Субстратная специфичность и биологическая роль обратной гиразы из экстремально термофильных архебактерий
Обратная гираза выделена из новой архебактерий D. amylolythicus. Показано, что однонитевая ДНК ингибирует действие обратной гиразы. На примере гетеродуплексной ДНК, сконструированной на основе двух плазмид, одна из которых имеет короткую вставку относительно другой, показано, что фермент может созда...
Saved in:
| Published in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Date: | 1988 |
| Main Authors: | , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1988
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153838 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Субстратная специфичность и биологическая роль обратной гиразы из экстремально термофильных архебактерий / А.И. Слесарев, С.А. Козявкин // Биополимеры и клетка. — 1988. — Т. 4, № 3. — С. 119-123. — Бібліогр.: 9 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-153838 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Слесарев, А.И. Козявкин, С.А. 2019-06-14T17:45:28Z 2019-06-14T17:45:28Z 1988 Субстратная специфичность и биологическая роль обратной гиразы из экстремально термофильных архебактерий / А.И. Слесарев, С.А. Козявкин // Биополимеры и клетка. — 1988. — Т. 4, № 3. — С. 119-123. — Бібліогр.: 9 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00021C https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153838 547.963.32 Обратная гираза выделена из новой архебактерий D. amylolythicus. Показано, что однонитевая ДНК ингибирует действие обратной гиразы. На примере гетеродуплексной ДНК, сконструированной на основе двух плазмид, одна из которых имеет короткую вставку относительно другой, показано, что фермент может создавать дополнительные положительные сверхвитки в исходно положительно сверхспирализованной ДНК, если в составе такой ДНК имеется однонитевый участок. Эти результаты означают, что обратная гираза подобно эубактериальной топоизомеразе I специфична к однонитевой ДНК. Благодаря такой специфичности обратная гираза может поддерживать оптимальный уровень положительной сверхспирализации в экстремальных термофилах и тем самым стабилизировать ДНК этих организмов. Зворотну гіразу виділено з нової архебактерії D. amylolythicus. Показано, що однониткова ДНК інгібує дію зворотної гірази. На прикладі гетеродуплексної ДНК, сконструйованої на основі двох плазмід, одна з яких має коротку вставку відносно іншої, показано, що фермент може створювати додаткові позитивні надвитки у початково позитивно надспіралізованій ДНК, якщо у складі такої ДНК є однониткова ділянка. Ці результати означають, що зворотна гіраза подібно еубактерійній топоізомеразі I специфічна до однониткової ДНК. Завдяки такій специфічності зворотна гіраза може підтримувати оптимальний рівень позитивної надспіралізації в екстремальних термофілах і тим самим стабілізувати ДНК цих організмів. Reverse gyrase has been isolated from new archaebacterium D. amylolythicus. It was found that single-stranded DNA was effective in inhibiting the action of reverse gyrase. Using heteroduplex molecules formed from a pair of plasmids, one of which contains a small insertion relative to the other, it is shown that enzyme introduces additional positive supercoils into positively supercoiled DNA if a short single-stranded loop is placed in the DNA. These results suggest that reverse gyrase is specific to single-stranded DNA like eubacterial topoisomerase I. Due to such specificity reverse gyrase can support optimal level of positive supercoiling in extreme thermophiles and prevents denaturation of the gcnomic DNA of these organisms. Авторы выражают благодарность С. М. Миркину и А. В. Вологодскому за критические замечания. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Структура и функции биополимеров Субстратная специфичность и биологическая роль обратной гиразы из экстремально термофильных архебактерий Субстратна специфічність і біологічна роль зворотної гірази з екстремально термофільних архебактерій Substrate specificity and biological role of reverse gyrase from extreme thermophilic archaebacteria Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Субстратная специфичность и биологическая роль обратной гиразы из экстремально термофильных архебактерий |
| spellingShingle |
Субстратная специфичность и биологическая роль обратной гиразы из экстремально термофильных архебактерий Слесарев, А.И. Козявкин, С.А. Структура и функции биополимеров |
| title_short |
Субстратная специфичность и биологическая роль обратной гиразы из экстремально термофильных архебактерий |
| title_full |
Субстратная специфичность и биологическая роль обратной гиразы из экстремально термофильных архебактерий |
| title_fullStr |
Субстратная специфичность и биологическая роль обратной гиразы из экстремально термофильных архебактерий |
| title_full_unstemmed |
Субстратная специфичность и биологическая роль обратной гиразы из экстремально термофильных архебактерий |
| title_sort |
субстратная специфичность и биологическая роль обратной гиразы из экстремально термофильных архебактерий |
| author |
Слесарев, А.И. Козявкин, С.А. |
| author_facet |
Слесарев, А.И. Козявкин, С.А. |
| topic |
Структура и функции биополимеров |
| topic_facet |
Структура и функции биополимеров |
| publishDate |
1988 |
| language |
Russian |
| container_title |
Биополимеры и клетка |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Субстратна специфічність і біологічна роль зворотної гірази з екстремально термофільних архебактерій Substrate specificity and biological role of reverse gyrase from extreme thermophilic archaebacteria |
| description |
Обратная гираза выделена из новой архебактерий D. amylolythicus. Показано, что однонитевая ДНК ингибирует действие обратной гиразы. На примере гетеродуплексной ДНК, сконструированной на основе двух плазмид, одна из которых имеет короткую вставку относительно другой, показано, что фермент может создавать дополнительные положительные сверхвитки в исходно положительно сверхспирализованной ДНК, если в составе такой ДНК имеется однонитевый участок. Эти результаты означают, что обратная гираза подобно эубактериальной топоизомеразе I специфична к однонитевой ДНК. Благодаря такой специфичности обратная гираза может поддерживать оптимальный уровень положительной сверхспирализации в экстремальных термофилах и тем самым стабилизировать ДНК этих организмов.
Зворотну гіразу виділено з нової архебактерії D. amylolythicus. Показано, що однониткова ДНК інгібує дію зворотної гірази. На прикладі гетеродуплексної ДНК, сконструйованої на основі двох плазмід, одна з яких має коротку вставку відносно іншої, показано, що фермент може створювати додаткові позитивні надвитки у початково позитивно надспіралізованій ДНК, якщо у складі такої ДНК є однониткова ділянка. Ці результати означають, що зворотна гіраза подібно еубактерійній топоізомеразі I специфічна до однониткової ДНК. Завдяки такій специфічності зворотна гіраза може підтримувати оптимальний рівень позитивної надспіралізації в екстремальних термофілах і тим самим стабілізувати ДНК цих організмів.
Reverse gyrase has been isolated from new archaebacterium D. amylolythicus. It was found that single-stranded DNA was effective in inhibiting the action of reverse gyrase. Using heteroduplex molecules formed from a pair of plasmids, one of which contains a small insertion relative to the other, it is shown that enzyme introduces additional positive supercoils into positively supercoiled DNA if a short single-stranded loop is placed in the DNA. These results suggest that reverse gyrase is specific to single-stranded DNA like eubacterial topoisomerase I. Due to such specificity reverse gyrase can support optimal level of positive supercoiling in extreme thermophiles and prevents denaturation of the gcnomic DNA of these organisms.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153838 |
| citation_txt |
Субстратная специфичность и биологическая роль обратной гиразы из экстремально термофильных архебактерий / А.И. Слесарев, С.А. Козявкин // Биополимеры и клетка. — 1988. — Т. 4, № 3. — С. 119-123. — Бібліогр.: 9 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT slesarevai substratnaâspecifičnostʹibiologičeskaârolʹobratnoigirazyizékstremalʹnotermofilʹnyharhebakterii AT kozâvkinsa substratnaâspecifičnostʹibiologičeskaârolʹobratnoigirazyizékstremalʹnotermofilʹnyharhebakterii AT slesarevai substratnaspecifíčnístʹíbíologíčnarolʹzvorotnoígírazizekstremalʹnotermofílʹniharhebakteríi AT kozâvkinsa substratnaspecifíčnístʹíbíologíčnarolʹzvorotnoígírazizekstremalʹnotermofílʹniharhebakteríi AT slesarevai substratespecificityandbiologicalroleofreversegyrasefromextremethermophilicarchaebacteria AT kozâvkinsa substratespecificityandbiologicalroleofreversegyrasefromextremethermophilicarchaebacteria |
| first_indexed |
2025-11-26T00:12:36Z |
| last_indexed |
2025-11-26T00:12:36Z |
| _version_ |
1850596326743474176 |
| fulltext |
T H E R M O D Y N A M I C S O F T H E B-Z T R A N S I T I O N O F P O L Y [ d ( G - C ) ]
IN W A T E R / E T H A N O L S O L U T I O N . T H E «TIE» CALORIMETRY
A. T. Karapetyan *, Ε. E. Minyat, P. 0. Vardevanyan *, V. I. Ivanov
Ins t i tu te of Molecular Biology, Academy of Sciences of the U S S R , Moscow
* P e d a g o g i c a l Ins t i tu te , Armenian SSR, Ki rovakan
S u m m a r y
P o l y [ d ( G - C ) ] in 55 % e thanol solut ion sh i f t s f rom the Ζ form to the В form with the
t empera tu re rise f rom 20 to 50 °С. E n t h a l p y of the B-Z t rans i t ion , ΔΗΒΖ, ha s been de-
termined with a «tie», a polyamine, which stabil ized the Ζ con fo rma t ion : ΔΗΒΖ =
= —1.4 kca l /mol . This va lue w a s shown to be pract ica l ly independent f rom the ionic
s t r e n g t h in the r a n g e of 5 · 10~4—2· 10~3 Μ NaCl.
1. Karapetyan А. Т., Minyat Ε. E., Ivanov V. I. Increase in t empe ra tu r e induces the Ζ
to В t rans i t ion of poly d (G-C) in wate r -e thanol s o l u t i o n / / F E B S Lett .— 1984,—173,
N 1 . — P . 243—246.
2. Pohl F. M., Jovin Т. M. Sa l t - induced co-operat ive confo rma t iona l c h a n g e of a synthe-
tic DNA: equil ibrium and kinetic s tudies with po ly (dG-dC) / / J. Мої. Biol.— 1972.—
67, N 3.— P. 375—396.
3. ivanov V. L, Minyat Ε. E. The t r ans i t ions between left- and r igh t -handed fo rms of
poly (dG — dC) / / Nucl. Acids Res.— 1981,—9, N 18 .—P. 4783—4798.
4. Woisard Α., Guschlbauer W., Fazakerley G. V. The low ionic s t r eng th form of the so-
dium salt of poly (dm 5 C-dG) is а В D N A / / I b i d . — 1986.—14, N 1 ,—P. 3515—3519.
5. Ethidium b romide as a cooperat ive effector of a DNA s t ruc tu re / F. M. Pohl , Т. M. Jo-
vin, W. Baer , Ch. Holbrook / / Proc. Nat . Acad. Sci. USA.— 1972.—69, N 13.—
P. 3805—3809.
6. Lazurkin Yu. S., Frank-Kamenetskii M. D., Trifonov E. N. Mel t ing of DNA: its s tudy
and appl ica t ion as a research m e t h o d / / B i o p o l y m e r s . — 1970.—9, N 10.— P. 1253—
1306.
7. Франк-Каменецкий Μ. Д., Карапетян А. Т. Теория плавления Д Н К в присутствии
низкомолекулярных в е щ е с т в / / М о л е к у л я р . биология.— 1-972.—6, № 7 . — С. 624—635.
Ин-т молекуляр. биологии АН СССР, Москва Получено 09.03.87
Кировакан. пед. ин-т
У Д К 547.963.32
СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ
И БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ОБРАТНОЙ ГИРАЗЫ
ИЗ ЭКСТРЕМАЛЬНО ТЕРМОФИЛЬНЫХ АРХЕБАКТЕРИЙ *
А. И. Слесарев, С. А. Козявкин
Введение. Существование живых организмов при высоких температу-
рах (вплоть до 110 °С [1]) ставит проблему стабилизации вторичных
и третичиых структур биологических макромолекул. Обнаружение спе-
циального фермента, создающего положительную сверхспирализацию в
ДНК,— обратной гиразы — в двух различных экстремально термофиль-
ных архебактериях (Su l fo lobus aciclocaldarius с оптимумом роста при
75 °С [2, 3] и Desulforococcus amylolyticus с оптимумом роста при 92 °С
[4]) , а также обнаружение положительной сверхспирализации в Д Н К ,
выделенной из 5. acidocaldarius [5], дают основания предположить,
что создание положительной сверхспирализации является общим прин-
ципом стабилизации двойной спирали Д Н К в экстремальных термофи-
лах. Поскольку основная роль при этом принадлежит обратной гиразе,
то в настоящее время вызывает интерес изучение специфики и
механизма действия фермента, а также его места в ряду других то-
поизомераз.
Данная работа посвящена исследованию субстратной специфично-
сти обратной гиразы из D. amylolyticus.
* Представлена членом редколлегии М. Д. Франк-Каменецким.
1 Б И О П О Л И М Е Р Ы II КЛЕТКА,— 1988 — Т . 4, № 3
Материалы и методы. Полученный ранее препарат обратной гиразы из D. amylo-
lyticus [4] (фосфоцеллюлозная фракция) подвергли дальнейшей очистке на гепарин-
еефарозе. Д л я этого фосфоцеллюлозную фракцию диализовали против буферного
раствора (50 мМ трис-НС1, р Н 7,5, 0,2 Μ NaCl, 1 мМ спермидин, 0,1 мМ дитиогреитол)
я наносили на колонку с гепарин-сефарозой объемом 3 мл, уравновешенную этим ж е
буфером. Колонку промывали тремя объемами стартового буфера и проводили элю-
цию 50 мл линейного градиента NaCl : 0,2—1,0 Μ. Активность во фракциях определя-
ли, как описано ранее [4]. Активные фракции объединяли, диализовали против 50 мМ
К-фосфатного буфера, р Н 7,4, наносили на колонку с оксиапатитом и концентрирова-
ли, элюируя 0,8 Μ К-фосфатным буфером, р Н 7,5. Эту фракцию затем диализовали
против буфера, содержащего 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 0,5 Μ NaCl, 1 мМ спермидин,
I мМ ФМСФ, 1 мМ 2-меркаптоэтанол, 20 %-ный глицерин. Белковый состав фракции
анализировали электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии DS-Na
по [4]. Полученный препарат топоизомеразы с о д е р ж а л один основной полипептид с
•молекулярной массой 135000, с которым и связана активность.
Д Н К плазмиды рАОЗ любезно предоставлена В. Г. Коштоевым, Д Н К pUC19 —
В. И. Лямичевым, Д Н К рАТ48.— И. Г. Панютиным, однонитевая Д Н К фага М13 —
Н. С. Незнановым (Ин-т молекуляр. генетики (ИМГ) АН С С С Р ) . Чтобы получить по-
ложительно сверхспирализованные при температуре > 2 5 °С препараты, Д Н К плазмид
pUC19 или рАТ48 инкубировали при 4 °С с топоизомеразой I из асцитной карциномы
Кребс II, любезно предоставленной С. М. Миркиным ( И М Г АН С С С Р ) .
Одиночный топоизомер получали следующим образом: проводили электрофорез
Д Н К рАОЗ в 2 %-ной агарозе в присутствии 0,03 м к г / м л бромистого этидия в течение
24 ч при напряженности электрического поля 1 В /см . Затем вырезали полосу, соот-
ветствующую топоизомеру с фиксированным значением числа зацеплений. Д Н К экстра-
гировали из геля стандартным образом [6] .
Кольцевую замкнутую Д Н К ( к з Д Н К ) с однонитевой петлей конструировали по
методу Киркегаард и Вонга [7] на основе Д Н К плазмид pUC19 и рАТ48. Последняя
отличается от pUC19 наличием АТ-последовательности длиной 48 пар оснований, встро-
енной в Stnal-сакт pUC19 [8] . Д Н К рАТ48 линеаризовали рестрикциоиной эндонуклеа-
зой Hindll, Д Н К pUC19 — cfrlOI. Затем эти Д Н К смешивали и отжигали. Гетеро-
дуплексные кольцевые молекулы с однонитевыми разрывами отделяли препаративным
электрофорезом в 1,5 %-ной агарозе, а затем экстрагировали из геля. Очищенные ге-
теродуплексные молекулы лигировали Т4-ДНК-лигазой при 4 °С. В результате получи-
лись кольцевые замкнутые молекулы, содержащие одну нить от pUC19 и одну нить от
рАТ48. В таких молекулах содержался некомплементарный участок из 48 оснований.
Реакции обратной гиразы с к з Д Н К проводили в стандартной реакционной систе-
ме [4] . Продукты топоизомеризации анализировали методом двухмерного электрофоре-
за, как описано ранее [4].
Результаты. После хроматографии на гепарип-сефарозс препарат
обратной гиразы бы доведен до состояния, близкого к гомогенности.
Активность связана с основным полипептидом с молекулярной массой
135000 (данные не приведены).
Д л я определения субстратной специфичности обратной гиразы мы
исследовали влияние однонитевой Д Н К на эффективность работы фер-
мента. В стандартную реакционную систему, содержащую отрицатель-
н о сверхспирализованную Д Н К pBR322y добавляли различные коли-
чества однонитевой Д Н К фага М13. Продукты топоизомеризации ана-
лизировали методом двухмерного электрофореза (рис. 1). Как видно,
добавление однонитевой Д Н К ингибирует действие обратной гиразы.
Далее мы исследовали влияние однонитевой петли в составе кз
Д Н К на работу обратной гиразы. Эксперименты проводили на Д Н К
pUC19, рАТ48 и гетеродуплексной к з Д Н К с однонитевой петлей, скон-
струированной па основе этих двух плазмид. Все Д Н К были исходно
одинаково положительно сверхспирализованы (рис. 2, Б и 3, Б, Г ) . Ре-
зультаты действия фермента на эти Д Н К приведены на рис. 2, А и
3, А, В. Из рис. 3 видно, что в условиях эксперимента обратная гираза
не действует на pUC19 и рАТ48. Однако в тех же условиях фермент
сверхспирализует гетеродуплексную к з Д Н К с однонитевой петлей
1 2 0 Б И О П О Л И М Е Р Ы II КЛЕТКА,— 1988 — Т . 4, № 3
Рис. 1. Ингибирование действия обратной гиразы однонитевой Д Н К . Различные коли-
чества Д Н К М13 добавляли в стандартную реакционную систему, с о д е р ж а щ у ю Д Н К
pBR322: молярное отношение М13 и pBR322 равно: 1 (Л) ; 0,1 ( £ ) ; контроль (без Д Н К
М13) (В). Реакцию проводили при 90 °С. Продукты топоизомеризации анализировали
методом двухмерного электрофореза в 1 %-ной агарозе. Разделение в первом направ-
лении вели сверху вниз, во втором — справа налево в том ж е буфере, содержащем
2 м к г / м л хлорохина. Количество фермента в смеси 0,05 мкг, количество Д Н К
pBR322 — 0,3 мкг
Fig. 1. Inhibit ion of the reverse gy rase action by a s ing le -s t randed DNA. Var ious amo-
un t s of DNA M13 were added in the s t anda rd react ion mixture con ta in ing pBR322. Re-
action w a s carried out at 90 °С. Analys i s of topoisomer iza t ion p roduc t s w a s carried out
by two-dimens iona l e lectrophoresis in 1 % a g a r o s e gel. Separa t ion in the f irs t d imension
was f rom top to bot tom, in the second one — f r o m r ight to left in the same buf fe r con-
t a in ing 2 μ ρ / m l chloroquine. The quan t i ty of enzyme in the mix ture w a s 0.05 μg , t ha t
of DNA pB'R322 w a s 0.3 μg. The molar ra t ios M13 to pBR322 were: A) 1; Б) 0.1;
B) cont ro l (wi thout DNA M13)
Рис. 2. Действие обратной гиразы на положительно сверхспирализованную гетеродуп-
лексную к з Д Н К с однонитевой петлей: А — обратную гиразу (0,1 мкг) инкубировали
с 0,5 мкг положительно суперспирализованной к з Д Н К с однонитевой петлей в стан-
дартной реакционной системе при 80 °С (справа видны: открытая кольцевая Д Н К
(верхнее пятно) и-линейная Д Н К (нижняя полоса) ; слева — ветвь положительных то-
поизомеров) ; Б — контроль (в отсутствие фермента) . Продукты топоизомеризации
анализировали двухмерным электрофорезом (см. рис. 1) в 1,5 %-ной агарозе
Fig. 2. Action of reverse gy ra se on posi t ively supercoiled he te roduplex closed ci rcular
DNA with a s ing le - s t randed loop: A — reverse gy ra se (0.1 μ g ) w a s incubated with 0.5 μ g
of posi t ively supercoiled DNA con ta in ing the s ing le -s t randed loop in the s t a n d a r d react ion
mixture at 80°С (the visible b a n d s on the r ight are: open circular DNA (upper spot) a n d
l inear DNA (lower b a n d ) ; on the left — ledders of posi t ive topo i somers ) ; Б — control
(wi thout the enzyme) . Topoisomer iza t ion produc ts were ana lyzed by two-d imens iona l
e lect rophores is in 1 .5% a g a r o s e gel (see Fig. 1)
Рис. 3. Инкубирование обратной ги-
разы с положительно сверхспирализо-
ванными Д Н К pUC19 и рАТ48 (по
данным двухмерного электрофореза в
1,5 %-ной агарозе, см. рис. 1): обрат-
ную гиразу (0,1 мкг) инкубировали в
стандартных условиях с 0,2 мкг Д Н К
рАТ48 (Л) ; ДНК pUC19 (0,2 мкг)
(В); контроль в отсутствие фермента
Д Н К рАТ48 (0,4 мкг) (Б); Д Н К
pUC19 (0,35 мкг) (Г) . В этих условиях обратная гираза не действует на исходно по-
ложительно сверхспирализованную Д Н К , но действует на гетеродуплексную к з Д Н К с
однонитевой петлей (см. рис. 2)
Fig. 3. Incubat ion of reverse gy ra se with posit ively supercoiled DNA pUC19 and pAT48
(on the da ta of two-d imens iona l e lect rophoresis in 1 .5% a g a r o s e gel, see Fig. 1): re-
verse gy ra se (0.1 w a s incubated with 0.2 μ £ DNA pAT48 (A); DNA pUC19
(0.2 μ β ) (В); control wi thout the enzyme: DNA pAT48 (0.4 μ g ) (Б); DNA pUC19
(0.35 μ ^ ) (Γ) . Under these condi t ions reverse gy ra se does not act on posi t ively super-
coiled DNA, but acts (under the same condi t ions) on heteroduplex DNA with the single-
s t r anded loop (see Fig. 2) .
121 Б И О П О Л И М Е Р Ы II КЛЕТКА,— 1988 — Т . 4, № 3
(рис. 2). Следовательно, наличие однонитевого участка в составе
к з Д Н К активирует работу обратной гиразы.
Обнаруженное свойство позволяет предположить, что обратная
гираза является топоизомеразой I типа. Это мы проверили экспери-
ментально. На рис. 4 показано действие фермента на одиночный отри-
цательный топоизомер Д Н К рАОЗ. Видно, что обратная гираза уве-
личивает число зацеплений исходного топоизомера на число, кратное 1
(рис. 4у Б). Следовательно, обратная гираза из D. amylolyticus, так ж е
как и обратная гираза из
5. acidocaldarius [2, 3], при-
надлежит к топоизомеразам
I типа.
Обсуждение. Обнаружен-
Рис. 4. Изменение числа зацеплений в к з Д Н К обратной гиразой. Одиночный отрица-
тельно сверхспирализовапиый топоизомер рАОЗ инкубировали с обратной гиразой в
стандартных условиях: А — Д Н К рАОЗ (0,3 мкг) , инкубированная с 0,1 мкг обратной
гиразы (число зацеплений при переходе от одного топоизомера к другому изменяется
на 1); Б — одиночный топоизомер рАОЗ (0,2 мкг) , инкубированный с 0,1 мкг обратной
гиразы (обратная гираза увеличивает число зацеплений на число, кратное 1); В — о т -
рицательно свсрхспирализованный одиночный топоизомер рАОЗ в отсутствие фермента.
Полученные топоизомеры анализировали двухмерным электрофорезом (см. рис. 1) в
2 %-ной агарозе
Fig. 4. C h a n g e in the l inking number of closed circular DNA by reverse gyrase . Λ nega-
tive unique topoisomer рАОЗ w a s incubated with reverse gyrase under the s t anda rd con-
di t ions: A — D N A p /103 (0.3 jig) incubated with 0.1 μ g reverse gyrase . This is a cont-
rol d e m o n s t r a t i n g tha t the l inking number c h a n g e s by + 1 ; Б — unique topoisomer рАОЗ
incubated with 0.1 μ g reverse gy ra se (reverse gy ra se convert this topoisomer to series
of topo isomers increas ing their l inking number one by one) ; В — nega t ive ly supercoiled
unique topoisomer рАОЗ wi thout the enzyme. Topoisomers produced by reverse gy ra se
were examined by two-d imens iona l e lectrophoresis in 2 % a g a r o s e gel (see Fig. 1)
Рис. 5. Модель создания обратной гиразой положительной сверхспирализации посред-
ством временно создаваемого однонитевого разрыва . Обратная гираза связывается с
одной нитью Д Н К и производит временный разрыв. Затем происходит «протаскивание»
через этот разрыв другой нити и лигирование разрыва . Этот процесс обратная гираза
осуществляет только в том случае, если исходно взаимное расположение нитей такое,
как указано слева. В такой модели разрываемая и протаскиваемая нити д о л ж н ы быть
одионитевыми
Fig. 5. A model for posi t ive supercoi l ing by reverse gyrase . Reverse gy rase b inds one
s t r and of DNA and t r ans i en t ly nicks it. Af te r this the enzyme passess the other s t rand
t h r o u g h the break. Sea l ing the break resul t s in a change in l inking fixed at + 1 . Reverse
gy ra se pe r fo rms this process only in the case if m u t u a l or ienta t ion of DNA s t r a n d s is
as indicated on the left of the F igu re
ное нами свойство субстратной специфичности обратной гиразы к одпо-
нитевой Д Н К , а также однонаправленность вращения нитей двойной
спирали Д Н К позволяют предположить определенный механизм рабо-
ты этого фермента. По-видимому, обратная гираза осуществляет пере-
нос одной пити через создаваемый ею временный разрыв в другой
нити, причем взаимная ориентация нитей должна быть строго опреде-
ленной, отвечающей созданию одного положительного сверхвитка
(рис. 5). Отметим, что механизм действия гираз эубактерий и обратных
гираз экстремально термофильных архебактерий различен.
В предыдущей работе было показано, что обратная гираза закру-
чивает отрицательно сверхспирализоваппую Д Н К до высоких степе-
ней положительной сверхспирализации [4]. Вместе с тем, если Д Н К
1 2 2 Б И О П О Л И М Е Р Ы II КЛЕТКА,— 1988 — Т . 4, № 3
исходно положительно сверхспирализована, то фермент в тех ж е усло-
виях не способен закручивать ее до более высокой сверхспиральной
плотности. Д л я объяснения этих результатов следует предположить,
что фермент, связываясь с однонитевыми участками в отрицательно
сверхспирализованной Д Н К , работает процессивно.
В настоящее время известно, что специфичностью к однонитевой
Д Н К обладают только эубактериальные топоизомеразы I типа [9] .
Мы показали, что такой ж е специфичностью обладает обратная гираза
из экстремально термофильных архебактерий. По-видимому, это свой-
ство имеет важное биологическое значение. Появление однонитевых
участков в отрицательно сверхспирализованной Д Н К приводит к акти-
вации эубактериальных топоизомераз I типа. Эти ферменты релаксируют
возникшее напряжение и тем самым стабилизируют двойную спираль.
Аналогично при высоких температурах появление однонитевых участ-
ков активирует обратную гиразу. В этих условиях стабилизация Д Н К
осуществляется за счет положительной сверхспирализации. Таким об-
разом, специфичность рассматриваемых топоизомераз может исполь-
зоваться в бактериях для поддержания сверхспирализации Д Н К на
определенном уровне.
Авторы выражают благодарность С. М. Миркину и А. В. Вологод-
скому за критические замечания.
S U B S T R A T E S P E C I F I C I T Y A N D B I O L O G I C A L R O L E O F R E V E R S E G Y R A S E
F R O M E X T R E M E T H E R M O P H I L I C A R C H A E B A C T E R I A
A. I. Slesarev, S. A. Kozjavkin
I n s t i t u t e of Molecu la r Genet ics , A c a d e m y of Sciences of the U S S R , M o s c o w
S u m m a r y
Reverse g y r a s e h a s been isola ted f rom n e w a r chaebac t e r i um D. amylolythicus. It w a s
f o u n d t h a t s i n g l e - s t r a n d e d DNA w a s ef fec t ive in inh ib i t ing the ac t ion of r everse gy ra se .
U s i n g he t e rodup lex molecu lcs fo rmed f rom a pa i r of p l a smids , one of which c o n t a i n s a
sma l l inser t ion re la t ive to the other , it is s h o w n t h a t e n z y m e in t roduces add i t i ona l po-
s i t ive superco i l s into posi t ively supercoi led D N A if a shor t s i n g l e - s t r a n d e d loop is p la-
ced in the DNA. These r e su l t s s u g g e s t t h a t r everse g y r a s e is specif ic to s i n g l e - s t r a n d e d
D N A like eubac te r i a l t o p o i s o m e r a s e I. Due to such specif ic i ty reverse g y r a s e c a n s u p p o r t
o p t i m a l level of pos i t ive supe rco i l ing in ex t reme the rmoph i l e s and p r e v e n t s d e n a t u r a t i o n
of the genomic DNA of these o r g a n i s m s .
1. Stetier K. 0., Konig H., Stakebrandt E. Pyrodiciium gen. novv a n e w g e n u s of s u b m a -
r ine d i sc -shaped su lphu r r e d u c i n g a rchaebac te r i a g r o w i n g o p t i m a l l y at 1 0 5 ° C / / S y s t .
Appl. Microbiol — 1983 —4, N 3 , — P . 535—551.
2. Nakasu S., Kikushi A. Reverse gy ra se ; A T P - d e p e n d e n t type I t o p o i s o m e r a s e f rom
Sulfolobus / / E M B O J.— 1985,—4, N 1 0 , — P . 2705—2710.
3. High pos i t ive supe rco i l ing in vitro c a t a lyzed by an A T P and po lye thy l ene glycol-s t i -
m u l a t e d t o p o i s o m e r a s e f r o m Sulfolobus acidocaldarius / P . For t e r re , G. M i r a m b e a u ,
K. J axel et al. / / Ibid.— N 8 , — P . 2123—2128.
4. Слесарев А. И. П о л о ж и т е л ь н а я топоизомеразная активность , о б н а р у ж е н н а я у новой
экстремально термофильной анаэробной архебактерии, в о с с т а н а в л и в а ю щ е й серу / /
Биополимеры и клетка .— 1988.—4, № 1.— С. 28—34.
5. Positive supercoi led DNA in a v i rus- l ike par t ic le of an a r c h a e b a c t e r i u m / M. N a d a l ,
G. M i r a m b e a u , P . Fo r t e r r e et a l . / / N a t u r e . — 1986,—321, N 6 0 6 7 . — P . 256—258.
6. Maniatis Т., Fritsch Ε. E., Sambrook J. Mo lecu l a r c lon ing . A l a b o r a t o r y m a n u a l . —
New York : Cold S p r i n g H a r b o r Lab., 1982—390 p.
7. Kirkegaard K., Wang J. C. Bac te r i a l D N A t o p o i s o m e r a s e I can relax pos i t ive ly super -
coiled D N A c o n t a i n i n g a s i n g l e - s t r a n d e d l o o p / / J . Мої. Biol .— 1985.—185, N 3.—
P. 625—637.
8. Panyutin /., Lyamichev V., Mirkin S. A s t r u c t u r a l t r a n s i t i o n in d (AT) ?l : d ( A T ) n in-
se r t s wi th in superhel ica l D N A / / J . Biomol . S t ruc t , and D y n a m . — 1985.—2, N 6,—
P. 1221 — 1233.
9. Wang J. C. DNA l o p o i s o m e r a s e s / / A n n . Rev. Biochem.— 1985 —54 — P. 665—697.
Иіі-т молекуляр . генетики АН С С С Р , Москва Получено 01.04.87
123 Б И О П О Л И М Е Р Ы II КЛЕТКА,— 1988 — Т . 4, № 3
|