Характерные черты специфической ферментативной функции тромбина и их связь со структурой
В обзоре рассматриваются особенности структуры тромбина, связанные с высокой эффективностью и селективностью его физиологических функций. В огляді наведено відомості щодо особливостей структури тромбіна, які впливають на високу селективність та ефективність його дії у системі згортання кровію Розгля...
Saved in:
| Published in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Date: | 1996 |
| Main Author: | |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1996
|
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153789 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Характерные черты специфической ферментативной функции тромбина и их связь со структурой / А.А. Серейская // Биополимеры и клетка. — 1996. — Т. 12, № 1. — С. 5-15. — Бібліогр.: 39 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-153789 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Серейская, А.А. 2019-06-14T16:13:46Z 2019-06-14T16:13:46Z 1996 Характерные черты специфической ферментативной функции тромбина и их связь со структурой / А.А. Серейская // Биополимеры и клетка. — 1996. — Т. 12, № 1. — С. 5-15. — Бібліогр.: 39 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00040D https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153789 577.344 В обзоре рассматриваются особенности структуры тромбина, связанные с высокой эффективностью и селективностью его физиологических функций. В огляді наведено відомості щодо особливостей структури тромбіна, які впливають на високу селективність та ефективність його дії у системі згортання кровію Розглядається значення додаткового екзосайту впізнавання – зв'язування ферменту у взаємодії з фібриногеном. Обговорюється можливість виникнення конформаційних змін внаслідок утворення комплексу фібриноген – тромбін, що спричинює прискорення каталітичного процесу. This review deals with thrombin peculiarities responsible for its highly selective and effective action in blood clotting system Role of enzyme additional binding-recognition exosites in interaction with fibrinogen is analyzed. As a result of thrombin-fibrinogen recognition complex formation is supposed some conformational changes to arise that couple exosite with active centre and accelerate the catalytic process. В заключение выражаю благодарность С. В. Полтановой за помощь в оформлении рукописи. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Характерные черты специфической ферментативной функции тромбина и их связь со структурой Характерні риси специфічної ферментативної функції тромбіна та їх зв'язок із структурою Characteristic features of specific fermentative function of thrombin and it's connection with the structure Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Характерные черты специфической ферментативной функции тромбина и их связь со структурой |
| spellingShingle |
Характерные черты специфической ферментативной функции тромбина и их связь со структурой Серейская, А.А. |
| title_short |
Характерные черты специфической ферментативной функции тромбина и их связь со структурой |
| title_full |
Характерные черты специфической ферментативной функции тромбина и их связь со структурой |
| title_fullStr |
Характерные черты специфической ферментативной функции тромбина и их связь со структурой |
| title_full_unstemmed |
Характерные черты специфической ферментативной функции тромбина и их связь со структурой |
| title_sort |
характерные черты специфической ферментативной функции тромбина и их связь со структурой |
| author |
Серейская, А.А. |
| author_facet |
Серейская, А.А. |
| publishDate |
1996 |
| language |
Russian |
| container_title |
Биополимеры и клетка |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Характерні риси специфічної ферментативної функції тромбіна та їх зв'язок із структурою Characteristic features of specific fermentative function of thrombin and it's connection with the structure |
| description |
В обзоре рассматриваются особенности структуры тромбина, связанные с высокой эффективностью и селективностью его физиологических функций.
В огляді наведено відомості щодо особливостей структури тромбіна, які впливають на високу селективність та ефективність його дії у системі згортання кровію Розглядається значення додаткового екзосайту впізнавання – зв'язування ферменту у взаємодії з фібриногеном. Обговорюється можливість виникнення конформаційних змін внаслідок утворення комплексу фібриноген – тромбін, що спричинює прискорення каталітичного процесу.
This review deals with thrombin peculiarities responsible for its highly selective and effective action in blood clotting system Role of enzyme additional binding-recognition exosites in interaction with fibrinogen is analyzed. As a result of thrombin-fibrinogen recognition complex formation is supposed some conformational changes to arise that couple exosite with active centre and accelerate the catalytic process.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153789 |
| citation_txt |
Характерные черты специфической ферментативной функции тромбина и их связь со структурой / А.А. Серейская // Биополимеры и клетка. — 1996. — Т. 12, № 1. — С. 5-15. — Бібліогр.: 39 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT sereiskaâaa harakternyečertyspecifičeskoifermentativnoifunkciitrombinaiihsvâzʹsostrukturoi AT sereiskaâaa harakternírisispecifíčnoífermentativnoífunkcíítrombínataíhzvâzokízstrukturoû AT sereiskaâaa characteristicfeaturesofspecificfermentativefunctionofthrombinanditsconnectionwiththestructure |
| first_indexed |
2025-11-26T19:17:08Z |
| last_indexed |
2025-11-26T19:17:08Z |
| _version_ |
1850770953934471168 |
| fulltext |
ISSN 0233-7657. Биополимеры и клетка. 1996. Т. 12. № 1
Характерные черты специфической ферментативной
функции тромбина и их связь со структурой
А. А. Серейская
Институт биоорганической химии и нефтехимии HAH Украины,
252660 Киев, ул. Мурманская, 1
В обзоре рассматриваются особенности структуры тромбина, связанные с вы-
сокой эффективностью и селективностью его физиологических функций.
Трипсиноподобная сериновая протеиназа тромбин является ключевым фер-
ментом свертывания крови и в этой роли эффективно катализирует ограни-
ченный протеолиз фибриногена и ряда других компонентов системы гемо-
стаза. В то же время сравнение тромбина с трипсином in vitro по гидролизу
моно- и дипептидных производных Arg и Lys, соответствующих первичной
специфичности этих ферментов, показало, что собственно каталитический
потенциал тромбина весьма невысок [1 ]. Однако в отношении гидролиза
более протяженных Arg-субстратов тромбин оказался мощным катализато-
ром, эффективность действия которого даже выше, чем в случае фибрино-
гена [2 ]. То есть при взаимодействии с субстратами определенного типа
(как с низко-, так и высокомолекулярными) возможно создание условий,
усиливающих каталитический процесс. Это связано с тем, что, в отличие от
трипсина, тромбин принадлежит к ферментам, для которых очень важны
множественные контакты с субстратом [3]. Очевидно, многоточечное свя-
зывание с субстратом облегчает образование продуктивного фермент-суб-
стратного комплекса, увеличивает вероятность наиболее благоприятной для
катализа ориентации расщепляемой связи в каталитической щели и посред-
ством тонких конформационных изменений повышает эффективность рабо-
ты каталитического аппарата [4J.
Чтобы аргументировать это положение, рассмотрим особенности струк-
туры активного центра, участков связывания тромбина и взаимодействия
его с субстратами различных типов. Для этого привлечем данные субстрат-
но-ингибиторного и рентгеноструктурного анализа (PCA) тромбина [5—7 ]
и используем их при исследовании основных функциональных участков
фермента с помощью его атомно-молекулярной модели [8—10].
Тромбин представляет собой почти сферическую молекулу, размеры ее
45 χ 45 χ 50 А3. Короткая Α-цепь не отделена пространственно от длинной
каталитической Б-цепи, а как бы оплетает глобулу последней. Так же, как
у родственных панкреатических протеиназ, аналогом которых является
Б-цепь, посредине глобулы проходит впадина, разделяющая ее на две части
(домены). Тромбин отличается от трипсина и химотрипсина тем, что у него
эта впадина резче выражена, глубже заходит в толщу молекулы, ее точнее
назвать расщелиной. По модели рассчитаны размеры расщелины: глубина
© А. А СЕРЕЙСКАЯ, 1996
5
Α. Α. СВР ЕЙСКАЯ
12—15, ширина 6—7, высота 22 А, она расширяется книзу. При образова-
нии фермент-субстратного комплекса в эту расщелину попадает расщепля-
емая связь с соседними к ней остатками субстрата, т. е. ее можно считать
полостью активного центра. Стенки полости сформированы как линейными,
так и петлевыми сегментами Б-цепи. Слева (с «севера», по обозначениям
PCA [5]) в стенку включены Argl73 — ІІЄІ74, основания петлевых сегмен-
тов Asn95 — Leu99, Phe34 — Cys42, справа (с «юга») — петлевые сегмен-
ты Gly216 — Cys220, Asnl43 — -Gln.151. Петлевые сегменты выступают
над поверхностью стенок, образуют выросты, выпячивания, направленные в
глубь полости. При этом наиболее экспонированными в глубине полости
оказываются гидрофобные радикалы. Это боковые цепи Ие174, ТугбОА,
РгобОС, Trp60D, Phe60H, Thrl47, Тгр148 и др. Среди них преобладают
уникальные для тромбина остатки 9-членной вставки (в сравнении с
трипсином и химотрипсином, на что указывает буквенный индекс при
нумерации по последовательности химотрипсиногена). Гидрофобные остат-
ки образуют своеобразную полость — гидрофобную клетку, являющуюся
важной архитектурной особенностью («мотивом», по современной термино-
логии) молекулы тромбина. Гидрофобная клетка пересекает полость актив-
ного центра, в одних участках сливаясь с ее стенками, в других —
ограничивая ее объем (внутреннее пространство).
Боковые радикалы заряженных остатков располагаются на дне и ближе
к верхнему концу полости активного центра (Glu217, Glul92, Asnl43,
Glnl51, Arg73).
Пространство между остатками Aspl02, His57, Serl95, составляющими
каталитическую триаду, представляет собой каталитическую щель, где
размещается фермент-субстратный тетраэдрический комплекс и происходит
собственно каталитический акт. Остатки каталитической триады находятся
в консервативных по первичной последовательности областях тромбина, что
отражает принципиальное сходство механизма катализа тромбина с други-
ми сериновыми протеиназами.
Интересно отметить локализацию остатков каталитической триады по
разные стороны расщелины активного центра: Aspl02, His57 принадлежат
левому домену Б-цепи, Serl 95 — правому. То же относится к трипсину и
химотрипсину. Но поскольку у этих ферментов щель активного центра не
так глубока, как у тромбина, каталитические остатки их лучше ориентиро-
ваны друг относительно друга. По данным моделирования [8 ], расстояние
ΝΔ 1 His57 — 0 Δ 1 Asp 102 у тромбина (3,4 А ) больше, чем у трипсина и
химотрипсина (2,6 А ) [11], а имидазольное кольцо остатка His немного
повернуто вокруг оси и поэтому находится не в оптимальной ориентации
относительно у-атома активного серина (не компланарно ему). Кроме того,
нависающие над каталитической щелью слева и справа массивные индоль-
ные радикалы Trp60D и, особенно, Тгр148 мешают входу и точному
размещению расщепляемой связи в каталитической щели. Эти особенности
геометрии каталитического центра тромбина, а также увеличение расстоя-
ния между элементами триады, возможно, вызывают некоторые затрудне-
ния в образовании водородных связей при функционировании релейной
системы переноса заряда, что может сказаться на скорости каталитического
этапа, снизить его каталитический потенциал. Вероятно, вследствие этого
тромбин оказывается слабым катализатором при гидролизе простых суб-
стратов типа ArgOMe, ТАМе, БАМе [2].
В правой стенке полости активного центра между остатками Serl 95
(сверху) и Ser214 (снизу) находится проем, ведущий в карман первичного
связывания. Его узкий извилистый ход сложнее по форме и более протяжен,
чем у трипсина, глубина его примерно 7 А. Нижнюю (левую) стенку
кармана составляет пептидный скелет остатков Ser214 — Trp215 — Gly216,
6
ХАРАКТЕРНЫЕ ЧЕРТЫ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ФУНКЦИИ ТРОМБИНА
отделяющий его от полости активного центра. Сверху карман прикрывает
нависающий над ним дисульфидный мостик Cys42 — Cys58. Дно кармана
формируют остатки Gly219 — Cys220, Aspl89. Карбоксильная группа
Aspl89(0Δ 1) является противоионом, реагирующим с гуанидиновым ради-
калом Arg или Lys (Р1 субстрата), чем определяется первичная специфич-
ность тромбина и трипсина. Фиксация субстрата в первичном кармане у
тромбина хуже, чем у трипсина. В нем способна разместиться лишь
гуанидиновая часть боковой цепи Arg, а углеводородная часть выступает из
кармана и не фиксируется. Ионные взаимодействия с Aspl89 у тромбина,
возможно, ослаблены из-за близости положительно заряженной вставки
Argl 87 — Gly 188. Такое строение кармана недостаточно благоприятно для
фиксации расщепляемой связи в составе фермент-субстратного комплекса.
Метиловый эфир Arg, который связывается с тромбином только по первич-
ному карману, гидролизуется им намного хуже, чем трипсином. В силу
изложенных обстоятельств не все соответствующие первичной специфично-
сти тромбина субстраты являются субстратами эффективными, поскольку
неадекватны особенностям строения, отличающим специфичность высшего
порядка. Вовлечение в процесс гидролиза новых участков молекулы тром-
бина, ответственных за вторичную и третичную (супер)специфичность,
представляет собой компенсаторный механизм, повышающий каталитиче-
ский потенциал тромбина до уровня не ниже трипсинового [3, 4, 12].
Остановимся на деталях строения вторичной и третичной контактных
зон тромбина. При этом следует иметь в виду, что а) субцентры фермента
(S1—Sn), взаимодействующие с конкретным аминокислотным остатком
субстрата, могут быть как сформированы из нескольких остатков, так и
один и тот же остаток может быть включен в разные субцентры; б) в
литературе нет единой терминологии по данному вопросу, кроме понятия
«субцентр», вводят термин «карман» (первичного связывания, дистальный,
проксимальный),«арилсвязывающий» центр. Однако намечается некое раз-
личие в этих терминах: S1... Sn относится ко взаимодействию с главной
пептидной цепью субстрата, а в «карман» входят боковые группы.
Главная цепь субстрата (P1 — P3) огибает стенку кармана первичного
связывания и располагается почти параллельно боковому радикалу Pl
(Arg), входящему в карман. При этом она образует антипараллельный
складчатый лист с S l — S 3 тромбина (Ser214 — Trp215 — Gly216). Суб-
центр Si, взаимодействующий с Pl субстрата, имеет сложное строение. N-
и О-атомы основной цепи Arg образуют водородные связи с Ser214, Gly 193,
Serl 95 и имидазольным кольцом His57. Гуанидиновый остаток Arg, нахо-
дясь в кармане, формирует солевой мостик с Aspl89 и водородную связь с
Gly219.
Субцентр S2 также непосредственно примыкает к каталитической
триаде. Размеры S2 ограничены, он оптимален для связывания небольших
и средних гидрофобных остатков. Начинается он с имидазольного кольца
активного His57, которое таким образом включается в его структуру. В
центре S2 находится Тгр215, вместе с Р2 субстрата участвующий в
формировании β-листа. Для реализации такой конформации необходимо,
чтобы остаток в Р2 субстрата был способен к изгибу и имел бы не слишком
большие размеры, иначе возникнут неблагоприятные контакты со стенкой
кармана. Последнее может отрицательно сказаться на эффективности ката-
лиза. Этому условию удовлетворяют остатки Pro или Gly. По сравнению с
ними Val в Р2 менее эффективен, хотя именно Val занимает эту позицию
в фибриногене; вероятно, вследствие этого имитирующие участок фибрино-
геыа с Val в Р2 олигопептиды расщепляются тромбином in vitro намного
хуже, чем некоторые природные субстраты с Pro в Р2 (например, гастрин-
релизинг фактор [13]). Слева и спереди S2 ограничивают остатки TyroOA
7
Α. Α. СВР ЕЙСКАЯ
и Trp60D. Снизу располагается Leu99, отделяющий субцентр S2 от S3.
В качестве S3 субцентра выступает Gly216, дающий две водородные
связи с РЗ субстрата, участвуя таким образом в формировании антипарал-
лельного /3-листа. S2 и S3 находятся по разные стороны щели активного
центра. Со стороны S2 между ними создается еще углубление: D-дисталь-
ный [14] или арилсвязывающий [15] карман, образованный стенкой S2 и
боковыми радикалами остатков, формирующих гидрофобную клетку —
Trp215, Leu99, ТугбОА, Trp60D, ІІЄІ74. Полость этого кармана по объему
соответствует бензольному ядру. Субцентр S2 вместе с арилсвязывающим
карманом составляют аполярный, вторичный связывающий (суб)центр,
являющийся важнейшей структурной и функциональной особенностью тро-
мбина. Оригинальность этой структуры подчеркивается тем, что в ее
формировании участвуют остатки петли Tyr — Pro — Pro — Trp
(60А — D) — уникальной для тромбина 9-членной вставки.
Следует отметить своеобразную стереоспецифичность аполярного цент-
ра [16]. Если в положении Р2 замена L-остатка на D приводит к тому, что
субстрат перестает гидролизоваться, то в РЗ D-конфигу рация предпочти-
тельнее. Поэтому D-Phe-Pro-Arg-pNA (CH2Cl), имеющий в РЗ объемный
гидрофобный остаток в D-конфигурации, относится к лучшим субстратам
(ингибиторам) тромбина.
Необходимым условием правильного размещения гидрофобного остатка
в арилсвязывающей полости является локализация его под определенным
углом к Pl (субстрата или ингибитора), занимающего Sl-первичный карман
связывания. Это обеспечивается присутствием в Р2 Pro или Gly, благодаря
изгибу пептидной цепи направляющих гуанидин Arg в первичный карман,
причем D-Val в Р2 как бы «выбивает» его оттуда. Таким образом, можно
представить себе положение, при котором начальная хорошая подгонка по
аполярному центру приводит затем к наиболее точному размещению
радикала Pl в первичном кармане [17].
Гидрофобный карман D субсайта S3 и субсайт S2 близко подходят к
остаткам каталитической триады активного центра. Вероятно, адекватное
заполнение их остатками Р2 и РЗ субстрата вызывает некое смещение в
сторону каталитического центра, следствием которого будет приобретение
более активной конформации, а также усиление системы переноса заряда.
Например, если Ne2 His57 и Oy Ser 195 находятся слишком далеко друг от
друга для образования водородной связи, то смещение (поворот) плоскости
имидазольного кольца His может исправить эту ситуацию. То же самое в
отношении взаимной ориентации His57 и Aspl02. Таким образом, воздей-
ствие на каталитическую триаду слева (снизу) от расщепляемой связи при
продуктивном комплексообразовании с субстратом по вторичной зоне спо-
собно усилить каталитический потенциал активного центра. По-видимому,
кроме гидролиза искусственных синтетических субстратов, этот механизм
срабатывает при расщеплении тромбином ряда белковых (полипептидных)
субстратов, соответствующих его вторичной специфичности, т. е. с Pro в Р2
и гидрофобным остатком в РЗ.
Но центральный субстрат тромбина в системе свертывания крови
фибриноген не удовлетворяет требованиям вторичной специфичности тром-
бина. У него в Р2 стоит Val, не обеспечивающий необходимого изгиба цепи
и этим затрудняющий гидрофобные контакты в D-кармане (S3). Положение
несколько улучшает L-Phe в позиции Р9, так как поворот цепи за счет
кластера глицинов (РЗ — Р5) приближает его к S3 — 84-элементам
гидрофобной клетки [7, 15]. Однако, как показывает модель (РСА 17]),
этот Phe не попадает полностью в полость арилсвязывающего субцентра
фермента, и если вызывает какие-то конформационные изменения в нуж-
ном направлении, то они еще недостаточны для повышения каталитической
8
ХАРАКТЕРНЫЕ ЧЕРТЫ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ФУНКЦИИ ТРОМБИНА
активности до уровня, соответствующего гидролизу интактного фибриноге-
на, протяженных фрагментов его Аа-цепи (1—44, 1—51) или синтетиче-
ских трипептидных субстратов.
В случае протеолиза тромбином фибриногена и некоторых других его
физиологических субстратов срабатывает механизм третичной (супер) спе-
цифичности, в котором определяющими становятся взаимодействия между
ферментом и субстратом вне зоны активного центра и участка расщепляе-
мой связи [18—20].
Дополнительные участки взаимодействия тромбина со специфическими
высокомолекулярными лигандами формируются с помощью кластеров поло-
жительно заряженных остатков, значительная часть которых сосредоточена
в β- и у-петлевых выступах поверхности Б-цепи. β-Петля 67—81 (на модели
сверху справа) топологически подобна Са-связывающей петле панкреатиче-
ских сериновых протеиназ [21 ], но приобретает у тромбина особую функ-
цию — участвует в процессе рекогниции. Не менее важна у-петля 145—150,
она включает вставку 149А-Е и располагается ниже /?-петли недалеко от
щели активного центра.
Будучи связанными с глобулой только у основания, β- и у-петли
выступают над ее поверхностью, довольно подвижны, не имеют жесткой
пространственной структуры. В то же время для β-петли допускают наличие
солевых мостиков между разноименно заряженными остатками Arg67 —
Glu80, Glu80 — Lys70, Lys70 Glu77 [21 ], что придает ей определенную
форму.
β-Петля вместе с прилегающими к ней остатками у-петли и простран-
ственно близкими одиночными положительно заряженными остатками
Arg35, Lys36, Lys 109, LysllO составляют дополнительный центр (ДЦ)
узнавания — связывания высокомолекулярных субстратов тромбина. Кати-
онную природу ДЦ и внешнее в отношении активного центра положение
отражает его синонимическое название ABE — анионсвязывающий экзо-
сайт. ABE 1 ответствен за взаимодействие с фибриногеном [22 ] (отсюда еще
одно наименование: FRS-сайт рекогниции фибриногена), фибрином, тром-
бомодулином, гирудином, рецептором тромбина на тромбоцитах, кофакто-
ром гепарина 2. Расстояние от ДЦ до кармана связывания (каталитического
Serl 95) оценивается в 18—20 А.
Кроме ABE 1, существует еще ABE 2, который служит для связывания
гепарина [23]. Располагается он на противоположной стороне поверхности
глобулы Б-цепи,
Сложная пространственная структура ABE 1, в создании которой,
помимо электростатических, очевидно, участвуют и гидрофобные силы,
необходима для продуктивного контакта со специфическими высокомолеку-
лярными лигандами. При разрушении дополнительного центра (например,
у β- или у-тромбина) резко уменьшается или совсем теряется способность
тромбина свертывать фибриноген и выполнять некоторые другие биологиче-
ские функции, хотя каталитическая активность по отношению к низкомо-
лекулярным субстратам сохраняется [24 ]. В частности, к такому результату
приводит нарушение структуры /?-петли при расщеплении связей 11е68 —
Arg77A или Arg77A — Asn78 (β-тромбин) [25], а также вследствие мута-
ции Квикі [26]: Arg67 -» Cys, препятствующей формированию солевого
мостика между концами петли.
Для эффективного протеолиза фибриногена необходимо узнавание —
связывание ДЦ с комплементарным ему участком субстрата (КС), удален-
ным от расщепляемой связи. На фибриногене он расположен в сегменте
33 — 51 Аа-цепи [27, 28]. Показано, что α-тромбин гораздо эффективнее,
чем у-тромбин, отщепляет фибринопептид (FPA) Αα-цепи. Но разница
между ними исчезает и скорость гидролиза α-тромбина снижается до уровня
9
Α. Α. СЕРЕЙСКАЯ
-̂тромбина при нарушений участка КС (Аа 34—51) [291
Взаимодействие между ДЦ и КС непосредственно не затрагивает
каталитического центра тромбина. Поэтому синтетический пептид, имити-
рующий последовательность 27—50 Αα-цепи фибриногена, ингибирует свер-
тывание и отщепление FPA, но не подавляет катализа специфического
низкомолекулярного субстрата, как показано при гидролизе Gly — Pro —
Arg — pNA [30].
Дополнительный центр и комплементарный сайт субстрата составляют
аппарат третичной (супер)специфичности тромбина [19]. Необходимость
предварительного узнавания — связывания специфического субстрата по
ДЦ не снижает важности связывания его в первичном кармане активного
центра. Это дало повод говорить о мостиковом связывании (bridge-binding),
как о характерной черте тромбина [31 ].
С помощью модели тромбина был проведен конформационный анализ
комплекса, образующегося при контакте ДЦ с КС фибриногена [10].
Рассчитаны топологические и энергетические параметры системы. Показа-
но, что комплексообразованию не препятствуют какие-либо существенные
стерические затруднения. Значительный вклад в формирование комплекса
принадлежит электростатическому притяжению. Уменьшение свободной
энергии за счет последнего составляет 45 ккал/моль, т. е. достаточно для
образования энергетически выгодного комплекса тромбина и фибриногена
вне области активного центра. Связывание фибриногена с тромбином
сопровождается потерей энтропии, следовательно, предполагает некую сте-
пень жесткости или возникновение напряжения. Напряжение появляется в
результате сочетания благоприятных и неблагоприятных электростатиче-
ских контактов. Для комплекса рекогниции фибриноген — тромбин элект-
ростатические силы являются определяющими, в отличие от комплекса с
гирудином, для которого также характерно мостиковое связывание, но
гидрофобные контакты не менее важны, чем электростатические [32 ].
Образование комплекса КС — ДЦ сопровождается изменением кон-
формации его компонентов, что хорошо видно при сравнении компьютер-
ных изображений свободной /?-петли и в составе комплекса (рисунок).
Интактный ДЦ (β-домен) имел вид изогнутой (искривленной) петли,
верхняя и нижняя ветви которой располагаются одна под другой, а изгиб
направлен вперед. В результате взаимодействия с фибриногеном петля
разогнулась, повернулась приблизительно на 90 градусов и приобрела
винтообразную форму (рисунок, б). При этом наибольшие пространствен-
ХАРАКТЕРНЫЕ ЧЕРТЫ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ФУНКЦИИ ТРОМБИНА
ные изменения коснулись положения атомов в участке, находящемся на
изгибе петли (Arg73 — Glu77), гораздо меньше смещены остатки возле ее
основания (Arg67 — Gly69, Ile79 — Lys81). Боковые радикалы остатков,
вокруг Са-атомов которых происходило вращение при разгибании и пово-
роте петли, изменили свое направление. Так, боковой радикал Lys70 и
имидазольное кольцо His71 повернулись вокруг оси примерно на 180
градусов. Эти данные означают, что взаимодействие ДЦ тромбина с его
специфическим субстратом фибриногеном связано с конформационными
изменениями.
Проанализированы пространственные соотношения между остатками
ДЦ и КС в комплексе [10]. Расстояния между их заряженными боковыми
группами позволяют говорить об образовании четырех водородно (-солевых)
связей. Донорные и акцепторные группы, входящие в эти ионные пары, и
расстояния между ними приведены в табл. 1.
Сближение обоих лигандов в результате связывания их дальнодейству-
ющими солевыми мостиками делает возможным гидрофобные и иного рода
ближние взаимодействия. Весьма вероятно участие в подобных взаимодей-
ствиях со стороны тромбина Thr74, Туг76 /?-петли и Тгр148 у-петли, со
стороны фибриногена — Asn42, Туг43, ТгрЗЗ. В частности, относительно
ТгрЗЗ фибриногена, расположенного на границе КС, показано, что модифи-
кация его приводит к резкому снижению скорости гидролиза α-тромбином,
но не отражается на действии у-формы [27, 29 ].
На вероятность изменения локализации Trp 148 при образовании комп-
лекса рекогниции указывают следующие данные.
1. По РСА, наибольшие различия в структуре комплексов тромбина с
низкомолекулярными (РРАСК [5 ]) и высокомолекулярными (гирудин)
специфическими ингибиторами приходятся на область у-петли Glu 146 —
Gly 150, разница по положению атома Ca Trpl48 между комплексами
составляет 6,3 А [33]. В комплексе с РРАСК Тгр148 расположен близко от
активного центра, своим объемным радикалом прикрывает его щель, а в
комплексе с гирудином петля 146—150 расположена несколько иначе:
окружает и сдвигает индольный радикал Trp [33 ]. Поскольку РРАСК с ДЦ
не реагирует, то очевидно, что эта область в комплексе с ДЦ тромбина
соответствует свободному ферменту, тогда как гирудин в данном случае
выступает аналогом фибриногена (комплекс с гирудином близок к таковому
с фибриногеном). Это значит, что связывание по ДЦ меняет конформацию
у-петли и, возможно, отодвигает Trpl48 от каталитической щели.
2. Связывание специфического лиганда (С-концевого пептида гируди-
на) в ДЦ защищает у-петлю от протеолиза (химотрипсином, эластазой) и
сопровождается увеличением удельной флюоресценции, скорее всего, из-за
смещения остатка Trp у-петли [34]. По мнению авторов, это свидетельст-
вует об аллостерическом взаимодействии, которое сопрягает (couples) ак-
тивный центр с у-петлей.
1 1
Α. Α. СВР ЕЙСКАЯ
Возможность конформационных изменений в у-петле и активном цент-
ре в итоге связывания с экзосайтом (ДЦ) специфического участка тромби-
нового рецептора тромбоцитов, сходного с КС фибриногена, отмечена при
кристаллографическом исследовании их комплекса [35 ]. Вследствие образо-
вания комплекса ДЦ — КС, очевидно, происходит переориентация заря-
женных групп, водородных и гидрофобных связей из района контакта КС
фибриногена и ДЦ тромбина на другие (внутримолекулярные) области
фермента.
Как волна по упругой поверхности, конформационные изменения могут
распространяться от /?-петли на у-петлю, а затем и на активный центр.
Такому индукционному процессу способствуют уже упомянутые особенно-
сти строения β- и у-петель, их относительная подвижность, отсутствие
жесткой вторичной структуры (они связаны со всей глобулой только у
основания, остальная же часть их выступает над поверхностью).
Образование комплекса ДЦ — КС инициирует специфическое (опти-
мальное) расположение фибриногена относительно тромбина. В итоге взаи-
модействия (узнавания — связывания) ДЦ — КС и последующих кон-
формационных изменений цепь фибриногена в участке расщепляемой связи
должна занять в молекуле тромбина положение, которое отличается от
исходного в свободном ферменте, но в области активного центра соответст-
вует конфигурации, создаваемой при связывании упомянутых выше адек-
ватных по вторичной специфичности лигандов.
Таким образом, за счет укладки цепи специфического субстрата справа
происходят благоприятные для катализа изменения в области активного
центра, гидролиз фибриногена может идти так же эффективно, как и
соответствующих вторичной специфичности низкомолекулярных (трипеп-
тидных) субстратов.
Конкретно пока что представляются вероятными три пути сопряжения
активного центра с дополнительным в результате образования комплекса
рекогниции.
1. Переключение каталитического механизма с однопротонного на
двухпротонный в результате смещения какого-либо остатка в направлении
активного Serl95, что дает ему возможность принять на себя функцию
дополнительного (по отношению к His57) донора — акцептора системы
переноса заряда. На основании опытов с тромбином, модифицированным по
гистидину (не тождественному His57), предположили [36], что в ДЦ входит
остаток His, который образует ионную пару с близлежащим ароматическим
остатком в свободном ферменте. При взаимодействии со специфическим
субстратом эта пара распадается, и освобождающийся His вовлекается в
сферу активного центра. Судя по модели, такую роль мог бы сыграть His71
/?-петли. Таким образом, однопротонный механизм становится двухпротон-
ным, при этом усиливается эффективность системы переноса заряда.
2. Изменение конформации, смещение какого-либо остатка каталитиче-
ской триады (например, поворот плоскости имидазольного кольца His57),
которое сокращает расстояние между каталитическими остатками, что
повышает вероятность завязывания соответствующих водородных связей в
системе переноса заряда.
3. Отодвигание, смещение остатков, затрудняющих (частично заслоня-
ющих) вход в щель активного центра, например Trp 148. Как указывалось
выше, этот остаток Trp располагается в у-петле и может быть оттянут в
результате прямого гидрофобного контакта с ароматическими остатками КС
фибриногена или перераспределения водородных связей в ДЦ с участием
ароматических остатков Trp β-петли.
Помимо приведенных выше данных PCA о появлении конформацион-
ных изменений в результате связывания по ДЦ, в пользу гипотезы о
12
ХАРАКТЕРНЫЕ ЧЕРТЫ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ФУНКЦИИ ТРОМБИНА
сопряжении ДЦ и активного центра в результате образования комплекса
рекогниции со специфическим субстратом свидетельствуют и кинетические
эксперименты.
Модификации тромбина, избирательно снижающие его свертывающую
активность, т. е. разрушающие ДЦ, в большей мере снижают каталитиче-
ский этап реакции отщепления FPA (по кш) , чем образование комплекса
Михаэлиса (по 1 / Км). Подобные модификации могут быть вызваны ограни-
ченным протеолизом (образование несвертывающих форм β-, у-Тр), при-
родными и геноинженерными мутациями, химическими воздействиями
(табл. 2). Это доказывает, что дело не просто в увеличении мест связыва-
ния, а и в воздействии на каталитический центр.
Таблица 2
Влияние модификаций на свертывание фибриногена и отщепление
фибринопептида А тромбином (кинетические параметры)
Тромбин (его Б-цепь), как можно видеть на модели, подобно другим
сериновым протеиназам состоит из двух основных доменов. По гипотезе же
Дуфтона [39], для трипсиноподобных сериновых протеиназ характерно
движение этих двух доменов относительно друг друга, что аллостерически
вызывает изменение конформации, способствующее ускорению расщепле-
ния чувствительной связи. В случае гидролиза специфических высокомоле-
кулярных субстратов тромбином такое смещение доменов происходит вслед-
ствие контакта ДЦ и КС справа от каталитического центра. Но можно
представить себе и благоприятные изменения в активном (каталитическом)
центре в результате взаимодействия слева от него между аполярным
центром и специфическим низкомолекулярным субстратом (вторичная спе-
цифичность). При этом повышение эффективности работы каталитического
аппарата в большей мере зависит от улучшения связывания, чем от
усиления каталитического этапа. На это указывает преимущественное
снижение 1 /Km при нарушении аполярного центра.
Так, при гидролизе D-Phe-Pip-Arg-pNA нарушение S2 и/или арилсвя-
зывающего центра выражается в 16-кратном уменьшении этой величины,
тогда как к ш практически не меняется [38 ].
В смысле усиления каталитического действия оба способа воздействия,
вероятно, подобны. Но принципиальная разница между ними та, что при
реализации третичной специфичности определенная автономность, изолиро-
ванность ДЦ и КС от активного центра и участка расщепляемой связи
удлиняют и усложняют путь индукционного воздействия, сужая круг
субстратов И, следовательно, делая его более селективным, подходящим для
целей биорегуляции.
13
Α. Α. СВР ЕЙСКАЯ
В заключение выражаю благодарность С. В. Полтановой за помощь в
оформлении рукописи.
А. О. Єврейська
Характерні риси специфічної ферментативної функції тромбіна та їх зв'язок із структурою
Резюме
В огляді наведеш відомості щодо особливостей структури тромбіна, які впливають на високу
селективність та ефективність його дії у системі згортання крові Розглядається значення
додаткового екзосайту впізнавання — зв* язування ферменту у взаємодії з фібршюгеном. Обго
ворюється можливість виникнення конформаційних змін внаслідок утворення комплексу фібри
но ге н — тромбін, що спричинює прискорення каталітичного процесу.
A. A. Sereyskaya
Characteristic features of specific fermentative function of thrombin and it's connection with the structure
Summary
This review deals with thrombin peculiarities responsible for its highly selective and effective action in blood
clotting system Role of enzyme additional binding-recognition exosites in interaction with fibrinogen is
analyzed. As a result of thrombin-fibrinogen recognition complex formation is supposed some conforma-
tional changes to arise that couple exosite with active centre and accelerate the catalytic process.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Hartley В. S. The active centers of serine proteinases / / Ann. N. Y. Acad. Sci.—1974.—227.—
P.438—445.
2. Isquierdo C., Burguillo F. J. Synthetic substrates for thrombin 11 Int. J. Biochem.—1989.—21,
N 6.—P.579—592.
3. Серебряный С. Б. Тромбин, его строение и особенности катализа / / Биохимия и
физиология животных и человека.—1982.—№ 6.—С. 14—26.
4. Sereyskaya А. A., Karabut JL V., Shchechkin /. Е. On the efficiency and selectivity of thrombin
catalysis 11 Thrombosis Res.—1994.—74, N 5.—P. 549—550.
5. Bode W., Mayr /., Baumann U. et aL Refined 1,9 A crystal structure of human α-thrombin 11
EMBO J.—1989.—8.—P. 3467—3475.
6. Stubbs M. T., Oschkinat HMayr I. et ai The interaction of thrombin with fibrinogen, A
structural basis for its specificity 11 Eur. J. Biochem.—1992.—206.—P. 187—195.
7. Martin P. D., Robertson W., Turk D. et ai The structure of residues 7—16 of the Aa-chain
of human fibrinogen bound to bovine thrombin at 2.3 A resolution / / J . Biol. Chem.—1992.—
267, N 11.—P. 7911—7920.
8. Серейская А. А., Карабут Л. В., Смирнова И. В., Щечкин И. Е. О взаимодействии
дополнительного центра тромбина с комплементарным сайтом фибрингена / / Докл. АН
Украины.—1991.—№ 11.—С. 140—143.
9. Карабут Л. ВСерейская А. А. Особенности строения контактной зоны тромбина.
Возможные механизмы взаимодействия его с низко- и высокомолекулярными субстрата-
ми / / Биополимеры и клетка.—1992.—8, № 5.—С. 31—35.
10. Карабут Л. В., Щечкин И. E., Серейская А. А. Моделирование комплекса рекогниции
фибриногена тромбином / / Там же.—1994.—10, № 6.—С. 80—84.
11. Tsukada #., Blow D. Μ. Structure of α-chymotrypsin refined at 1.68 A resolution 11 J. Мої.
Biol.—1985.—184, N 9.—P. 703—711.
12. Кибирев В. K.r Серейская А. А. Структурные основы специфичности тромбина / /
Биохимия животных и человека.—1989.—Вып. 13.—С. 10—18.
13. Chang J. Υ. Thrombin specificity. Requirement for apolar aminoacids... 11 Eur. J. Biochem.—
1985.—151, N 2.—P. 217—224.
14. Banner D. W., Hadvary P. Crystallographic analysis at 3.0 A resolution of the binding to human
thrombin of four active site-directed inhibitor / / J. Biol. Chem.—1991.—266, N 30.—
P. 20085—20093.
15. Bode W., Turk DSturzebecher J. Geometry, X-ray crystallographic determination of
NAPAP-trypsin complex a. modelling of NAPAP-thrombin a. MQPA-thrombin / / Eur. J.
Biochem.—1990.—193, N 1.—P. 175—182.
16. Пояркова С. Α., Кибирев В. К, Серебряный С. Б. Исследование ингибиторного действия
14
ХАРАКТЕРНЫЕ ЧЕРТЫ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ФУНКЦИИ ТРОМБИНА
метиловых эфиров аргининсодержащих олигопептидов Fia тромбин и трипсин / / Укр.
биохим. журн.—1987.—59, № 5.—С. 5—11.
17. Пояркова С. А , Кибирев В. К, Серебряный С. Б. Ингибирование протеолитической
активности тромбина метиловыми эфирами аргининсодержащих олигопептидов / / Там
же.—1986.—58, № 6.—С. 3—8.
18. Magnusson S., Petersen Т. Е. Proteases a. biological control 11 Conf. on cell proliferation:
Abstr.— New York: Cold Spring Harbor Lab., 1975.—Vol 2.—P. 123—149.
19. Серейская А А. О суперспецифичности тромбина .// Молекуляр. биология.—1980.—
Вып. 27.—С. 68—79.
20. Fenton J. IV. Thrombin specificity / / Ann. Ν. Υ. Acad. Sci.-1981.—370.—P. 468—495.
21. Karshikov Α., Bode W. Electrostatic propertier of thrombin: importance for structural
stabilization and ligand binding / / Sem. Thromb. Hemost.—1993.—19, N 4.—P. 334—343.
22. Fenton J. W., Olsson T., Zabinski M. et al. Anion-binding exosite of human α-thrombin and
fibrin(ogen) recognition / / Biochemistry.—1988.—27, N 18.—P. 7106—7112.
23. Whinna H. C., Church F. C. Interaction of thrombin with AT, heparin cofactor 2, and protein
C inhibitor 11 J. Prot. Chem.—1993.—12, N 6.—P. 677—688.
24. Seegers W., Hassouna H., Walz G. et al. Prothrombin and thrombin. Selected aspects of
thrombin formation, properties, inhibition and immunology 11 Sem. Thromb. Hemost.—1975.—
1 — P. 211—283.
25. Hofsteenge J., Braun P. J.y Stone S. R. Enzymatic properties of proteolytic derivatives of human
«-thrombin 11 Biochemistry. —1988.—27, N 6.—P. 2144—2151.
26. Henricsen R. А.у Mann K G. Identification of primary structural defect in dysthrombin Quick
1 / / Ibid.—N 26.—P. 9161—9165.
27. Hogg D. II.} Blomback B. Mechanism of fibrinogen-fibrinogen reaction 11 Thromb. Res.—
1978.—12.—P. 953—964.
28. Scheraga H. A. Chemical basis of thrombin interactions with fibrinogen 11 Ann. N. Y. Acad.
Sci.-1986.—485.—P. 124—133.
29. Серейская А. А , Смирнова И. В., Карабут Л. В., Четыркина С. Н. Критическая роль
взаимодействия анионсвязывающего дополнительного центра тромбина с комплементар-
ным ему участком Αα-цепи фибриногена для проявления высокой специфичности
фермента / / Биохимия.—1994.—59, № 3.—С. 360—367.
30. Binne С. G., Lord S. Т. A synthetic analog of fibrinogen a-21—50 is an inhibitor of
thrombin 11 Thromb. Haemost—1991.—65.—P.165—168.
31. Maraganore J. M., Bourdon P., Jablonski J. et al Design and characterization of hirulogs: a
novel class of bivalent inhibitors of thrombin / / Biochemistry.—1990.—29.—P. 7095—7101.
32. Hopfner K.-P., Ayala Y., Szewchuk Z. et al. Chemical compensation in maqcomolecular
bridge-binding to thrombin / / Ibid.—1993.—32, N 12.—P. 2947—2953.
33. Rydel T. /., Tulinsky A , Bode W., Huber R. Refined structure of hirudin-thrombin-complex 11
J. Мої. Biol.—1991.—221.—P. 583—601.
34. Parry Μ. A., Stone S. R., Hofsteenge J., Jackman M. P. Evidence for common structural
changes in thrombin induced by active site or exosite binding 11 Biochem. J.—1993.—290.—
P. 665—670.
35. Mathews I. I., Padmanabhan K. P., Ganesh V. et al. Crystallographic structures of thrombin
complexed with thrombin receptor peptides / / Biochemistry.—1994.—33, N 11.—P. 3266—
3279.
36. Church F. C., Lundblad R. L., Noyes С. M. Modification of histidines in human prothrombin 11
J. Biol. Chem.—1985.—260, N 8.—P. 4936—4940.
37. Lundblad R. L.y Noyes C. M., Featherstone C. L et al. Reaction of bovine α-thrombin with
tetranitromethane / / Ibid.—1988.—263, N 8.—P. 3279-3734.
38. Le Bonniec B. F.y Guinto E. RMacGillivary R. T. A. et al. Role of thrombins
Tyr-Pro-Pro-Trp motif in interaction with fibrinogen, thrombomodulin, protein C, AT and
Kunitz inhibitors / / Ibid.—1993.—268, N 26.—P. 19055—19061.
39. Dufton M. J. Could domain movements be involved in mechanism of trypsin-like serine
proteases? / / FEBS Lett.—1990.—271, N 12.—P. 9—13.
УДК 577 344 Поступила в редакцию 26.04.95
15
|