Ориентационные эффекты, вызываемые присутствием в плазмиде pUC фрагментов rplJL-rpoBC-оперона Escherichia coli
Сконструирован ряд рекомбинантных плазмид pUC, содержащих фрагменты rplJL-rpoBC-оперона E. coli. Установлено, что однонаправленной ориентацией в плазмидах pUC обладают фрагменты EcoRI (1568 п.о.), включающий ген rplJL с промотором PL₁₀, и BspRI-A- фрагмент, содержащий структурную часть гена rplJL ....
Saved in:
| Published in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Date: | 1988 |
| Main Authors: | , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1988
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153911 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Ориентационные эффекты, вызываемые присутствием в плазмиде pUC фрагментов rplJL-rpoBC-оперона Escherichia coli / Ε.Б. Патон, И.В. Крупская, А.Н. Живолуп // Биополимеры и клетка. — 1988. — Т. 4, № 3. — С. 163-167. — Бібліогр.: 20 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-153911 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Патон, Е.Б. Крупская, И.В. Живолуп, А.Н. 2019-06-14T18:39:42Z 2019-06-14T18:39:42Z 1988 Ориентационные эффекты, вызываемые присутствием в плазмиде pUC фрагментов rplJL-rpoBC-оперона Escherichia coli / Ε.Б. Патон, И.В. Крупская, А.Н. Живолуп // Биополимеры и клетка. — 1988. — Т. 4, № 3. — С. 163-167. — Бібліогр.: 20 назв. — рос. 0233-7657 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153911 577.21 Сконструирован ряд рекомбинантных плазмид pUC, содержащих фрагменты rplJL-rpoBC-оперона E. coli. Установлено, что однонаправленной ориентацией в плазмидах pUC обладают фрагменты EcoRI (1568 п.о.), включающий ген rplJL с промотором PL₁₀, и BspRI-A- фрагмент, содержащий структурную часть гена rplJL . Ориентация обоих фрагментов в рекомбинантных плазмидах такова, что направление транскрипции гена rplJL встроенного фрагмента и lacZ'-вектора – противоположно. Сконструйовано низку рекомбінантних плазмід pUC, що містять фрагменти rplJL-rpoBC-оперону E. coli. Встановлено, що односпрямовані орієнтації у плазмідах pUC притаманні фрагменту EcoRI (1568 п. о.), що містить ген rplJL з промотором PL₁₀, і BspRI-A-фрагменту зі структурною частиною гена rplJL. Орієнтація обох фрагментів у рекомбінантних плазмідах така, що напрямок транскрипції гена rplJL вбудованого фрагмента і lacZ'-вектора – протилежний. A number of recombinant pUC plasmids containing E. coli rplJL-rpoBC-operon fragments were constructed. A rplJ gene and PL₁₀ promoter containing 1568 bp EcoRI fragment and rplJ gene structural part containing BspRI-A-fragment were found to be oriented in pUC plasmids unidirectionally, in such a way that genes rplJ of the inserted fragment and lacZ' of the vector were transcribed in the opposite direction. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Краткие сообщения Ориентационные эффекты, вызываемые присутствием в плазмиде pUC фрагментов rplJL-rpoBC-оперона Escherichia coli Орієнтаційні ефекти, що викликаються присутністю в плазміді pUC фрагментів rplJL-rpoBC-оперону Escherichia coli Orientational effects caused in the pUC plasmid by E. coli rplJL-rpoBC-operon fragments Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Ориентационные эффекты, вызываемые присутствием в плазмиде pUC фрагментов rplJL-rpoBC-оперона Escherichia coli |
| spellingShingle |
Ориентационные эффекты, вызываемые присутствием в плазмиде pUC фрагментов rplJL-rpoBC-оперона Escherichia coli Патон, Е.Б. Крупская, И.В. Живолуп, А.Н. Краткие сообщения |
| title_short |
Ориентационные эффекты, вызываемые присутствием в плазмиде pUC фрагментов rplJL-rpoBC-оперона Escherichia coli |
| title_full |
Ориентационные эффекты, вызываемые присутствием в плазмиде pUC фрагментов rplJL-rpoBC-оперона Escherichia coli |
| title_fullStr |
Ориентационные эффекты, вызываемые присутствием в плазмиде pUC фрагментов rplJL-rpoBC-оперона Escherichia coli |
| title_full_unstemmed |
Ориентационные эффекты, вызываемые присутствием в плазмиде pUC фрагментов rplJL-rpoBC-оперона Escherichia coli |
| title_sort |
ориентационные эффекты, вызываемые присутствием в плазмиде puc фрагментов rpljl-rpobc-оперона escherichia coli |
| author |
Патон, Е.Б. Крупская, И.В. Живолуп, А.Н. |
| author_facet |
Патон, Е.Б. Крупская, И.В. Живолуп, А.Н. |
| topic |
Краткие сообщения |
| topic_facet |
Краткие сообщения |
| publishDate |
1988 |
| language |
Russian |
| container_title |
Биополимеры и клетка |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Орієнтаційні ефекти, що викликаються присутністю в плазміді pUC фрагментів rplJL-rpoBC-оперону Escherichia coli Orientational effects caused in the pUC plasmid by E. coli rplJL-rpoBC-operon fragments |
| description |
Сконструирован ряд рекомбинантных плазмид pUC, содержащих фрагменты rplJL-rpoBC-оперона E. coli. Установлено, что однонаправленной ориентацией в плазмидах pUC обладают фрагменты EcoRI (1568 п.о.), включающий ген rplJL с промотором PL₁₀, и BspRI-A- фрагмент, содержащий структурную часть гена rplJL . Ориентация обоих фрагментов в рекомбинантных плазмидах такова, что направление транскрипции гена rplJL встроенного фрагмента и lacZ'-вектора – противоположно.
Сконструйовано низку рекомбінантних плазмід pUC, що містять фрагменти rplJL-rpoBC-оперону E. coli. Встановлено, що односпрямовані орієнтації у плазмідах pUC притаманні фрагменту EcoRI (1568 п. о.), що містить ген rplJL з промотором PL₁₀, і BspRI-A-фрагменту зі структурною частиною гена rplJL. Орієнтація обох фрагментів у рекомбінантних плазмідах така, що напрямок транскрипції гена rplJL вбудованого фрагмента і lacZ'-вектора – протилежний.
A number of recombinant pUC plasmids containing E. coli rplJL-rpoBC-operon fragments were constructed. A rplJ gene and PL₁₀ promoter containing 1568 bp EcoRI fragment and rplJ gene structural part containing BspRI-A-fragment were found to be oriented in pUC plasmids unidirectionally, in such a way that genes rplJ of the inserted fragment and lacZ' of the vector were transcribed in the opposite direction.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153911 |
| citation_txt |
Ориентационные эффекты, вызываемые присутствием в плазмиде pUC фрагментов rplJL-rpoBC-оперона Escherichia coli / Ε.Б. Патон, И.В. Крупская, А.Н. Живолуп // Биополимеры и клетка. — 1988. — Т. 4, № 3. — С. 163-167. — Бібліогр.: 20 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT patoneb orientacionnyeéffektyvyzyvaemyeprisutstviemvplazmidepucfragmentovrpljlrpobcoperonaescherichiacoli AT krupskaâiv orientacionnyeéffektyvyzyvaemyeprisutstviemvplazmidepucfragmentovrpljlrpobcoperonaescherichiacoli AT živolupan orientacionnyeéffektyvyzyvaemyeprisutstviemvplazmidepucfragmentovrpljlrpobcoperonaescherichiacoli AT patoneb oríêntacíiníefektiŝoviklikaûtʹsâprisutnístûvplazmídípucfragmentívrpljlrpobcoperonuescherichiacoli AT krupskaâiv oríêntacíiníefektiŝoviklikaûtʹsâprisutnístûvplazmídípucfragmentívrpljlrpobcoperonuescherichiacoli AT živolupan oríêntacíiníefektiŝoviklikaûtʹsâprisutnístûvplazmídípucfragmentívrpljlrpobcoperonuescherichiacoli AT patoneb orientationaleffectscausedinthepucplasmidbyecolirpljlrpobcoperonfragments AT krupskaâiv orientationaleffectscausedinthepucplasmidbyecolirpljlrpobcoperonfragments AT živolupan orientationaleffectscausedinthepucplasmidbyecolirpljlrpobcoperonfragments |
| first_indexed |
2025-11-25T23:28:45Z |
| last_indexed |
2025-11-25T23:28:45Z |
| _version_ |
1850584163407626240 |
| fulltext |
Краткие
сообщения
УДК 577.21
ОРИЕНТАЦИОННЫЕ ЭФФЕКТЫ,
ВЫЗЫВАЕМЫЕ ПРИСУТСТВИЕМ В ПЛАЗМИДЕ pUC
ФРАГМЕНТОВ rp1JL-rpoBC-ΟΠΕΡΟΗΑ ESCHERICHIA COLI
Ε. Б. Патон, И. В. Крупская, А. Н. Живолуп
Явление однонаправленной ориентации фрагментов чужеродной Д Н К при встраивании
в плазмидные и фаговые векторы описано в [1—3]. Ранее мы сообщали об однонаправ-
ленной ориентации фрагментов rplJL-rpoBC-оперона Е. coli при клонировании их в
плазмиде pUC [4, 5] и фаге М13 [6]. Подобный эффект при клонировании фрагментов
этого оперона отмечался и другими авторами [3]. Показана т а к ж е невозможность по-
лучения рекомбинантных плазмид, включающих отдельные фрагменты вышеуказанного
оперона Е. coli, и летальность для клеток Ε. coli рекомбинантных плазмид, содержащих
участки rplJL-rpoBC-оперона Е. coli [7, 8].
Д а н н а я работа посвящена исследованию ориентационных эффектов, наблюдаемых
при клонировании фрагментов rplJL-rpoBC-оперона Е. coli в плизмиде pUС.
Материалы и методы. В работе использовали штамм Е. coli К-12 JM101 [9] .
Клетки Е. coli культивировали в богатой среде LB [10], включающей д р о ж ж е в о й
экстракт и бакто-триптон, а в случае твердых с р е д — 1 , 5 % агар фирмы «Difco»
(США) . Использован ампициллин отечественного производства. Д л я получения реком-
бинантных плазмид и их рестрикционного анализа использовали рестрикционные эндо-
нуклеазы и Д Н К - л и г а з у фага Т4 производства Н П О «Фермент» (Вильнюс). Д л я элект-
рофореза Д Н К применяли агарозные (фирмы «BioRad», США) и полиакриламидные
(ПААГ) (фирмы «Мегск», Ф Р Г ) гели. Электрофорез проводили по стандартным мето-
дикам [11], используя трис-ацетатный буфер. Окрашивали гели раствором бромистого
этидия фирмы «Calhiochem» (США) . Плазмидную Д Н К выделяли из клеток Е. coli
щелочным методом [12], а в случае препаративной наработки проводили равновесное
центрифугирование ее в градиенте плотности хлористого цезия (о. с. ч., С С С Р ) , как
описано в [13]. Фрагменты Д Н К выделяли из агарозных гелей электроэлюцией [11],
а из акриламидных — по методу [11]. В работе использованы Р Н К а з а фирмы «Wort-
h ing ton» (Англия) и лизоцим фирмы «Serva» ( Ф Р Г ) . Остальные использованные ре-
активы были отечественного производства и имели квалификацию х. ч. или о. с. ч.
Получение рекомбинантных плазмид проводили следующим образом. EcoRI-фраг-
менты величиной 1568, 1250 и 1085 пар оснований (п. о.), включающие гены рибосом-
ных белков и промоторы rplJL-rpoBC-оперона Е. coli, выделяли в препаративных ко-
личествах после расщепления описанной ранее [4] рекомбинантной плазмиды
pUC 19/гроВ (рис. 1) рестриктазой EcoRI. Фрагменты BspRI (А и В) получали, рас-
щепляя рсстриктазой BspRI £со/? / -фрагмспт (1568 п. о.), содержащий промотор PL]0
и гены rplA', rplJ и rplL'. Д Н К pUC18 в случае лигирования с £со /? / -фрагментами
расщепляли этой ж е эндонуклеазой, в случае лигирования с / ^ / ^ / - ф р а г м е н т а м и Д Н К
pUC19 — рестриктазой Smal. Реакцию лигирования в случае «липких» (EcoRI) кон-
цов проводили в течение 1—2 ч при 20 °С, в случае «тупых» (BspRI-Smal) - при 14 °С
в течение 6—12 ч по стандартной методике [11].
Са 2 + -компетентные клетки Е. coli получали и трансформировали плазмидной
Д Н К , как указано в [11]. После трансформации клетки Е. coli высевали на твердую
среду LB, содержащую 50 м к г / м л ампициллина, учитывая наличие в pUC гена bla,
Z-gal ( Ю - 4 г / м л ) , И П Т Г (1,7~6 г / м л ) , а т а к ж е присутствие в векторной плазмиде
участка /ас-оперона Е. coli.
Результаты и обсуждение. Ранее нами показано, что Bglll-фрагмент rplJL-rpoBC-
оперона Ε. coli при встраивании в плазмиду pUC (в отличие от плазмид pBR322 и
pHSG415 [14]) и нитевидный фаг М13 ориентируются однонаправленно [4, 5] . Из-
вестно [15, 16], что в состав rplKAJL-rpoBC-ouepona Ε. coli входят гены, кодирующие
синтез рибосомных белков Lll (rplK), LI (rplA), L10 (rplJ) и L7/L12 (rplL), а т а к ж е
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1988.— Т. 4, ЯЬ 3 163
гены гроВ и rpoC, кодирующие синтез β- и β ' -субъединиц РНК-полимеразы Ε. coli.
Транскрипция генов этого оперона направляется двумя сильными Plm (гены rplb(,
грі А) и PL ю (гены rplJL, гроВС), и двумя слабыми промоторами Ρ β и Я β/.
Известно, что клонирование сильного промотора сопряжено с некоторыми слож-
ностями [17—19]. Встраивание его в определенной ориентации может вызвать интен-
сивную транскрипцию в область «огі» и привести к потере стабильности рекомбинантов
Рис. 1. Физико-генетическая карта плазмиды pUC19/rpoB [4] . Стрелками обозначены
участки узнавания рестриктазами EcoRI (EI), Hindi 11 (Η), SalGI (SI), Eco47III (E3).
Участки узнавания рестриктазами EcoRI, SalGI и Hindi 11 в полилинкерной области
pUC 18 обозначены пунктирными стрелками. Обозначены величины фрагментов в п. о.
Fig. 1. Physical and genet ic m a p of the pUC19/rpoB p lasmid [4]. Ar rows indicate re-
str ict ion si tes for EcoRI (E I ) , Hindi 11 (H) , SalGI ( S I ) , Eco47III (E3) . Dotted line de-
s i g n a t e s EcoRI, Hindlll and SalGI recogni t ion sites in the pUC18 polyl inker area.
F r a g m e n t s ' length is g iven in bp
Рис. 2. Электрофорез в 1 %-ном горизонтальном геле рекомбинантных плазмид pUCI8,
содержащих £со /? / -фрагменты 1568 (3) , 1250 (2) и 1085 п. о. ( / ) , включающие промо-
торы Рцоу Р ^ ' и Ρ β соответственно; а, б — альтернативные ориентации клонируемых
фрагментов. В качестве маркерных использованы Д Н К космиды pJC703 [4], расщеп-
ленная EcoRI, и плазмиды pUC19/rpoB [4], расщепленная совместно EcoRI и SalGI
Fig. 2. А 1 % hor izon ta l a g a r o s e gel e lect rophoresis of the recombinant pUC18 p l asmids
c o n t a i n i n g 1568 bp (3) y 1250 bp (2) and 1085 bp (1) EcoRI f r a g m e n t s with p romote r s
Pl\o, Ρβ ' and Ρβ у respectively. EcoRI d iges ted pJC703 cosmid [4] DNA and EcoRI —
SalGI double-diges ted pUC19/rpoB p lasmid DNA are used as markers , а, б — two orien-
t a t ions of the cloned f r a g m e n t
вследствие нарушения репликации плазмид. Причиной нестабильности может стать
присутствие двух сильных промоторов в такой ориентации, когда транскрипция, ини-
циируемая ими, конвергентна. Ориентационный эффект, вызываемый присутствием
сильного промотора, может в ы р а ж а т ь с я и в том, что фрагмент чужеродной Д Н К
встраивается только в одной, «молчащей», ориентации, при которой транскрипция со-
держащихся в нем генов невозможна. Показано , что присутствие гена рибосомного
белка на мультикопийной плазмиде может вызывать летальный эффект для клеток-
хозяев [8]. Учитывая вышеперечисленные обстоятельства, мы предприняли попытку
изучения причин замеченных нами ранее ориентационных эффектов [4, 5] путем кло-
нирования в мультикопийной плазмиде pUC отдельных фрагментов rplJL-rpoBC-опе-
рона Ε. coli.
Д л я конструирования рекомбинантных плазмид, содержащих фрагменты с промо-
торами Р ц о, Ρ β и Ρ β . , мы использовали полученную нами ранее рекомбинантную
плазмиду pUC19/rpoB. Как видно на рис. 1, где приведена физико-генетическая карта
этой плазмиды, фрагменты Д Н К , включающие указанные выше промоторы, можно по-
164 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1988.— Т. 4, ЯЬ 3 164
лучить расщеплением Д Н К этой п л а з м и д ы рестриктазой EcoRI. П о с л е гидролиза 50 мкг
pUC19/rpoB р естриктазой EcoRI полученные п р о д у к т ы р а з д е л я л и э л е к т р о ф о р е з о м в
0,8 %-ном а г а р о з н о м геле и ф р а г м е н т ы EcoRI-В (1568 п. о.: гены г pi A', rpl J и rplU
с п р о м о т о р о м Ρ но) j EcoRI-D (1085 п. о.: rplL', гроВпромотор Ρβ) и EcoRI-C
(1250 п. о.: гроВ', гроС', промотор Ρ β , ) в ы д е л я л и из геля электроэлюцией и о б р а б а т ы -
вали по [11] . К о н с т р у и р о в а н и е р е к о м б и н а н т н ы х п л а з м и д описано в р а з д е л е « М а т е р и а -
лы и методы». У ч и т ы в а я первичную с т р у к т у р у pUC 18 [20] и к л о н и р о в а н н ы х ф р а г м е н -
тов [16] , д а л ь н е й ш е м у а н а л и з у подвергали лишь клоны Е. coli, не о б л а д а ю щ и е г о л у б о й
о к р а с к о й на индикаторной среде с Z -ga l и И П Т Г , поскольку при встраивании у к а з а н -
ных ф р а г м е н т о в р а м к а считывания гена lacZ pUC18 не в о с с т а н а в л и в а е т с я . П р и опре-
делении ориентации встроенных EcoRI-Β-, С- и D-фрагментов (в наличии которых
в рекомбинантных п л а з м и д а х у б е ж д а л и с ь , р а с щ е п л я я последние р е с т р и к т а з о й EcoRI
и а н а л и з и р у я продукты расщепления э л е к т р о ф о р е з о м ) мы использовали присутствие
в у к а з а н н ы х ф р а г м е н т а х уникальных и асимметрично р а с п о л о ж е н н ы х мест у з н а в а н и я
рестриктазой HindiII (для E с о R I - В - ф р а г м е н т а ) и SalGI (для EcoRI-C- и D - ф р а г м е н -
тов) (рис. 1). П о л и л и н к е р н а я о б л а с т ь pUC18 т а к ж е с о д е р ж и т у н и к а л ь н ы е места узна -
вания д а н н ы м и ферментами . Р е с т р и к ц и о н н о м у а н а л и з у было подвергнуто 25 клонов
Е. coli, с о д е р ж а щ и х рекомбинантные п л а з м и д ы со встроенным EсоRI -B-фрагментом ,
и по 30 клонов со встроенными EcoRI-C- и / ^ -фрагментами . К а р т и н а э л с к т р о ф о р е т и ч е -
ского а н а л и з а продуктов расщепления рекомбинантных п л а з м и д р е с т р и к т а з а м и HindiII
и SalGI с в и д е т е л ь с т в о в а л а о том, что EсоRI-B-фрагмент , в отличие от С- и / ^ ф р а г -
ментов, ориентирован во всех р е к о м б и н а н т н ы х п л а з м и д а х в одном н а п р а в л е н и и т а к и м
о б р а з о м , что направление транскрипции р а с п о л о ж е н н ы х на нем генов п р о т и в о п о л о ж н о
н а п р а в л е н и ю транскрипции гена lacZ' векторной п л а з м и д ы (рис. 2 ) .
Р а н е е нами описывалась [5] о д н о н а п р а в л е н н а я ориентация в п л а з м и д е pUC18 и
н е в о з м о ж н о с т ь клонирования в п л а з м и д е pUC19 BglII-EcoRI-фрагмента rplJL-rpoBC-
оперона Ε. coli, в к л ю ч а ю щ е г о гены г pi A', rplJ и rplL'. С у щ е с т в у ю т д а н н ы е [8] о том ,
что наличие в к л е т к а х Е. coli мультикопийной рекомбинантной п л а з м и д ы pGA217,
в к л ю ч а ю щ е й HindllI-фрагмент rplJL-rpoBC-oucpoua Ε. coli, с о д е р ж а щ е й гены rplA'
и rpW ( кодирующий белок L10 с н е д о с т а ю щ и м и 20 а м и н о к и с л о т а м и С - к о н ц а ) , вызы-
вает летальный эффект . Причиной этого я в л я е т с я синтез рибосомного белка L10, коди-
руемого т а к о й плазмидой , репрессирующий синтез белка L7/LI2, кодируемого хромо-
с о м а л ь н ы м геном rplL, н а р у ш а я таким образом сборку рибосомпой субъединицы. П о -
к а з а н а т а к ж е [7] н е в о з м о ж н о с т ь конструирования рекомбинантной п л а з м и д ы pBR322,
в к л ю ч а ю щ е й £ с о / ? / - ф р а г м с н т в ы ш е у к а з а н н о г о оперона, с о д е р ж а щ и й гены rplK!, rplA,
rplJ и rplL'. С д р у г о й стороны, установлено [7] , что мутации внутри лидерного района
гена rplJ ( м е ж д у промотором P L l 0 и началом структурной части гена rplJ), регулирую-
щего э ф ф е к т и в н о с т ь трансляции м Р Н К rplJ, снимают л е т а л ь н ы й эффект , в ы з ы в а е м ы й
наличием в к л е т к а х £ . coli мультикопийной плазмиды, с о д е р ж а щ е й ген rplJ. С ф а к т о м
летального э ф ф е к т а мультикопиипых плазмид , кодирующих синтез белка L10, согласу-
ются наши н а б л ю д е н и я (по картине э л е к т р о ф о р е з а ) резкого снижения копиииости
плазмид , с о д е р ж а щ и х ген г pi J в составе £ с о # / - ф р а г м е н т а (1568 п. о.) и BgUI-EcoRI-
ф р а г м е н т а [5] , а т а к ж е з амедление скорости роста клеток £ . coli, с о д е р ж а щ и х т а к и е
п л а з м и д ы . У ч и т ы в а я присутствие в п л а з м и д е pUC промотора lac, м о ж н о п р е д п о л о ж и т ь ,
что н а б л ю д а е м а я нами единственная ориентация EcoRI-фрагмента, с о д е р ж а щ е г о ген
rplJ с промотором P L , о , является следствием в з а и м о д е й с т в и я эгпх двух промоторов .
П р и д а й н о й ориентации промоторы lac и PL\о инициируют конвергентную транскрип-
цию, у м е н ь ш а ю щ у ю количество м Р Н К , т р а н с к р и б и р у е м о й с гена rplJ, что приводит
к уменьшению количества белка L10 и о с л а б л я е т его негативный эффект . Альтерна -
т и в н а я ориентация в ы ш е у к а з а н н о г о ф р а г м е н т а , по-видимому, н е в о з м о ж н а , поскольку
привела бы к усилению транскрипции rplJ и потере жизнеспособности клонов £ . coli,
с о д е р ж а щ и х такие рекомбинантные плазмиды. В свете вышеперечисленного мы счита-
ли ц е л е с о о б р а з н ы м расчленение E с о R I - ф р а г м с н т а на с у б ф р а г м е н т ы , в к л ю ч а ю щ и е от-
дельно промотор PLίο и с т р у к т у р н у ю часть гена rplJ и п о с л е д у ю щ е е к л о н и р о в а н и е их
в п л а з м и д е pUC. И з первичной с т р у к т у р ы rpUL-rpoBC-ouepona £. coli [16] м о ж н о за -
ключить, что при расщеплении EcoRI-фрагмента (1568 п. о.) р е с т р и к т а з о й BspRI об
разуются , в частности, ф р а г м е н т А (882 п. о.) , с о д е р ж а щ и й лидерный участок и п о л н у ю
с т р у к т у р н у ю часть гена rplJ, и ^ - ф р а г м е н т (237 п. о . ) , в к л ю ч а ю щ и й промотор PLl0.
Д л я в с т р а и в а н и я в п л а з м и д у pUC19 BspRI-фрагменты А и В в ы д е л я л и после
разделения их в 10 %-ном П А А Г [11] . К а к и в случае EсоRI -фрагментов , после кон-
струирования рекомбинантных п л а з м и д и т р а н с ф о р м а ц и и компетентных клеток £ . coli
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1988.— Т. 4, ЯЬ 3 165
анализу подвергали клоны, утерявшие голубую окраску на среде l Z-ga l и И П Т Г .
Определение ориентации встроенных BspRI-фрагментов проводили, анализируя по 20
рекомбинантных плазмид в случае каждого BspRI-фрагмента. Д Н К рекомбинантных
плалмид расщепляли Ж і о н у к л е а з о й рестрикции BspRI и сравнивали с продуктами рас-
щепления этим же ферментом векторной плазмиды pUC19. Д л я дальнейшего анализа
отбирали плазмиды, молекулярная масса которых превышала на соответствующую ве-
личину массу исходной. Определяя ориентацию BspRI-A-фрагмента, мы учитывали, что
расщепление его рестриктазой HindiII дает два фрагмента (622 и 260 п. о.) . Учитывая
Рис. 3. Электрофорез в 1 %-
ном агарозном ( / ) и 10 %-
ном П А А Г (2) расщеплен-
ных рестриктазой Hindlll
плазмид pUC19, содержа-
щих BspRI-A-фрагмент со
структурной частью гена
rplJ, и совместно рестрикта-
зами Есо47ІІІ и Hindi II
плазмид, с о д е р ж а щ и х
В5/?^/ -В-фрагмент с промо-
тором Pliо в двух ориента-
циях (а, б ) . В качестве ре-
пера использована плазмида
pBR322, расщепленная
BspRI
Fig. 3. А 1 % a g a r o s e ( / )
and 10 % P A A G (2) electro-
phores is of Hindi II — dige-
sted pUC19 p l a smids wi th in-
serted rplJ gene s t ruc tu ra l
par t c o n t a i n i n g BspRI—A—
f r a g m e n t ( / ) , and double
digested by Eco47III and Hindi 11 pUC19 r ecombinant p lasmid wi th the Р ы о - p r o m o t e r
con ta in ing ВspRI-B-fragment inser ted in both o r i en ta t ions (а, 6)
наличие уникального участка узнавания Hindi 11 на pUC19, расщепление рекомбинант-
ных плазмид, включающих BspRI-^ -фрагмент , могло привести в зависимости от его
ориентации в них к образованию HindiII-фрагментов величиной 2913 и 655 п. о. или
3275 и 293 п. о. соответственно. Электрофоретический анализ Я / ш Ш / - г и д р о л и з а т о в по-
лученных нами рекомбинантных плазмид (рис. 3) показал, что все они содержат
-фрагмент в одинаковой ориентации, при которой направление транскрипции
генов rplJ встроенного фрагмента и /acZ'-векторной плазмиды противоположно (рис .3 ) .
В случае BspRI-B-фрагмента определение ориентации его в рекомбинантных плазмидах
проводили путем расщепления их совместно рестриктазами Eco47III и Hindlll, учиты-
в а я наличие уникального участка узнавания Есо47ІІІ в BspRI-B-фрагменте [16] и
Hindlll — в полилинкерной области pUC19 [20]. При расщеплении рекомбинантных
плазмид совместно Есо47П1 и Hindlll в зависимости от ориентации BspRI-В-фратмеп-
та можно было ожидать выщепления Eco47III-HindI II-фрагментов (264 п. о. или
39 п. о.). Как видно на рис. 3, электрофоретический анализ продуктов расщепления
рекомбинантных плазмид показал наличие в них BspRI-B-фрагмента в обеих
ориентациях.
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что в рекомби-
иантной плазмиде pUC возможны обе ориентации BspRI-В-фрагмента, содержащего
промотор Pi,ю, и лишь одна ориентация BspRI-А-фрагмента, содержащего структурную
часть гена rplJ. Такая ориентация этого гена при отсутствии промотора Рцо, по-види-
мому, является «молчащей». Альтернативная ж е ориентация гена rplJ, вероятно, при-
водит к инициации транскрипции гена rplJ с /ac-промотора векторной плазмиды и син-
тезу летального для клетки количества белка L10. Свидетельством в пользу такого
заключения может быть тот факт, что встраивание содержащего структурную часть
гена rplJ BspRI-A-фрагмента не ведет к снижению копийности содержащих его реком-
бинантных плазмид.
1 6 6 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1988.— Т. 4, ЯЬ 3 166
ORIENTATIONAL E F F E C T S CAUSED IN THE pUC PLASMID
BY E. COLI rplJL-rpoBC-OPERON FRAGMENTS
Ε. В. Paton, I. V. Kroupskaya, A. N. Zhyvoloup
Ins t i tu te of Molecular Biology and Genetics,
Academy of Sciences of the Ukrainian SSR, Kiev
S u m m a r y
A number of recombinant pUC p lasmids conta ining E. coli rplJL-rpoBC-operon f r a g m e n t s
were constructed. A rplJ gene and PL\o promoter conta in ing 1568 bp EcoRI f r a g m e n t
and rplJ gene s t ructural par t conta in ing - f ragment were found to be oriented
in pUC p lasmids unidirectionally, in such a way that genes rplJ of the inserted f r a g m e n t
and lacZ' of the vector were transcribed in the opposite direction.
1. Close T. J., Christ man J. L.r Rodriguez R. L. Μ13 bacter iophage and pUC p lasmids
con ta in ing DNA inser ts but still capable of β-galac tos idase α-complementa t ion / /
Gene.— 1983.—23, N 1 .—P. 131—136.
2. Cloning and expression of the gene for bacter iophage 77 RNA polymerase / P. Da-
vanloo, A. H. Rosenberg, J . J. Dunn, F. W. Studier / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—
1984 . - 81 , N 7 . — P . 2035—2039.
3. Barry G., Squires C. L., Squires C. Control fea tures within the rplJL-rpoBC t r ans -
cription unit of Escherichia coli / / Ibid.— 1979.—76, N 10 .—P. 4922—4926.
4. Патон Ε. В., Живолуп Α. Η., Вараница JI. А. Присутствие двух сильных промото-
ров определяет ориентацию фрагмента Д Н К при встраивании в плазмиду pUC19 / /
Биополимеры и клетка.— 1986.—2, № 4.— С. 217—219.
5. Патон Е. В., Крупская И. В., Живолуп А. Н. Особенности клонирования фрагмен-
тов гроВС-оперона Escherichia coli в плазмидах р £ / С / / Т а м же.— 1987.—3, № 6.—
С. 307—312.
6. Патон Е. В., Вудмаска М. И., Свердлов Е. Д. Однонаправленная ориентация гена
гроВ Е. coli при клонировании в нитевидные фаги М13пгр8 и M13tnWB2348 //
Биоорг. химия.— 1984.—10, № 11.—С. 1544—1547.
7. Post-transcriptional regula tory m u t a n t s in a ribosomal protein-RNA polymerase ope-
ron of E. coli / N . P. Fiil, J. D. Friesen, W. L. Downing, P. P. D e n n i s / / C e l l . — 1980.—
19, N 4 , — P . 837—844.
8. Friesen J. D., An G., fiil N. The lethal effects of a plasmid resul t ing from transcr ip-
t ional read through of rplJ f rom the rplKA operon in Escherichia coli// Мої. and
Gen. Genet.— 1983 —189, N 2 — P . 275—281.
9. Zinder N. D., Boeke J. D. The f i lamentous phage (Ff) as vectors for recombinant
D N A — a r e v i e w / / G e n e . — 1982,—19, N 1 ,—P. 1 — 10.
10. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике.— М. : Мир, 1976.—395 с.
11. Maniatis Т., Fritsch Ε. F., Sambrook J. Molecular cloning — a laboratory manual .—
New York: Cold Spr ing Harbor Lab., 1982,—545 p.
12. Birnboim H. C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombi-
nan t plasmid DNA / / Nucl. Acids Res.— 1979.—7, N 6,— P. 1513—1523.
13. Clewell D. В., Helinski D. R. Supercoiled circular DNA protein complex in Escherichia
coli: purif icat ion and induced conversion to an open circular DNA f o r m / / P r o c . Nat .
Acad. Sci. USA.— 1969.—62, N 3 . — P . 1159—1166.
14. Вуд маска Μ. И., Патон Ε. Б. Клонирование участка rplJL-rpoBC-оперона Esche-
richia coli в плазмидах pBR322 и pHSG415 / / Докл. АН УССР.— 1987.—№ 9.—
С. 58—62.
15. Downing W. L.f Dennis P. P. Transcript ion products f rom the rplKAJL-rpoBC gene
c l u s t e r / / J . Мої. Biol.— 1987.—194, N 4 . — P . 609—620.
16. Nucleotide sequence of the ribosomal protein gene cluster ad jacen t to the gene for
RNA polymerase subunit in Escherichia coli / L. F. Post , G. D. Strycharz, M. Nomu-
ra, H. L e w i s / / P r o c . Nat . Acad. Sci. USA.— 1979.—76, N 4 . — P . 1697—1701.
17. Stueber D., Bujard H. Transcript ion f rom efficient promoters can interfere with plas-
mid replication and diminish expression of plasmid specified genes / / EMBO J.—
1982,—1, N 11.—P. 1399—1404.
18. Stassi D. L., Lacks S. A. Effect of s t rong promoters on the cloning in Escherichia
coli of DNA f r agmen t s f rom Streptococcus pneumoniae / / Gene.— 1982.—18, N 3.—
P. 319—328.
19. Cloning and analysis of s t rong promoters is made possible by the downs t ream pla-
cement of a RNA terminat ion s ignal / R. Gentz, A. Langner , A. C. Y. Chang et al. / /
Proc. Nat. Acad. Sci. USA.— 1981.—78, N 8 . — P . 4936—4940.
20. Yanish-Perron C., Vieira J., Messing J. Improved M13 phage c loning vectors and host
s trains: sequences nucleotide of the M13mpl8 and pUC19 v e c t o r s / / G e n e . — 1985.—
33, N 1 .—P. 103—119.
Ин-т молекуляр. биологии Получено 26.05.87
и генетики АН УССР, Киев
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1988 — Т. 4. Кя 167
|