Измерение констант ДНК-белкового связывания с помощью комплекса хроматограф «Милихром» — ЭВМ

Для определения констант ДНК-белкового связывания использован метод гель-хроматографии. В качестве регистрирующего прибора применен комплекс, состоящий из многоволнового сканирующего хроматографа «Милихром » и ЭВМ «Искра-226». Программное обеспечение, разработанное для этого комплекса, позволяет в л...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	1988
Автори:	Каламбет, Ю.А., Бурова, Е.И., Жучков, А.А., Кнорре, В.Л., Александров, А.А.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1988
Назва видання:	Биополимеры и клетка
Теми:	Структура и функции биополимеров
Онлайн доступ:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153814
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Измерение констант ДНК-белкового связывания с помощью комплекса хроматограф «Милихром» — ЭВМ / Ю.А. Каламбет, Е.И. Бурова, А.А. Жучков, В.Л. Кнорре, А.А. Александров // Биополимеры и клетка. — 1988. — Т. 4, № 1. — С. 20-27. — Бібліогр.: 19 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-153814
record_format	dspace
spelling	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1538142025-02-23T19:53:53Z Измерение констант ДНК-белкового связывания с помощью комплекса хроматограф «Милихром» — ЭВМ Зміна констант ДНК-білкового зв’язування за допомогою комплексу хроматограф «Милихром» — ЕОМ Measurement ob DNA-protein binding constants by means of chromatograph «Milichrom» —computer complex Каламбет, Ю.А. Бурова, Е.И. Жучков, А.А. Кнорре, В.Л. Александров, А.А. Структура и функции биополимеров Для определения констант ДНК-белкового связывания использован метод гель-хроматографии. В качестве регистрирующего прибора применен комплекс, состоящий из многоволнового сканирующего хроматографа «Милихром » и ЭВМ «Искра-226». Программное обеспечение, разработанное для этого комплекса, позволяет в любой момент времени определять концентрации ДНК и белка. Получаемая информация о зависимости концентраций ДНК и белка от времени используется для определения констант ДНК- белкового связывания. Метод применен к исследованию взаимодействия РНК-полимеразы Е. соli с рядом плазмидных ДНК и четырьмя одноните- выми олигодезоксирибонуклеотидами — фрагментами промоторов Е. coli Для определения констант ДНК-белкового связывания использован метод гель-хроматографии. В качестве регистрирующего прибора применен комплекс, состоящий из многоволнового сканирующего хроматографа «Милихром» и ЭВМ «Искра-226». Программное обеспечение, разработанное для этого комплекса, позволяет в любой момент времени определять концентрации ДНК и белка. Получаемая информация о зависимости концентраций ДНК и белка от времени используется для определения констант ДНК-белкового связывания. Метод применен к исследованию взаимодействия РНК-полимеразы Е. соli с рядом плазмидных ДНК и четырьмя однонитевыми олигодезоксирибонуклеотидами — фрагментами промоторов Е. coli The method of gel-chromatography is used to determine the constants of DNA-protein binding. The complex consisting of multiwave scanning chromatograph «Milichrom» and computer «Iskra-226» is used as a registering device. The software for this complex allows determining DNA and protein concentrations at any moment. Information on time dependence of DNA and protein concentrations is used to determine the constants of DNA-protein binding. The method is applied to investigate the interaction of RNA-polymerase of E. coli by a number of plasmids and four one-stranded oligodesoxyribonucleotides — ihe fragments of E. coli promoters. 1988 Article Измерение констант ДНК-белкового связывания с помощью комплекса хроматограф «Милихром» — ЭВМ / Ю.А. Каламбет, Е.И. Бурова, А.А. Жучков, В.Л. Кнорре, А.А. Александров // Биополимеры и клетка. — 1988. — Т. 4, № 1. — С. 20-27. — Бібліогр.: 19 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00020D https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153814 543.544.42.08:577.214.625 ru Биополимеры и клетка application/pdf Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров
spellingShingle	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров Каламбет, Ю.А. Бурова, Е.И. Жучков, А.А. Кнорре, В.Л. Александров, А.А. Измерение констант ДНК-белкового связывания с помощью комплекса хроматограф «Милихром» — ЭВМ Биополимеры и клетка
description	Для определения констант ДНК-белкового связывания использован метод гель-хроматографии. В качестве регистрирующего прибора применен комплекс, состоящий из многоволнового сканирующего хроматографа «Милихром » и ЭВМ «Искра-226». Программное обеспечение, разработанное для этого комплекса, позволяет в любой момент времени определять концентрации ДНК и белка. Получаемая информация о зависимости концентраций ДНК и белка от времени используется для определения констант ДНК- белкового связывания. Метод применен к исследованию взаимодействия РНК-полимеразы Е. соli с рядом плазмидных ДНК и четырьмя одноните- выми олигодезоксирибонуклеотидами — фрагментами промоторов Е. coli
format	Article
author	Каламбет, Ю.А. Бурова, Е.И. Жучков, А.А. Кнорре, В.Л. Александров, А.А.
author_facet	Каламбет, Ю.А. Бурова, Е.И. Жучков, А.А. Кнорре, В.Л. Александров, А.А.
author_sort	Каламбет, Ю.А.
title	Измерение констант ДНК-белкового связывания с помощью комплекса хроматограф «Милихром» — ЭВМ
title_short	Измерение констант ДНК-белкового связывания с помощью комплекса хроматограф «Милихром» — ЭВМ
title_full	Измерение констант ДНК-белкового связывания с помощью комплекса хроматограф «Милихром» — ЭВМ
title_fullStr	Измерение констант ДНК-белкового связывания с помощью комплекса хроматограф «Милихром» — ЭВМ
title_full_unstemmed	Измерение констант ДНК-белкового связывания с помощью комплекса хроматограф «Милихром» — ЭВМ
title_sort	измерение констант днк-белкового связывания с помощью комплекса хроматограф «милихром» — эвм
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1988
topic_facet	Структура и функции биополимеров
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153814
citation_txt	Измерение констант ДНК-белкового связывания с помощью комплекса хроматограф «Милихром» — ЭВМ / Ю.А. Каламбет, Е.И. Бурова, А.А. Жучков, В.Л. Кнорре, А.А. Александров // Биополимеры и клетка. — 1988. — Т. 4, № 1. — С. 20-27. — Бібліогр.: 19 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT kalambetûa izmereniekonstantdnkbelkovogosvâzyvaniâspomoŝʹûkompleksahromatografmilihromévm AT burovaei izmereniekonstantdnkbelkovogosvâzyvaniâspomoŝʹûkompleksahromatografmilihromévm AT žučkovaa izmereniekonstantdnkbelkovogosvâzyvaniâspomoŝʹûkompleksahromatografmilihromévm AT knorrevl izmereniekonstantdnkbelkovogosvâzyvaniâspomoŝʹûkompleksahromatografmilihromévm AT aleksandrovaa izmereniekonstantdnkbelkovogosvâzyvaniâspomoŝʹûkompleksahromatografmilihromévm AT kalambetûa zmínakonstantdnkbílkovogozvâzuvannâzadopomogoûkompleksuhromatografmilihromeom AT burovaei zmínakonstantdnkbílkovogozvâzuvannâzadopomogoûkompleksuhromatografmilihromeom AT žučkovaa zmínakonstantdnkbílkovogozvâzuvannâzadopomogoûkompleksuhromatografmilihromeom AT knorrevl zmínakonstantdnkbílkovogozvâzuvannâzadopomogoûkompleksuhromatografmilihromeom AT aleksandrovaa zmínakonstantdnkbílkovogozvâzuvannâzadopomogoûkompleksuhromatografmilihromeom AT kalambetûa measurementobdnaproteinbindingconstantsbymeansofchromatographmilichromcomputercomplex AT burovaei measurementobdnaproteinbindingconstantsbymeansofchromatographmilichromcomputercomplex AT žučkovaa measurementobdnaproteinbindingconstantsbymeansofchromatographmilichromcomputercomplex AT knorrevl measurementobdnaproteinbindingconstantsbymeansofchromatographmilichromcomputercomplex AT aleksandrovaa measurementobdnaproteinbindingconstantsbymeansofchromatographmilichromcomputercomplex
first_indexed	2025-11-24T18:46:39Z
last_indexed	2025-11-24T18:46:39Z
_version_	1849698549242003456
fulltext	турация Д Н К в кислой среде / /Молекуляр . биология.— 1981.— 15, № 5.— С. 1093— 1101. 7. Фридман А. С., Ландо Д. Ю. Кооперативное контактное взаимодействие между ли- гандами, адсорбированными на ДНК, вызывает уменьшение ширины температур- ного интервала плавления / / Тез. докл. V Всесоюз. конф. по спектроскопии биополи- меров—Харьков, 1984 — С . 251. 8. Tachibana Η., Wada A. Ligand induced melting reaction of specific-sequence DNA molecules / / Biopolymers.— 1982.—21, N 9.— P. 1873—1886. 9. Fine structure of DNA melting curves / Yu. L. Lyubchenko, M. D. Frank-Kamenetskii, Α. V. Vologodskii et al. / / Ibid.— 1976,— 15, N б — P. 1019—1036. 10. Raukas E., Raitn T. Thermal denaturation of distamicin A—DNA complexes as follo- wed hyperchromic spectra / / Biophys. Chem.—- 1980.— 11, N 2.— P. 233—237. 11. Об особенностях перехода спираль — клубок Д Н К в области инверсии относитель- ной стабильности GC- и АТ-пар, обусловленной ионами Си2+ и Мп 2 + / Ю. П. Бла- гой, В. А. Сорокин, В. А. Валеев, Г. О. Г л а д ч е н к о / / Д о к л . АН СССР — 1978.— 240, № 2.— С. 459—462. 12. Melchior W. В., von Hippel P. Η. Alteration of the relative stability of dA-dT and dG-dC base pairs in D N A / / P r o c . Nat. Acad. Sci. USA.— 1973.—70, N 2 .—P. 298— 302. 13. Record Af. Т., Woodbury C. P., Ross В. I. Characterization of rod-like DNA frag- ments / / Biopolymers.— 1975,— 14, N 2.— P. 393—408. 14. Woodbury C. P., Record Μ. T. A range of GC-independent denaturation solvents for D N A / / I b i d . — Ν 11.—P. 2417—2420. 15. Монаселидзе Д. P., Мгеладзе Г. Η. Тепловые свойства Д Н К и полидезоксирибо- нуклеотидов в широкой области концентраций ионов солей и полимера / / Биофизи- ка.— 1977.— 22, № 5,— С. 950—958. 16. Shapiro J. Т., Stannard В. SFelsenfeld G. The binding of small cations to deoxyri- bonucleic acid. Nucleotide specificity / / Biochemistry.— 1969·—8, N 8 .—P. 3233—3241. 17. Габриелян А. Г. Конформационные переходы Д Н К в концентрированных растворах нейтральных солей / / Биофизика.— 1979.— 24, № 4.— С 620—632. РІн-т биоорг. химии АН БССР, Минск Получено 04.06.86- У Д К 543.544.42.08:577.214.625 ИЗМЕРЕНИЕ КОНСТАНТ ДНК-БЕЛКОВОГО СВЯЗЫВАНИЯ С ПОМОЩЬЮ КОМПЛЕКСА ХРОМАТОГРАФ «МИЛИХРОМ» — ЭВМ Ю. А. Каламбет, Е. И. Бурова, А. А. Жучков, В. Л. Кнорре, А. А. Александров Введение. В литературе описано большое число способов определения констант ДНК-белкового связывания с помощью гель-хроматографии [1—4]. Во всех вариантах постановки хроматографического экспери- мента исходными данными для подсчета констант являются зависи- мости концентраций Д Н К и белка от времени. Для облегчения расче- тов желательно иметь обе зависимости. Однако при детектировании хроматограммы на одной длине волны обе зависимости получить не- возможно. Использование многоволнового детектора хроматографа «Мили- хром» [5] делает задачу одновременного определения концентраций разрешимой. В работах [3, 4] регистрировали хроматограммы с по- мощью самописца, и для определения соотношения количеств Д Н К и белка применяли спектральное отношение на двух длинах волн. При таком способе регистрации невозможно адекватно оценить ошибку определения количеств веществ и затруднено использование большого числа длин волн. Регистрация хроматограммы с использованием ЭВМ и последую- щий анализ полученных данных позволяют решить задачу определения количеств Д Н К и белка в смеси с максимальной точностью и с учетом измерений, сделанных на любых выбранных длинах волн. В данной работе представлены результаты проведенных нами с помощью комплекса хроматограф «Милихром» — ЭВМ «Искра-226» экспериментов по изучению взаимодействия РНК-полимеразы Esche- 20 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА,— 1988,— Т. 4, № Ь richia coli с Д Н К плазмид рАОЗ, pUC19, pBR322 со вставкой гена гор- мона роста, а также с однонитевыми олигодезоксирибонуклеотидными последовательностями — фрагментами промоторов Spc и trpR генов Е. coli. Материалы и методы. Д Н К . Плазмиды рАОЪ [6] (штамм С600), pUC19 [7] (JM83), pBR322 со вставкой гена гормона роста человека (НВ101) выделяли из кле- ток Е. coli щелочным методом с последующим равновесным центрифугированием в градиенте плотности CsCl в присутствии бромистого этидия. О л и г о н у к л е о τ и д ы. Для анализа связывания с РНК-полимеразой Е. coli использовали следующие однонитевые синтетические олигодезоксирибонуклеотиды: 1) 5'-TATAATGCC из «—11—3» области 5рс-промотора; 2) 5'-TATAATGCCGCG из «-—11 + 1» области Spc-промотора: 3) 5'-TATCGTACTCTT из «—13—2» области промо- тора гена irpR\ 4) S'-ATAGCATGAGAA из «—2—13» области промотора гена trpR. Синтетические олигонуклеотиды 1 и 2 соответствуют участку транскрибируемой нити Д Н К в «—10» области Зрс-промотора рибосомных генов Е. coli\ 3 и 4 представ- ляют собой комплентарные участки Д Н К из промотора гена trpR репрессора Е. coli. Олигонуклеотиды 1 и 2 синтезированы и любезно предоставлены Н. В. Амсрхановым, а 3 и 4 — Л. В. Барановой (Ин-т цитологии и генетики Сиб. отд-ния АН СССР). Ρ Η К-п о л и м е ρ а з а. Очистку холофермента PHR-полимеразы проводили по методу [8]. Гомогенность фермента составляла > 9 5 % по данным электрофореза в 7 %-ном полиакриламидном геле в присутствии DS-Na. Содержание гг-субъединицы определяли спектрофотометрически в процессе отделения ее от минимального фермента на ионообменной смоле «Bio-Rex 70» («Віо-Rad», США). Определение концентрации активного фермента в препарате проводили по методу [9]. С в я з ы в а н и е и к и н е т и к а д и с с о ц и а ц и и. Связывание РНК-полимеразы с Д Н К осуществляли в следующих условиях. Инкубационная смесь объемом 50 мкл содержала 20 мМ ТЭА-НС1, рН 7,9, 100 мМ КС1, 10 мМ MgCl2, 0,2 мМ ДТТ, 20 мкг/мл Д Н К и РНК-полчмсразу (молярное отношение концентраций фермента и Д Н К варьи- ровало от 5 до 60). Смесь инкубировали при 37 °С в течение 30 мин, затем проводили ступенчатую фиксацию специфических комплексов Д Н К с РНК-полимеразой формаль- дегидом [10], добавляя его до концентрации 0,2 %, через 2 мин—до 2 % и выдержи- вали еще 10 мин. Связывание РНК-полимеразы с олигонуклеотидом проходило в процессе хромато- графии фермента на колонке, заполненной олигонуклеотидом, в том же буфере, что и при связывании с ДНК, при комнатной температуре. В экспериментах по кинетике диссоциации комплексов РНК-полимеразы с Д Н К для инактивирования свободной полимеразы в растворе использовали гепарин(«Spofа», ЧССР) в концентрациях от 5 до 100 мкг/мл. Через определенные промежутки времени после добавления гепарина отбирали аликвоту инкубационной смеси, проводили сту- пенчатую фиксацию комплексов, формальдегидом и гель-хроматографический анализ. Х р о м а т о г р а ф и я . Гель-хроматографию комплексов Д Н К с РНК-полимеразой, зафиксированных формальдегидом, проводили в стеклянных колонках объемом 20U— 600 мкл, заполненных TSK-гелем HW65F («Тоуо Soda», Япония). Раствор, содержащий 0,5 мкг Д Н К и РНК-полимеразу, наносили на колонку с помощью насоса хроматографа <- Милих ром». Скорость подачи растворителя насосом хроматографа составляла 10— 20 мкл/мии. Состав элюента — буфер для связывания Д Н К с РНК-полимеразой. Ти- пичная хроматограмма изображена на рис. 1. Д Н К и комплекс выходили в исключен- ном объеме (пик /1), несвязанная РНК-полимераза — примерно в середине диапазона фракционирования колонки (пик Б). Во избежание ошибки, связанной с перекрыванием пиков, соотношение Д Н К — белок в пике исключенного объема определяли по спектру первой половины этого пика. Хроматографическое определение изотермы связывания РНК-полимеразы с олиго- дезоксирибонуклеотидами проводили импульсным методом [1]. Стеклянную колонку объемом 300—600 мкл, заполненную смолой «Sephadex-50S», уравновешивали буфе- ром для связывания, в который добавлен олигонуклеотид в различных концентрациях (or 1 до 20 мкг/мл). На колонку наносили «импульс» РНК-полимеразы (3—5 мкг). Для хроматографии использовали раствор, содержащий олиго-ДНК в различных кон- центрациях (от 1 до 20 мкг/мл). В ходе хроматографии РНК-полимераза «обгоняет» олигонуклеотид, увлекая за собой ту его часть, которая связана с ферментом. За «им- пульсом» РНК-полимеразы остается провал, связанный с тем, что полимераза забрала Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА,— 1988.—Т. 4, № 1 4 — 7-674 21 часть олигонуклеотида из раствора. Таким образом, создаются условия, при которых комплекс РНК-полимеразы с олигонуклеотидом находится в равновесии с растворенным олигонуклеотидом. Хроматограмма представлена на рис. 2. Определение соотношения концентраций РНК-полимеразы и олигонуклеотида в комплексе проводится по спектру первой половины пика А на рис. 2. М е т о д р а с ч е т а к о н с т а н т с в я з ы в а н и я Р Н К-п о л и м е р а з ы с Д Н К - При расчете констант связывания предполагается, что имеются два типа мест связыва- л а * мкл Рис. 1. Хроматографический профиль элюции комплексов РНК-полимеразы Е. coli с Д Н К на геле TSK HW65. Оптическое поглощение А на длине волны 280 ( / ) и 260 нм (2). Пик А соответствует Д Н К и комплексу, пик Б — свободному ферменту Fig. 1. Chromatographic profile of elution of RNA-polymerase — DNA complexes on TSK HW65 gel. The optical absorption A is shown for two wavelengths: 280 nm ( / ) and 260 nm (2). Peak A co rr^sponds to DNA and the complex, peak Б — to unbound enzyme Рис. 2. Хроматографический профиль элюции комплексов РНК-полимеразы Е. coli с олигодезоксирибонуклеотидами на смоле «Sephadex-50S». Оптическое поглощение на длине волны 260 ( / ) и 280 нм (2). Пик А соответствует комплексу Fig. 2. Chromatographic profile of elution of RNA-polymerase — oligodesoxyribonucleoti- de complexes on «Sephadex G-50S» gel. The optical absorption in shown for two wave- lengths: 260 nm ( /) and 280 nm (2). Peak A corresponds to the complex где Д — место сильного связывания (все места сильного связывания считаются одина- ковыми); Ρ— РНК-полимераза; ДР— комплекс; К — константа специфического· связывания. (2) где С д н к — молярная концентрация Д Н К в растворе; г — молярное отношение концент- [ЯР] раций РНК-полимеразы и Д Н К в комплексе, т. е. г = ρ ; г0 — число мест сильно- Чцнк 22 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА.— 1988.—Т. 4, № } ния— сильного и слабого, или неспецифического. Взаимодействие с местами сильного· связывания описывается уравнением R0 — молярное отношение исходных концентраций РНК-полимеразы и Д Н К в растворе; Янс — молярное отношение концентраций РНК-полимеразы, идущей на неспецифическое связывание, и ДНК. Места слабого связывания в нашей модели описываются уравнениями Мак-Ги и фон Хиппеля [11]. Количество свободной РНК-полимеразы в растворе, необходимое для подсчета константы сильного связывания, определяли по уравнению [11] в пред- положении, что константа «еспецифического связывания РНК-полимеразы с Д Н К рав- Рис. 3. Изотермы связывания РНК-полимеразы Е. coli с Д Н К плазмиды pBR322 со вставкой ( / ) ; с Д Н К плазмиды pUC19 (2) и Д Н К плазмиды рАОЗ (3); ft— число мо- лекул РНК-полимеразы, связанных с ДНК; Ro — число молекул РНК-полимеразы в растворе, приходящихся на одну пару нуклеотидных оснований Fig. 3. Isotherms of RNA-polymerase binding to DNA of plasmids: pBR322 with an insertion ( / ) ; pUC19 (2), and рАОЗ (3); r is a number of RNA-polymerase molecules bound with DNA; R0 is the number of RNA-polymerase molecules per one pair of nucle- otide bases in solution на 5-Ю5 Μ" 1 (концентрация Д Н К измеряется в молях пар оснований на литр), в при- сутствии 0,05 Μ NaCl и 0,01 Μ MgCl2 [12]. Размер места связывания составляет 42 нуклеотида [13]. В формуле (2) известной величиной является С д Н К ; R — рассчитывается из (3) списанным выше способом из начальной концентрации РНК-полимеразы в. растворе; г определяется в ходе хроматографического эксперимента с помощью разработанного комплекса программного обеспечения. Построение зависимости г от ^ позволяет определить параметры связывания К и г0. В случае связывания РНК-полимеразы с олигонуклеотидом имеется лишь один тип мест связывания, и может связаться только одна молекула РНК-полимеразы, поэтому г 0 = 1. ·. * Ν Результаты и обсуждение. На рис. 3 представлена зависимость среднего числа молекул РНК-полимеразы, специфически связанных с Д Н К (г), от исходного числа молекул РНК-полимеразы в растворе, приходящихся на моль пар оснований Д Н К Изотермы связыва- ния построены для Д Н К плазмид pBR322 ( — 4362 н. п.) со вставкой размером 800 нуклеотидов (ген гормона роста человека), pUC19 (2686 н. п.) и рАОЗ (1683 н. п.). Начальный наклон этих кривых опре- деляется константой связывания, значения кривых в насыщении опре- деляют число мест специфического связывания на данной ДНК. Для Д Н К pBR322 со вставкой число мест связывания равно 20+1 , для pUC19 — 74=1, для рАОЗ — 4 ± 1 . Точность получаемых значений обу- словлена ошибкой в определении отношения концентраций белка и Д Н К и в основном связана со значительным перекрыванием двух хро- матографических пиков (А и Б на рис. 1) при насыщающих концен- трациях РНК-полимеразы. Таким образом, для данных Д Н К одно Б И О П О Л И М Е Р Ы И К Л Е Т К А , - 1988,—Т. 4, № 1 4 * 23 го связывания на ДНК; R — молярное отношение концентраций свободной РНК-полиме- разы и Д Н К в растворе: место связывания фермента приходится на 250, 380 и 420 пар основа- ний соответственно. Эти данные согласуются с последующим анализом отфильтрованных комплексов с помощью электронной микроскопии. При значениях / ? 0 > 0 , 0 5 все изотермы связывания выходят на насы- щение вследствие того, что константы связывания К для данных Д Н К близки. Предполагается, что все места связывания на Д Н К идентичны. Зависимости г от Ro перестраивали в координаты г от R и из получен- ной зависимости определяли значения равновесных констант специфи- ческого связывания согласно формуле (2). Для данных трех Д Н К в 2—50; 3—100 мкг/мл; r(t) —среднее число молекул фермента, специфически связанных с ДНК в момент времени t Fig. 4. Kinetics of release of the polymerase from DNA of pBR322 plasmid with an in- sertion at various heparin concentrations. 1 — 5 ^ig/ml; 2 — 50 (ug/ml; 3—100 μ^/ηιΐ . Value 100 r (t)/r(0) is plotted against time on logarithmic scale. r(t) is the mean value of enzyme molecules bound with DNA at time t пределах ошибки эксперимента получили одинаковые значения К = = 3-109 М - 1 (рассчитано на моль пар оснований Д Н К ) . Это значение согласуется с данными, полученными в работе [14], где с помощью метода электронной микроскопии определена константа взаимодействия РНК-полимеразы Е. coli с Д Н К репликативной формы фага fd. Полу- ченное нами значение согласуется также с результатами Сибурга и др. [16], которые рассчитали равновесную константу взаимодействия с пятью промоторами репликативной формы fd, исходя из отношения кинетических констант, определенных методом связывания на филь- трах. При 0,01 Μ MgCl2 , 0,12 Μ КС1 величины К варьировали в диа- пазоне 2-108—2-109 М-1 . Для олигонуклеотидов константа связывания в принципе может быть рассчитана из одной точки на изотерме связывания, так как г0 = = 1, и число неизвестных параметров в уравнении (2) уменьшается до одного. Для препарата 1 была получена изотерма равновесного свя- зывания, и мы определяли одновременно К и го. В данном эксперименте полученное максимальное отношение, равное 1,28, может быть обуслов- лено следующими обстоятельствами: а) отсутствием точного значения коэффициента экстинкции для олигонуклеотидов, который в данных экспериментах принимался равным 35 о. е . -мл/мг на 260 нм; б) воз- можным частичным изменением спектра олигонуклеотида при связы- вании с РНК-полимеразой; менее вероятно значительное изменение спектра РНК-полимеразы при связывании с олигонуклеотидом. Из постановки эксперимента вытекает ограничение для максималь- но измеряемой константы: концентрация фрагмента должна быть до- статочной для насыщения РНК-полимеразы в процессе хроматографии. 24 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА,— 1988,— Т. 4, № Ь Поэтому в данных условиях постановки эксперимента получена ниж- няя оценка константы связывания с препаратом 1: /С>0,6-106 М - 1 . Показано, что с олигонуклеотидами из промотора trpR-гена (пре- параты 3 и 4) связывания с РНК-полимеразой при концентрациях олигонуклеотидов до 1,2· Ю - 6 Μ не наблюдается. В экспериментах с препаратом 2 связывание обнаруживается, однако его параметры не определялись. Наличие связывания РНК-полимеразы Е. coli с препаратами из участка «—10» Spc-промотора Е. coli продемонстрировано также в [17], где измерена эффективность связывания с РНК-полимеразой (10 % для препарата 1 и 41 % для препарата 2) по задержке меченых олигонуклеотидов на фильтрах. Хроматографическим методом изучали также кинетику диссоциа- ции специфических комплексов РНК-полимеразы Е. coli с Д Н К плаз- миды pBR322 со вставкой. Время фиксации комплексов формальде- гидом должно быть значительно меньше среднего времени жизни ком- плекса, чтобы использование метода фиксации формальдегидом было адекватно решению данной задачи. Получено, что обработки формаль- дегидом в течение 2 мин достаточно для фиксации всех специфически связанных комплексов. Это время гораздо меньше времени диссоциа- ции специфических комплексов по литературным данным [15]. В качестве агента для инактивации свободной РНК-полимеразы в растворе использовали гепарин, который является мощным ингиби- тором связывания РНК-полимеразы с Д Н К [18]. В хроматографиче- ских экспериментах его применение при исследовании кинетики диссо- циации более предпочтительно, чем, например, тРНК, poly d(A—Τ) или ДНК, которые также связывают РНК-полимеразу, но в отличие от гепарина дают большой вклад в оптическое поглощение, а также при хроматографии могут не отделяться от пика комплекса. Кинетика диссоциации для данной концентрации гепарина подчи- няется экспоненциальному закону r(t) =r (0 )ехр (— t/τ), (4) где t — время; τ — среднее время жизни комплекса, которое зависит от концентрации гепарина. Предполагается, что все места связывания с РНК-полимеразой для данного типа Д Н К идентичны. Из рис. 4 следует, что при различных концентрациях гепарина величина г(0) варьирует, на графике представлено отношение r(t)/r(0) в логарифмическом масштабе. Видно, что скорость диссоциации спе- цифических комплексов Д Н К с РНК-полимеразой зависит от концен- трации гепарина в растворе. Например, при С = 50 мкг/мл константа диссоциации /С=8-10~3 мин -1, что соответствует среднему времени жизни комплексов τ = 1 2 0 мин. На рис. 5 построена зависимость 1 / т от С, которая в данном диа- пазоне концентраций гепарина может быть описана линейным урав- нением 1/τ = Kd + KtC, (5) полученным в работе [15]. Здесь Kd— истинная константа скорости диссоциации комплексов; Kt— константа скорости реакции взаимодей- ствия гепарина со специфическим комплексом. Kd можно получить экстраполяцией значений Ι / τ к нулевой концентрации гепарина. В на- шем случае /Crf=2-10~3 мин -1, что соответствует среднему времени жизни 500 мин при 0,05 Μ NaCl. Показано, что скорость реакции вза- имодействия гепарина со специфическим комплексом / 0 = 23· Ю -4 л Х Х г _ 1 - с - 1 . Значение Kd сравнимо по величине с Kd для специфических комплексов РНК-полимеразы с Д Н К репликативной формы fdy полу- ченными в [15] при 0,01 Μ NaCl. Значение Kt из [15] меньше значе- ния, полученного нами, в четыре раза. Причиной может быть исполь- зование различных коммерческих препаратов гепарина, который состо- Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА,— 1988.—Т. 4, № 1 4 — 7-674 2 5 ит из смеси полимеров с разной молекулярной массой, при этом не- известно, какая минимальная длина полимера необходима для того, чтобы связаться с РНК-полимеразой. Известно, что обработка комплексов в течение 10 с гепарином в концентрации 5 мкг/мл приводит к быстрой и полной диссоциации не- специфического связывания [19]. Нами показано, что такая обработка комплексов гепарином перед фиксацией не приводит к уменьшению 20 ЬО 60 80 С, мкг/мл Рис. 5. Зависимость константы скорости диссоциации комплексов (К) от концентрации (С) гепарина в растворе Fig. 5. Plot of the rate constant of complexes dissociation (K) against heparin concentra- tion (C) in the solution числа молекул РНК-полимеразы, фиксируемых на Д Н К формальдеги- дом. Этот факт еще раз свидетельствует в пользу того, что формаль- дегид не фиксирует неспецифических комплексов. В заключение хотелось бы обсудить преимущества использования хроматографического метода. Описанные выше усредненные характе- ристики связывания, полученные хроматографическим методом, могут быть детализированы с помощью электронной микроскопии. Зафикси- рованные комплексы, исследуемые хроматографическим методом, мож- но в дальнейшем без дополнительной очистки использовать для ана- лиза в электронном микроскопе. Сравним данный метод с другими. Наиболее широко используется для изучения взаимодействия белков с Д Н К метод связывания на нит- роцеллюлозных фильтрах. Считается, что для удержания Д Н К на филь- тре достаточно, чтобы с молекулой Д Н К была прочно связана хотя бы одна молекула белка. По этой причине связывание на фильтрах не может дать полной изотермы связывания при наличии более чем одного места связывания Д Н К с белком или кооперативного характера свя- зывания. Некоторые белки могут не связываться с нитроцеллюлозой. Хроматографический метод имеет много общего с методом центри- фугирования, но используемые в хроматографии детекторы гораздо более чувствительны. При использовании метода электронной микроскопии для изме- рения связывания без предварительной фиксации комплексов не учи- тывается влияние пленки-подложки, что может сильно сдвигать рав- новесие. Следствием использования комплекса микроколоночный хромато- граф «Милихром» — ЭВМ «Искра-226» является наиболее полное из- влечение информации из хроматографических кривых, что способствует увеличению чувствительности метода и уменьшению его трудоемкости. 26 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА,— 1988,— Т. 4, № Ь M E A S U R E M E N T Ol· DNA-PJROTEIN BINDING CONSTANTS BY MEANS OF CHROMATOGRAPH «MILICHROM» — COMPUTER COMPLEX Yu. A. Kalambet, Ε. I. BuAova, A. A. Juchkov, V. L. Knorre, A. A. Alexandrov Institute of Molecular Genetics, Academy of Sciences of the USSR, Moscow S и in т а г у The method of gel-chromatography is used to determine the cons tants of DNA-protein binding. The complex consist ing of mult iwave scanning chromatograph «Milichrom» and computer «Iskra-226» is used as a regis ter ing device. The sof tware for this complex al lows determining DNA and protein concentrat ions at any moment. Informat ion on time de- pendence of DNA and protein concentrat ions is used to determine the cons tants of DNA- protein binding. The method is applied to invest igate the interaction of RNA-polymerase •of E. coli by a number of plasmids and four one-stranded oligodesoxyribonucleotides — the f r agments of E. coli promoters. 1. Raju Ε. V., Davidson N. Binding of RNAse to denatured and native deoxyribonucleic acids / / Biopolymers.— 1969,— 8, N 6.— P. 743—755. 2. Frankel A. D., Ackers G. K., Smith H. O. Measurement of DNA-protein equilibria us ing gel chromatography: application to the Hinfl restriction e n d o n u c l e a s e / / B i o - chemistry.— 1985.—24, N 12.—P. 3049—3054. 3. Volodin Α. Α., Shepelev V. Α., Kosaganov Yu. N. Stoichiometry and kinetics of com- plex formation by the recA protein and a double-stranded DNA / / FEBS Lett.— 1982.— 145, N 1.—P. 53—56. 4. Shepelev V. Α., Kosaganov Yu. N., Lazurkin Yu. S. Interaction of the HMG1 protein with nucleic acids / / Ibid.— 1984.— 172, N 2.— P. 172—176. 5. Microcolumn liquid chromatography with mul t iwavelength photometric detection. OB-4 microcolumn liquid chromatograph / G. I. Baram, M. A. Grachev, N. I. Komarova et a l . / / J . Chromatogr.— 1983.—264, N 1 .—P. 69—90. 6. Nucleotide sequence of small ColEI derivatives: s t ructure of the regions essential for autonomous replication and colicin E l i m m u n i t y / A . Oka, N. Nomura, M. Morita et al. / / Мої. and Gen. Genet.— 1979.— 172, N 2.— P. 151 — 159. 7. Yanisch-Perron C., Vieira J., Messing J. Amproved M13 phage cloning and host s trains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors / / Gene.— 1985.— 33, N 1 .—P. 103—119. S. Burgess R. R., Jendrisak J. J. A procedure for the rapid, large scale purification of Escherichia coli DNA-dependent RNA-polymerase involving polymin Ρ precipitation and DNA-cellulose ch roma tog raphy / /B iochemis t ry .— 1975.— 14, N 21 .—P. 4634— 4638. 9. A quantitative assay for bacterial RNA-polymerases / M. J. Chamberlin, W. C. Nier- man, J. Wiggs, N. N e f f / / J . Biol. Chem.— 1979.—254, N 20,— P. 10061 — 10069. 10. Investigation of the binding of Escherichia coli RNA polymerase to DNA from bacte- riophages T2 and T7 by kinetic formaldehyde method and electron microscopy / D. I. Cherny, A. A. Alexandrov, Μ. I. Zarudnaya et a l . / / E u r . J. Biochem.— 1977,— 79, N 2 . — P . 309—317. 11. McGhee / . D., von Hippel P. H. Theoretical aspects of DNA-protein interactions: co- operative and non-cooperative binding of large l igands to a one-dimensional homo- geneous latice / / J . Мої. Biol.— 1974.—86, N 2 . — P . 469—489. 12. Nonspecific interactions of Escherichia coli RNA polymerase with native and denatu- red DNA: differences in the binding behaviour of core and holoenzyme / P. H. de Ha- seth, Т. M. Lohman, R. R. Burgess, Μ. T. Record, Jr. / / Biochemistry.— 1978.— 17, N 9 . — P . 1612—1622. 13. Revzin Α., Woychik R. P. Quant i ta t ion of the interaction of Escherichia coli RNA po- lymerase holoenzyme with double-helical DNA using a thermodynamical ly r igorous centr i fugat ion method / / Ibid.— 1981.— 20, N 2.— P. 250—256. 14. Giacomoni P. U., Detain E., Le Pecq J. B. Electron microscopy analysis of the inte- raction between Escherichia coli DNA-dependent RNA polymerase and the replicati- ve form of phage fd DNA. 1. Mapping of the binding s i t e s / / E u r . J. Biochem — 1977.—78, N 2.— P. 205—213. 15. Giacomoni P. U., Detain E., Le Pecq J. B. Electron microscopy analys is of the inte- raction between Escherichia coli DNA-dependent RNA polymerase and the replicative form of phage fd DNA. 2. Analysis of the dissociation k i n e t i c s / / I b i d — P . 215—220. 16. Seeburg P. H., Nusslein C., Schaller H. Interaction of RNA polymerase with promo- ters from bacteriophage fd // Ibid.—74, N 1.—P. 107—113. 17. Кнорре В. JI., Савинкова JI. К., Салганик Р. И. Олигонуклеотидные последователь- ности, избирательно связываемые РНК-полимеразой Е. coli / / Биополимеры и клет- ка.— 1985.— 1, № 6.— С. 283—292. 18. Chamberlin Μ. J. The selectivity of t r a n s c r i p t i o n / / A n n u . Rev. Biochem.— 1974— 43 .—P. 721—775. 19. Melancgn P., Burgess R. R., Record M. Т., Jr. Direct evidence for the preferential binding of Escherichia coli RNA polymerase holoenzyme to the ends of deoxyribonuc- leic and restriction f r a g m e n t s / / B i o c h e m i s t r y . — 1983 —22, N 22 .—P. 5169—5176. Ин-т молекул яр. генетики АН СССР, Москва Получено 30.06.86 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА,— 1988.—Т. 4, № 1 4 — 7-674 2 7

Измерение констант ДНК-белкового связывания с помощью комплекса хроматограф «Милихром» — ЭВМ

Репозитарії

Схожі ресурси