Активация пролиферации В-лимфоцитов мыши и циклические нуклеотиды в ранние стадии активации
Показано, что активация В-лимфоцитов мыши сопровождается ранним Са-зависимым повышением cGMP, но не сАМР, в клетках, которого недостаточно для пролиферации лимфоцитов, останавливающихся в G₁- фазе клеточного цикла. Показано, що активація В-лімфоцитів миші супроводжується раннім Са-залежним підвищенн...
Saved in:
| Published in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Date: | 1988 |
| Main Author: | |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1988
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154107 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Активация пролиферации В-лимфоцитов мыши и циклические нуклеотиды в ранние стадии активации / С.В. Комиссаренко // Биополимеры и клетка. — 1988. — Т. 4, № 6. — С. 303-309. — Бібліогр.: 19 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-154107 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Комиссаренко, С.В. 2019-06-15T07:57:27Z 2019-06-15T07:57:27Z 1988 Активация пролиферации В-лимфоцитов мыши и циклические нуклеотиды в ранние стадии активации / С.В. Комиссаренко // Биополимеры и клетка. — 1988. — Т. 4, № 6. — С. 303-309. — Бібліогр.: 19 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00023D https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154107 57.083.3+577.113.3 Показано, что активация В-лимфоцитов мыши сопровождается ранним Са-зависимым повышением cGMP, но не сАМР, в клетках, которого недостаточно для пролиферации лимфоцитов, останавливающихся в G₁- фазе клеточного цикла. Показано, що активація В-лімфоцитів миші супроводжується раннім Са-залежним підвищенням cGMP, але не сАМР, у клітинах, якого недостатньо для проліферації лімфоцитів, що зупиняються в G₁-фазі клітинного циклу. Splenocytes and isolated mouse spleen B lymphocytes were activated in culture by: antibodies to μ-chains of mouse immunoglobulins, Fab and F(ab')2 fragments of such antibodies, LPS from E. coli and interleukin 2(IL-2). Cell activation was monitored by [³H]-incorporation and by flow cytofluorimetry. The latter permitted detecting cell-cycle phases distribution of cells stained by acridine orange. It was shown that anti-μ antibodies were cytotoxic to mouse splenocytes and B lymphocytes. Isolated B cell could not be stimulated by Fab or F(ab')₂ anti-μ, fragments but were activated by LPS and by F(ab')₂ + IL-2, though F(ab')₂ were stimulative to mouse splenocytes. In most cases activated cells passed G₁ phase and were arrested at the GrS boundary. LPS or F(ab')₂ anti-μ, addition to isolated B cells in culture caused a Ca²⁺-dependent increase in cGMP but not cAMP levels in these cells. Methylene bisphosphonic acid being administered to mice 24 hours before B cells isolation did not change cAMP or cGMP levels in LPS of F(ab')₂ activated B lymphocytes. These data show that during the first minutes of B cell activation by LPS or F(ab')₂ anti-μ, fragments there occurs a Ca²⁺-dependent increase in the cGMP level which is not sufficient for these cells proliferation and progression through the whole cell-cycle. The cells are usually arrested in G₁ phase. Автор выражает глубокую благодарность докторам 3. Дарзинкевичу и Л. Стояно-Койко за цитофлюориметрический анализ лимфоцитов (Слоан-Кеттеринг противораковый центр) и проф. К.П. Заку (Киев. НИИ эндокринологии и обмена веществ) за электронную микроскопию В-лимфоцитов мыши. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Клеточная биология Активация пролиферации В-лимфоцитов мыши и циклические нуклеотиды в ранние стадии активации Активація проліферації В-лімфоцитів миші і циклічні нуклеотиди на ранніх стадіях активації Mouse B lymphocyte activation of proliferation and cyclic nucleotides at early stages of activation Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Активация пролиферации В-лимфоцитов мыши и циклические нуклеотиды в ранние стадии активации |
| spellingShingle |
Активация пролиферации В-лимфоцитов мыши и циклические нуклеотиды в ранние стадии активации Комиссаренко, С.В. Клеточная биология |
| title_short |
Активация пролиферации В-лимфоцитов мыши и циклические нуклеотиды в ранние стадии активации |
| title_full |
Активация пролиферации В-лимфоцитов мыши и циклические нуклеотиды в ранние стадии активации |
| title_fullStr |
Активация пролиферации В-лимфоцитов мыши и циклические нуклеотиды в ранние стадии активации |
| title_full_unstemmed |
Активация пролиферации В-лимфоцитов мыши и циклические нуклеотиды в ранние стадии активации |
| title_sort |
активация пролиферации в-лимфоцитов мыши и циклические нуклеотиды в ранние стадии активации |
| author |
Комиссаренко, С.В. |
| author_facet |
Комиссаренко, С.В. |
| topic |
Клеточная биология |
| topic_facet |
Клеточная биология |
| publishDate |
1988 |
| language |
Russian |
| container_title |
Биополимеры и клетка |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Активація проліферації В-лімфоцитів миші і циклічні нуклеотиди на ранніх стадіях активації Mouse B lymphocyte activation of proliferation and cyclic nucleotides at early stages of activation |
| description |
Показано, что активация В-лимфоцитов мыши сопровождается ранним Са-зависимым повышением cGMP, но не сАМР, в клетках, которого недостаточно для пролиферации лимфоцитов, останавливающихся в G₁- фазе клеточного цикла.
Показано, що активація В-лімфоцитів миші супроводжується раннім Са-залежним підвищенням cGMP, але не сАМР, у клітинах, якого недостатньо для проліферації лімфоцитів, що зупиняються в G₁-фазі клітинного циклу.
Splenocytes and isolated mouse spleen B lymphocytes were activated in culture by: antibodies to μ-chains of mouse immunoglobulins, Fab and F(ab')2 fragments of such antibodies, LPS from E. coli and interleukin 2(IL-2). Cell activation was monitored by [³H]-incorporation and by flow cytofluorimetry. The latter permitted detecting cell-cycle phases distribution of cells stained by acridine orange. It was shown that anti-μ antibodies were cytotoxic to mouse splenocytes and B lymphocytes. Isolated B cell could not be stimulated by Fab or F(ab')₂ anti-μ, fragments but were activated by LPS and by F(ab')₂ + IL-2, though F(ab')₂ were stimulative to mouse splenocytes. In most cases activated cells passed G₁ phase and were arrested at the GrS boundary. LPS or F(ab')₂ anti-μ, addition to isolated B cells in culture caused a Ca²⁺-dependent increase in cGMP but not cAMP levels in these cells. Methylene bisphosphonic acid being administered to mice 24 hours before B cells isolation did not change cAMP or cGMP levels in LPS of F(ab')₂ activated B lymphocytes. These data show that during the first minutes of B cell activation by LPS or F(ab')₂ anti-μ, fragments there occurs a Ca²⁺-dependent increase in the cGMP level which is not sufficient for these cells proliferation and progression through the whole cell-cycle. The cells are usually arrested in G₁ phase.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154107 |
| citation_txt |
Активация пролиферации В-лимфоцитов мыши и циклические нуклеотиды в ранние стадии активации / С.В. Комиссаренко // Биополимеры и клетка. — 1988. — Т. 4, № 6. — С. 303-309. — Бібліогр.: 19 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT komissarenkosv aktivaciâproliferaciivlimfocitovmyšiicikličeskienukleotidyvranniestadiiaktivacii AT komissarenkosv aktivacíâprolíferacíívlímfocitívmišííciklíčnínukleotidinaranníhstadíâhaktivacíí AT komissarenkosv mouseblymphocyteactivationofproliferationandcyclicnucleotidesatearlystagesofactivation |
| first_indexed |
2025-11-27T07:30:10Z |
| last_indexed |
2025-11-27T07:30:10Z |
| _version_ |
1850803546272825344 |
| fulltext |
УДК 57.083.3 + 577.113.3
АКТИВАЦИЯ ПРОЛИФЕРАЦИИ В-ЛИМФОЦИТОВ МЫШИ
И ЦИКЛИЧЕСКИЕ НУКЛЕОТИДЫ
В РАННИЕ СТАДИИ АКТИВАЦИИ*
С. В. Комиссаренко
Введение. Несмотря на большое количество работ, посвященных акти-
вации лимфоцитов, в настоящее время нет единого мнения о том, ка-
кие из биохимических процессов являются важнейшими или уникаль-
ными в передаче сигнала об активации клетки от ее поверхностной
мембраны к ядру. Очевидно, что наряду с существованием на поверх-
ности клетки большого разнообразия рецепторов для различных эф-
фекторов и (или) дифференцировочных антигенов, набор которых опре-
деляется соответствующей стадией созревания лимфоцитов, стимуляция
клетки, ведущая к ее пролиферации и (или) дифференциации, осуществ-
ляется за счет ограниченного количества синэргически или антагонис-
тически взаимодействующих биохимических процессов. Поэтому отли-
чающиеся эффекторные молекулы могут активировать общие для них
биохимические пути в разные временные точки или одновременно, кон-
курируя за них между собой. Среди важнейших событий, лежащих в
основе или сопровождающих активацию лимфоцитов, сейчас выделяют
следующие: увеличенный транспорт экзогенных ионов (прежде всего
К + и Са2 +) в клетку [1]; активацию метаболизма мембранных фосфо-
липидов, что может приводить к активации фосфолипазы С, гидролизу
фосфатидилинозитолбисфосфата с образованием диацилглицерола, ак-
тивирующего протеинкиназу С, и инозитолтрифосфата, способствующе-
го освобождению и увеличению концентрации эндогенного кальция, а
также повышению внутриклеточного рН [2, 3], или же к активации
фосфолипазы А2 и каскада арахидоиовой кислоты с образованием про-
стагландинов, тромбоксанов и активацией гуанилатциклазы [4]; акти-
вацию мембранных протеинкиназ, часть которых относится к белкам-
продуктам экспрессии одной группы клеточных протоонкогенов [5], а
также функционирование другой группы клеточных протоонкогенов,
продукты экспрессии которых находятся в ядре и могут регулировать
пролиферацию и дифференциацию клеток [6]. Уровни циклических нук-
лсотндов и их соотношение в клетке имеют важное регуляторное зна-
чение, в частности в отдельных фазах клеточного цикла [7], однако
данные о роли сАМР и cGMP в стимулировании лимфоцитов остаются
противоречивыми [8, 9], хотя участие циклазных систем в пролифера-
ции и(или) дифференциации многих типов клеток весьма очевидно
[10]. Трудности в исследовании молекулярных механизмов активации
лимфоцитов во многом связаны со сложностью этих механизмов, а так-
же с отсутствием адекватных экспериментальных моделей, позволя-
ющих иметь достаточное для биохимического анализа количество мате-
риала. Цель настоящей работы заключалась в исследовании влияіїия
разных эффекторов на активацию лимфоцитов и на содержание сАМР
и cGMP в «ранние сроки» стимуляции этих клеток. В качестве модели
активации лимфоцитов использовали выделенные В-клетки мыши, сти-
мулированные F{abf)2-фрагментами антител против μ-цепей IgM мыши
или липополисахаридом (LPS) Escherichia coli.
Материалы и методы. Для выделения В-лимфоцнтов получали епленоцпты мышей
C3H/Hej (возраст 8—12 педель). Т-клетки лизировали моноклональиыми антителами
анти-Thy 1,2 (источником антител был разведенный в 104 раз асцит мыши с соответст-
вующей гибридомой), инкубируя спленоциты 30 мин при 4 °С, а затем добавляя к
* Работа частично выполнялась в Слоан-Кеттеринг противораковом центре,
Ныо-Иорк, США, в соответствии с соглашением о научном сотрудничестве между АН
СССР и Национальной академией наук США.
Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА.— 1 !.ί·8.— Т. 4. № 6 303
осадку клеток на ЗО мин при 37 °С разведенный в 15 раз комплемент кролика. Эритро-
циты лизировали гипотоническим шоком 20 с при 4 °С в 0,0256 Μ NaCl. Обрывки ли-
зированных клеток убирали центрифугированием, а осадок, состоящий из целых кле-
ток, суспендировали в среде RPMI-1640 с 10 % эмбриональной телячьей сыворотки и
инкубировали 60 мин при концентрации (4—5) · 106 клеток/1 мл и 37 °С в пластиковых
флаконах для удаления прилипающих клеток. Неприлипающие клетки смывали с фла-
конов теплой средой RPMI-1640, центрифугировали, доводили этой ж е средой до 107
клеток в 1 мл и вносили по 0,5 мл в пластиковые пробирки для измерения cNMP.
Выделенные В-клетки обычно составляли около 30 % начального количества ядерных
клеток селезенки. Контроль на качество выделения проводили электронно-микроскопи-
чески с помощью иммуноэнзимоцитохимического метода РАР, обрабатывая полученную
аналогичным способом суспензию В-лимфоцитов мыши последовательно кроличьими ан-
тителами против иммуноглобулинов мыши, свиными антителами против иммуноглобу-
линов кролика и комплексом Р А Р (пероксидаза — антитела против пероксидазы). как
описано ранее [11]. Практически все (до 9 5 % ) полученные клетки имели Ig на своей
поверхности и интактную ультраструктуру. Эффекторы (Са 2 + , ЭГТА, 2-меркаптоэтанол,
LPS или / 7 (а^ , ) 2 -фрагменты) добавляли в RPMI-1640 до общего объема 1 мл. Конеч-
ные концентрации эффекторов были: С а 2 + — 1 мМ (помимо 0,4 мМ С а 2 + , находивше-
гося в среде), ЭГТА — 5 мМ, 2-меркаптоэтанол — 0,05 мМ, L P S — 50 мкг/мл, F(ab')2 —
45 мкг/мл. Лимфоциты активировали при 37 °С, добавляя L P S Ε. coli («Difco», США)
или F(ab')2. Реакцию останавливали через 3, 10 и 30 мин, внося по 0,5 мл 1,5 Μ НСЮ 4
и замораживая пробы при —20 °С. Содержание сАМР и cGMP в клетках определяли
радиоиммунологически с соответствующими моноспецифическими антисыворотками пос-
ле очистки cNMP на колонке с А1203, разделения сАМР и cGMP на колонках с Do-
wex 1 X 8 («Віо-Rad», США), ацетилирования образцов и стандартов и выражали в
фмолях (cGMP) или пмолях (сАМР) на 1 мг белка, внося поправки на гашение образ-
цов и потери при хроматографии, сравнивая с [3Н]-меченными контролями [12]. Фраг-
менты F(ab')2 анти-μ были получены гидролизом козьих антител против белков мие-
ломы М О Р С 104Е (μ, λ) мыши. Перед гидролизом козья антисыворотка была истоще-
на на иммобилизованном на сефарозе 4В («Pharmacia», Швеция) белке миеломы
М О Р С 315 (α, λ) , а анти-μ антитела были выделены при рН 2,8 на иммуносорбенте
сефароза 4В — белок миеломы МС 471В (μ, χ ) . Иммуносорбент синтезировали, как
описано ранее [13]. Гидролиз отдиализированных против 0,1 Μ ацетатного буфера,
рН 4,1, антител проводили в 2 %-ном пепсине 36 ч при 37 °С. Затем белок переводили
в 10 мМ фосфатный буфер, рН 6,9, «осветляли» центрифугированием 60 мин при
30000 g и 4 °С и хроматографировали на колонке 16X700 мм с биогелем Р-150, 100—
200 меш («Віо-Rad», США) в том же буфере. Основной пик элюировался во фракции,
соответствующей молекулярной массе 105000—110000. Гомогенность и идентичность по-
лученного F(ab')2 были подтверждены электрофорезом в тонком слое 7,5 %-ного по-
лиакриламидного геля с DS-Na. Из части выделенного ^ ( а Ь ' ^ - ф р а г м е н т а восстановле-
нием дитиотреитолом и блокированием SH-групп иодацетамидом были получены Fab-
фрагменты. Активацию В-лимфоцитов контролировали двумя способами: по включению
[ 3 Н]тимидина и цитофлюориметрически. В первом случае к культуре клеток в 96-яче-
ечных плашках, содержащих в каждой ячейке 5 -Ю 5 клеток в 200 мкл среды RPMI-1640
с 10 % эмбриональной телячьей сыворотки и соответствующие эффекторы, за 8 ч до
конца культивирования добавляли 18,5 кБк [ 3 Н]тимидина. При активации В-клеток
мышей изучали действие фрагментов F(abr)9 анти-μ антител (конечные концентрации
15 н 45 мкг /мл) , которое сравнивали с действием аффинно выделенных, но не гидро-
лизованных анти-μ антител (30 и 150 мкг /мл) , Fab-фрагментов этих антител
(45 мкг /мл) , LPS Ε. coli (10 и 50 мкг/мл) и лимфокина интерлейкина 2 (IL-2). Источ-
ником IL-2 была разведенная в 20 раз обогащенная культуральная жидкость активи-
рованных клеток LBRM-33, предоставленная д-ром С. Гилисом (Ун-т штата Вашингтон,
США). Во всех культурах В-клеток присутствовал 2-меркаптоэтанол в концентрации
DT05 мМ. В-лимфоциты культивировали 30, 55 и 80 ч при 37°С, 5 %-ном С 0 9 и 100 %-
ной влажности. В нескольких экспериментах вместо обогащенных В-клеток использо-
вали спленоциты этих ж е мышей, степень активации которых определяли по включе-
нию [ 3 Н] тимидина в Д Н К этих клеток. Д л я определения уровня синтеза Д Н К В-лим-
фоциты или спленоциты переносили с помощью автоматического собирателя клеток на
стекловолоконные фильтры, промывали водой, сушили и определяли радиоактивность
в реактиве Брея на жидкостно-сцинтилляционном спектрометре. Параметры активации
клеток измеряли цитофлюориметрически на проточном лазерном цитофлюорографе
304 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА,— 1988.—Т. 4, № 6 304
FC 200 («ORTHO», США) и Nova 1220 миникомпыотере («Data General», США) после
окраски клеток акридиновым оранжевым, перенося 105 клеток в 200 мкл среды в 0,4 мл
0,1 %-ного раствора тритона Х-100. После инкубации в течение 30 с при комнатной
температуре добавляли 1,2 мл раствора акридинового оранжевого (6 мкг/мл) в 0,02 Μ
фосфат-цитратном буфере, рН 3,0, и сразу же измеряли флюоресценцию клеток [14].
Результаты и обсуждение. При анализе данных по включению
[3Н]тимидина в Д Н К спленоцитов (табл. 1) и обогащенных В-лимфо-
дитов (табл. 2) оказалось, что в обоих случаях добавление к клеткам
целых молекул антител (150 мкг/мл) приводило к очень сильному сни-
жению включения метки по сравнению с контролем, которым служили
культивируемые клетки без добавления каких-либо эффекторов. Такое
Т а б л и ц а 1
Включение [3Н]тимидина (имп·мин-1) в ДНК 5-Ю5 спленоцитов мыши (М±т)
3H]thymidine incorporation (counts per minute) into 5-Ю5 mouse splenocytes DNA
M±rn)
Эффекторы, мкг/мл
Время культивирования, ч
Эффекторы, мкг/мл
•18
I
69
I
96
Контроль, клетки в среде 4611+374 7025+455 9903+672
Антитела, 30 3806+258 6063+524 10786+540
Антитела, 150 197+62 434+132 251+59
F (ab')2, 45 49498+1230 49743+2627 30020+4083
Fab, 45 3897+296 6463+997 8758+688
LPS, 10 10968+270 6590+596 5496+229
LPS, 50 17896+535 7078+652 5578+335
Т а б л и ц а 2
Включение \'0Н]тимис)ина (ими-мин~]) в ДНК 5-Ю5 В-лимфоцитов мыши (М±т)
[3H]thymidine incorporation (counts per minute) into 5-Ю5 mouse B-lymphocijtes DNA
(M±m)
Эффекторы
Время культивирования, ч
Эффекторы
30 55 80
Контроль, клетки в среде 2258+99 3976+262 43524-238
Антитела, 150 мкг/мл 154+36 314+64 203+52
F (ab')2, 15 мкг/мл 2676+124 3507+223 4544+324
F (ab')2, 45 мкг/мл 2753+115 4501+317 4210+324
Fab, 45 мкг/мл 3041 + 153 3176+289 4226+200
LPS, 10 мкг/мл 16678+795 11010+1044 3120+223
LPS, 50 мкг/мл 16694+1187 14972+779 4141+511
F (аЬ')2 (45 мкг/мл)+IL-2 (1:20) 13208+746 12895+661 4616+248
IL-2 (1:20) 11426+1030 8865+456 5782+224
снижение могло быть только за счет цитотоксического действия анти-
тел. Если ж е из этих анти-μ антител, вызывающих гибель клеток, вы-
делить F (аb')2-фрагменты, то последние в концентрации 45 мкг/мл
вызывали значительную активацию спленоцитов мыши. LPS также, но
в меньшей степени, стимулировал спленоциты в концентрации 50 и
10 мкг/мл. Fab-фрагменты этих же антител, обладающие одним анти-
генсвязывающим центром, не влияли на пролиферацию спленоцитов.
Представляет интерес сравнение данных по действию одних и тех ж е
эффекторов на спленоциты и на обогащенные В-лимфоциты. Оказы-
вается, что активирующее действие фрагментов F(ab')2 анти-μ, наблю-
давшееся на спленоцитах, полностью отсутствует на В-клетках, хотя
клетки, с которыми могут взаимодействовать эти фрагменты, в обоих
случаях остаются одними и теми же — В-лимфоцитами, имеющими
Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА,— 1988.—Т. 4, № 6 305
IgM-рецепторы на поверхностной мембране. Очевидно, что для эффек-
тивной стимуляции В-клеток фрагментами F(ab')2 анти-μ необходимы
другие типы клеток, присутствующие среди спленоцитов и отсутству-
ющие во фракции В-лимфоцитов и удаленные при обработке сплено-
цитов антителами анти -Thy 1,2 (Т-лимфоциты) и (или) прилипанием
к пластику (клетки ряда макрофагов ) . Свойство ^ ( а б ^ г - ф р а г м е н т о в
стимулировать пролиферацию В-клеток среди спленоцитов частично
восстанавливалось на обогащенных В-лимфоцитах при добавлении
Т а б л и ц а 3
Цитофлюориметрический анализ активации В-лимфоцитов мыши
Flow c.ytojluorimetry analysis of mouse В lymphocytes activation
П р и м е ч а н и е . 1 — мертвые клетки, %; 2 — клетки в Go-фазе, %; 3 — стимулиро-
ванные клетки, % (в фазах G 1 + S + G 2 + M ) ; 4 — клетки в Gi-фазе, %; 5 — клетки в
S-фазе, %; б — клетки в фазах G2 и Μ, %; X — определения не проводили.
F(ab')2 к культуре клеток вместе с IL-2, который мог служить источ-
ником факторов, заменяющих Т-клетки. Активирующее действие L P S
в культурах спленоцитов и В-лимфоцитов проявлялось практически
одинаково, что подтверждает независимость эффекта L P S от Т-лимфо-
цитов. Д а н н ы е по стимуляции клеток, полученные исходя из включения
[ 3 Н]тимидина в Д Н К этих клеток, были подтверждены и дополнены с
помощью проточной цитофлюориметрии обогащенных В-лимфоцитов.
Этот метод с применением акридинового оранжевого позволяет опре-
делить относительное количество Д Н К (по зеленой флюоресценции при
515—575 нм) и одновременно Р Н К (по красной флюоресценции при
600—650 нм) в единичных клетках и таким образом рассчитать по со-
ответствующим программам, в какой фазе цикла находится к а ж д а я
клетка, количество активированных клеток, а т а к ж е отдифференциро-
вать ж и в ы е клетки от мертвых или агглютинированных [14]. Было
показано, что интактные молекулы анти-μ антител, из которых полу-
чали F(ab')2- и Fab-фрагменты, в отличие от имеющихся данных ли-
тературы о пролиферативном действии растворимых [15] или инсолю-
билизированных [16] анти-μ антител не только не обладали активиру-
ющим эффектом, но и были цитотоксичны при концентрации 150 мкг/мл,
вызывая гибель до 92—94 % В-лимфоцитов в культуре (табл. 3) .
Наибольшую активацию В-клеток вызывали L P S и смесь F(ab/)2-фраг-
ментов с IL-2. Однако степень активации была незначительной. Она
достигала 25—27 % клеток в культуре и лишь вдвое превышала коли-
306 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА,— 1988.—Т. 4, № 6 306
чество стимулированных клеток в контроле, которые, по-видимому, бы-
ли активированы за счет ростовых факторов, присутствующих в эмбрио-
нальной сыворотке крови. Такой сравнительно низкий уровень актива-
ции В-лимфоцитов с помощью LPS связан, очевидно, с тем, что линия
мышей C3H/Hej фенотипически слабо отвечает на L P S Ε. coli как на
митоген. Неполная активация при помощи F(ab')2 с IL-2 может объяс-
няться недостаточным содержанием костимулирующего фактора
(BSF-1 или IL-4, или BCGF-1) [17] в препаратах IL-2, полученных из
культуры активированных клеток. В пробах, где активация клеток
Т а б л и ц а 4
Содержание циклических GMP и AMP в В-лимфоцитах селезенки мышей-
после их активации LPS или F(abf)2-фрагментами анти-μ антител
Cyclic GMP and AMP levels in mouse spleen В lymphocytes after their activation
by LPS or by F(ab')2 fragments of anti-μ antibodies
Эффектор Cc.2+ ЭГТА
Время ак-
тивации,
мин
cGMP/белок лимфо-
цитов, фмоли/мг
сДМР/белок лимфо-
цитов, пмоли/мг
Контроль 0 1384-16 1 7 , 3 + 3 , 2
F (ab% + - L 3 120+22 2 0 , 6 + 4 , 3
F (аЬ')2 + 3 369+37 1 7 , 0 + 3 , 4
LPS 1 3 470+55 1 5 , 7 + 3 , 0
F(ab') 2 —L
1 10 168+41 1 9 , 0 + 2 , 0
F (ab')2
1
1 — 10 485+52 2 0 , 7 + 3 , 4
LPS — 10 585+76 1 9 , 0 + 3 , 5
F (ab')2 + з о 165+35 1 2 , 1 + 2 , 9
F (ab')2
- l ·
з о 129+21 1 4 , 8 + 3 , 6
LPS з о 166+35 1 2 , 0 + 2 , 4
достигала наибольших величин, было рассчитано распределение клеток
по фазам клеточного цикла. Оказалось, что при стимуляции клеток
LPS, F(ab')2 с IL-2 и IL-2 активированные В-клетки находятся пре-
имущественно в Gi-фазе, что может быть связано с большей длитель-
ностью этой фазы по сравнению с другими (быстрым прохождением
клеткой S-, G2- и М-фаз) или с невозможностью перехода клеток из
Gi- в S-фазу клеточного цикла. Первая возможность маловероятна,
так как низкое включение [3Н]тимидина в аналогичных экспериментах
свидетельствует о том, что лишь незначительная часть лимфоцитов
прошла S-фазу, а также потому, что длительность фаз цикла обычно
постоянна для клеток данного типа и составляет у активированных
В-лимфоцитов по 8 ч для Gi- и S-фаз и 4 ч для 0 2 + М - ф а з [17]. Боль-
шинство зрелых лимфоцитов обычно является нестимулированными
клетками, находящимися в G0 (или в Giq) фазе цикла. Активация про-
лиферации лимфоцитов приводит к прохождению ими клеточного цикла
(Gi-, S-, G2-, М-фазы) и к делению клетки. Однако для этого необхо-
мо присутствие ряда факторов, без которых клетки останавливаются
в так называемых рестрикционных точках цикла — на границе Go—Gi,
Gi—S и в йг-фазе цикла [17]. По-видимому, в использованной нами
системе обогащенных В-лимфоцитов мыши L P S и F(ab')2 с IL-2 спо-
собствовали переходу клеток лишь из G0- в Gi-фазу. При этом только
незначительная часть этих активированных клеток в дальнейшем за-
вершала клеточный цикл из-за отсутствия α-факторов или факторов
прогрессии, секретируемых макрофагами (IL-1, СЗЬ и C3d субкомпо-
нентов комплемента) и необходимых для перехода из Gi- в S-фазу.
Вышеописанный способ получения В-лимфоцитов использовали
также для исследования уровней циклических нуклеотидов в этих клет-
ках через 3, 10 и 30 мин после добавления LPS (50 мкг/мл) или
F(ab/)2-фрагментов (45 мкг/мл). сАМР и cGMP определяли в клетках,
находившихся в бессывороточной среде с Са 2 + или с С а 2 + + Э Г Т А , ра-
диоиммунологически с помощью моноспецифических антител. Эти дан-
ные приведены в табл. 4. Очевидно, что F ( ай '^ -фрагменты анти-μ ан-
Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА,— 1988.—Т. 4, № 6 307
тител и LPS через 3 и 10 мин после добавления повышают в В-лимфо-
цитах уровень cGMP, практически не влияя на содержание сАМР в
этих клетках. Увеличение содержания cGMP в клетках под действием
^ (яб 'Ь-фрагментов зависело от наличия в среде ионов Са, хелатиро-
вание которых ЭГТА останавливало повышение cGMP. Уровень cGMP
не увеличивался также при использовании вместо /7(ай /)2-фрагментов
одновалентных ґай-фрагментов или при добавлении ЭГТА к пробам,
содержащим LPS и Са2+ (числовые значения здесь не приведены).
Принимая во внимание известное иммуномодуляторное и комп-
лексообразующее действие метиленбисфосфоновой кислоты (МБФК)
[18], был поставлен эксперимент по исследованию влияния этого пре-
парата на уровень cGMP в В-лимфоцитах через 10 мин после стиму-
ляции этих клеток F(ab')2 (45 мкг/мл) и LPS (50 мкг/мл). МБФК
вводили мышам подкожно в дозе 40 мг на 1 кг веса за 24 ч до выде-
ления В-клеток. Оказалось, что введенная in vivo М Б Ф К практически
не влияла на последующее увеличение cGMP в В-лимфоцитах под
действием LPS и ^(аб^г-фрагментов. Так, в выделенных В-клетках
животных, которым за 24 ч до опыта инъецировали МБФК, уровень
cGMP до добавления LPS или F (ab/)2 к культивируемым клеткам со-
ставлял 136+21 фмоль/мг белка, а после активации клеток в течение
10 мин фрагментами F(ab')2 анти-μ или LPS соответственно: 470+21
и 4 8 0 + 2 2 фмоль cGMP на 1 мг белка.
Результаты проведенной работы свидетельствуют о том, что ран-
ние этапы (первые минуты) активации В-лимфоцитов мышей под дей-
ствием LPS или F(ab')2-фрагментов антител против μ-цепей иммуно-
глобулинов мыши сопровождаются повышением уровня cGMP в этих
клетках. Эта активация зависит от наличия ионов Са и происходит
при кластеризации рецепторов поверхностной мембраны В-клеток
(только двухвалентные F(ab')2-фрагменты, но не Fab-фрагменты той
же специфичности, могли активировать клетки). Условия такой акти-
вации коррелируют с условиями, приводящими к стимуляции пролифе-
рации лимфоцитов. Тем не менее увеличение количества cGMP, ко-
торое, по-видимому, сопряжено с активацией cGMP-зависимой проте-
инкиназы [19], не является достаточным условием для последующей
активации пролиферации В-клеток. Под влиянием F(ab/)2 и LPS сти-
мулированные клетки останавливаются в Gi-фазе цикла. Для прохо-
ждения лимфоцитом всех фаз клеточного цикла необходимо последо-
вательное действие нескольких факторов, действующих на общие или
синэргические метаболические пути.
Автор выражает глубокую благодарность докторам 3. Дарзинке-
вичу и Л. Стояно-Койко за цитофлюориметрический анализ лимфоци-
тов (Слоан-Кеттеринг противораковый центр) и проф. К. П. Заку (Ки-
ев. Н И И эндокринологии и обмена веществ) за электронную микроско-
пию В-лимфоцитов мыши.
MOUSE В LYMPHOCYTE ACTIVATION OF PROLIFERATION
AND CYCLIC NUCLEOTIDES AT EARLY STAGES OF ACTIVATION
S. V. Komissarenko
Α. V. Palladin Institute of Biochemistry, Kiev
S u m m a r y
Splenocytes and isolated mouse spleen В lymphocytes were activated in culture by: anti-
bodies to μ-chains of mouse immunoglobulins, Fab and F(ab/)2 f ragments of such anti-
bodies, LPS from E. coli and interleukin 2(IL-2). Cell activation was monitored by [ 3 H]-
incorporation and by flow cytofluorimetry. The latter permitted detecting cell-cycle pha-
ses distribution of cells stained by acridine orange. It was shown that anti-μ antibodies
were cytotoxic to mouse splenocytes and В lymphocytes. Isolated В cell could not be
308 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА,— 1988.—Т. 4, № 6 308
stimulated by Fab or F(ab/)2 anti-μ f ragments but were activated by LPS and by
F(ab')2 + IF-2, though F(ab')2 were stimulative to mouse splenocytes.
In most cases activated cells passed Gi phase and were arrested at the G r S bo-
undary. LPS or F(abf)2 anti-μ addition to isolated В cells in culture caused a Ca2+-de-
pendent increase in cGMP but not cAMP levels in these cells. Methylene bisphosphonic
acid being administered to mice 24 hours before В cells isolation did not change cAMP
or cGMP levels in LPS of F(abr)2 activated В lymphocytes. These data show that du-
ring the first minutes of В cell activation by LPS or F(abf)2 anti-μ f ragments there
occurs a Ca2 + -dependent increase in the cGMP level which is not sufficient for these
cells proliferation and progression through the whole cell-cycle. The cells are usual-
ly arrested in Gi phase.
1. Ashcroft F. M. Ion channels in l ymphocy te s / / Immuno l . Today.— 1984.—5, N 8.—
P. 232—233.
2. Nishizuka Y. The role of protein kinase С in cell surface signal transduction and tu-
mour promotion / / N a t u r e . — 1984,—308, N 5961.—P. 693—698.
3. В lymphocyte receptors and polyphosphoinositide degradation / M. K- Bijsterbosch,
Ch. J. Meade, G. A. Turner, G. G. B. K l a u s / / C e l l . — 1 9 8 5 —41, N 3 ,—P. 999—1006.
4. Membrane perturbation and stimulation of arachidonic acid metabolism / D. Gemsa,
H.-G. Leser, M. Seitz et a l . / / М о ї . Immunol.— 1982,—19, N 10 — P . 1287—1296.
5. Olashaw N., Pledger W. Mechanisms initiating cellular proliferation / / Mediators in
cell growth and differentiation / Eds R. Ford, A. Maizel.— New York: Raven press,
1985.— P. 31—44.
6. Cell-cycle control of c-myc but not c-ras expression is lost following chemical trans-
f o r m a t i o n / J . Campisi, Η. E. Gray, A. B. Pardee et a l . / / C e l l . — 1984,—36, N 2.—
P. 241—247.
7. Содержание циклических нуклеотидов в разных фазах клеточного цикла плазмаци-
томных клеток и влияние экзогенных нуклеотидов на распределение клеток по кле-
точному ЦИКЛУ / Д. А. Лукинов, С. В. Комиссаренко, С. Н. Тихонова и д р . / / Д о к л .
АН УССР.— 1986.— № 2.— С. 67—69.
8. Parker Ch. Ψ. Control of lymphocyte f u n c t i o n / / N e w England J. Med.— 1976,—295,—
P. 1 180—1186.
9. Cyclic nucleotides and calcium in lymphocyte regulation and activation / J. W. Had-
den, R. G. Coffey, R. Ananthakrishnan, Ε. M. H a d d e n / / A n n . N. Y. Acad. Sci.—
1979 —332.— P. 241—254.
10. Nestler E. J., Greengard P. Protein phosphorylation in the b r a i n / / N a t u r e . — 1983.—
305, N 5935,— P. 583—588.
11. Ультраструктура различных популяций иммуноглобулиннесущих лимфоцитов, ме-
ченных ПАП-комплексом, и топография иммуноглобулинов на поверхности клеточ-
ной мембраны / К. П. Зак, С. В. Комиссаренко, 3. А. Бутенко и д р . / / М о л е к у л я р .
биология.— 1982.—Вып. 33.—С. 11 — 15.
12. Coffey R. G. Assays for cyclic nucleotides including clinical applications / / Immuno-
pharmacology / Eds J. W. Hadden et al.— New York: Plenum press, 1977.— P. 389—
412.
13. Комиссаренко С. В., Аврамеас С. Свойства иммуносорбентов, приготовленных свя-
зыванием антигенов с активированным глутаровым альдегидом полиакриламидным
гелем, BrCN-активированной агарозой и сополимеризацией антигенов глутаровым
альдегидом / / У к р . биохим. журн.— 1978.—50, № 4.— С. 500—511.
14. Darzynkiewicz Ζ. Acridine orange as a molecular probe in studies of nucleic acids
in situ / / Flow cytometry and sorting / Eds M. R. Melamed et al.— New York: John
Wiley and Sons, 1979,—P. 285—316.
15. Activation of mouse lymphocytes by anti-immunoglobulin. 1. Parameters of the pro-
liferative response / D. Sieckmann, R. Asofsky, D. Mosier et a l . / / J . Exp. Med.—
1978.—147, N 3 .—P. 814—829.
16. Parker D. C. Stimulation of mouse lymphocytes by insoluble antimouse immunoglo-
bul ins / /Nature .—1975,—258, N 5533,—P. 361—363.
17. Melchers F., Andersson I. Factors controlling the B-cell cycle / / A n n . Rev. Immunol.—
1986,—4.—P. 13—36.
18. Применение дифосфонатов в качестве иммуномодуляторов / С. В. Комиссаренко,
Н. П. Карлова, И. Н. Колесникова и д р . / / Х и м и я и биология иммунорегуляторов.—
Рига : Зинатне, 1985.—С. 237—252.
19. Komissarenko S. V., Hadden J. W. Cyclic nucleotides and cNMP dependent protein
kinases in lymphocyte ac t i va t i on / /Abs t r . Vth Int. Congr. Immunol.— Kvoto, 1983.—
P. 25.
Ин-т биохимии им. А. В. Палладина Получено 19.03.87
АН УССР, Киев
Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА.—1988.—Т. 4, № 6 309
|