюта, Н.Ю.
Строковская, Л.И.
Скуратовская, И.Н.
author_facet Мирюта, Н.Ю.
Строковская, Л.И.
Скуратовская, И.Н.
topic Структура и функции биополимеров
topic_facet Структура и функции биополимеров
publishDate 1990
language Russian
container_title Биополимеры и клетка
publisher Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
format Article
title_alt Структурні характеристики областей інтеграції ДНК вірусу ядерного поліедрозу і ДНК клітини-хазяїна в геномі великий вощинної молі
Structural characteristics of the integration regions of NPV DNA and host cell in the Galleria mellonella genome
description Исследованы некоторые структурные характеристики мест связывания клеточных и вирусных последовательностей в ДНК большой вощинной моли (БВМ) пражской линии и в геноме вируса ядерного полиэдроза (ВЯН) БВМ. Показана возможность ковалентной связи генома вируса с геномом БВМ. Исследование кинетических и термических фракций ДНК БВМ пражской линии с различными молекулярными массами методами молекулярной гибридизации позволило локализовать области, содержащие участки гомологии вирусной и клеточной ДНК в вирусном геноме и исследовать области вирусной ДНК, прилегающие к клеточной. На основании проведенных исследований предложена модель интеграции геномов ВЯЛ БВМ и БВМ пражской линии. Досліджено деякі структурні характеристики місць зв’язування клітинних і вірусних послідовностей у ДНК великої вощинної молі (БВМ) празької лінії і в геномі вірусу ядерного поліедрозу (ВЯП) БВМ. Показана можливість ковалентного зв’язку геному вірусу з геномом БВМ. Дослідження кінетичних і термічних фракцій ДНК БВМ празької лінії з різними молекулярними масами методами молекулярної гібридизації дозволило локалізувати області, що містять ділянки гомології вірусної і клітинної ДНК у вірусному геномі і досліджувати області вірусної ДНК, прилеглі до клітинної. На підставі проведених досліджень запропоновано модель інтеграції геномів ВЯП БВМ і БВМ празької лінії. The physical state of the viral genome in the cell and certain structural characteristics of binding sites of virus and cell sequences in Gallerla mellonella DNA and NPV DNA have been investigated. The possibility of covalent bond between genome DNAs of virus and cell is shown. The studies of kinetic and thermal fractions obtained from G. mellonella larvae of the Prague stock for DNA with different weights have permitted localizing NPV DNA regions containing homology regions, showing linkage between virus and cell DNA in the cell genome, investigating virus DNA regions adjacent to cell DNA. This DNA proved to contain homology regions and neighbouring virus DNA fragments. A model of integration of NPV genome with G. mellonella larvae genome has been suggested.
issn 0233-7657
url https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153612
citation_txt Структурные характеристики областей интеграции ДНК вируса ядерного полиэдроза и днк клетки-хозяина в геноме большой вощинной моли / Н.Ю. Мирюта, Л.И. Строковская, И.Н. Скуратовская // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 4. — С. 51-59. — Бібліогр.: 16 назв. — рос.
work_keys_str_mv AT mirûtanû strukturnyeharakteristikioblasteiintegraciidnkvirusaâdernogopoliédrozaidnkkletkihozâinavgenomebolʹšoivoŝinnoimoli
AT strokovskaâli strukturnyeharakteristikioblasteiintegraciidnkvirusaâdernogopoliédrozaidnkkletkihozâinavgenomebolʹšoivoŝinnoimoli
AT skuratovskaâin strukturnyeharakteristikioblasteiintegraciidnkvirusaâdernogopoliédrozaidnkkletkihozâinavgenomebolʹšoivoŝinnoimoli
AT mirûtanû strukturníharakteristikioblasteiíntegracíídnkvírusuâdernogopolíedrozuídnkklítinihazâínavgenomívelikiivoŝinnoímolí
AT strokovskaâli strukturníharakteristikioblasteiíntegracíídnkvírusuâdernogopolíedrozuídnkklítinihazâínavgenomívelikiivoŝinnoímolí
AT skuratovskaâin strukturníharakteristikioblasteiíntegracíídnkvírusuâdernogopolíedrozuídnkklítinihazâínavgenomívelikiivoŝinnoímolí
AT mirûtanû structuralcharacteristicsoftheintegrationregionsofnpvdnaandhostcellinthegalleriamellonellagenome
AT strokovskaâli structuralcharacteristicsoftheintegrationregionsofnpvdnaandhostcellinthegalleriamellonellagenome
AT skuratovskaâin structuralcharacteristicsoftheintegrationregionsofnpvdnaandhostcellinthegalleriamellonellagenome
first_indexed 2025-11-27T05:54:42Z
last_indexed 2025-11-27T05:54:42Z
_version_ 1850803527471857664
fulltext СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Лазуркин Ю. С. Молекулярное плавление Д Н К и эффект тонкой структуры кривых плавления//Молекуляр. биология.— 1977.— 11, № 6 . — С. 1311 —1324. 2. Fine structure of DNA melting curves /Yu. L. Lyubchenko, Μ. D. Frank-Kamenetskii, Α. V. Vologodskii et al. // Biopolymers.— 1976.— 15, N 6 .—P. 1019—1036. 3. Wada A., Yabuki S., Husimi Y. Fine structure in the thermal denaturation of DNA: high temperature resolution spectrophotometry s tud ies / /Cr i t . Rev. Biochem.— 1980.— 9, N 2.— P. 87—144. 4 Wartell R. MBenight A. S. Thermal denaturation of DNA molecules: a comparison of theory with exper iment / /Phys . Repts.— 1985,— 126, N 2 — P . 67—107. 5. Vitek A., Reddy C. R., Pivec L. Numerical analysis of absorption curves of a mul- tiphase shape by a computer // Biochim. et biophys. acta — 1974 —353, N 3.— P. 385—391. 6. Blake R. D., Lefoley S. G. Spectral analysis of high resolution direct-derivative mel- t ing curves of DNA for instantaneous and base composi t ion/ /Ibid.— 1978.—518, N 2 — P. 233—246. 7. Pavlov V. MLyubchenko Yu. L. A new method for recording of DNA differential melting curves /'/ Biopolymers.— 1978.— 17, N 4.— P. 795—798. 8. High-resolution thermal denaturation of DNA. 1. Theoretical and practical conside- rations for the resolution of thermal subtransition / A. T. Ansevin, D. L. Vizard, B. W. Brown, J. McConathy/ / Ib id .— 1976.— 15, N 1.—P. 153—174. 9. Gabarro J. Numerical analysis of thermal denaturation of nucleic ac ids / /Analy t . Biochem.— 1978 — 91, N 2 .—P. 309—322. 10. Волков Ε. А. Численные методы.— Μ. : Наука, 1982.— 254 с. 11. Gruenwedel D. W. Salt effects on the denaturation of DNA//Biochim. et biophys. acta.— 1974.—340, N 1.—P. 16—30. 12. Карапет ян Α. TВардеванян Π. О., Франк-Каменецкий Μ. Д. Влияние концентра- ции ионов Na+ на теплоту перехода спираль—клубок // Биополимеры и клетка.— 1989.—5, № 5.—С. 31—37. Ереван, гос. ун-т Получено 29.09.89 Кировакан. гос. пед. ин-т УДК 578.841:577.113:578.23 © Н. Ю. Мирюта, Л. И. Строковская, И. Н. Скуратовская, 1990 СТРУКТУРНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ОБЛАСТЕЙ ИНТЕГРАЦИИ ДНК ВИРУСА ЯДЕРНОГО ПОЛИЭДРОЗА И ДНК КЛЕТКИ-ХОЗЯИНА В ГЕНОМЕ БОЛЬШОЙ ВОЩИННОЙ МОЛИ Исследованы некоторые структурные характеристики мест связывания клеточных и ви- русных последовательностей в ДНК большой вощинной моли (БВМ) пражской линии и β геноме вируса ядерного полиэдроза (ВЯН) БВМ. Показана возможность кова- лентной связи генома вируса с геномом БВМ. Исследование кинетических и термических фракций ДНК БВМ пражской линии с различными молекулярными массами методами молекулярной гибридизации позволило локализовать области, содержащие участки гомологии вирусной и клеточной ДНК в вирусном геноме и исследовать области вирус- ной ДНК, прилегающие к клеточной. На основании проведенных исследований предло- жена модель интеграции геномов ВЯЛ БВМ и БВМ пражской линии. Введение. Вирусоносительство широко распространено у чешуекрылых насекомых и проявляется под влиянием физических, химических и био- логических факторов. Различные популяции большой вощинной моли (БВМ) отличаются по способности к активации в них латентного ви- руса ядерного полиэдроза (ВЯП) БВМ. У БВМ пражской линии, на- пример, не наблюдается ни спонтанный, ни индуцированный ядерный полиэдроз. Предполагалось, что у нее нет латентного вируса. Предпо- ложение о носительстве вирусных геномов этими насекомыми возник- ло, в частности, для объяснения результатов экспериментов по зараже- нию насекомых БВМ пражской линии чужеродными ВЯП. При этом через несколько пассажей образовывались полиэдры, по форме харак- терные для ВЯП Б В М [1]. Продолжая начатые исследования [2], в этой работе мы изучали физическое состояние вирусного генома в клет- ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1990. Т. б. № 4 4 * 51 ке и некоторые структурные характеристики нуклеотидных последова- тельностей, окружающих стыки вирусной и клеточной Д Н К в геномах клетки и вируса. Материалы и методы. В работе использовали Д Н К личинок и грены БВМ праж- ской линии и Д Н К ВЯП БВМ штамма Ml , описанного в работе [3]. Суперспиральную Д Н К ВЯП БВМ получали центрифугированием лизата в градиенте плотности хлорис- того цезия с бромистым этидием. Высокополимерную клеточную Д Н К выделяли из грены или ядер личинок БВМ фенольно-детергентным методом. Для построения физической карты генома ВЯП БВМ использовали метод двойной переварки рестриктазами SmaI, BamHI, HindIII. EcoRI [4, 5]. Расположение фрагмен- тов карты корректировали с помощью гибридизации с индивидуальными клонирован- ными фрагментами ВЯП БВМ в качестве зондов. 3 2 Р-ДНК с удельной активностью IO7—4-Ю8 имп·мин - 1 ·мкг - 1 получали методом ник-трансляции [6]. Препараты клеточной Д Н К фрагментировали с помощью ультразвука в течение 0,5; 2; 15 мин при мощности 150 Вт и частоте 20 кГц. Молекулярную массу оценивали с помощью метода электронной микроскопии. Полученные препараты фракциони- ровали. Кинетические фракции (фракция, обогащенная повторами, CoT1-eiCljS, и фракция, обогащенная уникальной Д Н К С0Г:>1,5) получали, отжигая денатурированную Д Н К в 0,12 M натрий-фосфатном буфере до C0T= 1,5 и фракционируя ее на оксиапатите цри 60 °С [7]. Аликвоту фракции, обогащенной повторами, обрабатывали 57-нуклеазой при 37 °С в течение 45 мин [8]. Термическое фракционирование клеточной Д Н К проводили в 0,06 M натрий-фос- фатном буфере, ступенчато повышая температуру. Количественное содержание вирусной Д Н К во фракциях клеточной Д Н К опреде- ляли с помощью методов кинетики реассоциации и точечной гибридизации [9, 10]. Количество вирусных эквивалентов в геноме клетки оценивали с помощью метода ки- ьетики реассоциации по формуле где M — размер генома клетки; Mp—размер генома вируса; С — концентрация кле- точной ДНК; Cp — концентрация меченой вирусной ДНК; а — поправка, определяемая из реконструкционного опыта; t\/2 — время реассоциации 5 0 % меченой вирусной Д Н К В Присутствии исследуемой клеточной ДНК; t\/2p—то же в присутствии тимусной Д Н К теленка (отрицательный контроль) [9]. При использовании метода гибридизации в растворе [9] во время исследования термических фракций клеточной Д Н К подбирали пары значений Ar,, гг, наиболее соответствующие экспериментальным кривым (і — номер фракции; Xi—доля вирусного генома, присутствующая во фракции і; Гі — мо- ля ртгэе отношение вирусных нуклеотидных последовательностей во фракции і к мече- ной вирусной Д Н К ) , с помощью формулы, приведенной в [ П ] : при условии нормировки ΣΧί = 1. Для исследования того, какие фрагменты вирусной Д Н К присутствуют в изучаемых фракциях клеточной ДНК, использовали метод гибри- дизации на фильтрах [12]. Результаты и обсуждение. П о с т р о е н и е ф и з и ч е с к о й к а р - т ы г е н о м а ВЯП БВМ. Физическая карта была построена методом одиночных и двойных переварок с использованием рестриктаз SmaIj HindIII, EcoRI н а о с н о в е и м е ю щ е й с я к а р т ы п о SrnaI и BamHI [ 4 ] . Использование алгоритма, предложенного Фитчем [5], позволило вы- брать вариант карты с наименьшими среднеквадратическими погреш- ностями. На рис. 1 представлен вариант карты, скорректированный с помощью гибридизации на фильтрах и использованием в качестве зон- дов ряда BamHI и EcoRI-фрагментов. О б н а р у ж е н и е в и р у с н ы х н у к л е о т и д н ы х п о с л е д о - в а т е л ь н о с т е й в г е н о м е БВМ. Для обнаружения и оценки ко- личества вирусных нуклеотидных последовательностей в препаратах клеточной Д Н К БВМ были проведены опыты по кинетике реассоциа- 52 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1990. Т. б. № 4 4* 51 ции высокомеченной Д Н К ВЯП БВМ в присутствии тимусной Д Н К (отрицательный контроль), тимусной и известного количества вирусной Д Н К ( положительный контроль) и Д Н К пражской линии. Результаты одного из экспериментов приведены на рис. 2. Статистическая обработ- ка значений количества вирусных эквивалентов на геном клетки, полу- ченных в 10 экспериментах, показала, что на геном БВМ пражской, линии приходится 2 ,0+1 ,0 геном ВЯП БВМ. Методом блот-гибридизации по Саузерну также показано присут- ствие вирусспецифических последовательностей. Отсутствие некоторых фрагментов вирусной Д Н К можно объяснить деградацией части фраг- ментов клеточной Д Н К при выделении, так как способы выделения В S C W f i Ъй Sf < * JMM. ScoRl MP*. * M G j J и ш ш hrt hr2 hr9 Jirif brs ABHVfit * t C 4 B i BamHI , Л , B ι · Ρ ι C , /7 , SmaI I 1 , 1 1 L I 1 1 I I I 0 20 40 60 80 100 % Рис. I. Физическая карта генома ВЯП БВМ. Утолщенными линиями обозначены облас- ти, содержащие гомологичные клеточным последовательности Fig. I. Physical шар of the Galleria mellonella NPV genome. Regions containing homo- logy sequences are indicated by open boxes препаратов вирусной и клеточной Д Н К отличаются. Однако тот факт, что появился ряд новых полос, в том числе соответствующих более крупным фрагментам, чем самый большой фрагмент вирусной Д Н К (рис. 3), позволяет нам интерпретировать эти данные следующим об- разом. Сравнение радиоавтографов, полученных при гибридизации про- дуктов гидролиза BamHI и EcoRI клеточной и вирусной Д Н К с 32P- Д Н К ВЯП БВМ, продемонстрировало, что в препарате клеточной Д Н К наблюдались некоторые отличия по отношению к вирусной Д Н К : не обнаруживаются полосы, соответствующие EcoRI-Ay Dy Fj Hy Iy N, О, Q- и BatnHI-Ay Cy Dy Ey Fy Gy Я-фрагментам, и появились новые полосы (рис. 3). Гибридизация з ф - Д Н К ВЯП БВМ с BamHI- и ^ ^ / - ф р а г - ментами тимусной Д Н К не наблюдалась, проведен контроль на полно- ту переварки (данные не приведены). Полученные данные могут сви- детельствовать или об интеграции вирусной и клеточной Д Н К в геноме БВМ, или о модификации вирусных нуклеотидных последовательностей в клетке. Чтобы разобраться в этом вопросе, мы провели эксперимен- ты с целью получения фракций клеточной Д Н К , содержащих стыки вирусных и клеточных нуклеотидных последовательностей. С т р у к т у р н ы е х а р а к т е р и с т и к и о б л а с т е й и н т е г р а - ц и и в и р у с н о й и к л е т о ч н о й Д Н К в г е н о м а х в и р у с а и к л е т к и . Исходя из того, что в зависимости от времени фрагмента- ции ультразвуком можно выделить несвязанные между собой фрагмен- ты вирусной и клеточной Д Н К и фрагменты, которые с большей веро- ятностью содержат и вирусную, и клеточную Д Н К [13], получили пре- параты клеточной Д Н К с фрагментами различной молекулярной мас- сы (· IO6): 0,04—0,4 (M3), 0,2—1,0 (M2) и 0,4—1,5 с отдельными моле- кулами 3—5 (Μι). Исследование кинетических фракций в препаратах M3, M2, M i по- казало, что при увеличении размера молекул увеличивается доля фрак- ции Д Н К , обогащенной повторами, увеличивается также содержание вирусной Д Н К в ней (0,10; 0,35; 0,87 вирусного генома). Обработанная 5У-нуклеазой эта обогащенная повторами фракция содержит 0,10; 0,10; ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1990. Т. б. № 4 4* 51 Рис. 1. Физическая карта генома ВЯП БВМ. Утолщенными линиями обозначены облас- ти, содержащие гомологичные клеточным последовательности Fig. 1. Physical шар of the Galleria mellonella NPV genome. Regions containing homo- logy sequences are indicated by open boxes 0,04 генома В Я П в M3 , M2 , Mi соответственно (рис. 1). Из этих резуль- татов видно, что в Мз практически все повторяющиеся последователь- ности не связаны с уникальными последовательностями вирусной Д Н К . Таким образом, вирусные и клеточные нуклеотидные последовательно- сти препарата Д Н К M3 распределяются независимо друг от друга и могут служить контролем по этому признаку. Количест- венное содержание Д Н К вируса во фракциях клеточ- ной Д Н К , обогащенных по- вторами, в Μι, М2, M3 ука- зывает на то, что в случае интеграции вирусных и кле- точных последовательностей и в вирусном, и в клеточном геномах образуются, скорее всего, структуры с переме- жающимися вирусными и клеточными последователь- ностями, так как макси- Рис. 2. Обнаружение вирусных нуклеотидных последовательностей в клеточной Д Н К БВМ: кинетика реассоциации 3 2 Р-ДНК ВЯП БВМ (0,02 мкг/мл) в присутствии тимус- ной Д Н К (180 мкг/мл) (I)1 Д Н К БВМ пражской линии (180 мкг/мл) (2), тимусной Д Н К (180 мкг/мл) и Д Н К ВЯП БВМ (0,25 мкг/мл) (3) Fig. 2. Detection of viral nucleotide sequences in G. mellonella cell DNA preparation : reassociation kinetics of 32-P-labelled G. melonella NPV DNA (0.02 μ£/πι1) in the pre- sence of calf thymus DNA (180 μβ/ηιΐ (I)1 G. mellonella DNA of Prague stock (180 μg/ml (2), calf thymus DNA (180 μg/ml) and G. mellonella NPV DNA (0.25 μg/ml (3) Рис. 3. Исследование вирусных нуклеотидных последовательностей в препаратах Д Н К БВМ пражской линии: а — гибридизация по Саузерну 3 2 P-ДНК ВЯП БВМ (0,1 мкг) с Д Н К БВМ (15 мкг), обработанной EcoRI ( / ) ; Д Н К ВЯП БВМ (10 нг), обработан- ной EcoRI (2); Д Н К ВЯП БВМ (Юнг) , обработанной BamHI (3); Д Н К БВМ (15 мкг), обработанной BamHI (4), Д Н К ВЯП БВМ (2 нг), обработанной BamHI (5); б —схе- матическое представление этого радиоавтографа. Гибридизация 3 2 Р-ДНК ВЯП БВМ с Д Н К тимуса теленка, обработанной EcoRI и BamHI1 не наблюдалась Fig. 3. Research of virus nucleotide sequences in G. mellonella cell DNA preparation: a — Southern hybridization of 32P-Iabelled G. mellonella NPV DNA (0.1 μg) with G. mellonella DNA (15 μg) cleaved by EeoRI (I), G. mellonella NPV DNA (10 ng) clea- ved by EcoRl (2), G. mellonela NPV DNA (10 ng) cleaved by BamHl (3), G. mellonella DNA (15 μ^) cleaved by BamHl (4), G. mellonella NPV DNA (2 ng) cleaved by BamHl (S)1 б — scheme of this radioautograph. Hybridization of 32P-Iabelled G. mellonella NPV DNA with calf thymus DNA cleaved by EeoRl and BamHl has not been detected мальный размер фрагментов в M2 и M i (1,0—1,5)-IO6 (иногда в M1 (3—5)-IO6) при количестве полных копий вирусного генома в клеточ- ном 2—3 (размер вирусного генома 100-IO6). Поэтому, вероятно, с клеточными нуклеотидными последовательностями перемежаются не- полные вирусные геномы. Поскольку геном вируса содержит повторяющиеся последователь- ности (рис. 4) и учитывая возможность распределения уникальных ви- русных последовательностей во фракцию с 10 _ 2 <сС 0 Г<;1,5 [14], мы ло- 5 4 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1990. Т. б. № 4 4* 51 кализовали на карте генома В Я П области, содержащие повторяющиеся последовательности, используя в качестве зонда фракцию клеточной Д Н К , обогащенную повторами, обработанную SZ-нуклеазой. В опытах по гибридизации этого зонда с продуктами гидролиза вирусной Д Н К HindIII обнаружена гибридизация с HindIII-B, D1 E1 F1 G1 I1 M1 О. И з этих опытов и количественных исследований, приведенных выше, следу- ет, что эти HindIII-фрагменты содержат вирусные нуклеотидные после- довательности, вероятно, гомологичные клеточным и представляющие Рис. 4. Распределение клеточной (а) и вирусной (б) ДНК по кинетическим фракциям клеточной ДНК БВМ (/ — ДНК с С0Т> 1,5; 2 — ДНК с С 0 Г < 1 , 5 ; 3 — ДНК с C j C <1 ,5 , обработанная SZ-нуклеазой): / — Д Н К Mi (обработанная ультразвуком (УЗ) в течение 0,5 мин); II — ДНК M2 (обработанная УЗ в течние 2 мин); III — Д Н К M3 (обработанная УЗ в течение 15 мин) Fig. 4. Distribution of the cell (a) and virus (6) DNA on kinetic G. mellonella DNA fractions ( / - D N A with C 0 ^ 1.5, 2 — DNA with С 0 Г < 1 . 5 , 3 — the latest one clea- ved by Sl nuclease) I—G. mellonella DNA ultrasonicated through 0.5 minutes (Mi), II — G. mellonella DNA ultrasonicated through 2 minutes (M2), III—G. mellonella DNA ultrasonicated through 15 minutes (M3) Рис. 5. Диаграммы распределения клеточной (а) и вирусной (б) ДНК по термическим фракциям: / — ДНК M1; / / — ДНК M2; / / / — ДНК M3 Fig. 5. Distribution diagrams of the cell (a) and virus (6) DNA on thermal G. mello- nella DNA fractions: / - D N A M b / / - D N A M2, III — DNA M3 собой, по крайней мере частично, повторы. Сопоставляя полученные ре- зультаты с физической картой генома В Я П Б В М (рис. 1), можно ска- зать, что в вирусном геноме существует несколько областей, гомоло- гичных клеточным последовательностям. Эти области содержат части перечисленных фрагментов Iirl — HindIII-E; hr2 — HindIII-B; Zir3 — HindIII-G1 D; hn —HindIII-F, I1 Hr5-HindIII-O1 M ( р и с . 1 ) . Клеточную Д Н К Б В М фракционировали т а к ж е по нуклеотидному составу с помощью термического фракционирования. Известно, что ви- русная Д Н К элюирует при термическом фракционировании в относи- тельно узком интервале температур по сравнению с клеточной [15]. Профиль распределения тотальной Д Н К по термическим фракциям при изменении M в наших экспериментах практически не изменился (рис. 5) . Эксперименты по кинетике реассоциации 3 2 Р - Д Н К В Я П Б В М в присутствии Д Н К термических фракций позволили оценить парамет- ры Xi и Ti для фракций препаратов Mu M2f M3 при условии, что в клетке присутствует П О Л Н Ы Й И Л И ПОЧТИ П О Л Н Ы Й геном вируса ( 2 Х г = 1 ) . Н а рис. 5, б приведены диаграммы распределения долей вирусных гено- мов, содержащихся в термических фракциях препаратов M b M2, M3. Распределение вирусных нуклеотидных последовательностей в препара- тах клеточной Д Н К изменилось с изменением молекулярной массы с M3 до Mi: изменилось количество фракций, содержащих вирусные по- следовательности в Mi и M2 по сравнению с M3, изменилось количест- венное распределение вирусной Д Н К по фракциям. Исследование ко- 5 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1990. Т. б. № 4 4* 51 личества и перемещения «новых» вируссодержащих фракций, а т акже количественного перераспределения вирусных нуклеотидных последова- тельностей между ними в препаратах клеточной Д Н К M i и M2 по Рис. 6. Обнаружение фрагментов вирусной ДНК, гибридизующихся с Д Н К фракции 95(1) в препарате M b которая не содержит вирусной Д Н К в M3: денситограммы ра- диоавтографов, полученных при гибридизации 3 2 Р-ДНК ВЯП БВМ (а) и 3 2 Р-ДНК фракции 95 (1) (б) с Д Н К ВЯП БВМ, обработанной HindIII Fig. 6. Detection of virus DNA fragments hybridized with 95(7) DNA fraction in Mi preparation which contains no virus DNA in M3 : densitograms of radioautograp'hs ob- tained under hybridization of 32P-Iabelled G. mellonella NPV DNA (a) and 32P-Iabelled 95 (1) cell DNA fraction (6) with G. mellonella NPV DNA cleaved by HindIII сравнению с M3 позволяет предположить, что, вероятно, обнаружена ковалентная связь вирусной Д Н К с несколькими областями клеточной Д Н К , которые характеризуются температурами плавления 77; 89— 95 0C. Фракции 89 °С для M i и 92 0C для M 2 содержат около 30 % ви- 56 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1990. Т. б. № 4 4* 51 русного генома, остальные из перечисленных фракций содержат 1,5— 2 % вирусного генома, кроме фракции 95(2) , представляющей собой Д Н К , не расплавившуюся при 95 °С в 0,06 M фосфатном буфере, ко- торая содержит в Mi около 16 % вирусного генома (рис. 5) . Д л я исследования вирусных нуклеотидных последовательностей, прилегающих к клеточной Д Н К , гибридизовали термические фракции клеточной Д Н К (в качестве зонда) с # т ^ / / / - ф р а г м е н т а м и Д Н К ВЯП БВМ. Во фракциях 89—95 °С в M i и M2 обнаружены, например, ви- русные нуклеотидные последовательности, входящие в области гомо- логии hr2 и Hr3 и прилегающие к HindIII-A1 J (рис. 6). Сопоставление Рис. 7. Выявление области числа стыков вирус- ных и повторяющихся клеточных последова- тельностей Д Н К (я), наиболее соответствую- щих экспериментальным данным: теоретиче- ская зависимость количества вирусной ДНК, перешедшей во фракцию клеточной ДНК, обо- гащенную повторами, при увеличении разме- ров молекул с M3 до Mi для фрагментов Д Н К размером (1—5) · IO6, предположительно со- держащих участки (0,75—4)-IO6 последова- тельностей вирусной Д Н К (Λ 2), для фрагментов размером до 1-Ю6 , содержащих уча- стки (0,5—0,75)-IO6 последовательностей вирусной Д Н К (2, 3). Пересечение теорети- ческих линий с экспериментальными (4, 5) позволяет оценить область наиболее веро- ятных значений числа стыков Fig. 7. Determination of the number of linking region (n) of virus and repeated cell nucleotide sequences corresponding to the greatest extent to experimental data: theore- tical dependence of the quantity of virus DNA moved into repeat-rich cell fraction with the growth of the fragment molecular sizes from M3 to Mi for DNA fragments with si- zes of 1-5 MDa possibly containing sequences of virus DNA of 0.75-4 MDa (1, 2), for DNA fragments with sizes to 1 MDa containing 0.5-0.75 MDa of virus nucleotide sequ- ences (2, 3). Intersection of theoretical lines with experimental ones (4, 5) allows esti- mat ing the region of the most probable η values результатов гибридизации с картой вирусного генома позволило прий- ти к следующим выводам. Согласно правилу, по которому первичная интеграция происходит по областям с близким нуклеотидным составом [16], по крайней мере часть каждой из пяти областей, содержащих области гомологии, близка по нуклеотидному составу фракциям, соот- ветствующим 89, 92 °С. Если учесть, что эта фракция содержит около 30 % вирусного генома, то можно допустить возможность связи вирус- ных и клеточных последовательностей по всем областям гомологии в различных сайтах с соответствующим составом, а, возможно, и по дру- гим последовательностям, расположенным недалеко от областей гомо- логии. Часть этих областей соответствует по составу фракции 77 °С, фракциям 83 и 95(1) °С соответствуют части всех областей гомологии. Фракция 95(2) в препаратах M2 и M3 содержит 2—3 % вирусного ге- нома, тогда как в M i — 16 %. Эта фракция гибридизуется со всеми об- ластями гомологии и прилегающими к ним областями в M b а т акже с 2—3 областями в M2 и Мз, которые отличаются от вирусных последо- вательностей, обнаруженных в Mi. Таким образом, показано, что Д Н К ВЯП содержит области, го- мологичные клеточным. Однако во фракциях клеточной Д Н К в M i и M2, содержащих по сравнению с M3 вирусные нуклеотидные последова- тельности, присутствуют не только области гомологии, но и прилега- ющие к ним фрагменты вирусного генома. Эти данные можно интер- претировать как ковалентную связь между вирусными и клеточными последовательностями в геноме БВМ пражской линии. В ы б о р м о д е л и и н т е г р а ц и и . Рассмотрим возможные мо- дели интеграции вирусной и клеточной Д Н К в клеточном геноме: инте- грация вирусных копий в виде тандема голова-к-хвосту с повторяющи- мися последовательностями клеточной Д Н К (я = 2) ; интеграция ви- русных геномов с повторяющейся клеточной Д Н К в виде отдельных копий (я = 2&+2) ; интеграция вирусных нуклеотидных последователь- ностей С повторяющейся клеточной Д Н К в виде неполных К О П И Й вирус- ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1990. Т. б. № 4 4* 51 ного генома независимо друг от друга ( n > 2 k - \ - 2 ) , где η — количество стыков вирусной и повторяющейся клеточной Д Н К , k — число копий интегрированной вирусной Д Н К . Д л я выбора одной из этих моделей, а также для оценки значения η в выбранной модели рассмотрим зависимость количества вирусной Д Н К , перераспределившейся между фракциями клеточной Д Н К (ΔΧ<, AXi=XM i —Хм 3 , t = l , 2), от количества стыков вирусной и повторя- ющейся клеточной Д Н К (п). Пусть в клеточной Д Н К имеется η стыков вирусной и клеточной Д Н К и три набора фрагментов клеточной Д Н К Mi, M2 , M2 . В M 3 распределение по кинетическим фракциям клеточной Д Н К , вирусной и клеточной Д Н К происходит практически независимо. В крупных фрагментах наборов M i и M2 можно обнаружить стыки ви- русной и клеточной Д Н К экспериментально, так как количество пере- распределившейся вирусной Д Н К между фракциями клеточной Д Н К является функцией числа стыков. Построим функции AX (п) для слу- чаев, когда вирусная Д Н К составляет 0,75 размера наибольшего фраг- мента (5*106) и 0,5 размера фрагмента 1,5· 106 (M i) и 0,75 и 0,5 размера фрагмента 1*106 (M 2) . Ограниченные этими линиями множе- ства представляют собой промежуточные случаи. Экспериментально полученные значения Xi = 0,75 и X2 = 0,25 в Mi и M2 соответственно позволяют ограничить множества возможных значений η и найти их пересечение, которое представляет собой множество подходящих зна- чений для нашей модели (рис. 7). Таким образом, был оценен интер- вал возможных значений η 364-58. Величину нижнего значения можно интерпретировать как интеграцию двух копий вирусной Д Н К с 17— 18 сайтами клеточной Д Н К в виде неполных копий вирусного генома, по-видимому, вблизи областей* гомологии. Сравнивая эту модель инте- грации геномов ВЯП БВМ и БВМ пражской линии с обычно встреча- ющейся моделью интеграции голова-к-хвосту в трансформированных клетках, можно предположить, что подобная конструкция появилась в процессе эволюции трансформированного некогда генома БВМ праж- ской линии за счет осуществления ряда последовательных транспози- ций клеточной Д Н К в вирусную и наоборот. STRUCTURAL CHARACTERISTICS OF THE INTEGRATION REGIONS OF NPV DNA AND HOST CELL IN THE GALLERIA MELLONELLA GENOME N. Yu. Miryuta, L. I. Strokovskaya, I. N. Skuratovskaya Institute of Molecular Biology and Genetics, Academy of Sciences of the Ukrainian SSR, Kiev S u m m a r y The physical state of the viral genome in the cell and certain structural characteristics of binding sites of virus and cell sequences in Galleria mellonella DNA and NPV DNA have been investigated. The possibility of covalent bond between genome DNAs of virus and cell is shown. The studies of kinetic and thermal fractions obtained from. G. mello- nella larvae of the Prague stock for DNA with different weights have permitted locali- zing NPV DNA regions containing homology regions, showing linkage between virus and cell DNA in the cell genome, investigating virus DNA regions adjacent to cell DNA. This DNA proved to contain homology regions and neighbouring virus DNA fragments. A model of integration of NPV genome with G. mellonella larvae genome has been suggested. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Aizawa К. Infection of the greater wax moth, Galleria mellonella (Linnaeus) with the polyhedrosis virus of the silkworm, Bombyx mori (Linnaeus) / / J . Insect. Pathol.— 1962.—4, N 2.— P. 122—127. 2. Обнаружение ковалентно связанного с Д Н К клетки генома бакуловируса у большой вощинной моли / Н. Ю. Мирюта, Л. И. Строковская, И. П. Кок, И. Н. Скуратов- ская // Биополимеры и клетка.— 1985 — 1, № 2.— С. 106—108. 58 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1990. Т. б. № 4 4* 51 3. Кок И. П., Скуратовская И. H., Строковская JI. И. Молекулярные основы репродук- ции бакуловирусов.— К. : Наук, думка, 1980.— 173 с. 4. Строковская Л. И. Физическое картирование генома бакуловирусов // Методы мо- лекуляр. биологии.— К- : Наук, думка, 1986.— С. 73—80. 5. Fitch W. MSmith T. F., Ralph W. M. Mapping the order of DNA restriction frag- ments // Gene.— 1983.— 22, N 1.— P. 19—29. 6. Labelling DNA to high specific activity in vitro by nick translation with DNA poly- merase I / P . W. J. Rigby, M. Dieckmann, C. Rhodes, P. B e r g / / J . Мої. Biol.— 1977.— 113, N 1.—P. 251—273. 7. Реассоциация ДНК: физические и биологические аспекты / В. И. Прима, В. 3. Та- рантул, А. В. Шугалий, К. Г. Газарян / / Укр. биохим. журн.— 1974.— 46, № 2.— С. 255—269. 8. Вольфсон В. Г., Борхсениус С. Н. Распределение повторяющихся нуклеотидных по- следовательностей в ДНК макронуклеуса инфузории Tetrahymena // Молекуляр. биология.— 1978.— 12, JMb 4.— С. 894—900. 9. Gelb L. D., Kohne D. E., Martin Μ. A. Quantitation of simian virus sequences in african green monKey, mouse and virus transformed cell genomes / / J . Мої. Biol.— 1971.—57, N 1.—P. 129—145. 10. Fotis C. K, Weldon C. J., Argiris E. Determination of nucleic acid sequence homo- logues and relative concentrations by a dot hybridization procedure // Nucl. Acids Res.— 1979.—7, N 6.—P. 1541—1552. 11. Kraiselburd E., Gage L. R., Weissbach A. Presence of herpes simplex virus DNA fragment in an L-cell clone obtained after infection with irradiated herpes simplex virus 1 / / J . Мої. Biol.— 1975.—97, N 3.—P. 533—542. 12. Smith G. E., Summers M. D. The bidirectional transfer of DNA and RNA to nitro- cellulose or diazobenzyloxymethyl-paper//Anal. Biochem.— 1980.— 109, N 1.— P. 123—129. 13. Shoyab M., Dastoor M. N., Baluda M. A. Evidence for tandem integration of avian myeloblastosis virus DNA with endogenous provirus in leukemic chicken cells / /Proc . Nat. Acad. Sci. USA — 1976.—73, N 5.—P. 1749—1753. 14. Мартыненко Ε. И. Изучение физико-химических свойств и биосинтеза ДНК вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда: Автореф. дис. канд. биол. наук.— Киев, 1988.— 20 с. 15. Скуратовская И. H., Шугалий А. В., Никоненко В. И. Выделение и анализ Д Н К из полиэдров при ядерном полиэдрозе большой вощинной моли // Докл. АН УССР. Сер. биология.— 1974.— JVb 10.—С. 932—934. 16. Genomic localization of hepatitis B virus in a human hepatoma cell l i ne /M. Zerial, J. Salinas, J. Filipski, G. Gernardi / /Nucl . Acids Res.— 1986,— 14, N 21.—P. 8373— 8386. Ин-т молекуляр. биологии и генетики АН УССР, Киев Получено 18.08.89 УДК 577.217.34 © Т. В. Венкстерн, Д. М. Грайфер, Г. Г. Карпова, , И. А. Морозов, 1990 ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРОИЗВОДНОГО TPHKphe, НЕСУЩЕГО АРИЛАЗИДОГРУППУ НА ОСТАТКЕ G2 4 , С РИБОСОМАМИ ESCHERICHIA COLI И тРНК-(АДЕНИН-І- ) МЕТИЛТРАНСФЕРАЗОЙ ИЗ THE RMUS THERMO PHI LUS С помощью производного TPHKphe Е. coli, несущего арилазидогруппу на остатке G24, изучена фотоаффинная модификация рибосом Е. coli и тРНК-(аденин-1-)метилтран- сферазы из Т. thermophilus. Показано, что производное тРНК при облучении УФ-све- том (λ>310 нм) ковалентно присоединяется к тРНК-(аденин-1-)метилтрансферазе, но не присоединяется к рибосомам при локализации как в A-, так и в Р-участке. Введение. Одним из подходов к изучению структурной организации и динамики комплексов т Р Н К с рибосомами и ферментами является ме- тод аффинной модификации реакционноспособными производными т Р Н К . Особенно плодотворным оказалось использование фотоактиви- руемых производных T P H K p h e Е. coli, содержащих арилазидогруппы, распределенные примерно статистически по остаткам гуанина — (ази- до)стат-тРНКР Ь е . Эти производные получали в две стадии: вначале ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1990. Т. б. № 4 4* 51

Similar Items