Капиллярная эластовискозиметрия нуклеоидов эукариот
С помощью предложенного метода капиллярной эластовискозиметрии изучали структурные особенности надмолекулярных комплексов ДНК (НК ДНК) на различных уровнях их организации в клетках эукариот. Исследована зависимость величин эластовязкости НК ДНК от времени лизиса и ионной силы. Показано, что констант...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Дата: | 1988 |
| Автори: | , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1988
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154040 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Капиллярная эластовискозиметрия нуклеоидов эукариот / Д.Ю. Блохин, В.А. Стручков // Биополимеры и клетка. — 1988. — Т. 4, № 4. — С. 203-211. — Бібліогр.: 28 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-154040 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Блохин, Д.Ю. Стручков, В.А. 2019-06-15T06:21:06Z 2019-06-15T06:21:06Z 1988 Капиллярная эластовискозиметрия нуклеоидов эукариот / Д.Ю. Блохин, В.А. Стручков // Биополимеры и клетка. — 1988. — Т. 4, № 4. — С. 203-211. — Бібліогр.: 28 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00022B https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154040 576.315.42:577.23 С помощью предложенного метода капиллярной эластовискозиметрии изучали структурные особенности надмолекулярных комплексов ДНК (НК ДНК) на различных уровнях их организации в клетках эукариот. Исследована зависимость величин эластовязкости НК ДНК от времени лизиса и ионной силы. Показано, что константы скорости релаксации нуклеоидов для различных клеток эукариот существенно отличаются. Эластовискозиметрические кривые титрования этих клеток бромистым этидием имели бифазный характер аналогично кривым при седиментации. Показано, что изменение эластовискозиметрических характеристик нуклеоидов L1210 не обусловлено действием эндогенных протеаз, так как электрофоретический состав белков нуклеоидов при этом оставался постоянным. Нуклеазы в этих условиях эксперимента также оказались не активны. Метод капиллярной эластовискозиметрии оказался достаточно информативным и чувствительным в изучении свойств НК ДНК. За допомогою запропонованого методу капілярної еластовіскозиметрії вивчали структурні особливості надмолекулярних комплексів ДНК (НК ДНК) на різних рівнях їхньої організації у клітинах еукаріотів. Досліджено залежність величин еластов’язкості НК ДНК від часу лізису і іонної сили. Показано, що константи швидкості релаксації нуклеоїдів для різних клітин еукаріотів істотно відрізняються. Еластовіскозиметричні криві титрування цих клітин бромистим етидієм мали біфазний характер аналогічно кривим при седиментації. Показано, що зміна еластовіскозиметричних характеристик нуклеоїдів L1210 зумовлена дією ендогенних протеаз, так як електрофоретичний склад білків нуклеоїдів при цьому залишався постійним. Нуклеази за цих умов експерименту також були не активними. Метод капілярної еластовіскозиметрії виявився досить інформативним і чутливим у вивченні властивостей НК ДНК. The method of capillary viscoelastometry was used to study structural peculiarities of supramolecular complexes (SC DNA) at different levels of their organization (nucleoids and alkaline lysates) in eukaryotic cells mud loach sperm, P388, L1210, S37. The dependence of SC DNA viscoelasticity on time of lysic and ionic strength was studied. Velocity constants of nucleoid relaxation of various eukaryotic cells are shown to be significantly different. The curves of viscoelastometric titration of nucleoid of this eukaryotic cells with the ethidium bromide has a biphasic shape typical of supercoiled DNA, obtained by sedimentation. It is detected that the change in viscoelasticitic characteristics of L1210 nucleoids is not due to the action of endogenic proteases, since the electrophoretic composition of nucleoid proteins remained constant. Under these experimental conditions the nucleases were not active too. The method of capillary viscoelastometry appears to be enough informative and sensitive in studies of SC DNA properties. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Структура и функции биополимеров Капиллярная эластовискозиметрия нуклеоидов эукариот Капілярна еластовіскозиметрія нуклеотидів еукаріотів Capillary viscoelastometry of eukaryotic nucleoids Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Капиллярная эластовискозиметрия нуклеоидов эукариот |
| spellingShingle |
Капиллярная эластовискозиметрия нуклеоидов эукариот Блохин, Д.Ю. Стручков, В.А. Структура и функции биополимеров |
| title_short |
Капиллярная эластовискозиметрия нуклеоидов эукариот |
| title_full |
Капиллярная эластовискозиметрия нуклеоидов эукариот |
| title_fullStr |
Капиллярная эластовискозиметрия нуклеоидов эукариот |
| title_full_unstemmed |
Капиллярная эластовискозиметрия нуклеоидов эукариот |
| title_sort |
капиллярная эластовискозиметрия нуклеоидов эукариот |
| author |
Блохин, Д.Ю. Стручков, В.А. |
| author_facet |
Блохин, Д.Ю. Стручков, В.А. |
| topic |
Структура и функции биополимеров |
| topic_facet |
Структура и функции биополимеров |
| publishDate |
1988 |
| language |
Russian |
| container_title |
Биополимеры и клетка |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Капілярна еластовіскозиметрія нуклеотидів еукаріотів Capillary viscoelastometry of eukaryotic nucleoids |
| description |
С помощью предложенного метода капиллярной эластовискозиметрии изучали структурные особенности надмолекулярных комплексов ДНК (НК ДНК) на различных уровнях их организации в клетках эукариот. Исследована зависимость величин эластовязкости НК ДНК от времени лизиса и ионной силы. Показано, что константы скорости релаксации нуклеоидов для различных клеток эукариот существенно отличаются. Эластовискозиметрические кривые титрования этих клеток бромистым этидием имели бифазный характер аналогично кривым при седиментации. Показано, что изменение эластовискозиметрических характеристик нуклеоидов L1210 не обусловлено действием эндогенных протеаз, так как электрофоретический состав белков нуклеоидов при этом оставался постоянным. Нуклеазы в этих условиях эксперимента также оказались не активны. Метод капиллярной эластовискозиметрии оказался достаточно информативным и чувствительным в изучении свойств НК ДНК.
За допомогою запропонованого методу капілярної еластовіскозиметрії вивчали структурні особливості надмолекулярних комплексів ДНК (НК ДНК) на різних рівнях їхньої організації у клітинах еукаріотів. Досліджено залежність величин еластов’язкості НК ДНК від часу лізису і іонної сили. Показано, що константи швидкості релаксації нуклеоїдів для різних клітин еукаріотів істотно відрізняються. Еластовіскозиметричні криві титрування цих клітин бромистим етидієм мали біфазний характер аналогічно кривим при седиментації. Показано, що зміна еластовіскозиметричних характеристик нуклеоїдів L1210 зумовлена дією ендогенних протеаз, так як електрофоретичний склад білків нуклеоїдів при цьому залишався постійним. Нуклеази за цих умов експерименту також були не активними. Метод капілярної еластовіскозиметрії виявився досить інформативним і чутливим у вивченні властивостей НК ДНК.
The method of capillary viscoelastometry was used to study structural peculiarities of supramolecular complexes (SC DNA) at different levels of their organization (nucleoids and alkaline lysates) in eukaryotic cells mud loach sperm, P388, L1210, S37. The dependence of SC DNA viscoelasticity on time of lysic and ionic strength was studied. Velocity constants of nucleoid relaxation of various eukaryotic cells are shown to be significantly different. The curves of viscoelastometric titration of nucleoid of this eukaryotic cells with the ethidium bromide has a biphasic shape typical of supercoiled DNA, obtained by sedimentation. It is detected that the change in viscoelasticitic characteristics of L1210 nucleoids is not due to the action of endogenic proteases, since the electrophoretic composition of nucleoid proteins remained constant. Under these experimental conditions the nucleases were not active too. The method of capillary viscoelastometry appears to be enough informative and sensitive in studies of SC DNA properties.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154040 |
| citation_txt |
Капиллярная эластовискозиметрия нуклеоидов эукариот / Д.Ю. Блохин, В.А. Стручков // Биополимеры и клетка. — 1988. — Т. 4, № 4. — С. 203-211. — Бібліогр.: 28 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT blohindû kapillârnaâélastoviskozimetriânukleoidovéukariot AT stručkovva kapillârnaâélastoviskozimetriânukleoidovéukariot AT blohindû kapílârnaelastovískozimetríânukleotidíveukaríotív AT stručkovva kapílârnaelastovískozimetríânukleotidíveukaríotív AT blohindû capillaryviscoelastometryofeukaryoticnucleoids AT stručkovva capillaryviscoelastometryofeukaryoticnucleoids |
| first_indexed |
2025-11-24T15:49:14Z |
| last_indexed |
2025-11-24T15:49:14Z |
| _version_ |
1850848974422933504 |
| fulltext |
6. Synthesis of modified nucleoside 3',5'-biphosphates and their incorporation into oil-
goribonucleotides with T4 RNA l i g a s e / J . R. Barrio, M. C. G. Barrio, N. J. Leonard
et al. // Biochemistry.— 1978.— 17, N 11.— P. 2077—2081.
7. Фенилаланил-тРНК синтетаза из Escherichia coli: модификация фермента флюо-
ресцентными химически активными аналогами нуклеотидов / Г. А. Невинский,
B. Н. Подуст, В. Н. Анкилова, О. И. Л а в р и к / / Б и о о р г . химия.— 1983— 9, № 7.—
C. 936—946.
8. Горшкова И. И., Даций И. И., Лаврик О. И. Роль остатков аргинина во взаимо-
действии фенилаланил-тРНК синтетазы с субстратами / / Молекуляр. биология.—
1980.-14, № 1.—С. 118—124.
9. Shugart L. Effect of selective chemical modification of 4-thiouridine of phenylalanine
t ransfer ribonucleic acid on enzyme recogn i t i on / /Arch . Biochem. and Biophys.—
1972.-148, N 2 .—P. 488—495.
10. Bartmann P., Hanke Т., Holler E. Active site stoichiometry of L-phenylalanine : tRNA
ligase from Escherichia coli К-Ю// J. Biol. Chem.— 1975.—250, N 19.—P. 7668—
7674.
11. Аденозин- и этеноаденозин-5'-триметафосфаты: влияние образования ковалентной
связи на состояние аффинной метки в комплексе с фенилаланил-тРНК синтетазой /
Г. А. Невинский, В. Н. Подуст, С. Н. Ходырева и др. / / Молекуляр. биология.—
1984. -18, № 5.—С. 1311—1315.
12. Lavrik О. L, Nevinsky G. A. Phenylalanyl-tRNA synthetase from Escherichia coli
MRE-600. Activation by nucleotides and affinity modification of the effector binding
sites / / F E B S Lett.— 1980.—109, N 1.—P. 13—17.
13. Tal J., Deutscher M. P., Littauer U. Z. Biological activity of Escherichia coli
t R N A p h e modified in its C-C-A t e r m i n u s / / E u r . J. Biochem.— 1972.—28, N 2.—
P. 478—491.
14. Holler E., Baltzinger M., Faure A. Catalytic mechanism of phenylalanyl-tRNA synthe-
tase of Escherichia coli K-10. Different properties of native and photochemically
cross-linked t R N A P h e can be explained in the light of tRNA conformer equilibria / /
Biochemistry.— 1981.—20, N 5 .—P. 1139—1147.
Ин-т биоорг. химии Получено 15.12.86
Сиб. отд-ния АН СССР, Новосибирск
УДК 576.315.42:577.23
КАПИЛЛЯРНАЯ ЭЛАСТОВИСКОЗИМЕТРИЯ
НУКЛЕОИДОВ ЭУКАРИОТ
Д. Ю. Блохин, В. А. Стручков
Введение. Структурная организация Д Н К в интерфазном ядре эука-
риот является одной из центральных проблем молекулярной биологии,
которой посвящен ряд обзоров последних лет [1, 2] . Одним из надмо-
лекулярных уровней организации Д Н К является ее складчато-петлевая
структура с участием ядерного скелета, сохраняющаяся в составе ну-
клеоидов [3—5].
Р я д основных выводов о структуре и свойствах нуклеоидов полу-
чен на основании анализа их седиментационной подвижности в градиен-
тах концентраций нейтральной сахарозы [3, 6—8], хотя некоторыми
авторами использованы вискози- [9] и эластовискозиметрические [10,
11] методы исследования. Изучены некоторые свойства нуклеоидов, вы-
деленных из разных клеток [3, 5, 12].
Однако отсутствие стандартной процедуры выделения и анализа
нуклеоидов в ряде случаев затрудняет сопоставление результатов раз-
ных авторов. Одновременно с этим достаточно трудоемкие методы се-
диментационного анализа ограничивают возможности исследований.
В этой связи актуальной задачей является поиск простого и ин-
формативного аналитического приема и стандартизация условий выде-
ления нуклеоидов по ряду параметров. Решение этой задачи даст воз-
можность существенно расширить круг объектов исследования для
сравнительного изучения нуклеоидов и может открыть новые подходы
к исследованиям структурной организации этих комплексов.
Д л я изучения реологических свойств препаратов «надмолекуляр-
ной Д Н К » нами был предложен капиллярный эластовискозиметр [13,
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. — 1988. — Т. 4, №> 4 203
14], позднее конструктивно модифицированный [15] и использован-
ный для решения ряда радиобиологических и онкологических задач
[16, 17]. Простая конструкция прибора и иетрудоемкая процедура ана-
лиза выгодно отличают предложенный метод от ротационной эласто-
вискозиметрии и седиментации. Представлялось интересным оцепить
возможности капиллярной эластовискозиметрии для изучения структу-
ры и свойств нуклеоидов и других надмолекулярных комплексов Д Н К
эукариот.
В настоящей работе предлагаемым методом воспроизведены основ-
ные закономерности реологического поведения нуклеоидов, выделен-
ных из разных клеток, ранее установленные седиментациоппыми мето-
дами, а также оценены структурные изменения комплексов при моди-
фикации некоторых параметров процедуры выделения.
Материалы и методы. Объектами исследования служили спермин пресноводного
вьюна Misgurnus fossilis L. и клетки перевиваемых опухолевых штаммов: лейкозы
L1210 и Р388, асцитная саркома С37 мышей.
Спермин выделяли мягкой гомогенизацией семенников половозрелых особей, со-
держащихся при 4 °С [16]. Клетки опухолей выделяли из асцитной жидкости мышей
через б—8 сут после внутрибрюшинной инокуляции 106 опухолевых клеток на каждое
животное.
Препараты нуклеоидов получали мягким лизисом (в основном подобным мето-
ду [3]) клеток в растворе, состоящем из минимального буфера ΤΕΤ (трис-ЭДТА-три-
тоновыи: 10 мМ трис-основание, 0,1 Μ динатриевая соль ЭДТА, 0,5 %-ный тритон
Х-100, рН 7,6) с различным содержанием хлорида натрия. В ряде экспериментов при-
меняли лизирующий раствор иного состава: 1) на основе буфера ТКМ (трис-калий-
магниевый: 25 мМ трис-НС1, 25 мМ 1\С1, 5 мМ MgCl2, рН 7,6) с добавлением до 1 или
2 Μ NaCl и иуклеаз (ДНКаза I или бактериальная эндонуклеаза); 2) на основе ще-
лочного раствора (1 Μ NaCl, 0,1 Μ динатриевая соль ЭДТА, 0,1 Μ NaOH, рН 12,5).
В зависимости от цели эксперимента в состав лизирующего раствора дополнительно
вносили фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ) до 1 мМ; диэтилпирокарбонат (ДЭПК)
до 0,1 % по объему; бромистый этидий (БЭ) до 40 мкг/мл.
П р и г о т о в л е н и е л и з а т о в и и з м е р е н и е э л а с т о в я з к о с т и (Э В).
Клеточную суспензию в растворе Хенкса фильтровали через капроновую (70 мкм) и
титановую (40 мкм) сетки и разводили раствором Хенкса из расчета, чтобы рабочая
суспензия клеток содержала 100 мкг/мл ДНК.
В конические пробирки помещали по 200 мкл суспензии клеток и немедленно ин-
тенсивной струей косо по стенке пробирки приливали 4,8 мл лизирующего раствора
(20 °С). Эта процедура обеспечивает быстрое перемешивание образцов во всем объеме,
что важно для образования гомогенной суспензии и одновременно исключает гидроди-
намическую деградацию материала. Лизис проводили в термостате (20 °С) в течение
различного периода времени (от 5 мин до 7 сут). Лизаты осторожно по стенке пере-
носили в камеру капиллярного эластовискозиметра и через 1 мин открывали выходное
отверстие капилляра (диаметр капилляра 0,9 мм). Измеряли время истечения 4,0 мл
лизатов, что контролировали по накоплению соответствующего количества образцов
в чашке-накопителе предложенного нами контрольного устройства — инерционных ве-
сов с ртутным противовесом (подвижный центр масс).
Численное значение ЭВ выражали в единицах обратной процентной концентрации
Д Н К в образцах (дл/г) .
В ы д е л е н и е и а н а л и з б е л к о в н у к л е о и д о в . К аликвотам клеточных
лизатов добавляли два объема холодного этанола ( 9 5 % ) , препараты перемешивали и
охлаждали до —10 °С, через 30 мин осадки отделяли центрифугированием (1000 g,
15 мин, 4 °С; центрифуга К-23, «Janetzki», ГДР) , суспендировали в 2,0 мл буфера
ТКМ, содержащего 10 ед. Кунитца в 1 мл ДНКазы I («Serva», ФРГ) и 0,1 ммоль/л
ФМСФ («Serva», ФРГ) , инкубировали 30 мин при 20 °С. К образцам добавляли 4,0 мл
буфера ТКМ, содержащего дополнительно 3,0 моль/л NaCl, инкубировали 10 мин
(20 °С) и осаждали белки центрифугированием (1500 g, 15 мин, 20 °С). Осадки про-
мывали 2,0 Μ NaCl (на ТКМ) и дважды — дистиллированной водой с 1 % глицерина;
сохраняли в 10 %-ном водном растворе глицерина при —20 °С.
Электрофорез в полиакриламидном геле ( Т = 12,5 %; С = 2,6 %) в присутствии
DS-Na вели по Леммли [18].
204 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. — 1988. — Т. 4, №> 4 204
Статистическую обработку результатов производили на микрокалькуляторе
«Электроника БЗ-21» по программе расчета среднего арифметического и стандартного
отклонения.
Результаты и обсуждение. Прежде всего было установлено, что
значения ЭВ лизатов не зависят от концентрации Д Н К в диапазоне от
1,5 до 30,0 мкг /мл, что свидетельствует об отсутствии агрегации макро-
молекул в образцах. Поэтому в дальнейшей работе использовали лиза-
ты с концентрацией Д Н К 4,0 мкг /мл (0,0004 % ) .
ЭВ образцов определяется почти исключительно свойствами над-
молекулярного комплекса Д Н К , так как лизаты, получепиые в усло-
виях разрушения этого комплекса, обладают незначительной (3—5 %
от контроля) ЭВ (табл. 1).
У образцов, полученных при «щадящих» условиях лизиса (буфер
ΤΕΤ, содержащий 2,0 Μ NaCl ) , ЭВ обладает характерной бифазной
реакцией на повышение концентраций БЭ (рис. 1), что может быть
связано с присутствием в них суперспиральной Д Н К , обнаруженной
ранее разными методами в аналогичных препаратах надмолекулярных
комплексов [3, 5, 6, 12, 16]. Если это предположение верно, то индук-
ция однонитевых разрывов Д Н К (например, γ-облучением) должна при-
водить к прогрессирующему снижению реакции нуклеоидов па присут-
ствие интеркалятора [8] , так как наличие в доменах Д Н К хотя бы
одного одноиитевого разрыва делает невозможным существование на-
пряженной суперспиральной конформации [5, 19].
На рис. 1 представлены изменения кривой титрования нуклеоидов
БЭ, возникающие при облучении исходных клеток непосредственно
перед лизисом. Обнаруженная закономерность полностью согласуется
с предположением о детерминирующей роли конформационных перехо-
дов суперспиральной Д Н К в бифазном характере реакции нуклеоида
на интеркалятор. Поэтому в дальнейшей работе бифазность кривой
титрования служила свидетельством суперспиральности Д Н К в составе
надмолекулярного комплекса, а концентрация БЭ, вызывающая макси-
мальную релаксацию Д Н К («эквивалентная» концентрация),— мерой
плотности суперспирализации [5, 8, 12, 20].
Таким образом, обнаруженные нами данные полностью согласу-
ются с аналогичными результатами седиментационных исследований
Т а б л и ц а 1
ЭВ лизатов клеток лейкоза L1210, полученных в различных условиях лизиса
The vise о elasticity of L1210 mouse leukemic cells lysates obtained by different lysic
conditions
Объект Состав лизирующего
раствора Режим лизиса ЭВ, дл/г
Интактная клеточная суспен-
зия
То же
Разрушенные 5 %-ной ТХУ
клетки
То же
Интактная клеточная суспен-
зия
То же
ДНК из эритроцитов цыплят
(«Reanal», ВНР)
2 Μ NaCl (в буфере
ΤΕΤ)
1 Μ NaCl (в буфере
ΤΕΤ)
1 Μ NaCl (в буфере
Т К М + 1 0 ед/мл
ДНКазы I)
2 Μ NaCl (в буфере
ΤΕΤ)
0 ,9 Μ NaCl, 0 ,1 Μ
ЭДТА, 0 ,1 Μ NaOH, рН
12,5
То же
2 Μ NaCl (в буфере
ΤΕΤ)
60 мин, 20 °С
40 мин, 20 ° С +
+ 2 0 мин, 100 °С
60 мин, 20 °С
48 ч, 20 °С
540+44
1350 + 120
2 0 + 8
3 2 + 1 0
18+5
2 0 + 6
26004=230
2 7 + 5
5 + 1
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. — 1988. — Т. 4, №> 4 205
[З, 6, 8, 20], что свидетельствует об адекватности выбранного метода
анализа.
Из табл. 1 видно, что условия выделения надмолекулярных комп-
лексов существенно влияют на значения ЭВ образцов, поэтому д а ж е
незначительные модификации основных процедур выделения могут при-
водить к получению плохо воспроизводимых или вовсе несравнимых ре-
зультатов. В рамках задачи стандартизации метода получения препа-
ратов нас в первую очередь интересовало значение длительности лизи-
Рис. 1. Зависимость ЭВ нуклеоидов клеток лейкемии L1210 от концентрации БЭ: 1 —
контрольные клетки; 2—3— γ-облученные клетки, 10 и 50 Гр соответственно
Fig. 1. Dependence of viscoelasticity of LI210 leukemic cell nucleoids on ethidium bromi-
de (Eth Br) concentration: 1 — control cells; 2, 3 — γ-irradiated cells, 10 and 50 Gy,
respectively
Рис. 2. Зависимость ЭВ нуклеоидов клеток лейкемии L1210 от времени лизиса: 1 —
контроль; 2, 3 — клеточные лизаты после одно- и двукратного пропусканий через ка-
пилляр (d— 1 мм, G = 600 с - 1 ) соответственно. Вверху — форма кривых титрования
нуклеоида БЭ в зависимости от времени лизиса: а — 60 мин, б — 24, в—48 ч и более
Fig. 2. Dependence of viscoelasticity of L1210 leukemic cell nucleoids on time of lysis:
1 — control; 2, 3 — cell lysates after single and double forcing through capillary (d =
= 1 mm, G = 600 s _ 1 ) , respectively. Above — the shape of nucleoid titration curves with
Eth Br dependent on time of lysis: a — 60 min, б — 24 h, в — 48 h and more
где ЭВ; — текущее значение ЭВ в момент t.
Таким образом, кинетика лизиса характеризуется двумя парамет-
рами: максимальным значением ЭВ (при предельной, исчерпывающей
обработке в использованных условиях) и константой скорости про-
цесса К. Оба параметра оказались специфичными в отношении объек-
та исследования (табл. 2).
Процесс щелочного лизиса (аналогично [10]) характеризуется дру-
гой кинетикой (рис. 3) : положение и величина максимума ЭВ образ-
цов зависят от объекта и отражают, видимо, структурно-функциональ-
ные особенности складчато-петлевой организации Д Н К в различных
клетках (размер петлевых доменов, частота щелочелабильных сайтов
Д Н К и др.) .
Получаемые препараты являются чрезвычайно чувствительными к
гидродинамическому сдвигу: не только пипетирование, но и резкое пе-
206 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. — 1988. — Т. 4, №> 4 206
са клеток и влияние ионной силы лизирующего раствора па конечні
результаты эластовискозиметрического анализа образцов.
На рис. 2 показана зависимость ЭВ нуклеоидов от времени «не
трального» лизиса клеток (буфер ΤΕΤ, содержащий 2,0 Μ NaCl) . Η
блюдаемая кинетика изменений ЭВ имеет характер процесса «иасыш
ния» и описывается (по аналогии с кинетикой химической реакции пе
вого порядка) уравнением
или:
ремешивание образцов вызывает изменение ЭВ, причем как величина,
так и характер этого изменения зависят от времени (длительности) ли-
зиса и интенсивности воздействия (рис. 2).
Титрование нуклеоидов БЭ выявило уменьшение количества супер-
спиралыюй Д Н К , пропорциональное времени лизиса, а при длитель-
ных инкубациях (более 48 ч) суперспиральная Д Н К отсутствовала в
нуклеоидах из всех видов исследованных клеток (рис. 2). При исполь-
зовании щелочных условий лизиса мы не обнаружили суперспиральной
Рис. 3. Зависимость ЭВ щелочных лизатов клеток от времени лизиса: 1 — сперма вью-
на; 2— клетки лейкемии L1210. Вверху — форма кривых титрования БЭ в зависи-
мости от времени лизиса: а — 60 мин, б — 4, β — 24 ч и более
Fig. 3. Dependence of viscoelasticity of alkaline cell lysates on time lysis: 1 — mud loach
sperm; 2 — L1210 leukemic cell. Above the shape of titration curves with Eth Br depen-
dent on time of lysis: a — 60 min, б — 4 її, β — 24 h and more
Рис. 4. Элсктрофореграммы белков нуклеоида клеток лейкемии L1210 в зависимости от
времени лизиса: а — 30 мин; б — 4, в — 24, г — 72, д — 1 2 0 ч. Цифры обозначают по-
ложение маркерных белков
Fig. 4. Electrophoregrammes of proteins of L1210 leukemic cell nucleoid on time lysis:
a — 30 min, б — 4 h, в — 24 h, г — 72 h, д — 1 2 0 h. The position of protein markers
12—68 kD
Д Н К надмолекулярного комплекса из всех клеток во все исследован-
ные сроки (рис. 3).
Представленные данные позволяют рассматривать структуру ну-
клеоида в процессе лизиса как динамичную, непрерывно изменяющую-
ся в течение инкубации до некоторого «предельного» состояния, при
котором нативная организация комплекса в значительной мере утра-
чивается.
Анализируя процесс щелочного лизиса, можно связать наблюдае-
мые изменения реологических характеристик образцов с прогрессирую-
щей деградацией комплекса до составляющих компонентов, денатура-
цией белков и Д Н К , гидролизом химических связей и т .д . Ранее нами
показан неслучайный характер фрагментации Д Н К в щелочных усло-
виях [21], что интерпретируется в рамках представления о субъеди-
ничной (или «квазисубъединичной») организации Д Н К в составе хро-
матина [22].
Кинетика нейтрального лизиса, однако, требует более тщательной
оценки в отношении возможной роли остаточной ферментативной ак-
тивности лизосомальных гидролаз, присутствующих в клеточных
лизатах.
В качестве объекта для контрольных экспериментов мы выбрали
клетки Р388, имеющие наибольшую из всех исследованных клеток кон-
станту скорости лизиса (табл. 2). Электрофоретический анализ белков
нуклеоида не выявил никакого изменения белкового состава образцов
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. — 1988. — Т. 4, №> 4 207
при инкубации в буфере ΤΕΤ, содержащем 2,0 Μ NaCl, от 30 мин до
120 ч (рис. 4) . Кроме того, введение в состав лизирующего раствора
нуклеаз ( Д Н К а з а I — до 5 ед. Куиитца в 1 мл, бактериальная эндо-
нуклеаза — до 130 ед /мл , Р Н К а з а А — до 1,0 мг /мл) не изменяло
значений ЭВ образцов при 60-минутной инкубации и, с другой сторо-
ны, применение ингибиторов нуклеаз — диэтилпирокарбоната — не
влияло на значения ЭВ и кинетику процесса (данные не представле-
ны). Из этих результатов следует, что наблюдаемая в процессе дли-
тельных инкубаций спонтанная релаксация суперспиральной Д Н К не
связана с ферментативной деградацией надмолекулярного комплекса.
Такой вывод согласуется с фактом равенства значений К для клеток
асцитной саркомы С37 и спермиев вьюна, ферментативная активность
которых существенно различается, а также позволяет трактовать ана-
логичные результаты других авторов, использовавших для лизиса очи-
щенные препараты ядер гепатоцитов [10]. Заслуживают внимания дан-
ные [23] о неферментативной фрагментации Д Н К в концентрирован-
ных растворах ЭДТА.
Т а б л и ц а 2
Кинетические параметры лизиса разных клеток в ΤΕΤ-буфере, содержащем 2,0 Μ NaCly
при 20 °С
The kinetic values of different cells lysis in TET-buffer with 2,0 Μ NaCl
Значения ЭВ, дл/г
Объект *
Э^макс
К, ч~1
Э^макс
К, ч~1
Спермии вьюна 710-1-56 17900+2340 0,040
Лейкоз L1210 540±44 8400 + 1270 0,066
Лейкоз Р388 475+48 6950+720 0,071
Саркома С37 260 ± 3 7 66004=830 0,040
* Значение ЭВ при лизисе в течение 1 ч (20 °С).
Таким образом, в процессе длительных инкубаций в нейтральном
лизирующем растворе происходит постепенное ослабление или разру-
шение межмолекулярных взаимодействий, обеспечивающих конформа-
ционные ограничения суперспиральных доменов Д Н К , что приводит к
существенному изменению структуры и свойств нуклеоида; это объяс-
няет неравнозначность экспериментальных оценок при использовании
различных по длительности инкубаций д а ж е в растворах одинакового
состава, в условиях подавления активности эндогенных гидролаз.
Вопрос о влиянии ионной силы растворителя на конформацию
Д Н К неоднократно обсуждался в литературе [5, 10, 24]. Установлено,
что повышение ионной силы вызывает увеличение суперспиральной
плотности Д Н К двумя путями: собственно конформационными пере-
ходами двухцепочечной молекулы и диссоциацией коровых частиц ну-
клеосом. В наших экспериментах «эквивалентная» концентрация БЭ
[8, 20] при титровании нуклеоидов из клеток Р388 и спермиев вьюна
при переходе от 1,0 к 2,0 Μ NaCl увеличивалась на 20 %, что сопоста-
вимо с данными литературы [5] . Однако феномен зависимости гидро-
динамических характеристик препаратов надмолекулярных комплексов
Д Н К от ионной силы, наблюдавшийся и другими авторами [10], по-ви-
димому, не исчерпывается только изменением числа супервитков до-
менов Д Н К . Действительно, суперспиральная плотность Д Н К нуклео-
идов Р388 и спермиев вьюна изменяется при повышении ионной силы
в равной степени, в то время как значения ЭВ зависят от молярности
хлорида натрия различно (рис. 5). Максимальные значения ЭВ наблю-
даются при лизисе обоих видов клеток в 0,6 Μ NaCl (в буфере ТЕТ) ;
повышение концентрации соли снижает ЭВ в случае нуклеоидов Р388
в пять раз, а в случае нуклеоидов из спермиев вьюна — лишь на 25—
3 0 % .
208 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. — 1988. — Т. 4, №> 4 208
Можно предположить, что первая фаза (повышение ЭВ) связана
с диссоциацией гистона HI из состава комплекса и утратой хромомер-
ного уровня организации Д Н К , а вторая фаза (снижение ЭВ) — с по-
терей коровых гистонов и разворачиванием нуклеосом.
В данных экспериментах измерялась ЭВ лизатов, полученных при
лизисе в растворах с различной ионной силой (без ее изменения в
процессе инкубации). Однако если провести предварительный лизис
клеток в 1,0 Μ NaCl, а затем повысить концентрацию соли до 2,0 Μ
Т а б л и ц а 3
ЭВ лизатов клеток лейкоза Р388 при
сступенчатом лизисе» с изменением
ионной силы раствора
The viscoelasticity of Р388 mouse leukemic
cells lysates under the «step-lysis»
conditions with solutions ionic strength
variations
Содержание NaCl в составе
лизирующего раствора
на основе нейтрального буфера
ΤΕΤ, Μ
ЭВ, дл/г
Предвари-
тельный
лизис,
30 мин
Добавлен-
ный
раствор
Оконча-
тельный
лизис,
30 мин
ЭВ, дл/г
Рис. 5. Зависимость ЭВ нуклеоида от
ионной силы лизирующего раствора: 1 —
сперма вьюна; 2 — клетки лейкемии
L1210
Fig. 5. Dependence of nucleoid viscoelasti-
city on ionic strength of lysis solution:
1 — mud loach sperm; 2 — L1210 leuke-
mic cells
и дополнительно инкубировать образцы, то ЭВ полученных препара-
тов почти соответствует лизису в 1,0 Μ NaCl в течение суммарного
времени. И наоборот, предварительный лизис в 2,0 Μ NaCl с после-
дующим разбавлением образца и дополнительной инкубацией дает ли-
заты с ЭВ, характерной для 2,0 Μ NaCl (табл. 3).
Эти результаты предполагают, что рассматриваемый феномен не
является прямым следствием конформационных переходов Д Н К и толь-
ко частично связан с дегистонизацией материала. Имеются данные о
зависимости контурной длины каркасных фибрилл метафазных хромо-
сом от ионной силы [25, 26], и, хотя нельзя проводить полной анало-
гии между «скаффолдом» метафазных хромосом и матриксом иптер-
фазных ядер [27], можно предположить, что в данном случае проис-
ходит сокращение белковых фибрилл нуклеоида при высоких ионных
силах. Различия между объектами могут быть связаны с различным
белковым составом их нуклеоидов, а «необратимость» параметров при
изменении ионной силы — с известной необратимой перестройкой струк-
туры ядерного матрикса при различной последовательности отдельных
процедур его выделения [28]. Это наблюдение существенно ограничи-
вает возможности выделения «интактных» нуклеоидов из препаратов
очищенных клеточных ядер.
Таким образом, на основании полученных данных следует заклю-
чить, что: 1) капиллярная эластовискозиметрия клеточных лизатов яв-
ляется перспективным методом исследования структуры надмолекуляр-
ных комплексов Д Н К ; 2) структура нуклеоидов является динамичной
и подвержена значительным изменениям при модификации условий
выделения, что необходимо учитывать при анализе результатов иссле-
дования и экстраполяции параметров нуклеоидов на структуру натив-
пого хроматина.
Стандартизация условий выделения нуклеоидов позволяет прово-
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. — 1988. — Т. 4, №> 4 209
дить сравнительные исследования этих комплексов, выделенных из раз-
ных клеток, а также изучать структурно-функциональные аспекты фи-
зиологических и повреждающих воздействий на клетки. Этим вопросом
будут посвящены следующие сообщения.
CAPILLARY VISCOELASTOMETRY OF EUKARYOTIC NUCLEOIDS
D. Yu. Blokhin, V. A. Struchkov
All-Union Cancer Research Centre, Academy of Medical Sciences, USSR, Moscow
S u m m a r y
The method of capillary viscoelastometry was used to study structural peculiarities of
supramolecular complexes (SC DNA) at different levels of their organization (nucleoids
and alkaline lysates) in eukaryotic cells mud loach sperm, P388, L1210, S37. The de-
pendence of SC DNA viscoelasticity on time of lysic and ionic strength was studied.
Velocity constants of nucleoid relaxation of various eukaryotic cells are shown to be
significantly different. The curves of viscoelastometric titration of nucleoid of this
eukaryotic cells with the ethidium bromide has a biphasic shape typical of supercoiled
DNA, obtained by sedimentation. It is detected that the change in viscoelasticitic cha-
racteristics of L1210 nucleoids is not due to the action of endogenic proteases, since the
electrophoretic composition of nucleoid proteins remained constant. Under these expe-
rimental conditions the nucleases were not active too. The method of capillary visco-
elastometry appears to be enough informative and sensitive in studies of SC DNA
properties.
1. Igo-Kemenes ΤHorz W., Zachau H. G. C h r o m a t i n / / A n n . Rev. Biochem.— 1982.—
51.— P. 89—121.
2. Nicolini C. Chromatin structure: from nuclei to g e n e s / / A n t i c a n c e r Res.— 1983.—3,
N 1.—P. 63—86.
3. Cook P. R., Brazell 1. A. Conformational constrains in nuclear D N A / / J . Cell Sci.—
1976.—22, N 2 ,—P. 287—302.
4. McCready S. J., Akrigg Α., Cook P. R. Electron-microscopy of intact nuclear DNA
from human c e l l s / / I b i d . — 1979.—39, N 1.—P. 53—62.
5. Филиппович И. В., Сорокина Η. И. Суперспиральная Д Н К клеточного ядра // Успе-
хи соврем, биологии.— 1983—95, № 2.—С. 163—180.
6. Benyajati СWorcel A. Isolation, characterization and structure of the folded inter-
phase genome of Drosophila melanogaster / / Cell.— 1976.—9, N 2 .—P. 393—407.
7. Supercoiled DNA folded by non-histone proteins in cultured mammalian cells / T. Ide,
M. Nakane, K. Anzai, T. A n d o h / / N a t u r e . — 1975.—258.—P. 445—447.
8. Hartwig M. Organization of mammalian chromosomal DNA: supercoiled and folded
circular DNA subunits from interphase cell n u c l e i / / A c t a biol. et med. ger.— 1978.—
37, N 2 .—P. 421—432.
9. Ващенко В. И., Рещиков Α. Μ. Определение радиочувствительности субпопуляций
тимоцитов методом вискозиметрии нуклеоида/ /Радиобиология.— 1982.—22, № 5.—
С. 690—693.
10. A circular channel crucicible oscillating viscometer. Detection of DNA damage indu-
ced in vivo by exceedingly small doses of dimethylnitrosoamine / S. Parodi, P. Carlo,
A. Martelli et al. / / J. Мої. Biol.— 1981.—147, N 1.—P. 501—521.
11. Shafer R. H., Chase E. SEisenach / . Slow repair of X-ray-induced DNA damage
in rat 9L cells in vitro analyzed by v i scoe las tomet ry / /Rad ia t . Res.— 1981.—85,
N 1.—P. 47—56.
12. Г лазер В. Μ., Лучник Α. Η. Различия в плотности топологических витков Д Н К
злокачественно трансформированных и нормальных клеток сирийского хомячка / /
Докл. АН СССР.— 1981.—258, № 5.—С. 1227—1231.
13. Стручков В. А. О природе «сверхполимерной» дезоксирибонуклеиновой кислоты / /
Биофизика,— 1962.—7, № 5.—С. 538—550.
14. Стражевская Н. В., Стручков В. А. Организация надмолекулярных комплексов
Д Н К хроматина эукариот и их роль в радиационном эффекте / / Радиобиология.—
1977.—17, № 2.—С. 163—177.
15. А. с. 1267216 СССР, (51)4 G 01 N 11/08. Капиллярный эластовискозиметр /
B. А. Стручков, Н. Б. Стражевская / /Открытия . Изобретения.— 1986.— № 4 0 . —
C. 152.
16. Нечаевский Ю. В., Стражевская Н. Б. у-индуцированное повреждение суперспира-
лей Д Н К спермы вьюна / /Повреждение и репарация Д Н К / Под ред. А. И. Га-
зиева.—Пущино, 1980.—С. 107—114.
17. Блохин Д. Ю. Повреждение надмолекулярного комплекса Д Н К в механизме дей-
ствия противоопухолевых препаратов / /Вопр . онкологии.— 1985.—31, № 11.—
С. 60—66.
210 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. — 1988. — Т. 4, №> 4 210
18. Laemmli U. К. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T 4 / / N a t u r e . — 1970.—227.—P. 680—685.
19. Wang J. C. Superhelical D N A / / Trends Biochem. Sci.— 1980.—5, N 1.—P. 219—221.
20. Cook P. RBrazell /. A. The superhelical density of nuclear DNA from human
c e l l s / / E u r . J. Biochem.— 1977.—74, N 2 .—P. 527—531.
21. Struchkov V. A. On the subunit organization of DNA in eukaryotic c h r o m a t i n / /
Stud, biophys.— 1982.—87, N 2 /3 .—P. 153—154.
22. Стручков Β. Α., Стражевская Η. Б. Организация хромомероподобных структур
надмолекулярных комплексов Д Н К эукариот / / Материалы V Всесоюз. биохим.
съезда.—М. : Наука, 1986.—Т. 2.—С. 369—370.
23. Welsh R. S., Vyska К. Organization of highly purified calf thymus D N A / / B i o c h i m .
et biophys. acta.— 1981.—655, N 3 .—P. 291—306.
24. Wang / . C. Variation of the average rotation angle of the DNA helix and the super-
helical turns of covalently closed cyclic D N A / / J . Мої. Biol — 1969.—43, N 1.—
P. 25—39.
25. Isolation of the protein scaffold from mitotic HeLa cells chromosomes /К . W. Adolph,
S. M. Cheng, J. R. Paulson, U. K. L a e m m l i / / P r o c . Nat. Acad. Sci. USA.— 1977.—74,
N 11.— P. 4937—4941.
26. Наседкина Τ. В., Слезингер С. И. Изменения в структуре нуклеогистоновых фибрилл
хромосомы при удалении бивалентных катионов и гистона H I / / Ц и т о л о г и я . —
1983.-25, № 9.—С. 1054—1058.
27. Збарский И. Б. Белковый состав и организация ядерного матрикса / / Биополимеры
и клетка.— 1985 —1, № 1.—С. 26—32.
28. Чернохвостое В. В. Ядерный матрикс эукариотической клетки: некоторые вопросы
выделения, структуры и функционирования//Успехи соврем, биологии.— 1985.—99,
№ 3.— С. 371—384.
Всесоюз. онкол. науч. центр АМН СССР, Москва Получено 25.11.86
УДК 578.08:543.4
ФЛЮОРЕСЦЕНТНАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ
КРАЕВОГО ВОЗБУЖДЕНИЯ ИНДОЛА И ТРИПТОФАНА
А. П. Демченко, А. С. Ладохин
Введение. В последнее время большое значение приобрели флюорес-
центные методы изучения структуры и динамики белков. Поскольку
триптофановые остатки вносят основной вклад в собственную флюо-
ресценцию белков, повышенный интерес вызывают флюоресцентные
свойства индола и триптофана. Однако связь между свойствами окру-
жения этих хромофоров и их спектрами флюоресценции неоднозначна.
Как известно, триптофановая флюоресценция чувствительна к поляр-
ности среды, образованию комплексов в возбужденном состоянии
(эксиплексов) и к скорости дипольно-ориентационной релаксации мо-
лекул растворителя и белковых групп, окружающих хромофор [1—3].
Действие этих факторов приводит к значительным (до 40 нм) вариа-
циям спектров триптофановой флюоресценции. Это определяет высо-
кую чувствительность спектров флюоресценции к структурным измене-
ниям в белках и объясняет большую популярность этого подхода. Но
интерпретация результатов может быть очень сложной. Например, толь-
ко при достижении дипольно-ориентационного равновесия может быть
проанализирована полярность окружения хромофора путем сравнения
результатов, полученных на белках, с результатами исследований в
модельных жидких растворителях. В связи с этим возникает необходи-
мость в методе, который способен выявлять неотрелаксировавшие элек-
тронно-возбужденные состояния в белках.
Недавно было предложено проводить анализ дипольно-релаксаци-
онной подвижности в белках, применяя флюоресцентную спектроскопию
красного краевого возбуждения [4]. Эффекты красного края в спект-
рах флюоресценции возникают вследствие распределения хромофоров
по набору микросостояний, отличающихся по энергии взаимодействия
с окружением [5, 6]. Несмотря на широкое изучение этого эффекта
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. — 1988. — Т. 4, №> 4 211
|