Стабілізація дуплексних та триплексних комплексів оліготимідилату ковалентно приєднаним глікозидом імідазофеназину

Синтезовано декатимідилат, який містить на 3'-кінці нуклеозидне похідне імідазофеназину (Pzn). Вивчено вплив ковалентного приєднання барвника на формування комплементарних комплексів (dT)10 – дуплексу з (dA)15 та триплексів з (dA) 15 і poly(dA) ·poly(dT) – в буферних розчинах з нейтральним рН п...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	1998
Hauptverfasser:	Зозуля, В.М., Благой, Ю.П., Дубей, І.Я., Федоряк, О.Д., Щербакова, О.С., Федоряк, Д.М.
Format:	Artikel
Sprache:	Ukrainian
Veröffentlicht:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1998
Schriftenreihe:	Биополимеры и клетка
Schlagworte:	Структура и функции биополимеров
Online Zugang:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154139
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Стабілізація дуплексних та триплексних комплексів оліготимідилату ковалентно приєднаним глікозидом імідазофеназину / В.М. Зозуля, Ю.П. Благой, І.Я. Дубей, О.Д. Федоряк, А.С. Щербакова, Д.M. Федоряк // Биополимеры и клетка. — 1998. — Т. 14, № 1. — С. 54-61. — Бібліогр.: 26 назв. — укр.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-154139
record_format	dspace
spelling	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1541392025-02-09T20:27:57Z Стабілізація дуплексних та триплексних комплексів оліготимідилату ковалентно приєднаним глікозидом імідазофеназину Стабилизация дуплексных и триплексных комплексов олиготимидилата ковалентно присоединенным гликозидом имидазофеназинаСтабилизация дуплексных и триплексных комплексов олиготимидилата ковалентно присоединенным гликозидом имидазофеназина Stabilization of duplex and triplex complexes of oligothymidylate by covalently linked imidazophenazine glycoside Зозуля, В.М. Благой, Ю.П. Дубей, І.Я. Федоряк, О.Д. Щербакова, О.С. Федоряк, Д.М. Структура и функции биополимеров Синтезовано декатимідилат, який містить на 3'-кінці нуклеозидне похідне імідазофеназину (Pzn). Вивчено вплив ковалентного приєднання барвника на формування комплементарних комплексів (dT)10 – дуплексу з (dA)15 та триплексів з (dA) 15 і poly(dA) ·poly(dT) – в буферних розчинах з нейтральним рН при двох значеннях іонної сили: : μ–0,1 та 1 М. Дослідження здійснювали методом термічної денатурації з використанням абсорбційної та флюоресцентної спектроскопії. Показано, шр залишок Pzn значно стабілізує утворені дуплексні та триплексні комплекси за рахунок інтеркаляції хромофору барвника в послідовності dA та dAdT. Температура плавлення комплексів зростала на 10–12 °С для дуплексних і на 15–20 °С для триплексних структур. Синтезирован декатимидилат, содержащий на 3'-конце нуклеозидное производное имидазофеназина (Pzn). Исследовано влияние ковалентного присоединения красителя на формирование комплементарных комплексов (dT)10 – дуплекса с (dA)15 и триплексов с (dA)15 и poly(dA)·poly(dT) – в буферных растворах с нейтральным рН при двух значениях ионной силы: μ – 0,1 и 1 М. Изучение проводили методом термической денатурации с использованием абсорбционной и флюоресцентной спектроскопии. Показано, что остаток Pzn сильно стабилизирует образующиеся дуплексные и триплексные комплексы за счет интеркаляции хромофора красителя в последовательности dA и dA · dT. Температура плавления комплексов возрастала на 10–12 °С для дуплексных и на 15–20 °С для триплексных структур. Стабилизирующее действие нейтрального имидазофеназина оказалось сравнимым по величине с тем, которое оказывают катионные интеркалирующие красители, присоединяемые к олигонуклеотидам через полиметиленовый линкер. Decathymidylate containing nucleoside derivative of imidazophenazine (Pzn) at the 3'-end was synthesized. The effect of dye covalent attachment on the formation of complementary complexes of (dT)10, namely duplex with (dA)15 and triplex with (dA)15 and poly(dA)·poly(dT), was studied in buffer solutions of neutral pH at ionic strength μ–0,1 and 1 M. Thermal denaturation method using absorption and fluorescence spectroscopy was employed. It has been shown that Pzn residue strongly stabilized duplex and triplex complexes by dye chromophore intercalation into dA and dA·dT sequences. Melting point of complexes increased for 10–12 °C for duplex and 15–20 °C for triplex structures. Stabilizing effect of neutral imidazophenazine was comparable to that of cationic intercalating dyes linked to oligonucleotides via polymethylene linker. 1998 Article Стабілізація дуплексних та триплексних комплексів оліготимідилату ковалентно приєднаним глікозидом імідазофеназину / В.М. Зозуля, Ю.П. Благой, І.Я. Дубей, О.Д. Федоряк, А.С. Щербакова, Д.M. Федоряк // Биополимеры и клетка. — 1998. — Т. 14, № 1. — С. 54-61. — Бібліогр.: 26 назв. — укр. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0004B9 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154139 uk Биополимеры и клетка application/pdf Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров
spellingShingle	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров Зозуля, В.М. Благой, Ю.П. Дубей, І.Я. Федоряк, О.Д. Щербакова, О.С. Федоряк, Д.М. Стабілізація дуплексних та триплексних комплексів оліготимідилату ковалентно приєднаним глікозидом імідазофеназину Биополимеры и клетка
description	Синтезовано декатимідилат, який містить на 3'-кінці нуклеозидне похідне імідазофеназину (Pzn). Вивчено вплив ковалентного приєднання барвника на формування комплементарних комплексів (dT)10 – дуплексу з (dA)15 та триплексів з (dA) 15 і poly(dA) ·poly(dT) – в буферних розчинах з нейтральним рН при двох значеннях іонної сили: : μ–0,1 та 1 М. Дослідження здійснювали методом термічної денатурації з використанням абсорбційної та флюоресцентної спектроскопії. Показано, шр залишок Pzn значно стабілізує утворені дуплексні та триплексні комплекси за рахунок інтеркаляції хромофору барвника в послідовності dA та dAdT. Температура плавлення комплексів зростала на 10–12 °С для дуплексних і на 15–20 °С для триплексних структур.
format	Article
author	Зозуля, В.М. Благой, Ю.П. Дубей, І.Я. Федоряк, О.Д. Щербакова, О.С. Федоряк, Д.М.
author_facet	Зозуля, В.М. Благой, Ю.П. Дубей, І.Я. Федоряк, О.Д. Щербакова, О.С. Федоряк, Д.М.
author_sort	Зозуля, В.М.
title	Стабілізація дуплексних та триплексних комплексів оліготимідилату ковалентно приєднаним глікозидом імідазофеназину
title_short	Стабілізація дуплексних та триплексних комплексів оліготимідилату ковалентно приєднаним глікозидом імідазофеназину
title_full	Стабілізація дуплексних та триплексних комплексів оліготимідилату ковалентно приєднаним глікозидом імідазофеназину
title_fullStr	Стабілізація дуплексних та триплексних комплексів оліготимідилату ковалентно приєднаним глікозидом імідазофеназину
title_full_unstemmed	Стабілізація дуплексних та триплексних комплексів оліготимідилату ковалентно приєднаним глікозидом імідазофеназину
title_sort	стабілізація дуплексних та триплексних комплексів оліготимідилату ковалентно приєднаним глікозидом імідазофеназину
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1998
topic_facet	Структура и функции биополимеров
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154139
citation_txt	Стабілізація дуплексних та триплексних комплексів оліготимідилату ковалентно приєднаним глікозидом імідазофеназину / В.М. Зозуля, Ю.П. Благой, І.Я. Дубей, О.Д. Федоряк, А.С. Щербакова, Д.M. Федоряк // Биополимеры и клетка. — 1998. — Т. 14, № 1. — С. 54-61. — Бібліогр.: 26 назв. — укр.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT zozulâvm stabílízacíâdupleksnihtatripleksnihkompleksívolígotimídilatukovalentnopriêdnanimglíkozidomímídazofenazinu AT blagoiûp stabílízacíâdupleksnihtatripleksnihkompleksívolígotimídilatukovalentnopriêdnanimglíkozidomímídazofenazinu AT dubeiíâ stabílízacíâdupleksnihtatripleksnihkompleksívolígotimídilatukovalentnopriêdnanimglíkozidomímídazofenazinu AT fedorâkod stabílízacíâdupleksnihtatripleksnihkompleksívolígotimídilatukovalentnopriêdnanimglíkozidomímídazofenazinu AT ŝerbakovaos stabílízacíâdupleksnihtatripleksnihkompleksívolígotimídilatukovalentnopriêdnanimglíkozidomímídazofenazinu AT fedorâkdm stabílízacíâdupleksnihtatripleksnihkompleksívolígotimídilatukovalentnopriêdnanimglíkozidomímídazofenazinu AT zozulâvm stabilizaciâdupleksnyhitripleksnyhkompleksovoligotimidilatakovalentnoprisoedinennymglikozidomimidazofenazinastabilizaciâdupleksnyhitripleksnyhkompleksovoligotimidilatakovalentnoprisoedinennymglikozidomimidazofenazina AT blagoiûp stabilizaciâdupleksnyhitripleksnyhkompleksovoligotimidilatakovalentnoprisoedinennymglikozidomimidazofenazinastabilizaciâdupleksnyhitripleksnyhkompleksovoligotimidilatakovalentnoprisoedinennymglikozidomimidazofenazina AT dubeiíâ stabilizaciâdupleksnyhitripleksnyhkompleksovoligotimidilatakovalentnoprisoedinennymglikozidomimidazofenazinastabilizaciâdupleksnyhitripleksnyhkompleksovoligotimidilatakovalentnoprisoedinennymglikozidomimidazofenazina AT fedorâkod stabilizaciâdupleksnyhitripleksnyhkompleksovoligotimidilatakovalentnoprisoedinennymglikozidomimidazofenazinastabilizaciâdupleksnyhitripleksnyhkompleksovoligotimidilatakovalentnoprisoedinennymglikozidomimidazofenazina AT ŝerbakovaos stabilizaciâdupleksnyhitripleksnyhkompleksovoligotimidilatakovalentnoprisoedinennymglikozidomimidazofenazinastabilizaciâdupleksnyhitripleksnyhkompleksovoligotimidilatakovalentnoprisoedinennymglikozidomimidazofenazina AT fedorâkdm stabilizaciâdupleksnyhitripleksnyhkompleksovoligotimidilatakovalentnoprisoedinennymglikozidomimidazofenazinastabilizaciâdupleksnyhitripleksnyhkompleksovoligotimidilatakovalentnoprisoedinennymglikozidomimidazofenazina AT zozulâvm stabilizationofduplexandtriplexcomplexesofoligothymidylatebycovalentlylinkedimidazophenazineglycoside AT blagoiûp stabilizationofduplexandtriplexcomplexesofoligothymidylatebycovalentlylinkedimidazophenazineglycoside AT dubeiíâ stabilizationofduplexandtriplexcomplexesofoligothymidylatebycovalentlylinkedimidazophenazineglycoside AT fedorâkod stabilizationofduplexandtriplexcomplexesofoligothymidylatebycovalentlylinkedimidazophenazineglycoside AT ŝerbakovaos stabilizationofduplexandtriplexcomplexesofoligothymidylatebycovalentlylinkedimidazophenazineglycoside AT fedorâkdm stabilizationofduplexandtriplexcomplexesofoligothymidylatebycovalentlylinkedimidazophenazineglycoside
first_indexed	2025-11-30T12:17:53Z
last_indexed	2025-11-30T12:17:53Z
_version_	1850217673409953792
fulltext	I S S N 0233-7657. Биополимеры и клетка. 1998. Т. 14. № 1 Стабілізація дуплексних та триплексних комплексів оліготимідилату ковалентно приєднаним глікозидом імідазофеназину В. М. Зозуля, Ю. П. Благой, І. Я. Дубей 1, О- Д. Федоряк1, А. С . Щербакова, Д. M. Федоряк1 Фізико-технічний інститут низьких температур їм. Б. І. Вєркіна НАН України 310164, Харків, г.р. Леніна, 47 Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України 253660, Київ, вул. Мурманська, 1 Синтезовано декатимідилат, який містить на З'-кінці нуклеозидне похідне імідазофеназину (Pzn). Вивчено вплив ковалентного приєднання барвника на формування комплементарних комплексів (dT)\o — дуплексу з (dA)is та триплексів з (dA)is і poly(dA)poly(dT) — в буферних розчинах з нейтральним рН при двох значеннях іонної сили: ju-0,1 та 1 М. Дослідження здійснювали методом термічної денатурації з використанням абсорбційної та флюоресцентної спектроскопії. Показано, шр залишок Pzn значно стабілізує утворені дуплексні та триплексні комплекси за рахунок інтеркаляції хромофору барвника в послідовності dA та dAdT. Температура плавлення комплексів зростала на 10—12 °С для дуплексних і на 15—20 °С для триплексних структур. Стабілізуюча дія нейтрального імідазофеназину виявилася порівнянною за величиною з тією, яку спричиняють катіонні інтеркалюючі барвники, котрі приєднані до олігонуклеотидів через полі- метиленовий лінкер. Вступ. За останні роки молекули багатьох сполук, таких як інтеркалятори, флюорофори, нуклеолі- тичні агенти, сполуки з фотореактивкими групами та ін., були ковалентно приєднані до олігонук леотидів [1—3] . Показано , що приєднані молекули інтеркалюючих барвників стабілізують дво- та три- спіральні комплекси олігонуклеотидів [ 4 — 1 3 ] . Так , катіонні похідні феназину (четвертинні солі), ковалентно приєднані до термінальної фосфатної групи антисенсових олігонуклеотидів, виявляють сильний стабілізуючий вплив на дуплекси [7, 8 ]. Звичайно модифікація здійснюється через полі- метиленовий лінкер постсинтетично. У нашій ро боті досліджено модифікацію олігонуклеотидів у процесі твердофазного синтезу запропонованим ра ніше [14] нуклеозидним похідним імідазофеназину (далі — феназин, Pzn) , приєднаним до 3 - к і н ц я олігонуклеотидного ланцюга через залишок рибози © В. М ЗОЗУЛЯ, Ю П БЛАГОЙ, І. Я. ДУБЕЙ, О Д. ФЕДОРЯК, А. <::. ШЕРЬАКОВА, Д. М. ФЕДОРЯК, 1998 (рис. 1). Ця нейтральна ліпофільна молекула по винна полегшувати проникнення олігонуклеотид- них кон'югатів через клітинні мембрани. Крім того, відомо, що 3 ' -модифікація посилює нуклеазну стійкість олігонуклеотидів [1 , 15] , що також важ ливо для антисенсової та антигенної технологій. Нарешті , флюоресцентні властивості Pzn дозволя ють використовувати його як репортерну групу для мічення олігонуклеотидів. Нами вивчено вплив такої модифікації оліго нуклеотидів на ефективність гібридизації у модель них системах. Методом термічної денатурації з використанням абсорбційної та флюоресцентної спектроскопії досліджено формування 3 - м о д и ф і кованим декатимідилатом ( ( d T ) 1 0 P z n дуплексу та триплексу з (dA) , 5 , а т а к о ж триплексу з po ly (dA) -po ly(dT) . Д л я встановлення стабілізуючої дії Pzn отримані результати порівнювали з даними для систем з немодифікованим ( d T ) 1 0 . Матеріали і методи. Всі немодифіковані та модифіковані олігонуклеотиди були синтезовані на 54 Рис. 1. Структура похідного феназину (/) та модифікованого декатимідилату ( / / ) синтезаторі Вікторія 6М (Новосибірськ, Росія) стандартним Н-фосфонатним твердофазним мето дом [16] . Носій для синтезу олігонуклеотидів, мо дифікованих глікозидом імідазофеназину (/, див. рис. 1) на З ' -кінці , отримали шляхом приєднання 5-О-монометокситритильного похідного N1 -/?-D- рибофуранозиду імідазо [4,5-Ь ]феназину [14] до амінопропільованого силікагелю Silochrom S-80 че рез сукцинатну лінкерну групу у відповідності з [17] . Після завершення синтезу олігонуклеотиди відділяли від полімерного носія і деблокували, об робляючи концентрованим N H 3 протягом ночі (при кімнатній температурі для оліготимідилату та при 50 °С для ( d A ) J 5 ) . Олігомери виділяли електрофо резом у 20 % - м у денатуруючому поліакриламід- ному гелі. Після елюції з гелю олігонуклеотиди знесолювали за допомогою гель-фільтрації на ко лонці PD-10 («РЬагтас іа» , Швец ія ) . Використову вали poly (dA) poly (dT) фірми «Sigma» (США) . Всі спектральні експерименти проводили в Na- какодилатному буфері на деіонізованій дистильо ваній воді (10 мМ, 0,5 мМ EDTA, рН 7) . До слідження здійснювали при іонній силі розчину JU = = 0,1 і /або /и = I М (для створення іонної сили додавали NaCl ) . Концентраці ї оліго- та полінук- леотидів визначали спектрофотометрично, викори- СТАБІЛІЗАШЯ КОМПЛЕКСІВ ОЛІГОТИМІДИЛАТУ ІМЩАЗОФЕНАЗИНОМ стовуючи наступні молярні коефіцієнти екстинкції (M'W 1): 9800 при 257 нм для ( d A ) I 5 , 8600 при 266 нм для ( d T ) l 0 (при 21—23 °С) [18] та 6500 при 260 нм для poly (dA)-poly (dT) . Концентрацію ( d T ) , 0 P z n розраховували по поглинанню феназино- вого залишку у видимій області спектра (див. «Результати і обговорення»). Профіл і термічної денатурац і ї отримували шляхом реєстрації температурних залежностей УФ поглинання нуклеотидів та інтенсивності флюорес- ценц і ї приєднаного б а р в н и к а . Флюоресценц ію збуджували при довжині хвилі 450 нм і реєст рували сигнал у максимумі спектра випроміню вання ( d T ) I 0 P z n (537 нм) . Абсорбційні криві плав лення визначали на спектрофотометрі SPECORD UV-VIS («Кагі Zeiss Jena», Ф Р Н ) , а флюоресцен- тні — на лабораторному спектрофлюориметрі з електронною системою рахування фотонів [19] . Ці прилади були приєднані до персонального ком п 'ютера для накопичення і обробки даних. Погли нання і флюоресценцію вимірювали в спеціальній кварцевій кюветі (об'єм 60 мкл , довжина оптично го шляху 0,2 см) . Кювету поміщали в мідний утримувач, температуру якого змінювали за допо могою елементу Пелтьє , керованого комп'ютером. Виміри здійснювали при швидкості нагрівання 0,5 °С /хв . Результати і обговорення . Похідні феназину відомі як ефективні стабілізатори комплементар них комплексів нуклеїнових кислот. Стратегія ко валентної модифікації олігонуклеотидів феназином звичайно базується на введенні аміноалкільної гру пи у відповідне положення синтетичного оліго- нуклеотиду з наступною реакцією попередньо де блокованого і очищеного функціоналізованого олі- гомеру з четвертинною сіллю феназинію [7, 8 ]. Реакція окислювального амінування проходить се лективно по положенню 2 інтеркалятора. Проте одержання олігонуклеотидних кон'югатів безпосе редньо в процесі твердофазною синтезу часто виг лядає вигіднішим, оскільки при цьому уникають трудомісткого постсинтетичного мічення і додатко вої стадії очистки кінцевого продукту. Раніше були запропонован і носії, модифікован і акридином, флюоресцеїном, холестерином, біотином та іншими молекулами для синтезу олігонуклеотидів, що містять ці ліганди на З ' -кінці олігомеру [1 , 2 ] . В нашій роботі для 3 ' -модифікації олігонуклеотидів у відповідності з такою стратегією був використаний носій на основі силікагелю, модифікований нейт ральним нуклеозидним похідним феназину (І) з використанням методів, звичайних для отримання нуклеозидвмісних полімерів [17] . На цьому носієві здійснено синтез ( d T ) 1 0 стандартним Н-фосфонат- 55 ЗОЗУЛЯ В. М. ГА IH. ним методом. В отриманому таким чином кон'югаті (dT) , 0 Pzn рибонуклеозид імідазофеназину приєд наний до 3 ' -кінця олігонуклеотидного ланцюга че рез фосфодісфірний зв ' язок , як звичайний нуклео- зид. Слід зазначити, що залишок Pzn у вигляді Н-фосфонату чи амідофосфіту нуклеозиду (І) може бути також введений у 5 ' -к інцеве чи будь-яке внутрішнє положення олігонуклеотидної послідов ності в процесі її твердофазного синтезу. Абсорбційні і флюоресцентні властивості віль ного Pzn опубліковані раніше [19, 2 0 ] . Спектр поглинання ( d T ) l 0 P z n є суперпозицією спектрів поглинання оліготимідилату і феназину ( р и с 2 ) . Максимум його УФ смуги поглинання займає се реднє положення між максимумами поглинання вільного феназину (262 нм) і декатимідилату (266 нм) . Спектр поглинання феназину у видимій області має одну смугу з максимумом при 384 нм (коефіцієнт екстинкції 22400 М"см" 1 ) . При кова лентному приєднанні феназину до 3 ' -кінця ( d T ) 1 0 він дещо змінюється (червоний зсув на 0,6 нм, г іпохромізм б л и з ь к о 5 % ) . Неструктурований спектр випромінювання вільного феназину має максимум при 543 нм. При приєднанні барвника до олігонуклеотиду він зсувається до 537 нм, а інтен- F, о. о. Р и с 2. Спектри поглинання і флюоресценції вільного феназину (Pzn, 7) , декатимідилату < ( d T ) 1 0 , 2) та модифікованого дека тимідилату ( ( d T ) \| 0 P z n , 3). Флюоресценцію збуджували при довжині хвилі 450 нм сивність флюоресценції падає (приблизно на ЗО % при 20 °С) (див. рис. 2 ) . К о м п л е к с о у т в о р е н н я ( d A ) , 5 з ( d T ) , 0 і ( d T ) 1 0 P z n досліджували в розчинах з молярним співвідношенням ниток 1:1 і 1:2 при двох значен нях /и = 0 , 1 та L Концентрація (dA) , 5 в усіх випад ках складала 7 мкМ. Зміни поглинання при 260 нм (А 2 6 0 ) з підвищенням температури подані на рис. З у відносних одиницях, що визначаються як (A t- \ ) I (AJQ-AQ) , де A t , AQ і Arj0 — значення поглинання при деякій температурі t, при 0 і 70 °С відповідно. Як видно з цього рисунку, приєднаний Pzn під вищує температуру плавлення утворених комп лексів при обох іонних силах розчину. Більшість отриманих кривих плавлення відхиляється від зви чайного 5-подібного вигляду, передбачуваного мо деллю двох станів. У нижній частині криві перехо ду сильно розтягнуті, і асоціація олігонуклеотидів у сумішах 1:1 при /и = 0 , 1 і в сумішах 1:2 при обох значеннях іонної сили не завершується при охолод женні до 0 °С. В останньому випадку також прояв ляється двофазність кривих переходів і їхній зсув у бік низьких т е м п е р а т у р відносно переходів в еквімолярних сумішах. Виняток складає крива плавлення для системи ( d A ) . 5 - 2 ( d T ) 1 0 при // = 0 , 1 , яка майже збігається з к р и в о ю п е р е х о д у д л я е к в і м о л я р н о ї с у м і ш і (d A) 1 5 - ( d T ) ! 0 . Можна припустити, що спостережені ефекти обумовлені утворенням поряд з дуплексни ми також і триплексних структур. З метою виділення ефектів триплексних фор мувань були проведені виміри поглинання при 284 нм ( А 2 8 4 ) , результати яких наведено на рис. 4. Як відомо [211, ця довжина хвилі відповідає ізо- бестичній точці УФ поглинання для переходу уот- сон-криківських пар у невпорядкований стан, і відповідно усі зміни поглинання визначаються роз ривом хугстинівських зв ' язк ів у триплексах. Було встановлено, що зміна А 2 8 4 для вільних ( d T ) , 0 , ( d A ) 1 5 і ( d T ) I 0 P z n у діапазоні температур 0—70 °С не перевищує 1 % , що знаходиться у межах похибки вимірів (даних не наведено). Як видно з рис. 4, при / . - 1 для еквімолярних систем ( d A ) , 5 - ( d T ) I 0 і ( d A ) , 5 - ( d T ) J 0 P z n спостерігається ріст А 2 8 4 приблизно на 3 % . Цей ефект може бути викликаний дисоціацією деякої кількості сформова них триплексних комплексів. Утворення триплексів добре проявляється у сумішах з молярним спів відношенням ниток 1:2. Навіть при 0,1 М N a + для системи ( d A ) , 5 - 2 ( d T ) , 0 спостерігається гіперхро- мізм у 2,5 % при підвищенні температури від 0 до 50 °С (див. р и с 4 ) . Приєднання Pzn збільшує його до 5 %. З підвищенням концентраці ї N a + до 1 М ефективність формування триплексів зростає, про 56 СТАБІЛІЗАЦІЯ КОМПЛЕКСІВ ОЛІГОТИМІДИЛАТУ ІМІДАЗОФЕНАЗИНОМ Рис. 3. Криві плавлення, отримані по поглинанню при 260 нм для систем: / — ( d A ) J 5 - ( d T ) 1 0 ; 2— ( d A ) ] 5 • ( d T ) I 0 P z n ; 3— ( d A ) 1 5 - 2 ( d T ) I 0 ; 4 — ( d A ) 1 5 - 2 ( d T ) , 0 P z n ; о — ^ - 0 Д M; б — fi - 1 M Рис. 4. Криві плавлення, отримані по поглинанню при 284 нм для систем: 1 — ( d A ) 1 5 • (dT) І 0 ; 2 — ( d A ) ! 5 • (dT) 1 0 P z n при ju~ - 1 M; З і З' — ( d A ) , 5 - ( d T ) , 0 ; 4 і 4' - ( d A ) 1 5 - 2 ( d T ) 1 0 P z n при /г — 0,1 і 1 М відповідно що свідчить 8 % - й ріст А 2 8 4 для сумішей з мо дифікованим і немодифікованим ( d T ) 1 0 . Темпера турні інтервали змін узгоджуються з положен ням низькотемпературних ф а з переходів для цих систем, які виявляються на кривих плавлення, отриманих при 260 нм (див. рис. 3) . З цього рисунку видно, що приєднання Pzn зсуває перехід триплекс — дуплекс у бік вищих температур при близно на 20 °С. Майже такий зсув помічено при підвищенні концентрації іонів Na від 0,1 до 1 М. Утворення дуплексів і триплексів у сумішах ( d A ) 1 5 з ( d T ) 1 0 P z n підтверджується також даними флюоресцентних вимірів. На рис. 5 показано тем пературну залежність нормалізованої інтенсивності флюоресценції (F) ( d T ) 1 0 P z n в 1:1 і 2:1 сумішах з (dA) , 5 . Виміри здійснювали при тих же концент раціях олігонуклеотидів та іонних силах розчинів, що і при абсорбційних вимірах кривих плавлення. Формування дуплексів і триплексів проявля ється в гасінні флюоресценції . При цьому макси мум спектра емісії зсувається в синю область спек тра на 2 нм. Ці спектральні зміни свідчать про інтеркаляцію хромофору барвника в поліаденіло- вий ланцюг, що спостерігалося нами при взаємодії вільного Pzn з poly(rA) [19 ] . Однак ефекти гасіння суттєво менші, ніж для вільного Pzn, для якого здійснюється більш ніж 10-кратне зниження ф л ю оресценції. Як видно з рис. .5, при 0 °С флюорес- ценція приєднаного Pzn гаситься в дуплексних комплексах приблизно в 4, а в триплексних — у 2 рази. При розведенні ланцюгів з підвищенням тем ператури інтенсивність флюоресценції збільшуєть ся і після повної дисоціації комплексів збігається з 57 ЗОЗУЛЯ В. М. ТА IH. 1 1 г 1 1 1 1 О 20 40 60 Т, °С Рис. 5. Залежність нормалізованої інтенсивності флюоресценції від температури для систем: ( d A ) 1 5 • ( d T ) 1 0 P z n ( / , Г) та ( d A ) I 5 ; 2 ( d T ) 1 0 P z n (2, 2 ' ) ; / і 2 — /< - 0,1 М; V і 2' — /и- 1 М. Суцільна лінія — зміна інтенсивності вільного (dT){ 0 Pzn від температури інтенсивністю вільного ( d T ) I 0 P z n . Остаточна ди соціація спостерігається при таких же температу рах, які визначені з абсорбційних кривих плавлен ня (див. р и с 3) . З використанням останніх, отриманих при 260 нм, побудовано криві переходів у невпорядко- ваний стан дуплексних комплексів (dA) , 5 - ( d T ) 1 0 і ( d A ) j 5 * ( d T ) I 0 P z n (рис. 6 ) . Долю АТ-пар ( в ) розра ховували за стандартною методикою, використову ючи лінійні базові лінії [ 22 ] . Д л я комплексу ( d A ) 1 5 - ( d T ) I 0 P z n переходи розраховували також за допомогою флюоресцентних кривих плавлення. У цьому випадку В виражає долю зв ' я заних олі- гомерів ( d T ) , 0 P z n (а не долю АТ-пар , як у попе редньому випадку) , що розраховувалася з рівняння Ф - Ф / 1 - 0 ) + Ф^Є, де Ф = F/F70 — нормовані на значення інтенсив ності флюоресценції при 70 °С експериментальні значення; Ф^ і Ф^ — аналогічним чином нормовані інтенсивності флюоресценції вільного і зв 'язаного ( d T ) I 0 P z n відповідно. Д л я Ф ,̂ приймали значення F/F10 при 0 ° С Ковалентно приєднаний Pzn суттєво підвищує термостабільність дуплексу ( d A ) 1 5 - ( d T ) 1 0 як при низькій, так і високій іонній силі розчину (див. рис. 6 ) , що виявляється в підвищенні температури плавлення (Т ш ) на 10—12 °С (таблиця) . Проте абсорбційні криві плавлення стають більш пологи ми, Флюоресцентні ж виміри дали крутіші перехо ди, які збігаються з абсорбційними л и ш е в кінці дисоціації комплексу. Ефекти однакові при обох іонних силах. Р ізниця абсорбційних і флюоресцентних кри вих плавлення може бути пояснена двома причина ми. По-перше, цей ефект може обумовлюватися присутністю триплексних комплексів , плавлення яких робить більший відносний внесок у зміну поглинання, ніж у зміну флюоресценції . По-друге, зміцнення феназином дуплексу л и ш е з одного його к інця може в и к л и к а т и зб ільшення населеності проміжних станів з частковим розривом водневих Рис. 6. Профілі термічної денатурації дуплексів: J — ( d A ) I 5 • ( d T ) I 0 та 2 — ( d A ) , 5 • ( d T ) j 0 P z n , отримані з абсорбційних вимірів; З — ( d A ) i 5 * (dT) j 0 Pzn — з флюоресцентних даних; а — ^ - ОД M; б — /л - 1 М 58 СТАБІЛІЗАЦІЯ КОМПЛЕКСІВ О ЛІГОТИ М1Д И Л АТУ ІМІДАЗОФЕНАЗИНОМ Температура плавлення (Тт) дуплексів, утворених (dT)w і (dT)ioPzn з (dA)is Д у п л е к с ( d A ) i 5 ' < d T ) i o ( d A ) i 5 ( d T ) i o P h z ( d A ) 1 5 ( d T ) i o ( d A ) i 5 ( d T ) i o P h z ОД 0,1 1,0 1,0 1 9 , 7 ± 0 , 2 2 9 , 2 ± 0 , 2 ( 3 1 , 4 ± 0 , 2 ) 3 4 , 2 ± 0 , 2 4 3 , 6 ± 0 , 2 (46 ,2±() ,2) У дужках наведені значення, отримані з флюоресцентних кривих плавлення, решта — з абсорбційних. зв 'язків в АТ-парах з другого к інця дуплексу» Ц я часткова дисоціація проявляється в зміні поглинан ня при 260 нм, а флюоресценція її «не відчуває», реєструючи процес повного розведення ланцюгів після відділення хромофору барвника. Стабілізуюча дія Pzn на дуплекс виявилася порівнянною з аналогічними ефектами, встановле н и м и д л я і н ш и х і н т е р к а л ю ю ч и х б а р в н и к і в , приєднаних до олігонуклеотиду через лінкер. Так , приєднання акридинового похідного до однонитко- вого декамеру A T збільшувало значення Тт його комплексу з комплементарною послідовністю в гені 32 м Р Н К на 11,5 °С [5 ] . Бромистий етидій, при єднаний до З ' -к інця ( d T ) n , підвищував Тт дуплек су ( d A ) t 4 ( d T ) n на 10 °С [10] . Досліджений ва ріант модифікації олігонуклеотиду нейтральним феназиновим барвником дає стабілізуючий ефект такий же , який встановлений для катіонного по хідного феназину , приєднаного через полімети- леновий ланцюжок до З ' -к інця гептамеру [7] (під вищення Тт на 10—12 °С). Д л я у т в о р е н н я т р и п л е к с н и х к о м п л е к с і в ( d A ) , 5 * 2 ( d T ) l 0 необхідна висока іонна сила розчи ну. При /* = 1 точка напівпереходу для нього зна ходиться в інтервалі 10—15 °С (див. рис. 4 ) . Дещо більше значення Тт (17,7 °С) було отримане Піл- чем та ін. [23 3 для близького до нашої системи ( d A ) , 0 - 2 ( d T ) l 0 , напевно , через р і зницю іонних умов (використовувалися розчини з 50 мМ MgCl 2 ) . Приєднаний Pzn збільшує значення Тт переходу триплекс — дуплекс приблизно на 20 °С (див. р и с 4) . Для порівняння: автори роботи [6 ] спостерігали збільшення значення Тт на ІЗ °С для триплексу, утвореного 11-мерною ТС-послідовністю при її 5 ' - модифікації акридиновим похідним. ( d T ) I 0 , мо дифікований феназином, здатний ефективно фор м у в а т и т р и п л е к с н у с т р у к т у р у т а к о ж і п р и Рис. 7. Абсорбційні криві плавлення для зразків (а) та за лежність нормалізованої інтенсивності флюоресценції від темпе ратури для системи (dT) 1 0 Pznpoly (dA) poiy(dT) (б): J — po- i y ( d A ) p o l y ( d T ) ; 2 — <dT) 1 0 poly(dA) p o l y ( d T ) та 3 — (dT) 1 0 Pznpo ly (dA)-po ly (dT) при p - 1 M; концентрації полі меру (в парах основ) та олігомерів (в залишках тиміну) однакові (200 мкМ) 59 ЗОЗУЛЯ в. М. ТА ш. фізіологічних іонних умовах. При JU-0,1 значення Тт для триплексу складає приблизно 13 °С (див. рис. 4) . Для того щоб прояснити особливості утворення триплексів між ( d T ) I 0 P z n і довгою двоспіральною А Т - п о с л і д о в н і с т ю , б у л о в и к о р и с т а н о po ly (dA) -poIy(dT). Еквімолярні суміші (200 мкМ А Т - пар полімеру і 200 мкМ тимінових основ оліго- мерів) були досліджені в буферних розчинах при JA: = 1. Абсорбційні криві плавлення записувалися в максимумі смуги поглинання тиміну (266 нм, рис. 7) . Перед нагріванням зразки витримували при початковій температурі (близько 0 °С) до 10 год. Отримані абсорбційні криві плавлення для обох досліджених систем демонструють два переходи, на в і д м і н у від м о н о ф а з н о г о п е р е х о д у д л я po ly (dA) -poly(dT) (рис. 7, а ) . Низькотемпературні переходи демонструють відокремлення ( d T ) j 0 P z n або ( d T ) ! 0 від дволанцюгового полінуклеотиду. При т е м п е р а т у р і 0 °С ф о р м у в а н н я т р и п л е к с у (dT), 0poiy(dA..) poly(dT) с неповним. Точка сере дини переходу знаходиться приблизно при 5 °С. Приєднаний Pzn підвищував Тт триплексу при близно на 15 °С. Флюоресцентні виміри підтвердили ф а к т утво рення триплексних комплексів ( d T ) J 0 P z n з ро- ly(dA) -poly(dT) . Це проявлялося в гасінні флюо ресценції ( d T ) , 0 P z n ( р и с 7, б) і короткохвильовому зсуві максимуму спектра емісії на 2 нм. Темпера турний інтервал, у якому відбувається зміна інтен сивності флюоресценції ( d T ) , 0 P z n , викликана взає модією з поліну клеотидом, збігається з інтервалом переходу, отриманим абсорбційними вимірами. Формування декатимідилатом триплексної струк тури з довгим полімером poly (dA) • poly (dT) від бувається менш ефективно, ніж з (dA) 1 5 . При концентрації компонентів суміші, в 3 рази більшій, ніж для системи ( d A ) J 5 * 2 ( d T ) 1 0 , точка напівпе- реходу з н а х о д и т ь с я при н и ж ч і й т е м п е р а т у р і (Тт ~ 5 °С). Приєднання Pzn також дає менший ріст Тт (приблизно на 15 °С) (див. р и с 7 ) , ніж для триплексу з ( d A ) ] 5 . Напевне, ця різниця обумовле на більшою жорсткістю двоспіральної структури poly (dA) poly (dT) порівняно з короткими послі довностями (dA) • (dT) [24 ]. Цікаво, що нахил абсорбційних кривих плав лення в середній точці для дуплексних і триплекс них комплексів, утворених ( d T ) , 0 P z n , виявився меншим, ніж для комплексів, утворених немо- дифікованим ( d T ) , 0 (див. р и с 6 і 7 ) . Аналогічний ефект (зменшення величини максимуму похідної кривої оптичного переходу) спостерігався також у випадку приєднання залишку дауноміцину для ду плексів [25] і акридинового похідного для трип лексів [6 ]. Можливо, така зміна абсорбційних кри вих плавлення викликана частковим розплетенням уотсон-криківських або хугстиновських пар з боку вільного від барвника к інця олігонуклеотиду за рахунок утворення напіввідкритих станів [26] . Таким чином, приєднання нуклеозидного по хідного імідазофеназину до 3 ' -фосфатної групи олі гонуклеотиду суттєво підвищує стабільність дуп лексів і триплексів. Стабілізуючий ефект при єднаного таким способом нейтрального феназину не менший, ніж вплив катіонних інтеркалюючих барвників, приєднаних через алкільний лінкер. Автори вдячні п. А. С Ш а л а м а ю за люб 'язно наданий зразок модифікованого полімеру. В. N. Зозуля, Ю. П. Благой, И. Я. Дубей, О. Д Федоряк, А. С. Щербакова, Д. М. Федоряк Стабилизация дуплексных и триплексных комплексов олиготимидилата ковалентно присоединенным гликозидом имидазофеназина Резюме Синтезирован декатимидилат, содержащий на 3'-конце нукле- озидное производное имидазофеназина (Pzn). Исследовано вли яние ковалентного присоединения красителя на формирование комплементарных комплексов (dT)]Q — дуплекса с (dA)l5 и триплексов с (dA)ls и poly(dA)-poly(dT) — в буферных рас творах с нейтральным рН при двух значениях ионной силы: /и - - 0 , / и 1 М. Изучение проводили методом термической денатурации с использованием абсорбционной и флюоресцент ной спектроскопии. Показано, что остаток Pzn сильно стаби лизирует образующиеся дуплексные и триплексные комплексы за счет интеркаляции хромофора красителя в последователь ности dA и dAdT. Температура плавления комплексов возра стала на 10—12 аС для дуплексных и на 15—20 °С для триплексных структур. Стабилизирующее действие нейт рального имидазофеназина оказалось сравнимым по величине с тем, которое оказывают катионные интеркалирующие краси тели, присоединяемые к олигонуклеотидам через полиметиле- новый линкер. У. N. Zozulya, Yu. P. Blagoi, I. Y. Dubey, O. D. Fedoryak, A. S. Shcherbakova, D. M. Fedoryak Stabilization of duplex and triplex complexes of oligothymidylate by covalently linked imidazophenazine glycoside Summary Decathymidylate containing nucleoside derivative of imidazophe nazine (Pzn) at the З'-end was synthesized. The effect of dye covalent attachment on the formation of complementary complexes of (dT)l0, namely duplex with (dA)xs and triplex with (dA)l5 and poly(dA)-poly(dT), was studied in buffer solutions of neutral pH at ionic strength ju-0,1 and 1 M. Thermal denaturation method using absorption and fluorescence spectroscopy was employed. It has been shown that Pzn residue strongly stabilized duplex and triplex complexes by dye chromophore intercalation into dA and dAdT sequences. Melting point of complexes increased for 10—12 °С for duplex and 15—20 °С for triplex structures. Stabilizing effect of 60 СТАБІЛІЗАЦІЯ КОМПЛЕКСІВ ОЛІГОТИМІДИЛАТУ ІМІДАЗОФЕНАЗИНОМ neutral imidazophenazine was comparable to that of cationic intercalating dyes linked ю oligonucleotides via polymethylene linker. СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ 1. Goodchild J. Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides: a review of their synthesis and properties / / Bioconjugate Chem. — 1 9 9 0 . — 1 , N 3 — P. 165—187. 2. Beaucage S. L.f Iyer R. P. The functionalization of oligo nucleotides via phosphoramidite derivatives / / Tetrahedron.— 1993.—49, N 10 .—P. 1925—1963 . 3. Tfiuong N. Т., Helene C. Sequence-specific recognition and modification of double-helical DNA by oligonucleotides / / Angew. Chem. (Int. Ed. Engl.) — 1 9 9 3 . — 3 2 , N 5 — P . 666— 690. 4. Asseline U.t Toulme F.t Thuong N. T. et at Oligodeoxy- nucleotides covalently linked to intercalating dyes as base sequence-specific ligands. Influence of dye attachment site / / EMBO J . — 1 9 8 4 . — 3 , N 4 .—P. 7 9 5 — 8 0 0 . 5. Toulme J. Krisch II. M.t Ixyreau N. et al. Specific inhibition of mRNA translation by complementary oligonucleotides cova lently linked to intercalating agents / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 1986 .—83 .—P. 1 2 2 7 — 1 2 3 1 . 6. Sun J-S., Francois J. C , Montenay-Garestier T. et al Sequence-specific intercalating agents: Intercalation at specific sequences on duplex DNA via major groove recognition by oligonucleotide-intercalator conjugates / / Ib id .—1989 .—86.— P. 9198—9202 . 7. Lokhov S. G., Podyminogin M. A., Sergeev D. S. et al. Synthesis and high stability of complementary complexes of N-(2-hydroxyethyl)phenazinium derivatives of oligonucleotides / / Bioconjugate C h e m . — 1 9 9 2 . — 3 , N 5 .—P. 4 1 4 — 4 1 9 . 8. Maltseva Т. V., Agback P., Repkova M. N. et al The solution structure of a З'-phenazinium (Pzn) tethered DNA-RNA duplex with a dangl ing adenosine: r (5 'GAUUGAA3' ) : - : D ( 5 T C A A T C 3 ' - P z n ) / / Nucl. Acids R e s . — 1 9 9 4 . — 2 2 , N 25 .—P. 5 5 9 0 — 5 5 9 9 . 9. Fox K. R. Formation of DNA triple helices incorporating blocks of G GC and T • AT triplets using short acridine-linked oligo nucleotides / / Ibid.—N 11 .—P. 2 0 1 6 — 2 0 2 1 . 10. Mergny Boutorine A. S., Garestier M. et al Fluores cence energy transfer as a probe for nucleic acid structures and sequences / / Ibid.—N 6.—P. 9 2 0 — 9 2 8 . 11. Orson F. M.t Kinsey В. M., McShan W. M. Linkage structures strongly influence the binding cooperativity of DNA inter- calators conjugated to triplex forming oligonucleotides / / Ibid.—N 3 .—P. 4 7 9 — 4 8 4 . 12. Miller P. S., Bi G.t Kipp S. A. et al Triplex formation by a psoralen-conjugaled oligodeoxyribonucleotide containing the base analog 8-oxo-adenin / / Ib id .—1996 .—24, N 4 . — P. 730—736 . 13. Marchand C, Bailly C., Nguyen С. H. et al Stabilization of triple helical DNA by a benzopyridoquinoxaline intercalator / / Biochemistry.—1996.—35, N 15 .—P. 5 0 2 2 — 5 0 3 2 . 14. Makitruk V. L., Yarmoluk S. N., Shalamay A. S., Alexeeva I. V. Oligonucleotides modified with phenazine derivatives / / Nucl. Acids Res. , Symp. Ser. — 1 9 9 1 . — N 24 .—P. 244. 15. Uhlmann E., Peyman A. Antisense oligonucleotides: a new therapeutic principle / / Chem. Rev .—1990 .—90 , N 4 .— P. 5 4 3 — 5 8 4 . 16. Froehler В. C , Ng P. G.t Matteucci M. D. Synthesis of DNA via deoxynucleoside H-phosphonate intermediates / / Nucl. Acids Res .—1986 .—14 , N 13 .—P. 5 3 9 9 — 5 4 0 7 . 17. Oligonucleotide synthesis: A practical approach / Ed. M. J. Gait.—Oxford: IRL press, 1984 .—218 p. 18. Cassani G. R., Solium F. J. Oligodeoxythymidylate: Poly- deoxyadenylate and oligodeoxyadenylate: Polydeoxythymidy- late interactions / / B iochemis try .—1969 .—8, N 1 0 . — P. 3928—3936 . 19. Zozulya V., Blagoi Yu., Lober G. et al. Fluorescence and binding properties of phenazine derivatives in complexes with polynucleotides of various base composition and secondary structure / / Biophys. C h e m . — 1 9 9 7 . — 6 5 . — P . 5 5 — 6 3 . 20. Благой Ю. П., Зозуля В. II., Волошин И. М. и др. Исследование взаимодействия производных феназина с Д Н К методом поляризованной флюоресценции / / Биопо лимеры и клетка.—1997.—13, № 1.—С. 22—29. 21 . Riley М., Moling В., Chamberlin M.-J. Physical and chemical characterization of two- and three stranded adenine-thymine and adenine-uracil nanopolymer complexes / / J. Мої. Biol.— 1966 .—20 .—P. 3 5 9 — 3 8 9 . 22. Martin F. H.t Uhlenbeck O. C.f Doty P. Self-complementary oligoribonucleotides: Adenylic acid-urilic acid block copolymers / / Ib id .—1971 .—57.—P. 2 0 1 — 2 1 5 . 23. Pilch D. S., Levenson C., Shafer R. H. Structural analysis of the ( d A ) 1 0 - 2 ( d T ) 1 0 triple helix / / Proc. Nat. Acad. Sci. U S A . — 1 9 9 0 . — 8 7 , N 5 .—P. 1942—1946 . 24. Burkhoff A. M.y Tullius T. D. Structural details of an adenine tract that does not cause DNA to bend / / Nature.—1988.— 3 3 1 , N 6155 .—P. 4 5 5 — 4 5 7 . 25. Родовикова Т. С, Зарытова В. Ф., Лохов С. F. и др. Синтез, структура и свойства рубомициновых производных моно- и олигонуклеотидов / / Биоорг. химия.—1990 .—16, № 10.—Р. 1369—1378 . 26. Говорун Д. М. Структурно-динамічна модель спонтанних напіврозкритих станів Д Н К / / Биополимеры и клетка.— 1997 .—13, № 1.—С. 3 9 — 4 5 . Надійшла до редакції 05.11.97

Стабілізація дуплексних та триплексних комплексів оліготимідилату ковалентно приєднаним глікозидом імідазофеназину

Institution

Ähnliche Einträge