Взаимодействие флюоресцентных аналогов АТР и тРНК с фенилаланил-тРНК синтетазой
Изучена модификация фенилаланил-тРНК синтетазы из Escherichia coli, штамм MRE-600, с помощью 1N⁶-этеноаденозин-5'-трифосфата (εАТР) в присутствии различных лигандов. Предполагается, что ковалентное присоединение εАТР происходит в области связывания 3'-конца тРНК. Получены флюоресцентные пр...
Saved in:
| Published in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Date: | 1988 |
| Main Authors: | , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1988
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154039 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Взаимодействие флюоресцентных аналогов АТР и тРНК с фенилаланил-тРНК синтетазой / В.Н. Анкилова, В.А. Гордиенко, О.И. Лаврик, Н.А. Моор // Биополимеры и клетка. — 1988. — Т. 4, № 4. — С. 197-203. — Бібліогр.: 14 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859681667462987776 |
|---|---|
| author | Анкилова, В.Н. Гордиенко, В.А. Лаврик, О.И. Моор, Н.А. |
| author_facet | Анкилова, В.Н. Гордиенко, В.А. Лаврик, О.И. Моор, Н.А. |
| citation_txt | Взаимодействие флюоресцентных аналогов АТР и тРНК с фенилаланил-тРНК синтетазой / В.Н. Анкилова, В.А. Гордиенко, О.И. Лаврик, Н.А. Моор // Биополимеры и клетка. — 1988. — Т. 4, № 4. — С. 197-203. — Бібліогр.: 14 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Биополимеры и клетка |
| description | Изучена модификация фенилаланил-тРНК синтетазы из Escherichia coli, штамм MRE-600, с помощью 1N⁶-этеноаденозин-5'-трифосфата (εАТР) в присутствии различных лигандов. Предполагается, что ковалентное присоединение εАТР происходит в области связывания 3'-конца тРНК. Получены флюоресцентные производные тРНКPhe, содержащие этено-аденозин в 3'-концевой АССА-последовательности, и исследовано их взаимодействие с фенилаланил-тРНК синтетазой.
Вивчено модифікацію фенілаланіл-тРНК синтетази з Escherichia coli, штам MRE-600, за допомогою 1N⁶-етеноаденозин-5'-трифосфату (εАТР) за присутності різних лігандів. Передбачається, що ковалентне приєднання εАТР відбувається в області зв’язування 3'-кінця тРНК. Отримано флуоресцентні похідні тРНКPhe, що містять етеноаденозин у 3'-кінцевий АССА-послідовності, і досліджено їхню взаємодію з фенілаланіл-тРНК синтетазою.
Affinity modification of E. coli MRE-600 phenylalanyl-tRNA synthetase by 1,N⁶-etheno-adenosine-5-triphosphate (εATP) in the presence of different ligands has been investigated. ATP conversion into εATP results in the disturbance of specific contacts of nucle-otide with the ATP binding site in the enzyme. The εATP covalent attachment site is assumed To be situated in the tRNA 3'-terminus recognizing site. Fluorescent tRNAPhe analogs have been prepared by replacing adenosine 73 or 76 by 1,N⁶-ethenoadenosine. The activity of these analogs has been investigated in the aminoacylation. The low yield of photoinduced covalent attachment of these derivatives to phenylalanyl-tRNA synthetase is observed.
|
| first_indexed | 2025-11-30T17:44:50Z |
| format | Article |
| fulltext |
УДК 577.152.611
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ФЛЮОРЕСЦЕНТНЫХ АНАЛОГОВ АТР
И тРНК С ФЕНИЛАЛАНИЛ-тРНК СИНТЕТАЗОЙ
В. Н. Анкилова, В. А. Гордиенко, О. И. Лаврик, Н. А. Моор
Введение. Этенопроизводные нуклеотидов широко используются для
изучения структурно-функциональной топографии ферментов, зависи-
мых от нуклеотидов [1]. Получены производные тРНК различной спе-
цифичности, содержащие остатки этеноаденозипа [2, 3]. Особый ин-
терес представляет применение такого типа соединений в качестве
аффинных реагентов для модификации белков.
В работе [4] впервые обнаружена возможность ковалентного при-
соединения 1 ,Ы6-этеиоадепозин-5/-трифосфата (εΑΤΡ) к фенил аланил-
тРНК синтетазе (КФ 6.1.1.20). Настоящая работа посвящена более де-
тальному исследованию аффинной модификации фенил алан ил-тРН К
синтетазы с помощью εΑΤΡ. Получены флюоресцентные аналоги
τΡΗΚρί1β и исследовано их взаимодействие с сиптетазой.
Материалы и методы. Фенилаланил-тРНК синтетаза из Escherichia coli MRE-600
выделена согласно [5]. тРНК Р Ь е из Е. coli MRE-600 фирмы «Boehringer Mannheim»
(Австрия). РНК-лигаза Т4 из Е. coli производства НПО «Фермент» (Вильнюс). Ще-
лочная фосфатаза из Е. coli и тРНК из Е. coli MRE-600 производства НПО «Биолар»
(Олайнс). АТР[СТР] : тРНК нуклеотидилтрансфераза из Е. coli любезно предоставле-
на А. С. Буториным. L-фенилаланин, аденозин, ATP, GMP фирмы «Reanal» (Венгрия).
Пуромицин фирмы «Serva» (ФРГ). L-[14C]фенилаланин (13,3 ТБк/моль), [НС]АТР
(17 ТБк/моль) — «UVVVR» (ЧССР). Пирофосфат натрия (0,4 ТБк/моль) производст-
ва ВО «Изотоп», Моск. отд-ние. Аденозин-З', 5'-дифосфат (рАр) синтезировали из
аденозина согласно [6]. εΑΤΡ синтезирован В. Н. Подустом. 1,Ы6-этеноаденозин-3', 5'-
дифосфат (ρεΑρ) синтезировали из рАр по аналогии с методом получения εΑΤΡ [7].
1,№-этеноаденозин любезно предоставлен А. Т. Прудченко. Другие реактивы были ква-
лификации «осч» или специально очищены стандартными методами.
Ступенчатое укорачивание тРНКР11е с З'-конца, присоединение рАр или ρεΑρ к
«укороченным» тРНК с помощью РНК-лигазы Т4, достраивание ССА-конца тРНК
с помощью АТР[СТР] : тРНК нуклсотидилтрансферазы проводили согласно [2] с неко-
Т а б л и ц а 1
Влияние лигандов на инактивацию фенилаланил-тРНК синтетазы при облучении
с гАТР или этеноаденозином
Ligands influence on the phenylalanyl-tRNA synthetace inactivation under irradiation
in the presence of гАТР or ethenoadenosine
Реагент, мМ Лиганд Лиганд,
мМ ч- l
k
β. каж'
L
каж
εΑΤΡ, 0,10 — 0,046
» » АТР 1,0 — 0,046 1,0
» » GMP l.o — 0,060 0,8
» » РР 5,0 — 0,052 0,9
» » T PHK P h e 0,02 — 0,024 1,9
» » TPHKP h e(—А) 0,02 — 0,026 1,8
» » T P H K P h e + 0,02 — — —
» » + L - P h e + 0,01 — — —
» » + А Т Р 2,0 — 0,026 1,8
N-ацетилфенил-
» » аланил-тРНКРЬе 0,02 — 0,003 15
» » Пуромицин 1,0 — 0,019 2,5
Этеноаденозин, 0,10 — — 0,042 — —
» » T PHK P h e 0,02 — 0,024 1,8
» » TPHKP h e(—А) 0,02 — 0,043 1,0
* kкаж (kъкаж)—кажущиеся константы скорости инактивации фермента в реакции
аминоацилирования тРНК в отсутствие (присутствии) лигандов. Рассчитаны из кине-
тических кривых инактивации. Приведены средние значения 6—8 измерений, средние
отклонения не превышали ± 1 5 %.
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. — 1988. — Т. 4, № 4 197
торыми изменениями условий ферментативных реакций. После лигирования или ССА-
достраивания тРНК выделяли на Д Э А Э - с е ф а д е к с е А - 2 5 («Pharmacia», Швеция).
тРНКР1ге, содержащую 1,№-этеноаденозин в 73-м положении, после аминоацилирова-
ния хроматографировали н а Лихросфере Si-1000 («Merck», Ф Р Г ) . Меченые препараты
тРНКР11е получали, используя в реакции с нуклеотидилтрансферазой [14С]АТР. Це-
лостность структуры препаратов тРНК Р Ь е анализировали методом электрофореза в
полиакриламидном геле.
Спектры флюоресценции этенированных нуклеотидов и тРНК регистрировали на
спектрофлюориметре «Hitachi» MPF-2A (Япония).
Для облучения фениланалил-тРНК синтетазы с этенопроизводными АТР или
тРНКР11е использовали азотный лазер ЛГИ-21 с длиной волны излучения 337 нм. Ре-
акционная смесь (объемом 50—100 мкл) содержала 0,02 Μ калий-фосфатный буфер,
рН 7,5, 0,01 Μ MgCl2, 1,5 мг/мл (5 мкМ) фермента, 0,1—0,5 мМ εΑΤΡ. Концентрации
других лигандов указаны в табл. 1. Смесь облучали в течение 1—2 ч. Отбирали аликво-
ты (5—10 мкл) через определенные интервалы времени для измерения активности бел-
ка в реакциях аминоацилирования тРНК [5] или АТР-[32Р]пирофосфатного обме-
на [8]. В опытах с производными тРНК Р Ь е смесь содержала 10—50 мкМ τΡΗΚεΑ7ρ
или 0,5—5 мкМ τ Ρ Η Κ ε Α 7 3 · Смесь облучали в течение 5 ч. Препараты тРНКР Ь е предва-
рительно обрабатывали перекисью водорода согласно [9].
Уровень ковалентного присоединения [14С]єАТР или [14С]тРНК£д73 к фенилала-
нил-тРНК синтетазе определяли после отделения белка от остальных компонентов ре-
акционной смеси гель-фильтрацией на сефадексе G-100, уравновешенном 0,05 Μ трис-
HCl-буфером, рН 8,0, содержащим 0,5 Μ КС1, как описано в [4].
Образование комплекса фенилаланил-тРНК синтетазы с аминоациладенилатом
определяли сорбцией на ДЭАЭ-целлюлозных фильтрах («Whatman», Англия) по ме-
тоду [10].
При исследовании ингибирующего действия аналогов тРНКРЬе смесь для амино-
ацилирования содержала 0,1—1,2 мкМ тРНКР Ь е , 1—6 мкМ аналог тРНК Р Ь е и осталь-
ные компоненты согласно [5]. Тип ингибирования и величины Km и Кг определяли,
используя координаты Лайнуивера — Бэрка и прямой линейный график Корниш — Боу-
дена и Эйзенталь.
Результаты и обсуждение. Ранее было показано, что εΑΤΡ кова-
лентно присоединяется к фенилаланил-тРНК синтетазе при облучении
светом с длиной волны 337 нм [4]. При этом наблюдается инактива-
ция фермента в реакции аминоацилирования тРНК, что указывает на
специфичность модификации. Величина Κι для εΑΤΡ, найденная из за-
висимости величин &каж процесса инактивации от концентрации аналога
(0,1 мМ), близка величине К т для АТР. Однако другой важный крите-
рий аффинной модификации — защита специфическим субстратом от
модификации аналогом — в этом случае не используется [4]. Как АТР
(1,0 мМ), так и АТР совместно с фенил ал анином в условиях образова-
ния фенилаланиладенилата не защищают фермент от инактивации. По-
этому потребовалось более детальное изучение взаимодействия εΑΤΡ
с ферментом.
εΑΤΡ является субстратом фенилаланил-тРНК синтетазы из Е. coli
MRE-600 в реакции аминоацилирования тРНК [7]. В то время как
фермент не катализирует реакции обмена между εΑΤΡ и [32Р] пирофос-
фатом, образование промежуточного комплекса фенилаланил-тРНК син-
тетазы с фепилаланилэтеноаденилатом было зарегистрировано методом
сорбции на ДЭАЭ-целлюлозных фильтрах. Как видно из кривых, при-
веденных на рис. 1, активация фенилаланина в присутствии εΑΤΡ
происходит с меньшей эффективностью, чем в присутствии АТР. Таким
образом, введение этеногруппы в молекулу АТР приводит к нарушению
правильных контактов нуклеотида с АТР-узнающим участком фермента.
В пользу этого свидетельствуют данные о том, что этенопроизводные
АТР и аденозина не индуцируют синергизма в связывании фенилала-
нинола и фенилаланина соответственно [11]. По-видимому, нарушение
специфических взаимодействий затрудняет обмен между εΑΤΡ и пиро-
фосфатом и снижает эффективность аминоацилирования тРНК с учас-
тием промежуточного комплекса фермента с фенилаланилэтеноаденила-
198 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. — 1988. — Т. 4, № 4 198
том (V макс для εΑΤΡ составляет 1—2 % ОТ Кмакс для АТР в реакции
аминоацилирования тРНКРЬе [7]).
На рис. 2 приведены кинетические кривые инактивации фенилала-
нил-тРНК синтетазы при облучении с εΑΤΡ в реакциях аминоацилиро-
вания тРНК и АТР- [32Р] пирофосфатного обмена. Уровень инактивации
фермента в реакции аминоацилирования значительно глубже, чем в
реакции обмена, что может указывать на взаимодействие εΑΤΡ с участ-
ками фермента, более важными для функциональной активности фер-
мента в полной реакции синтеза аминоацил-тРНК, чем для активации
аминокислоты.
Данные табл. 1 по влиянию различных лигандов на инактивацию
фепилаланил-тРНК синтетазы при облучении с εΑΤΡ показывают, что
Рис. 1. Образование комплекса фенилаланил-тРНК синтетазы с аминоациладенилатом
(/) и аминоацилэтеноаденилатом (2) в присутствии различных концентраций АТР или
εΑΤΡ. Реакционная смесь содержит 0,05 Μ трис-НС!, рН 7,5, 0,4 мМ дитиотреитол,
10 мМ MgCl2, 20 мкМ L-[14C]фенилаланин, 0,1 мкМ фермент, 0,5 — 20 мМ АТР или
εΑΤΡ
Fig. 1. Complex formation of phenylalanyl-tRNA synthetase with aminoacyladenylate (/)
and aminoacylethenoadenylate (2) in the presence of different ATP or εΑΤΡ concentra-
tions. Reaction mixture contains 0.05 Μ tris-HCl, pH 7.5, 0.4 mM dithiothreitol, 10 mM
MgCl2, 20 μΜ L-[14C] phenylalanine, 0.1 μΜ enzyme, 0.5—20 mM ATP or εΑΤΡ
Рис. 2. Зависимость активности фенилаланил-тРНК синтетазы в реакциях аминоацили-
рования тРНК (1) и АТР-[32Р] пирофосфатного обмена (2) от времени облучения в
отсутствие (а) и присутствии (б, в) 0,1 мМ εΑΤΡ
Fig. 2. Irradiation time dependence of the phenylalanyl-tRNA synthetase activity in the
tRNA aminoacylation reaction (/) and the ATP-[32P] pyrophosphate exchange reaction
(2) in the absence (a) or in the presence (б, в) of 0.1 mM εΑΤΡ
GMP, нуклеотидный эффектор фенилаланил-тРНК синтетазы [12],
и пирофосфат не оказывают защитного действия. Достаточно заметный
защитный эффект проявляет тРНКРЬе. Этот результат позволил пред-
положить, что εΑΤΡ взаимодействует с участком связывания З'-конце-
вого аденозина тРНК. Отсутствие полной защиты может быть объясне-
но не абсолютно точным взаимодействием εΑΤΡ с этим участком фер-
мента либо тем, что акцепторный конец тРНК не образует прочного
контакта с белком в отсутствие других субстратов.
Можно ожидать большей конкуренции между εΑΤΡ и З'-концом
аминоацил-тРНК за взаимодействие с ферментом. Защитный эффект
фенилаланил-тРНК, образуемой in situ, не отличается от влияния
тРНК, что может быть связано с нестабильностью продукта реакции
аминоацилирования тРНК (в условиях модификации время полугидро-
лиза фенилаланил-тРНКРЬе~30 мин). В присутствии устойчивого ана-
лога аминоацил-тРНК — 1\[-ацетилфенилаланил-тРНКр11е — наблюдает-
ся практически полная защита фермента от инактивации под действи-
ем εΑΤΡ (табл. 1).
В качестве соединения, моделирующего З'-концевой аденозин, ами-
ноацилированный фенилаланином, был использован пуромицин. На
взаимодействие пуромицина с тРНК- либо аминоацил-тРНК-узнающим
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. — 1988. — Т. 4, № 4 199
участком фенилаланил-тРНК синтетазы указывает ингибирование этим
соединением реакции аминоадилирования тРНКрї1е при отсутствии ин-
гибирования реакции АТР-[32Р] пирофосфатного обмена. Пуромицин
значительно снижает уровень инактивации фенилаланил-тРНК синте-
тазы при облучении с εΑΤΡ (данные показаны в табл. 1).
Для дальнейшей проверки предположения о взаимодействии εΑΤΡ
с участком связывания З'-концевого аденозина тРНК исследовано влия-
ние тРНКРЬе без З'-концевого аденозина (тРНКРЬе (—А)) на инактива-
цию фермента с помощью εΑΤΡ. В этом случае наблюдается такой же
защитный эффект, что и в присутствии тРНКРЬе (табл. 1). Этот резуль-
тат может быть объяснен
Т а б л и ц а 2
Аминоацилирование укороченных тРНКРЪе
и продуктов их лигирования
Aminoacylation of «shortened» tRNAVhe derivatives
and their ligation products
тРНК
АТР(СТР):
тРНК
нуклеотидил-
трансфераза
Предельное
аминоацили-
рование,
гімоль
Phe/A26o (%)
т Р Н К Р Ь е 1500 (100)
тРНК(—А) + 1050 (70)
тРНК(—А)* — 570 (38)
тРНК(—А)* + 960 (64)
τ Ρ Η Κ ε Α 7 6 — ^ 1 5 ( < 1 )
т Р Н К є а 7 6 + 510 (34)
т Р Н К ( — А С С А ) + 60 (4)
τΡΗΚε.\73(—ССА) + 370 (25)
слабой конкуренцией εΑΤΡ
с З'-концевым аденозином
тРНКРЬе за взаимодействие
с ферментом.
Τ а б л и д а 3
Величины Km и Κι аналогов
тРНКр]и*
Km and Ki of tRNAphe
analogs
Аналог TPHKP h e
mkM mkM
П р и м е ч а н и е . тРНК(—А), тРНК(—CCA),
тРНК(—ACCA) — тРНК Р Ь е , укороченная на один,
три или четыре нуклеотида с З'-конца; τΡΗΚεΑ76>
τΡΗΚεΑ73 — тРНК Р Ь е , содержащая этеноаденозин
в 76-м или 73-м положениях соответственно.
* —тРНК(—А), лигированная в присутствии ρ Ар
и затем обработанная щелочной фосфатазой.
тРНКР11е
тРНК (—А)
тРНК(—ССА)
тРНК(—АССА)
тРНКел7б
τ Ρ Η Κ ε Λ 7 3
0,3
0,5
3,8
4,8
5,6
1,2
П р и м е ч а н и е . Приведены сред-
ние значения 2—6 измерений,
средние отклонения величин 15—
20 %.
Для сравнения подобные эксперименты были проведены с Ι,Ν6-
этеноаденозином. εΑΤΡ и этеноаденозин (в равных концентрациях)
в одинаковой степени ипактивируют фенил ал апил-тРНК синтетазу
(табл. 1). В присутствии тРНКРЬе наблюдается такой же защитный
эффект от инактивации этеноаденозином, что и при облучении с εΑΤΡ.
Однако тРНКРЬе, лишенная З'-концевого аденозина, в этом случае не
оказывает защитного влияния. Полученные результаты позволяют сде-
лать вывод о том, что в случае этепоаденозина происходит более точ-
ная «адресовка» в участок узнавания З'-концевого аденозина тРНК.
В то время как наличие трифосфатной группы в εΑΤΡ приводит, по-ви-
димому, к частичному нарушению специфических взаимодействий ну-
клеозидпой части εΑΤΡ с этим участком фермента.
При определении уровня ковалентного присоединения [140]εΑΤΡ
к фенилаланил-тРНК синтетазе в присутствии других лигандов полу-
чены результаты, согласующиеся с данными по защите фермента от
инактивации. Наиболее эффективно на неприсоединение εΑΤΡ к белку
влияет Ы-ацетилфенилаланил-тРНКРЬе (0,13 моль εΑΤΡ на моль фер-
мента в отсутствие и 0,03 моль εΑΤΡ на моль фермента в присутствии
Ν-ацетил фенил ал анил-тРНКРЬе).
Таким образом, результаты исследования свидетельствуют о том,
что введение этеногруппы в молекулу АТР искажает характер специ-
фического взаимодействия нуклеотида с фенилаланил-тРНК синтета-
зой. Хотя εΑΤΡ проявляет субстратную активность, однако при этом
нарушаются контакты с АТР-узнающим центром. Этот тип взаимодей-
200 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. — 1988. — Т. 4, № 4 200
ствия εΑΤΡ с ферментом не обнаруживается с помощью фотоиндуци-
руемой модификации. Наиболее вероятно, что ковалентное присоедине-
ние εΑΤΡ происходит в области связывания З ' -конца т Р Н К .
Представляло интерес изучение возможности аффинной модифи-
кации а м и н о а ц и л - т Р Н К синтетаз с помощью производных т Р Н К , со-
д е р ж а щ и х этенонуклеотиды, поскольку в этом случае следует о ж и д а т ь
более специфической «адресовки» реакциопноспособной группы в актив-
ный центр фермента. В литературе описаны производные т Р Н К Р Н е из
д р о ж ж е й и T P H K f e t из Е. coli, содержащие остатки этепоадепозипа в
определенных положениях акцепторного конца т Р Н К [2, 3] . Р а з р а б о -
танный метод использован нами для получения производных т Р Н К Р Ь е
из Е. coli, содержащих этеноадепозип в 76-м или 73-м положениях.
Уровень присоединения ρεΑρ к укороченным с З ' -коица на один,
три или четыре нуклеотида т Р Н К определяли по восстановлению акцеп-
торной активности продуктов лигирования. После отщепления З'-кон-
цевого фосфата в продуктах лигирования щелочной фосфатазой про-
водили их амипоацилирование в присутствии или отсутствие АТР [СТР] :
: т Р Н К иуклеотидилтрансферазы, способной достраивать З ' -ССА-конец
т Р Н К . В контрольных экспериментах в качестве донора Р Н К лпгазпой
реакции использовали рАр. Д а н н ы е представлены в табл. 2. Полного
восстановления акцепторной активности укороченных т Р Н К с помощью
пуклеотидилтрапсферазпой реакции не удалось достичь вследствие
частичной фрагментации т Р Н К . Уровень включения рАр в тРНКР 1 1 е
без З '-концевого нуклеотида составляет 3 8 % . тРНКеД7в ацилируется
фенил ал апипом, как и аналогичное производное т Р Н К Р Ь о из д р о ж ж е й
[2]. Из сравнения акцепторной активности тРНКРд 7 6 и т Р Н К ( — А ) ,
лигироваппоп в аналогичных условиях с помощью рАр, после предва-
рительной инкубации с пуклеотидилтрапсферазой можно оцепить, что
уровень присоединения ρεΑρ к т Р Н К ( — А ) составляет не менее 3 0 % .
TPHKf.\73, полученная путем лигирования тРНКР 1 1 е , укороченной на
четыре нуклеотида, с помощью ρεΑρ и последующей достройки ССА-
копца, сохраняет способность амппоацилироваться. Восстановление
акцепторной активности происходит па 17—25 % по сравнению с исход-
ной тРНКРЬе. Полученный препарат тРНКедгз был обогащен в два раза
с помощью обратпофазовой хроматографии.
В табл. 3 приведены величины К т и KL для различных т Р Н К , мо-
дифицированных по акцепторному концу. Удаление З '-копцевого ну-
клеотида снижает на порядок сродство т Р Н К к ф е н и л а л а н и л - т Р Н К
синтетазе. Дальнейшее укорачивание т Р Н К с З ' -коица па три или четы-
ре звена мало влияет па уменьшение эффективности комплексообразо-
вапия т Р Н К с ферментом. З а м е н а З'-копцевого адеиозина па этепоаде-
нозип приводит к утрате способности т Р Н К Р Ь е акцептировать фенил-
алаиип. Таким образом, З '-концевой аденозин т Р Н К Р Ь е необходим не
только для субстратной активности, по является, по-видимому, наибо-
лее важным компонентом в З '-концевой ССА-последовательпости для
продуктивного связывания т Р Н К Р Ь е с ферментом. Аналогичные резуль-
таты были получены ранее для т Р Н К Р Ь е из Е. coli К-12 [13]. З а м е н а
адеиозина в 73-м положении па этеиоадепозин пе влияет па субстрат-
ные свойства т Р Н К Р Ь е и в незначительной степени уменьшает сродство
к синтетазе.
Оба аналога т Р Н К Р Ь е , содержащие этеноаденозин, являются флюо-
ресцентными. Ямакс СПЄКТрОВ ф л Ю О р Є С Ц Є Н Ц И И τΡΗΚεΛ73 И t P H K p A 7 6 COOT-
ветствуют Яма кс спектра флюоресценции этеиоаденозина. При облучении
светом л а з е р а интенсивность флюоресценции тРНКел7з и тРНКєл7б
уменьшается, что может свидетельствовать о фотохимическом превра-
щении этепоадепозипа в составе т Р Н К . Во избежание дополнительной
фотореакции с участием 4-тиоуридина при УФ-облучении [14] все
препараты т Р Н К Р Ь е и ее аналогов перед облучением о б р а б а т ы в а л и
перекисью водорода. 4-тиоуридин окисляется до уридина [9], при этом
величина Km для т Р Н К Р Ь е не меняется.
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. — 1988. — Т. 4, № 4 201
При облучении фенилаланил-тРНК синтетазы в присутствии
τΡΗΚεΑ73 инактивации фермента не наблюдалось. Уровень ковалент-
ного присоединения [14С] τΡΗΚεΑ73 к ферменту при эквимолярном соот-
ношении биополимеров не превышал 0,01 моль аналога на моль белка.
З а 5 ч облучения не более 1 % тРНК обнаруживается в ковалентном
комплексе с белком. В то же время, учитывая высокое сродство
τΡΗΚεΑ73 к ферменту, можно считать, что в опытах с использованием
5—10-кратного избытка фермента по отношению к τΡΗΚεΑ73 (см . «Ма-
териалы и методы») основная доля тРНК находится в комплексе
с белком.
При облучении фенилаланил-тРНК синтетазы в присутствии
τ Ρ Η Κ ε Α 7 6 инактивации фермента также не обнаружено.
Таким образом, полученные производные TPHKphe оказались не
эффективными для аффинной модификации фенилаланил-тРНК синте-
тазы. Фотопревращение этенопроизводных тРНКР Ь е происходит мед-
леннее по сравнению с этеноаденозином: интенсивность флюоресценции
τΡΗΚεΑ73 и τΡΗΚεΑ76 уменьшается при облучении в течение 5 ч на 20 %,
а в случае этеноаденозина на 80 %. Низкий выход продукта фотоинду-
цируемой модификации может быть объяснен рассеиванием энергии
поглощенного света на другие основания в структуре тРНКРЬе , нахо-
дящиеся в стекинг-взаимодействиях с этеноаденозином. В пользу суще-
ствования этих взаимодействий указывает тушение флюоресценции
этеноаденозина в составе этенопроизводных тРНКРЬе , флюоресценция
которых увеличивается в 5—6 раз после щелочного гидролиза.
Авторы благодарны Н. В. Булычеву за проведение ряда экспери-
ментов, В. Н. Подусту и Г. А. Невинскому за предоставление препара-
тов εΑΤΡ и А. С. Буторину за препарат АТР [СТР] : тРНК нуклеоти-
дилтрансферазы.
INTERACTION OF FLUORESCENT АТР AND tRNA ANALOGS
WITH PHENYLALANYL-tRNA SYNTHETASE
V. N. Ankilova, V. A. Gordienko, О. I. Lavrik, N. A. Moor
Institute of Bioorganic Chemistry,
Siberian Branch of the Academy of Sciences of the USSR, Novosibirsk
S u m m a r y
Affinity modification of E. coli MRE-600 phenylalanyl-tRNA synthetase by l,N6-etheno-
adenosine-5-triphosphate (εΑΤΡ) in the presence of different ligands has been investi-
gated. ATP conversion into εΑΤΡ results in the disturbance of specific contacts of nucle-
otide with the ATP binding site in the enzyme. The εΑΤΡ covalent attachment site is
assumed to be situated in the tRNA З'-terminus recognizing site.
Fluorescent tRNAphe analogs have been prepared by replacing adenosine 73 or 76
by l,N6-ethenoadenosine. The activity of these analogs has been investigated in the ami-
noacylation. The low yield of photoinduced covalent attachment of these derivatives to
phenylalanyl-tRNA synthetase is observed.
1. Иванов Μ. В., Кост А. А. Исследование белков с помощью этенопроизводных аде-
нина и цитозина / /Успехи биол. химии.— 1980.—21.— С. 112—129.
2. Paulsen Η., Wintermeyer W. Incorporation of l,N6-ethenoadenosine into the З'-termi-
nus of tRNA using T4 RNA ligase. 1. Preparation of yeast tRNA p h e derivatives/ /
Eur. J. Biochem.— 1984.—138, N 1.—P. 117—123.
3. Paulsen H., Wintermeyer Ψ. Incorporation of l,N6-ethenoadenosine into the 3'-ter-
minus of tRNA using T4 RNA ligase. 2. Preparation and ribosome interaction of
fluorescent Escherichia coli tRNAf
M e t / / Ibid — P. 125—130.
4. Подуст В. Η., Невинский Г. Α., Лаврик О. И. Модификация фенилаланил-тРНК
синтетазы из Escherichia coli с помощью 1,№-этеноаденозин-5'-трифосфата / / Био-
полимеры и клетка.— 1985.—1, № 5 —С. 267—270.
5. Анкилова В. Н., Лаврик О. И., Ходырева С. Н. Очистка и некоторые свойства фе-
нилаланил-тРНК синтетазы из Escherichia coli MRE-600 / / Прикл. биохимия и мик-
робиология.— 1984.—20, № 2 — С . 208—216.
202 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. — 1988. — Т. 4, № 4 202
6. Synthesis of modified nucleoside 3',5'-biphosphates and their incorporation into oil-
goribonucleotides with T4 RNA l i g a s e / J . R. Barrio, M. C. G. Barrio, N. J. Leonard
et al. // Biochemistry.— 1978.— 17, N 11.— P. 2077—2081.
7. Фенилаланил-тРНК синтетаза из Escherichia coli: модификация фермента флюо-
ресцентными химически активными аналогами нуклеотидов / Г. А. Невинский,
B. Н. Подуст, В. Н. Анкилова, О. И. Лаврик/ /Биоорг . химия.— 1983.—9, № 7.—
C. 936—946.
8. Горшкова И. И., Даций И. И., Лаврик О. И. Роль остатков аргинина во взаимо-
действии фенилаланил-тРНК синтетазы с субстратами / / Молекуляр. биология.—
1980.-14, № 1.—С. 118—124.
9. Shugart L. Effect of selective chemical modification of 4-thiouridine of phenylalanine
transfer ribonucleic acid on enzyme recognition//Arch. Biochem. and Biophys.—
1972.-148, N 2.—P. 488—495.
10. Bartmann P., Hanke Т., Holler E. Active site stoichiometry of L-phenylalanine : tRNA
ligase from Escherichia coli K-10//J. Biol. Chem.— 1975.—250, N 19.—P. 7668—
7674.
11. Аденозин- и этеноаденозин-5'-триметафосфаты: влияние образования ковалентной
связи на состояние аффинной метки в комплексе с фенилаланил-тРНК синтетазой /
Г. А. Невинский, В. Н. Подуст, С. Н. Ходырева и др. / / Молекуляр. биология.—
1984.-18, № 5.—С. 1311—1315.
12. Lavrik О. L, Nevinsky G. A. Phenylalanyl-tRNA synthetase from Escherichia coli
MRE-600. Activation by nucleotides and affinity modification of the effector binding
sites / / F E B S Lett.— 1980.—109, N 1.—P. 13—17.
13. Tal J., Deutscher M. P., Littauer U. Z. Biological activity of Escherichia coli
tRNA p h e modified in its C-C-A te rminus / /Eur . J. Biochem.— 1972.—28, N 2.—
P. 478—491.
14. Holler E., Baltzinger M., Faure A. Catalytic mechanism of phenylalanyl-tRNA synthe-
tase of Escherichia coli K-10. Different properties of native and photochemically
cross-linked tRNAP h e can be explained in the light of tRNA conformer equilibria / /
Biochemistry.— 1981.—20, N 5.—P. 1139—1147.
Ин-т биоорг. химии Получено 15.12.86
Сиб. отд-ния АН СССР, Новосибирск
УДК 576.315.42:577.23
КАПИЛЛЯРНАЯ ЭЛАСТОВИСКОЗИМЕТРИЯ
НУКЛЕОИДОВ ЭУКАРИОТ
Д. Ю. Блохин, В. А. Стручков
Введение. Структурная организация ДНК в интерфазном ядре эука-
риот является одной из центральных проблем молекулярной биологии,
которой посвящен ряд обзоров последних лет [1, 2]. Одним из надмо-
лекулярных уровней организации ДНК является ее складчато-петлевая
структура с участием ядерного скелета, сохраняющаяся в составе ну-
клеоидов [3—5].
Ряд основных выводов о структуре и свойствах нуклеоидов полу-
чен на основании анализа их седиментационной подвижности в градиен-
тах концентраций нейтральной сахарозы [3, 6—8], хотя некоторыми
авторами использованы вискози- [9] и эластовискозиметрические [10,
11] методы исследования. Изучены некоторые свойства нуклеоидов, вы-
деленных из разных клеток [3, 5, 12].
Однако отсутствие стандартной процедуры выделения и анализа
нуклеоидов в ряде случаев затрудняет сопоставление результатов раз-
ных авторов. Одновременно с этим достаточно трудоемкие методы се-
диментационного анализа ограничивают возможности исследований.
В этой связи актуальной задачей является поиск простого и ин-
формативного аналитического приема и стандартизация условий выде-
ления нуклеоидов по ряду параметров. Решение этой задачи даст воз-
можность существенно расширить круг объектов исследования для
сравнительного изучения нуклеоидов и может открыть новые подходы
к исследованиям структурной организации этих комплексов.
Для изучения реологических свойств препаратов «надмолекуляр-
ной ДНК» нами был предложен капиллярный эластовискозиметр [13,
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. — 1988. — Т. 4, № 4 203
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-154039 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7657 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-11-30T17:44:50Z |
| publishDate | 1988 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Анкилова, В.Н. Гордиенко, В.А. Лаврик, О.И. Моор, Н.А. 2019-06-15T06:20:21Z 2019-06-15T06:20:21Z 1988 Взаимодействие флюоресцентных аналогов АТР и тРНК с фенилаланил-тРНК синтетазой / В.Н. Анкилова, В.А. Гордиенко, О.И. Лаврик, Н.А. Моор // Биополимеры и клетка. — 1988. — Т. 4, № 4. — С. 197-203. — Бібліогр.: 14 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00022A https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154039 577.152.611 Изучена модификация фенилаланил-тРНК синтетазы из Escherichia coli, штамм MRE-600, с помощью 1N⁶-этеноаденозин-5'-трифосфата (εАТР) в присутствии различных лигандов. Предполагается, что ковалентное присоединение εАТР происходит в области связывания 3'-конца тРНК. Получены флюоресцентные производные тРНКPhe, содержащие этено-аденозин в 3'-концевой АССА-последовательности, и исследовано их взаимодействие с фенилаланил-тРНК синтетазой. Вивчено модифікацію фенілаланіл-тРНК синтетази з Escherichia coli, штам MRE-600, за допомогою 1N⁶-етеноаденозин-5'-трифосфату (εАТР) за присутності різних лігандів. Передбачається, що ковалентне приєднання εАТР відбувається в області зв’язування 3'-кінця тРНК. Отримано флуоресцентні похідні тРНКPhe, що містять етеноаденозин у 3'-кінцевий АССА-послідовності, і досліджено їхню взаємодію з фенілаланіл-тРНК синтетазою. Affinity modification of E. coli MRE-600 phenylalanyl-tRNA synthetase by 1,N⁶-etheno-adenosine-5-triphosphate (εATP) in the presence of different ligands has been investigated. ATP conversion into εATP results in the disturbance of specific contacts of nucle-otide with the ATP binding site in the enzyme. The εATP covalent attachment site is assumed To be situated in the tRNA 3'-terminus recognizing site. Fluorescent tRNAPhe analogs have been prepared by replacing adenosine 73 or 76 by 1,N⁶-ethenoadenosine. The activity of these analogs has been investigated in the aminoacylation. The low yield of photoinduced covalent attachment of these derivatives to phenylalanyl-tRNA synthetase is observed. Авторы благодарны Н.В. Булычеву за проведение ряда экспериментов, В.Н. Подусту и Г.А. Невинскому за предоставление препаратов εΑΤΡ и А.С. Буторину за препарат АТР [СТР] : тРНК нуклеотидилтрансферазы. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Структура и функции биополимеров Взаимодействие флюоресцентных аналогов АТР и тРНК с фенилаланил-тРНК синтетазой Взаємодія флуоресцентних аналогів АТР і тРНК з фенілаланін-тРНК синтетазою Interaction of fluorescent ATP and tRNA analogs with phenylalanyl-tRNA synthetase Article published earlier |
| spellingShingle | Взаимодействие флюоресцентных аналогов АТР и тРНК с фенилаланил-тРНК синтетазой Анкилова, В.Н. Гордиенко, В.А. Лаврик, О.И. Моор, Н.А. Структура и функции биополимеров |
| title | Взаимодействие флюоресцентных аналогов АТР и тРНК с фенилаланил-тРНК синтетазой |
| title_alt | Взаємодія флуоресцентних аналогів АТР і тРНК з фенілаланін-тРНК синтетазою Interaction of fluorescent ATP and tRNA analogs with phenylalanyl-tRNA synthetase |
| title_full | Взаимодействие флюоресцентных аналогов АТР и тРНК с фенилаланил-тРНК синтетазой |
| title_fullStr | Взаимодействие флюоресцентных аналогов АТР и тРНК с фенилаланил-тРНК синтетазой |
| title_full_unstemmed | Взаимодействие флюоресцентных аналогов АТР и тРНК с фенилаланил-тРНК синтетазой |
| title_short | Взаимодействие флюоресцентных аналогов АТР и тРНК с фенилаланил-тРНК синтетазой |
| title_sort | взаимодействие флюоресцентных аналогов атр и трнк с фенилаланил-трнк синтетазой |
| topic | Структура и функции биополимеров |
| topic_facet | Структура и функции биополимеров |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154039 |
| work_keys_str_mv | AT ankilovavn vzaimodeistvieflûorescentnyhanalogovatritrnksfenilalaniltrnksintetazoi AT gordienkova vzaimodeistvieflûorescentnyhanalogovatritrnksfenilalaniltrnksintetazoi AT lavrikoi vzaimodeistvieflûorescentnyhanalogovatritrnksfenilalaniltrnksintetazoi AT moorna vzaimodeistvieflûorescentnyhanalogovatritrnksfenilalaniltrnksintetazoi AT ankilovavn vzaêmodíâfluorescentnihanalogívatrítrnkzfenílalaníntrnksintetazoû AT gordienkova vzaêmodíâfluorescentnihanalogívatrítrnkzfenílalaníntrnksintetazoû AT lavrikoi vzaêmodíâfluorescentnihanalogívatrítrnkzfenílalaníntrnksintetazoû AT moorna vzaêmodíâfluorescentnihanalogívatrítrnkzfenílalaníntrnksintetazoû AT ankilovavn interactionoffluorescentatpandtrnaanalogswithphenylalanyltrnasynthetase AT gordienkova interactionoffluorescentatpandtrnaanalogswithphenylalanyltrnasynthetase AT lavrikoi interactionoffluorescentatpandtrnaanalogswithphenylalanyltrnasynthetase AT moorna interactionoffluorescentatpandtrnaanalogswithphenylalanyltrnasynthetase |