Взаимодействие различных конформеров деацилированной тРНК с 80S рибосомами
Показано, что биологически неактивные конформеры тРНК способны ингибировать матричнозависимое связывание аминоацил-тРНК с 80S рибосомами, причем такие конформеры обладают более сильным ингибиторным эффектом, чем нативная деацилированная тРНК. Показано, що біологічно неактивні конформери тРНК здатні...
Saved in:
| Published in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Date: | 1987 |
| Main Authors: | , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1987
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153781 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Взаимодействие различных конформеров деацилированной тРНК с 80S рибосомами / Б.С. Негруцкий, А.В. Ельская // Биополимеры и клетка. — 1987. — Т. 3, № 3. — С.131-134. — Бібліогр.: 13 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859458739746111488 |
|---|---|
| author | Негруцкий, Б.С. Ельская, А.В. |
| author_facet | Негруцкий, Б.С. Ельская, А.В. |
| citation_txt | Взаимодействие различных конформеров деацилированной тРНК с 80S рибосомами / Б.С. Негруцкий, А.В. Ельская // Биополимеры и клетка. — 1987. — Т. 3, № 3. — С.131-134. — Бібліогр.: 13 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Биополимеры и клетка |
| description | Показано, что биологически неактивные конформеры тРНК способны ингибировать матричнозависимое связывание аминоацил-тРНК с 80S рибосомами, причем такие конформеры обладают более сильным ингибиторным эффектом, чем нативная деацилированная тРНК.
Показано, що біологічно неактивні конформери тРНК здатні пригнічувати матричнозалежне зв’язування аміноацил-тРНК з 80S рибосомами, причому такі конформери володіють сильнішим інгібіторним ефектом, ніж нативна деацильована тРНК.
Biologically inactive tRNA conformers are able to inhibit the poly(U)-dependent binding of phenylalanyl-tRNA to 80S ribosomes, being a more efficient inhibitor than native deacylated tRNA.
|
| first_indexed | 2025-11-24T02:41:38Z |
| format | Article |
| fulltext |
'2. Identification and characterization of large plasmids in Rhizobium meliloti using aga-
rose gel electrophoresis / F. Gasse, C. Boucher, J. S. Julliot et al. / / J. Gen. Microbi-
ol.— 1979.—113, N 2 .—P. 229—242.
3. Schleif R. Assaying of organisms for the presence of restriction e n d o n u c l e a s e s / / M e t h .
Enzymol.— 1980.—65.— P. 19—23.
4. Roberts R. J. Restriction and modification enzymes and their recognition sequences / /
Nucl. Acids Res.— 1985.—13.—SuppL—P. 165—199.
Ин-т молекуляр. биологии и генетики АН УССР, Киев Получено 21.04.86
Мн-т биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР, Пущино
У Д К 547.963.3
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ РАЗЛИЧНЫХ КОНФОРМЕРОВ
ДЕАЦИЛИРОВАННОЙ тРИК С 80S РИБОСОМАМИ
Б. С. Негруцкий, А. В. Ельская
Неактивные в аминоацилировании конформеры тРНК выделены из пе-
чени кроликов при некоторых состояниях, связанных с изменением био-
синтеза белка в организме [1—3]. Изучены активационные параметры
их ренатурации in vitro [4] и особенности образования комплекса с лей-
пил-тРНК-синтетазой [5]. Целью настоящей работы было исследование
взаимодействия указанных конформеров тРНК с рибосомами из печени
кролика. Эта задача актуальна и интересна, поскольку особенности вза-
имодействия тРНК с эукариотическими рибосомами до настоящего вре-
мени изучены крайне мало. Кроме того, исследование связывания био-
логически неактивных конформеров тРНК с рибосомами может дать
информацию о принципиальной возможности их ингибирующего дейст-
вия на белковый синтез на этапе трансляции.
Препараты тРНК из печени голодавших 10—12 сут и контрольных
кроликов получали, как описано ранее [5]. Суммарный препарат тРНК
из печени голодавших животных содержит смесь активных и неактив-
ных в аминоацилировании тРНК (тРНКа+н), а из печени контрольных
животных — активные конформеры (тРНКа). Деацилирование тРНК
проводили по методу [6]. 40S и 60S субчастицы рибосом из печени кро-
лика получали, как описано в [7]. [14С]фенилаланил-тРНК с удельной
активностью 1520 пмолей [14С]фенилаланина на 1 ед. А2бо, обогащенная
TPHKp h e и суммарная тРНК, лишенная фенилаланиновой тРНК
(тРНК~РІ1е), были получены по методу [8]. Связывание аминоацил-
тРНК с рибосомами изучали в системе, предложенной Ниренбергом и
Ледером [9]. Смесь в объеме 50 мкл содержала 0,02 Μ трис-HCl, рН 7,6,
0,1 Μ NH4C1, 0,02 Μ MgCl2, 5 пмолей 40S и 7,5 пмолей 60S субчастиц
рибосом, 20 пмолей [14С]фенилаланил-тРНК, различные количества де-
ацилированной тРНК и в ряде случаев 2 мкг поли(и) . [14С]фенилала-
нил-тРНК добавляли после преинкубации смеси при 4 °С в течение
10 мин и затем инкубировали пробы еще 45—75 мин при той же темпе-
ратуре. Образовавшиеся комплексы сорбировали на нитроцеллюлозные
фильтры с диаметром пор 0,45 мкм.
Одним из способов исследования взаимодействия деацилированной
тРНК с рибосомами является определение ее ингибиторного действия
на связывание с рибосомами аминоацил- либо пептидил-тРНК [10, 11].
В настоящей работе взаимодействие рибосом с различными конформе-
рами тРНК оценивали по степени ингибирования связывания [14С]фе-
нилаланил-тРНК- Предварительно были определены оптимальные для
матричнозависимого и безматричного связывания количества фенилала-
нил-тРНК и время инкубации.
На рис. 1, α представлены результаты исследования ингибирующе-
го действия различных конформеров тРНК на поли (U)-зависимое свя-
зывание фенилаланил-тРНК с 80S рибосомами. Видно, что тРНКа+н
Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА.— 1987.—т. З, № 3 4-7-72 131
проявляет более выраженное ингибирующее действие по сравнению с
тРНКа. Характеристические величины аг·, применяющиеся для оценки
влияния различных ингибиторов на связывание аминоацил-тРНК с ри-
босомами [12], отличаются в два раза, составляя 0,31 и 0,13 для
тРНКа+н и тРНКа соответственно. Ренатурация неактивных конформе-
ров тРНК приводила к исчезновению обнаруженных различий.
Из рис. 1, б следует, что активные и неактивные конформеры тРНК
практически не отличаются по степени ингибирования матричнозависи-
KJ>
Рис. 1. Ингибирующее действие тРНКа ( / ) и тРНКа+н (2) на связывание [ 1 4 С]фе-
нилаланил-тРНК с рибосомами: а — поли (U)-зависимое связывание с 80S рибосомами;
б — поли(U)-зависимое связывание с 40S субчастицами рибосом; в — безматричное
связывание с 80S рибосомами. В каждом случае за 100 % принято количество Г14С]фе-
нилаланил-тРНК, связавшейся в данной системе с рибосомами в отсутствие деацили-
рованной т Р Н К
Fig. 1. The inhibitory effect of t R N A a ( / ) , t R N A a + i (2) on the b inding of [ 1 4 C]phenyla la-
nyl - tRNA to r ibosomes: a — poly (U)-dependent b inding to 80S ribosomes; б — poly ( I n -
dependent b inding to 40S r ibosome subunits ; в — binding to 80S ribosomes in the absen-
ce of p o l y ( U ) . The quant i ty of [ 1 4 C]phenyla lanyl - tRNA bound to ribosomes in the absen-
ce of deacylated tRNA is taken as 100 %
мого связывания фенилаланил-тРНК с 40S субчастицами рибосом (зна-
чения й{ 0,042 и 0,037 соответственно). Подобные данные о разном свя-
зывании конформеров тРНКр і 1 е из Е. colt с 70S рибосомами и 30S суб-
частицами были получены в работе [13]. По всей видимости, относи-
Рис. 2. Влияние на поли (U)-зависимое связывание
[1 4С] фенилаланил-тРНК с 80S рибосомами препаратов
т Р Н К Р Ь е a ( / ) , т Р Н К Г Р Ь е a (2) тРНКPheа+н (*) и
тРНК-Pheа+н І 4 ) · З а 1 0 0 % принято количество [ 1 4С]фе-
нилаланил-тРНК, связавшейся с рибосомами в отсутст-
вие деацилированной т Р Н К
Fig. 2. The effect of tRNA a
P h e (1), t R N A ~ p h e (2),
тРНКPheа+н (3) and tтРНК-Pheа (4) prepara t ions on the po-
ly (U)-dependent b inding of [14C]phenyl<alanyl-tRNA to
80S ribosomes. The quant i ty of [1 4C] phenyLalanyl-tRNA
bound to ribosomes in the absence of deacylated tRNA is
taken as 100 %
тельно небольшие изменения конформации тРНК не важны для связы-
вания с малыми субчастицами рибосом, но весьма существенны для
адсорбции на целых рибосомах.
При безматричном связывании фенилаланил-тРНК нами не было
обнаружено различий в ингибирующем действии тРНКа+н И тРНКа
(рис. Ι , β ) . Поскольку в описанных экспериментах были использованы
препараты суммарной деацилированной тРНК, возникает вопрос, явля-
ется ли обнаруженный ингибиторный эффект при матричнозависимом
связывании результатом связывания с рибосомой деацилированной
тРНК Р Ь е или деацилированные тРНК другой специфичности также спо-
собны ингибировать связывание фенилаланил-тРНК? Для его выяснения
были получены обогащенные препараты TPHKp h e и препараты суммар-
ной TPHK~phe. Результаты представлены на рис. 2. Оказалось, что
TPHKa - p h e не оказывает влияния на связывание фенилаланил-тРНК с
132 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА.— 1987.—т. З, № 3 4-7-72 132
рибосомами, в то время как тРНКаРПе обладает выраженным ингиби-
торным действием. Следовательно, при данных концентрациях суммар-
ной деацилированной тРНКа ингибиторный эффект полностью обус-
ловлен кодонзависимым связыванием тРНК а
Р Ь е с рибосомами. Иная
картина наблюдалась в присутствии тРНКа+н — как TPHKphe , так и
тРНК~р11е обладали явным ингибиторным действием. Это свидетельст-
вует о том, что в присутствии поли(О) взаимодействовать с рибосома-
ми способны биологически неактивные конформеоы т Р Н К различных
специфичностей, а не только тРНКР Ь е . Отсюда понятен более выражен-
ный ингибиторный эффект тРНКа+п по сравнению С тРНКа.
В наших экспериментах с 1 молем 80S рибосом связывалось до
2 молей [14С]фенилаланил-тРНК, т. е. адсорбция происходила на два
сайта связывания. Однако в связи с трудностью точной дискриминации
сайтов на эукариотической рибосоме мы не можем определить, связан
ли повышенный по сравнению с контролем ингибиторный эффект
тРНКа+н с более выраженным взаимодействием неактивных конформе-
ров с обоими сайтами либо повышенным сродством к какому-то одно-
му из них.
Таким образом, нами получены доказательства того, что неактив-
ные в аминоацилировании конформеры тРНК способны связываться с
80S рибосомами и ингибировать кодозависимое связывание аминоацил-
тРНК, что может быть одним из факторов нарушения биосинтеза белка
при тех экстремальных состояниях организма, для которых характерно
появление неактивных конформеров тРНК.
THE INTERACTION OF DIFFERENT CONFORMERS
O F DEACYLATED tRNA WITH 80S RIBOSOMES
B. S. Negrutsky, Α. V. Elskaya
Institute of Molecular Biology and Genetics,
Academy of Sciences of the Ukrainian SSR, Kiev
S u m m a r y
Biologically inactive tRNA conformers are able 'to inhibit the poly(U)-dependent binding
of phenylalanyl-tRNA to 80S ribosomes, being a more efficient inhibitor than native de-
.acylated tRNA.
1. Биологически неактивные транспортные Р Н К животных / Г. X. Мацука, Т. П. Ба-
бий, Э. Б. Сквирская и д р . / / Б и о х и м и я . — 1973.—38, № 6.—С. 1221—1227.
2. Демидов С. В., Коваленко М. И., Ельская А. В. Изучение биологической активности
т Р Н К печени кроликов разного в о з р а с т а / / Б и о л . науки.— 1980.— № 12.— С. 18—
24.
3. Изучение молекулярных основ нарушения биосинтеза белка при экспериментальном
инфаркте миокарда и аутолизе миокарда / М. И. Коваленко, Г. А. Родовичюс,
А. И. Тамулявичюс и д р . / / М о л е к у л я р . биология.— 1984.— Вып. 37.— С. 18—21.
4. Негруцкий Б. С., Солдаткин К. А. Термодинамическая оценка конформационных пе-
реходов при ренатурации биологически неактивных конформеров т Р Н К / / Там же.—
С. 26—28.
5. Негруцкий Б. С., Ельская А. В. Особенности тепловой инактивации лейцил-тРНК-
синтетазы из печени кролика в присутствии различных конформеров т Р Н К / / Моле-
куляр. биология.— 1984—18, № 5.—С. 1297—1300.
6. Sarin P., Zamechnic P. On the stability of aminoacyl-sRNA to nucleophilic cataly-
sis / / Biochim. et biophys. acta.— 1964.—91, N 3.— P. 633—655.
7. Изучение кодового соответствия T P H K f l e молочной железы коров / Г. В. Овча-
ренко, А. П. Потапов, Б. С. Негруцкий и д р . / / У к р . биохим. журн.— 1983.—55,
№ 6.—С. 608—613.
S. Методы выделения т Р Н К и индивидуальных т Р Н К Л е й и т Р Н К Ф е н из животных
тканей / М. И. Коваленко, Н. И. Желтовская, А. В. Ельская, Г. В. Овчаренко / /
Методы соврем, биологии.— Киев : Наук, думка.— 1979.— С. 98—111.
9. Nirenberg Μ., Leder P. The effect of trinucleotides upon the binding of sRNA to ribo-
somes/ /Science .—1964.—145, N 3639.—P. 1399—1407.
10. Wurmbach ΡNierhaus К. H. Codon-anticodon interaction of the ribosomal Ρ (pepti-
dyl-tRNA) site / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.— 1979.—76, N 5 . — P . 2143—2147.
11. Peter M., Yarus M. Transfer RNA selection of the ribosomal A and Ρ sites / / J . Мої.
Biol.— 1979.—134, N 3 .—P. 471—491.
Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА.— 1987.—т. З, № 3 4 - 7 - 7 2 133
12. Ofengand J., Henes C. The function of pseudouridylic acid in t ransfer ribonucleic
a c i d / / J . Biol. Chem.— 1969.—244, N 22.—P. 6241—6253.
13. The mechanism of codon-anticodon interactions in ribosomes. Heterogeneity of tRNA
complexes with 70S ribosomes of Escherichia coli / S. V. Kirillov, V. I. Makchno,
V. B. Odintsov, Yu. P. S e m e n k o v / / E u r . J. Biochem.— 1978.—89, N 1.—P. 305—313.
Ин-т молекуляр. биологии и генетики АН УССР, Киев Получено 20.03.86*
УДК 575.155:575.224.46
ИССЛЕДОВАНИЕ РЕПЛИКАЦИИ ПЛАЗМИД,
СОДЕРЖАЩИХ ГЕНОМ SV40, В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
С. М. Ландау, Л. К. Сасина, Н. А. Чащин, Л. И. Чащина
В настоящее время широко применяют векторы для эукариотических
клеток на основе Д Н К вируса SV40. Основой для исследования функ-
циональной активности таких векторов должно быть изучение их спо-
собности реплицироваться в пермиссивной системе клеток.
Однако в последнее время стало известно, что векторы на основе
pBR322 содержат «ядовитые» последовательности, препятствующие ре-
пликации рекомбинантных молекул в культурах клеток млекопитающих
[1—3]. В связи с этим мы исследовали возможность индуцирования ре-
пликации рекомбинантных молекул, состоящих из плазмиды pBR325
(производная pBR322) и полного генома SV40, в пермиссивной системе
клеток CVI с помощью обезьяньего вакуолизирующего вируса 40.
В перевиваемой системе клеток CVI изучали репликацию бактери-
альных рекомбинантных плазмид, содержащих геном SV40. Исследова-
ли следующие плазмиды: 1) ρΥΜ, созданную на основе pBR322 и содер-
жащую один полный геном SV40 [1] и 2) сконструированные нами на
основе SV40 плазмиды pSV2, pSV9, содержащие один (pSV2 ) и два
(pSV9) полных генома SV40 [4]. Все исследованные химерные плаз-
мидные молекулы были получены с помощью рестриктазы В а т Н І , ко-
торая расщепляет молекулу Д Н К SV40 в позднем районе, кодиру-
ющем капсидные белки вириона, и гидролизует плазмиды pBR322 или
pBR325 в районе гена устойчивости к тетрациклину.
Для изучения репликации бактериальными плазмидами (0,5—
0,6 мкг) обрабатывали культуры клеток млекопитающих во флаконах
объемом 50 мл в присутствии кальций-фосфатного преципитата. Плаз-
мидные Д Н К из клеток млекопитающих выделяли в динамике инфек-
ции [3]. Проводили дот-гибридизацию выделенных из культур клеток
CVI плазмидных Д Н К с 32P-SV40 (3-Ю7 имп/мкг) или 3Ф-pBR322
(108 имп/мкг).
Еще до изучения репликации рекомбинантных бактериальных плаз-
мид в клетках млекопитающих необходимо было выяснить динамику
синтеза обезьяньего вакуолизирующего вируса SV40. Было показано,
что при инфицировании обезьяньих клеток вирусной суспензией пик
синтеза вирусной Д Н К обнаруживается через одни или двое суток, что
совпадает с данными литературы [5]. Позднее количество свободной ви-
русной Д Н К уменьшается. Через 6—7 сут практически не удается обна-
ружить вирусной Д Н К в эписомальном состоянии (рисунок, а).
Синтез Д Н К плазмиды ρΥΜ, так же как и вирусной ДНК, возрас-
тает через сутки (рисунок, б). Однако в отличие от Д Н К вируса SV40
рекомбииантную плазмиду ρΥΜ удается выявить даже спустя 7 сут
после трансфекции (рисунок, в), что свидетельствует о длительной са-
мопроизвольной ее репликации в культурах клеток млекопитающих.
Эти данные согласуются с данными литературы [3]. Расчет соотношения
площадей пиков авторадиограммы на рисунке, б, показал, что площадь
пика нулевой точки инфекции относится к площадям пиков первых,
вторых и третьих суток инфекции как 1 : 1 ; 4 : 1 ; 3 : .1,7. соответственно.
134 Б И О П О Л И М Е Р Ы И К Л Е Т К А . - 1987 —т. 3, № 3
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-153781 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7657 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-11-24T02:41:38Z |
| publishDate | 1987 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Негруцкий, Б.С. Ельская, А.В. 2019-06-14T16:03:52Z 2019-06-14T16:03:52Z 1987 Взаимодействие различных конформеров деацилированной тРНК с 80S рибосомами / Б.С. Негруцкий, А.В. Ельская // Биополимеры и клетка. — 1987. — Т. 3, № 3. — С.131-134. — Бібліогр.: 13 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.0001E0 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153781 547.963.3 Показано, что биологически неактивные конформеры тРНК способны ингибировать матричнозависимое связывание аминоацил-тРНК с 80S рибосомами, причем такие конформеры обладают более сильным ингибиторным эффектом, чем нативная деацилированная тРНК. Показано, що біологічно неактивні конформери тРНК здатні пригнічувати матричнозалежне зв’язування аміноацил-тРНК з 80S рибосомами, причому такі конформери володіють сильнішим інгібіторним ефектом, ніж нативна деацильована тРНК. Biologically inactive tRNA conformers are able to inhibit the poly(U)-dependent binding of phenylalanyl-tRNA to 80S ribosomes, being a more efficient inhibitor than native deacylated tRNA. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Краткие сообщения Взаимодействие различных конформеров деацилированной тРНК с 80S рибосомами Взаємодія різних конформерів деацильованої тРНК з 80S рибосомами The interaction of different conformers of deacylated tRNA with 80S ribosomes Article published earlier |
| spellingShingle | Взаимодействие различных конформеров деацилированной тРНК с 80S рибосомами Негруцкий, Б.С. Ельская, А.В. Краткие сообщения |
| title | Взаимодействие различных конформеров деацилированной тРНК с 80S рибосомами |
| title_alt | Взаємодія різних конформерів деацильованої тРНК з 80S рибосомами The interaction of different conformers of deacylated tRNA with 80S ribosomes |
| title_full | Взаимодействие различных конформеров деацилированной тРНК с 80S рибосомами |
| title_fullStr | Взаимодействие различных конформеров деацилированной тРНК с 80S рибосомами |
| title_full_unstemmed | Взаимодействие различных конформеров деацилированной тРНК с 80S рибосомами |
| title_short | Взаимодействие различных конформеров деацилированной тРНК с 80S рибосомами |
| title_sort | взаимодействие различных конформеров деацилированной трнк с 80s рибосомами |
| topic | Краткие сообщения |
| topic_facet | Краткие сообщения |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153781 |
| work_keys_str_mv | AT negruckiibs vzaimodeistvierazličnyhkonformerovdeacilirovannoitrnks80sribosomami AT elʹskaâav vzaimodeistvierazličnyhkonformerovdeacilirovannoitrnks80sribosomami AT negruckiibs vzaêmodíâríznihkonformerívdeacilʹovanoítrnkz80sribosomami AT elʹskaâav vzaêmodíâríznihkonformerívdeacilʹovanoítrnkz80sribosomami AT negruckiibs theinteractionofdifferentconformersofdeacylatedtrnawith80sribosomes AT elʹskaâav theinteractionofdifferentconformersofdeacylatedtrnawith80sribosomes |