Выделение специфической мРНК с помощью антисыворотки к белку р35 оболочки вируса осповакцины и картирование гена белка р35
Проведено иммунохимичеекое выделение специфической мРНК из клеток, инфицированных вирусом осповакцины (ВОВ), с помощью антисыворотки к белку р35 оболочки вириона. Показано, что кДНК, синтезированная на этой мРНК, специфически гибридизуется с геном, расположенным на левом плече HindIII А-фрагмента ви...
Saved in:
| Published in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Date: | 1990 |
| Main Authors: | , , , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1990
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154149 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Выделение специфической мРНК с помощью антисыворотки к белку р35 оболочки вируса осповакцины и картирование гена белка р35 / А.И. Муравлев, Н.А. Чикаев, Н.А. Нетесова, Н.В. Чешенко, А.Б. Беклемишев, Н.П. Мертвецов // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 6. — С. 83-89. — Бібліогр.: 21 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860125680206872576 |
|---|---|
| author | Муравлев, А.И. Чикаев, Н.А. Нетесова, Н.А. Чешенко, Н.В. Беклемишев, А.Б. Мертвецов, Н.П. |
| author_facet | Муравлев, А.И. Чикаев, Н.А. Нетесова, Н.А. Чешенко, Н.В. Беклемишев, А.Б. Мертвецов, Н.П. |
| citation_txt | Выделение специфической мРНК с помощью антисыворотки к белку р35 оболочки вируса осповакцины и картирование гена белка р35 / А.И. Муравлев, Н.А. Чикаев, Н.А. Нетесова, Н.В. Чешенко, А.Б. Беклемишев, Н.П. Мертвецов // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 6. — С. 83-89. — Бібліогр.: 21 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Биополимеры и клетка |
| description | Проведено иммунохимичеекое выделение специфической мРНК из клеток, инфицированных вирусом осповакцины (ВОВ), с помощью антисыворотки к белку р35 оболочки вириона. Показано, что кДНК, синтезированная на этой мРНК, специфически гибридизуется с геном, расположенным на левом плече HindIII А-фрагмента вирусной ДНК.
Проведено імунохімічне виділення специфічної мРНК з клітин, інфікованих вірусом осповакцини (ВОВ), за допомогою антисироватки до білка p35 оболонки віріона. Показано, що кДНК, синтезована на цій мРНК, специфічно гибрідизується з геном, розташованим на лівому плечі HindIII А-фрагмента вірусної ДНК.
An immunochemical isolation of a specific mRNA from vaccinia virus infected cells has been carried out using antiserum against the p35 protein of the virion envelope. The cDNA synthesized on this mRNA has been shown to hybridize specifically to the gene started at the distance of ~1150 base-pairs of the left end of the vaccinia virus DNA Hindlll A fragment. This gene encode a 26.200—Mr polypeptide. Treatment of the p2S protein with hitinase results in a decrease of its molecular weight to 28.5 kD. The gene mapped is supposed to encode the precursor of the vaccinia virus envelope glycoprotein p35.
|
| first_indexed | 2025-12-07T17:41:52Z |
| format | Article |
| fulltext |
11. Pro-oріотсlatiucortin gene: a mode l for n e g a t i v e r e g u l a t i o n of t r a n s c r i p t i o n by g l u - :
cocor t i co ids I J . Drou in , J . C h a r r o n , J . P . G a r n e r et al. / / J . Cell . B iochem.— 1987.—
35, N 4.— P. 293—304.
12. Down-regulation of g lucocor t i co id r ecep to r m R N A by g lucocor t i co id h o r m o n e s a n d '
r e cogn i t i on by the recep to r a specif ic b i n d i n g sequence wi th in the recep to r c D N A clo-
n e / S . Okre t , L. Poe l l i nge r , Y. D o n g , J.-A. G u s t a f s s o n / / Proc . Na t . Acad . Sci. U S A . —
1986,— 83, N 1 6 , — P . 5899—5903.
И і і-т цитологии и генетики Сиб. отд-ния А Н С С С Р , Плучено 10.05.90
Новосибирск
У Д К 578.821.51:578.5:577.217.33
А. И. Муравлев, Н. А. Чикаев, Н. А. Нетесова, Н. В. Чешенко,
А. Б. Беклемишев, Н. П. Мертвецов
ВЫДЕЛЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ мРНК
С ПОМОЩЬЮ АНТИСЫВОРОТКИ
К БЕЛКУ р35 ОБОЛОЧКИ ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ
И КАРТИРОВАНИЕ ГЕНА БЕЛКА р35
Проведено иммунохимичеекое выделение специфической мРНК из клеток, инфицирован-
ных вирусом осповакцины (ВОВ), с помощью антисыворотки к белку рЗо оболочки ви-
риона. Показано, что к ДНК, синтезированная на этой мРИК, специфически гибриди-
зуется с геном, расположенным на левом плече HindIII Л-фрагмента вирусной ДНК.
Введение. Вирус осповакцины (ВОВ) в настоящее время широко ис-
пользуется для экспрессии чужеродной генетической информации в эу-
кариотических клетках [1]. Актуальной в этой связи является пробле-
ма структурно-функционального исследования генома вируса и, в част-
ности, проблема картирования его структурных белков. Д л я ее решения
используют несколько довольно сложных и трудоемких методических
подходов. Это, прежде всего, гибридизационная селекция суммар-
ной вирусной м Р Н К на фрагментах геномной Д Н К BOB с последу-
ющим иммунохимическим анализом продуктов ее бесклеточной транс-
ляции [2—5] ; клонирование интересующих участков генома BOB в экс-
прессирующих бактериальных векторах и идентификация получаемых
при этом белковых вирусспецифических продуктов [6, 7] , а также им-
муиохимический скрининг экспрессирующих бактериальных «библио-.
тек» геномной вирусной Д Н К [8—10]. Несмотря па существенные раз-
личия, все эти подходы включают в себя использование либо моноспе-
цифических антисывороток, либо моноклональных антител к структур-
ным белкам ВОВ.
Ранее нами описано получение трех антисывороток к мажорному
белку оболочки BOB р35 [ l l ·] . Д а л е е с их помощью был проведен
иммуиопреципитациоиный анализ продуктов бесклеточной трансляции
суммарной вирусспецифической м Р Н К [12].
В данной работе осуществлено иммунохимичеекое выделение м Р Н К
с помощью одной из антисывороток к белку р35 оболочки вириона
BOB и проведен анализ локализации вирусного гена, гибридизующего-
ся с этой м Р Н К .
Материалы и методы. В р а б о т е использовали B O B ш т а м м а Л-ИВГІ , к у л ь т у р у кле-
ток CV-I (из коллекции Н П О «Вектор», Новосиб. обл . ) ; 125I меченный белок А из кле-
ток Siaphylococcus aureus с удельной активностью 2 - Ю 7 и м и - м и н - 1 - м к г - 1 , Р Н К - з а в и -
симую Д Н К - п о л и м е р а з у из вируса миелобластоза птиц (производство Н П О « В е к т о р » ,
Новосиб . обл . ) ; [ 3 2 P ] меченные н у к л е о з и д т р и ф о с ф а т ы с удельной а к т и в н о с т ь ю
IO5 Б Б к / м м о л ь ( П О « Р а д и о п р е п а р а т » , Т а ш к е н т ) ; э н д о н у к л е а з ы рестрикции (произ-
© А. И. МУРАВЛЕВ, Н. А. ЧИКАЕВ, Н. А. НЕТЕСОВА, Н. В. ЧЕШЕНКО,
А. Б. БЕКЛЕМИШЕВ, Н. П. МЕРТВЕЦОВ, 1990
ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1990. Т. 6. № б 6* 83
в о д с т в о Н П О «Фермент», Вильнюс) ; хптиназу (1,4-β- (2 -ацетамид-2-дезокси- / ) - глюко-
з и д ) г л и к а н о г и д р о л а з а ) с удельной активностью 2,5 е д / м г («S igma» , С Ш А ) . В а н а д и л р и -
б о н у к л е о з и д н ы е комплексы синтезированы и любезно предоставлены д л я этой ра -
боты И. А. Н а з а р е н к о (Новосиб. гос. ун-т) .
К у л ь т и в и р о в а н и е и очистка ВОВ, ф р а к ц и о н и р о в а н и е его белков, получение и ана-
лиз специфических антисывороток , методики э л е к т р о ф о р е з а белков и р а д и о и м м у н о а н а -
л и з а описаны ранее [11, 12].
Д л я выделения специфической м Р Н К осадок инфицированных клеток ресуспенди-
р о в а л и в б у ф е р е (0,25 M с а х а р о з а , 0,025 M трис-НСі , р Н 8,6; 0,05 M KCl, 0,005 M
M g C b , 0,01 M в а н а д и л р и б о н у к л е о з и д н ы е комплексы ( B P K ) , 1 % тритон X-100) , инку-
б и р о в а л и смесь 5 мин при 0 ° С и ц е н т р и ф у г и р о в а л и 15 мин при 3 000 g. К супернатан-
ту д о б а в л я л и KCl д о конечной концентрации 0,15 М, гепарин — до 1 мг/ 'мл и наслаи-
вали его на трехступенчатый градиент с а х а р о з ы следующего состава : 1-я ступень —
1,8 M с а х а р о з а , 0,025 M трис-HCl , р Н 8,6, 0,1 M KCl, 0,001 M M g C l 2 , 0,01 M В Р К ,
0,1 % тритон X-100; 2-я ступень — 1 M с а х а р о з а , 0,025 M трис-HCl , р Н 8,6, 0,1 M KCl,
0 ,005 M M g C l 2 , 0,01 M В Р К , 0,1 % тритон Х-100, 1 м г / м л гепарина , 1 /20 часть объе-
м а — а н т и с ы в о р о т к а ; 3-я ступень — 0,5 M с а х а р о з а , 0,025 M трис-HCl , р Н 8,6, 0,1 M
KCl, 0,005 M M g C l 2 , 0,01 M В Р К , 1 % тритон Х-100. Полученный градиент центрифу-
г и р о в а л и в течение 17 ч при 100 000 g при 4 °С. О с а д о к полисом р а с т в о р я л и в б у ф е р е
(0,01 M трис-HCl , р Н 8,6, 0 Л 5 M KaCl , 0,003 M M g C l 2 , 0,002 M В Р К , 0,1 % тритон
Х-100) и д о б а в л я л и к р а с т в о р у суспензию белок А - с е ф а р о з ы 4В. И н к у б и р о в а л и смесь в
течение 2 ч при 4 °С и постоянном перемешивании. После этого г р а н у л ы с е ф а р о з ы
о с а ж д а л и центрифугированием и п р о м ы в а л и их 3 р а з а по 15 мин буфером д л я раство-
рения полисом. Р Н К э л ю и р о в а л и буфером (0,2 M трис-HCl , р Н 7,2, 2 % DiS-Na, 0,02 M
Э Д Т А , 0,15 M N a C l ) . Э л ю а т д в а ж д ы о б р а б а т ы в а л и фенолом, н а с ы щ е н н ы м 0,1 M трис-
НСі , р Н 7,2. К водной ф а з е д о б а в л я л и т Р Н К до концентрации 20 м к г / м л и 2,5 о б ъ е м а
э т а н о л а . Полученный п р е п а р а т Р Н К еще 2 р а з а п е р е о с а ж д а л и э т а н о л о м и использова-
л и д л я синтеза [ 3 2 P ] меченной к Д Н К [13].
Геномную Д Н К B O B в ы д е л я л и из очищенного вируса экстракцией смесью фе-
н о л — х л о р о ф о р м [14]. [ 3 2 P ] меченную к Д Н К г и б р и д и з о в а л и с рестриктами вирусной
Д Н К , и м м о б и л и з о в а н н ы м и на н и т р о ц е л л ю л о з н о м ф и л ь т р е после р а з д е л е н и я их элек-
т р о ф о р е з о м в 0,6 %-ном агарозпом геле, а т а к ж е с к л о н и р о в а н н ы м и в п л а з м п д н о м век-
т о р е ф р а г м е н т а м и Д Н К B O B [13].
Ф р а г м е н т ы вирусной Д Н К к л о н и р о в а л и с т а н д а р т н ы м и методами , используя в р я д е
с л у ч а е в синтетические линкеры и а д а п т о р ы [13].
Б е л о к р35, выделенный электрофоретически из пластины п е л и а к р и л а м и д н о г о геля
[11] , о б р а б а т ы в а л и п р е п а р а т о м хитиназы в концентрации 1 м к г / м л в буфере (0,01 M
т р и с - H C l , р Н 9,0, 0,1 % I>S-;Na) при 20 °С в течение 1 ч. П е р е д внесением в реакцион-
н у ю смесь раствор х и т и н а з ы о б р а б а т ы в а л и в течение 5 мин 0,001 M д и и з о п р о п и л ф т о р -
ф о с ф а т о м ( Д Ф Ф ) .
Результаты и обсуждение. Ранее нами было показано, что из трех
антисывороток к белку р35 с продуктами бесклеточной трансляции
вирусной м Р Н К взаимодействует лишь антисыворотка АС35(ВЭМ) ,
причем преципитируемый ею полипептид имеет молекулярную массу
(м. м.) 27 000 [12]. Поэтому для получения специфической м Р Н К была
использована именно эта антисыворотка, а в качестве контроля — сы-
воротка пеиммунизированного кролика. м Р Н К выделяли из 2-Ю 8 кле-
ток CV-Jy взятых на 7-м ч инфекционного цикла. Поскольку все про-
цедуры осуществляли в присутствии ванадилрибоиуклеозидпых комп-
лексов, имеющих сильное поглощение при 260 им, количество выделен-
ной Р Н К не определяли. Половину ее использовали для синтеза
[32P] меченной к Д Н К . В случае Р Н К , выделенной с помощью
АС35 (ВЭМ), включение [3 2Р]ТТФ в к Д Н К составило ~ 3 · 1 0 5 имп/мин
(счет по Черенкову). В случае пеиммунной сыворотки включение ра-
диоактивной метки на уровне фона IO3 имп/мин).
Активности полученного [32P] меченного зонда оказалось доста-
точно для осуществления гибридизационного анализа Д Н К ВОВ. Из
данных рис. 1 видно, что к Д Н К гибридизуется только с HindIII Л-фраг-
мептом вирусной Д Н К , имеющим длину 45 тыс. нуклеотидиых
пар (п. п.).
84 ISSN 0233-7057. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. Н)90. Т. <i. J\o β
Ранее нами было показано, что вирусспецифическая м Р Н К , гиб
ридизующаяся с левым #m<i / / / -Sa /С/ -субфрагментом HindIII / !-фраг-
мента размером 2,5 тыс. п. о., направляет в белоксинтезирующей сис-
теме среди прочих синтез полипептида с м. м. ~ 27 ООО. Этот полипеп-
тид по электрофоретической подвижности совпадает с продуктом
трансляции суммарной вирусной мРНК, взаимодействующим с анти-
сывороткой АС35(ВЭМ) [15]. Синтез такого ж е полипептида, хотя и
Рис. 1. Г и б р и д и з а ц и я специфической [ 3 2 P ] меченной к Д Н К с HindIII-рестриктами Д Н К
B O B ш т а м м а Л - И В П : I—электрофореграмма HindIII-рестриктов; 2— р а д и о а в т о г р а ф
г и б р и д и з а ц и и
Fig·. 1. H y b r i d i z a t i o n of the specif ic [ 3 2 P ] - l a b e l l e d c D N A to vacc in ia D N A HindIII f r a g -
m e n t s ( s t r a in L — I V P ) . 1.— e l e c t r o p h o r e g r a m of H i n d i I I f r a g m e n t s ; 2j—autoradiogram
of t he h y b r i d i z a t i o n .
Рис . 2. Р е с т р и к ц и о н н ы е к а р т ы Д Н К B O B ш т а м м а W R [16] : / — к а р т а HindIII-фрагмен-
тов вирусной Д Н К ; 2 — к а р т а 5 ш С / - с у б ф р а г м е н т о в Я г т / / / / - Л - ф р а г м е н т а Д Н К В О В ;
3 — левый Hindi I I-A-Sal GI-фрагмент Д Н К B O B
F ig . 2. Res t r i c t i on m a p s of vacc in ia D N A ( s t r a in W R ) [16] 1.— the m a p of vacc in i a D N A
IfindIII f r a g m e n t s ; 2. — the m a p of S a l G I s u b f r a g m e n t s of the vacc in ia D N A HituIIII A-
f r a g m e n t ; 3.— the le f t HindIII A-SalGI f r a g m e n t of t h e vacc in ia DNA.
в гораздо меньшей степени, наблюдался на м Р Н К , гибридизующейся
с HindIII / ( -фрагментом Д Н К штамма Л - И В П , который идентичен
HindIII / -фрагменту штамма WR (данные не приведены). Первичная
с т р у к т у р а л е в о г о HindIII A-SalGI-фрагмепта Д Н К B O B о п у б л и к о в а -
на в литературе [16]. В этой структуре обнаружены три левопаправ-
леппые открытые рамки считывания, способные кодировать белки с
м. м. 9 000, 17 000, 26 000 (гены 9К, 17К, 26К соответственно), а т а к ж е
конец прокартированного ранее гена белка VP4b (рис. 2) . Мы пред-
положили, что ген 26К соответствует гену белка р35. Д л я проверки
этой гипотезы левый HindIII A-SalGI-фрагмеит субклонировали по
сайтам рестрикции SalGI-SstIf SаиЗA-XbaIf AccI-AccIf AccI-HindIIL
В результате в составе плазмиды pUC19 получены субфрагменты, со-
держащие участок гена белка VP4b (SalGI-SstI, плазмида pU4b)y
большую часть гена 91( с концевым участком гена белка VP4b (Sau3A-
XbaIy плазмида pU9K), ген 26К без первых 27 и. п. и с первыми 87 и. п,
гена 17К (AccI-AccI1 плазмида pU26K), ген 17К без первых 87 и. п.
(AccI-HindIII, плазмида pU17K) (рис. 2) . Все субфрагменты, а т а к ж е
ряд других фрагментов Д Н К BOB проверили па способность гибриди-
зоваться с [32P] меченной к Д Н К , синтезированной на индивидуальной
м Р Н К , выделенной с помощью антисыворотки АС35(ВЭМ) . В качестве
положительного контроля при этом использовали [р2Р] меченную к Д Н К ,
синтезированную на м Р Н К из суммарных полисом инфицированных
ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1990. Т. 6. № б 6* 8 5
клеток, не связавшихся с АС35(ВЭМ) в процессе выделения специфи-
ческой м Р Н К . Из данных, представленных на рис. 3, видно, что полу-
ченная специфическая к Д Н К гибридизуется только с фрагментом, со-
держащим ген 26КУ и в меньшей степени — с HindIII /(-фрагментом
Д Н К ВОВ. Отсутствие взаимодействия индивидуальной к Д Н К с сум-
марной вирусной Д Н К , по-видимому, объясняется очень низкой долен,
в ней одного гена (ген 26К составляет 1/250 часть длины генома). Д л я
того чтобы объяснить эти результаты, необходимо учесть также то, что
проведенный ранее транскрипционный анализ HindIII / ( -фрагмента
Рис 3. Гибридизации специфической (а) и с у м м а р н о й (б) [ 3 2 P ] меченных к Д Н К с
ф р а г м е н т а м и Д Н К B O B (штамм Л - И В Г І ) , к л о н и р о в а н н ы м и в п л а з м и д а х pBR322 и
pUCV;!; η — схема из несения ф р а г м е н т о в : 1 — Д Н К B O B (0,05 мкг ) ; 2 — правый HindIII-
A-SalGI-фрагмент (0,1 мкг ) ; 3 — п л а з м и д а pU26K (0,1 м к г ) ; 4 — п л а з м и д а pU9K
(0,1 мкг ) ; 5 — плазмида pU17K (0,1 мкг ) ; 6—плазмида pU4b (0,1 м к г ) ; 7—11 — внут-
ренние / ] (7шЯ/-субфрагменты HindIlI-A-фрагмента (по 0,1 мкг ) ; 12 — HindIII-1-фраг-
мент (0,1 м к г ) ; 13 — HindIII-L-фратмент (0,1 м к г ) ; 14 — п л а з м и д а pBR322 (0,1 м к г ) ;
15 — п л а з м и д а pUC19 (0,1 мкг ) ; 16 — HindIII-K-фрагмент
F ig . 3. H y b r i d i z a t i o n of spec i f ic (Л) a n d t o t a l (B) [ 3 2 P ] - l a b e l e d c D N A s to vacc in i a D N A
f r a g m e n t s c loned in pBR322 and pUC19 p l a s m i d s . C — the scheme of the DNA p a t t e r n s
a r r a n g e m e n t . 1.— vacc in ia D N A (0.05 μ £ ) ; 2.— right HindIII A-SalGl f r a g m e n t ; 3.—
pU26K (0.1 n g ) ; 4 — PU9K (0.1 j i g ) ; Ъ.— ρΌΠΚ (0.1 ^ig); 6 . — pU4b (0.1 μ g ) ; 7—11.—
in t e rna l BamHI s u b f r a g m e n t s of the HindIII Л - f r a g m e n t (0.1 μ g ) ; 12.— HindIII I f r a g -
m e n t (0.1 μβτ); 13,— HindIII L f r a g m e n t (0.1 μ g ) ; 1 4 . — p B R 3 2 2 (0 .1) ; 1 5 . — p U C 1 9
(0.1 μ g ) ; lb.—HindIII K f r a g m e n t (0.1 μ g ) .
(HindIII / -фрагмент по карте Д Н К штамма WR) не выявил в нем ка-
ких-либо генов, способных кодировать полипептид с м. м. ~ 27 000
[17]. Видимо, взаимодействие полученного зонда с этим фрагментом
связано со случайным частичным совпадением первичных структур
Д Н К , в то время как геном белка р35 является ген 26К, расположен-
ный на левом плече HindIII Л-фрагмента вирусной Д Н К . Д л я оконча-
тельного подтверждения данного факта в настоящее время проводится
клонирование гена 26К в экспрессирующем бактериальном векторе
(плазмиде pUR290) с целью иммунохимического анализа его белкового
продукта. Интересным представляется вопрос о том, каким образом
полипептид с м. м. 26 200 превращается в белок р35. Увеличение мо-
лекулярной массы могло бы быть связано с его гликозилированием,
поскольку известно, что белок р35 является гликопротеином [18].
В структуре полипептида, кодируемого геном с м. м. 26 000, обнаруже-
ны четыре потенциальных сайта N-гликозилирования [16]. Известно,
что в составе полисахаридных цепей гликопротеинов очень часто
встречаются остатки N-ацетилглюкозамина, связанные 1,4-р-гликозид-
ными связями. Одним из примеров такого гликопротеина является
овальбумин куриного яйца [19]. Гидролиз 1,4-Р-гликозидных связей
между остатками N-ацетилглюкозамина катализирует фермент хитина-
за (поли [1,4-β- (2-ацетамид-2-дезокси-/)-глюкозид) ] гликаиогидролаза) .
Мы обработали этим ферментом белок р35, выделенный электрофоре-
тически, для частичного его дегликозилирования. Н а рис. 4 видно, что
такая обработка приводит к уменьшению кажущейся м. м. белка р35
до 28 500.
86 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1990. Т. 6. № б 6* 86
Аналогичное изменение происходит и с овальбумином. Полученные
данные подтверждают тот факт, что предшественником белка р35 обо-
лочки вириона BOB является полипептид с м. м. 27 000 [12] и что его
геном может являться ген 26К, находящийся на левом плече HindIII
Л-фрагмента Д Н К ВОВ.
В то время как данная работа была практически завершена, в ли-
тературе появилась статья, авторы которой картировали ген белка р35
оболочки BOB штамма IHD в HindIII / / -фрагменте геномной Д Н К
(.HindIII / -фрагмент по карте Д Н К штамма Л - И В П ) [20]. Однако
Рис . 4. Э л е к т р о ф о р е г р а м м а белко-
вых п р е п а р а т о в : 1 — м а р к е р ы мо-
л е к у л я р н о й массы (45 ООО, оваль-
б у м и н ) ; 2 — с у м м а р н ы е белки ви-
риона ВОВ; «9 — 0,2 мкг п р е п а р а т а
х и т и н а з ы ; 4 — овальбумин , обра-
б о т а н н ы й хитиназой; 5 — электро-
форетически выделенный белок
р35 оболочки В О В ; 6 — белок р35,
о б р а б о т а н н ы й хитиназой
F ig . 4. E l e c t r o p h o r e s i s of p ro te in
p a t t e r n s . 1.— m o l c c u l a r w e i g h t m a r -
k e r s ( 4 5 k D - o v a l b u m i n ) ; 2.— vacci-
n ia v i r u s t o t a l p ro t e in s ; 3.— 0.2 [ig
of h y t i n a s e ; 4.— h y t i n a s e t r e a t e d
o v a l b u m i n ; 5,— e jec l rophore i icaMv
pu r i f i ed vacc in ia enve lope p ro te in
p35; 6.— h y t i n a s e t r e a t e d p ro te in
p35.
представленные авторами результаты не являются бесспорными. Во-
первых, для идентификации соответствующего продукта бесклеточной
трансляции они использовали антисыворотку к оболочке BOB штамма
IHD, в состав которой входит не только белок р35. Во-вторых, авто-
рами не показано, что выявленный ими с помощью этой антисыворотки
продукт бесклеточной трансляции точно совпадает по электрофорети-
ческой подвижности с вирионным белком р35. Это совершенно необ-
ходимо было сделать в случае немоноспецифической сыворотки. Кроме
того, в более ранней работе других авторов [21] продемонстрировано,
что тому ж е участку HindIII / / -фрагмента вирусной Д Н К соответст-
вует продукт бесклеточной трансляции, имеющий аномальную элект-
рофоретическую подвижность на уровне белка с м. м. 40 000, а
не 35 000.
В связи с этим опубликованные упомянутыми авторами данные
[20], по-видимому, нуждаются в дополнительном и более глубоком
экспериментальном анализе с учетом полученных нами результатов.
Таким образом, в данной работе проведено иммунохимичеекое вы-
деление м Р Н К с помощью антисыворотки к № 4 0 - ф р а к ц и и ВЭМ. По-
казано, что к Д Н К , синтезированная на этой м Р Н К , специфически гиб-
ридизуется с геном, находящимся на левом плече HindIII Л-фрагмента
вирусной Д Н К .
Этот ген кодирует полипептид с расчетной м. м. 26 200, который,
по-видимому, является предшественником гликопротеина оболочки
вириона BOB р35.
Авторы выражают признательность за ценные методические ре-
комендации И. А. Рязанкину и П. А. Белавину, а также О. И. Рязан-
киной — за предоставление клонированных HindIII / , / С и / .-фрагмен-
тов Д Н К ВОВ.
86 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1990. Т. 6. № б 6* 87
ISOLATION OF S P E C I F I C mRNA USING A N T I S E R U M AGAINST THE P 3 5 P R O T E I N
O F VACCINIA VIRUS E N V E L O P E AND M A P P I N G OF THE P 3 5 P R O T E I N GENE
А. I. Muravlev, N. A. Chikaev, N. A. Netesova, Ν. V. Cheshenko,
A. B. Beklemishev , N. P. Mertvetzov
АН-Union Sesearch Inst i tute of Molecular Biology,
Koltsovo, Novosibirsk region
S u m т а г у
An immunochemical isolation of a specific mRNA from vaccinia virus infected cells has
been carried out us ing ant iserum agains t the p35 protein of the virion envelope. The
cDNA synthesized on this mRNA has been shown to hybridize specifically to the gene
started at the distance of ~ 1 1 5 0 base-pairs of the left end of the vaccinia virus DNA
HindII I A f ragment . This gene encode a 26.200—M r polypeptide. Treatment of the p3 5
protein with hit inase results in a decrease of its molecular weight to 28.5 kD. The
gene mapped is supposed to encode the precursor of the vaccinia virus envelope
glycoprotein p35 .
С П И С О К Л И Т Е Р А Т У Р Ы
1. Mackett M., Smith G. L. Vaccinia virus expression vectors // J. Gen. Virol.— 1986 —
67, N 10.—P. 2067—2082.
2. Wittek R., Hanggi M., Hiller G. Mapping of a gene coding for a ma jo r late s t ructural
polypeptide on the vaccinia vi rus g e n o m e / / J . Virol.— 1984.— 49, N 2.— P. 371—378.
3. Wittek R., Richner B., Hiller G. Mapp ing of the genes coding for the two ma jo r vac-
cinia virus core polypeptides / / Nucl. Acids Res.—1984.— 12, N 12.—P. 4835—
4848.
4. Rosel JMoss B. Transcript ional and t ransia t ional mapp ing and nucleotide sequence
analys is of a vaccinia virus gene encoding the precursor of the ma jo r core polypeptide
4b // J. Virol.— 1985,— 56, N 3 . — P . 830—838.
5. Hirt P., Hiller G., Wittek R. Localization and fine s tructure of a vaccinia virus gene
encoding an envelope ant igen // Ibid.— 1986.—58, N 3 , — P . 757—764.
6. Weir /. P., Moss B. Use of a bacterial expression vector to identif i ty the gene
encoding a ma jo r core protein of vaccinia virus // Ibid.— 1985.— 56, N 2. — P.
534—540.
7. Niles E. G., Seto I. Vaccinia virus gene D8 encodes a virion t r ansmembrane protein //
Ibid.— 1988 — 62, N 10,—P. 3772—3778.
8. Maa J.-S., Esteban M. S t ructura l and functional studies of a 39,OOO-Mr immunodomi-
nant protein of vaccinia v i r u s / / I b i d — 1987,—61, N 12,—P. 3910—3919.
9. Rodriguez J. F., Esteban M. Mapp ing and nucleotide sequence of the vaccinia virus
gene that encodes a 14-kilodalton fussion p ro t e in / / Ib id .— N 11.— P. 3550—3554.
10. Rodriguez J. F., Kahn J. S. Moiecuiar cloning, encoding sequence and expression of
vaccinia virus nucleic acid-dependent nucleoside t r iphosphatase g e n e / / P r o c . Nat.
Acad. Sci. USA.— 1986.—83, N 24 — P. 9566—9570.
11. Муравлев А. И., Порываева Β. Α., Решетников С. С. Изучение антигенных свойств
белка р35 вируса осповакцины в составе различных белковых фракции вириона с
помощью моиоспецифичных антисывороток / / Молекуляр. генетика.— 1989.— № 9.—
С. 3—7.
12. Анализ структурных белков и продуктов бесклеточнои трансляции м Р Н К вируса
осповакцины с помощью моноспецифических антисывороток / А. И. Муравлев,
Н. А. Нетесова, В. Я. Тихонов, Э. Г. М а л ы г и н / / Т а м ж е , — № 10,—С. 19—24.
13. Маниатис TФрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование.— М. : Мир,
1984,— 480 с.
14. Cabrera С. VEsteban М. Procedure for purification of intact DNA from vaccinia
v i r u s / / J . Virol.— 1978,— 25, N 1 — P. 442—445.
15. Иммунохимический анализ продуктов трансляции мРНК, гнбридизующейся с левым
HindIII А -ои/-фрагмсптом Д Н К вируса осповакцины / Н. А. Нетесова, А. И. Мурав-
лев, Н. В. Чешенко и д р . / / М о л е к у л я р . генетика.— 1989.— № 11.— С. 21—23.
16. Weinrich S., Hruby D. Е. A tandemlv-oriented late gene cluster within the vaccinia
virus g e n o m e / / N u c l . Acids Res.— 1986— 14, N 7 . — P . 3003—3016.
17. Bajszar G., Wittek R., Moss B. Vaccinia virus thymidine kinase and neighbor ing ge-
nes: mRNAs and polypeptides of wild type virus and putat ive nonsense m u t a n t s / /
J. Virol.— 1983.—45, N 1,—P. 62—72.
18. Boisvert JYamamolo T. Purif icat ion and location of the ma jo r glycoprotein of vac-
cinia virus / /Microbios — 1976,— 16, N 43 .—P. 55—72.
19. Lee Y. C., Scoea J. R. A common structural unit in asparagine-ol igosaechar ides of se-
veral glycoproteins from different sources / / J . Biol. Chem.— 1972.— 247, N 18.—
P. 5753—5758.
20. Gordon /., Kovala T., Dales S. Molecular characterizat ion of a prominent ant igen of
the vaccinia virus enve lope / /Vi ro logy .— 1988.— 167, N 2 . — P . 361—369.
88 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1990. Т. 6. № б 6* 88
21. Conserved T A A A T G sequence at the t r a n s c r i p t i o n a l and t r a n s l a t i o n a l in i t i a t ion s i tes
of vacc in ia v i r u s l a te g e n e s dcduced by s t r u c t u r a l and f u n c t i o n a l a n a l y s i s of the
HindIII H g e n o m e f r a g m e n t / J. L. Rosel , P . L. Ea r l , J . P . Weir , B. M o s s / / J . Vi ro l .—
1986 ,—60 , N 2 , — P . 436—449.
В Н И И молекуляр . биологии Н П О «Вектор» П о л у ч е н о 11.03.90
М и н м е д п р о м а С С С Р , пос. К о л ь ц о в о Новосиб . обл.
Ин-т м о л е к у л я р . биологии и биохимии А Н К а з С С Р ,
А л м а - А т а
Ин-т биоорг. химии Сиб. отд-ния А Н С С С Р ,
Новосибирск
УДК 577.391
А. И. Медведев, Г. И. Ревина
КИСЛЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ КАК ИНГИБИТОРЫ РЕПАРАЦИИ
ДВУНИТЕВЫХ РАЗРЫВОВ ДНК
Показана способность полипептидов, состоящих из аспарагиновой и глутаминовой
кислот, ингибировать репарацию двунитевых разрывов ДНК, вызванных у-облучением
клеток HeLa и китайского хомячка. Полное ингибирование репарации наблюдалось при
концентрациях 20 (полиглу τ а мат, молекулярная масса 2 000—12 000) и 100 мкмоль/л
(аспартилглутамат, 1500—4 500). Оба полипептида в указанных концентрациях мало-
токсичны, действие ингибиторов обратимо.
Введение. Ингибиторы репарации разрывов Д Н К применяются в ра-
диобиологии, цитологии, прикладной онкологии для выяснения меха-
низма определения эффективности действия физических и химических
факторов, оказывающих летальное и мутагенное действие на клетки,
а также для усиления действия ионизирующего облучения при радио-
терапии опухолей. Описано использование ингибиторов разной хими-
ческой природы, вызывающих полное подавление восстановления дву-
нитевых разрывов (ДР) Д Н К в клетках эукариот, индуцированных
воздействием облучения. Такой эффект вызывают ЭДТА в концентра-
ции 5 000—10 000 мкмоль/л и специфический ингибитор ДНК-полиме-
раз 9-арабинофуранозиладенин (400 мкмоль/л) [1, 2].
В настоящей работе описываются свойства нового класса ингиби-
торов, отличающегося по химической природе от известных,— кислых
а-полипептпдов, также вызывающих полное ингибирование восстанов-
ления индуцированных γ-облучением Д Р Д Н К в клетках млекопита-
ющих в существенно меньших концентрациях и обладающих меньшей
токсичностью [3].
М а т е р и а л ы и методы. В р а б о т е исследовали д в а синтетических а н а л о г а природ-
ного м о д и ф и к а т о р а [4] р а д и а ц и о н н о г о мутагенеза — а с п а р т и л г л у т а м а т (АГ) со сред-
нечисленной м о л е к у л я р н о й массой (м. м.) 2 365 и п о л и г л у т а м а т ( П Г ) со среднечислен-
ной м.м. 3 953. П о л и п е п т и д А Г (м. м. 1 500—3 500) получали согласно р а н е е описан-
ной методике [4] , м. м. коммерческого («Fer rak» , З а п а д н ы й Б е р л и н ) п р е п а р а т а П Г
с о с т а в л я л а 2 000—15 000.
В экспериментах использовали монослойную к у л ь т у р у д в у х д н е в н ы х клеток китай-
ского хомячка клопов 237, 431 и клеток HeLa, к о т о р ы е к у л ь т и в и р о в а л и на среде И г л а
с д о б а в л е н и е м 10 % сыворотки крупного рогатого скота . С р а з у после посева клеток
в среду вводили [ 3 Н ] т и м и д и н (18,5 к Б к / м л ) на сутки. З а 16 ч д о начала эксперимента
среду с меченым тимидином сливали , клетки п р о м ы в а л и средой Э р л а и и н к у б и р о в а л и
в среде с сывороткой .
И с с л е д о в а н и е ингибирования п р о т е к а ю щ е й р е п а р а ц и и Д Р Д Н К проводили сог-
ласно методике [5] . К л е т к и о т м ы в а л и физиологическим р а с т в о р о м и инкубировали в
р а с т в о р а х полипептидов с у к а з а н н ы м и д а л е е концентрациями , об луча ли при мощности
д о з ы 3,6 Гр/мин (Со 6 0 ) при т е м п е р а т у р е 37 или 4 °С. П о с л е п р е к р а щ е н и я облучения ,
о б р а б о т к и полипептидом или одновременной обработки полипептидами и облучения
© А. И. МЕДВЕДЕВ, Г. И. РЕВИНА, 1990
ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1990. Т. 6. № б 6* 89
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-154149 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7657 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T17:41:52Z |
| publishDate | 1990 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Муравлев, А.И. Чикаев, Н.А. Нетесова, Н.А. Чешенко, Н.В. Беклемишев, А.Б. Мертвецов, Н.П. 2019-06-15T08:55:36Z 2019-06-15T08:55:36Z 1990 Выделение специфической мРНК с помощью антисыворотки к белку р35 оболочки вируса осповакцины и картирование гена белка р35 / А.И. Муравлев, Н.А. Чикаев, Н.А. Нетесова, Н.В. Чешенко, А.Б. Беклемишев, Н.П. Мертвецов // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 6. — С. 83-89. — Бібліогр.: 21 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0002A6 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154149 578.821.51:578.5:577.217.33 Проведено иммунохимичеекое выделение специфической мРНК из клеток, инфицированных вирусом осповакцины (ВОВ), с помощью антисыворотки к белку р35 оболочки вириона. Показано, что кДНК, синтезированная на этой мРНК, специфически гибридизуется с геном, расположенным на левом плече HindIII А-фрагмента вирусной ДНК. Проведено імунохімічне виділення специфічної мРНК з клітин, інфікованих вірусом осповакцини (ВОВ), за допомогою антисироватки до білка p35 оболонки віріона. Показано, що кДНК, синтезована на цій мРНК, специфічно гибрідизується з геном, розташованим на лівому плечі HindIII А-фрагмента вірусної ДНК. An immunochemical isolation of a specific mRNA from vaccinia virus infected cells has been carried out using antiserum against the p35 protein of the virion envelope. The cDNA synthesized on this mRNA has been shown to hybridize specifically to the gene started at the distance of ~1150 base-pairs of the left end of the vaccinia virus DNA Hindlll A fragment. This gene encode a 26.200—Mr polypeptide. Treatment of the p2S protein with hitinase results in a decrease of its molecular weight to 28.5 kD. The gene mapped is supposed to encode the precursor of the vaccinia virus envelope glycoprotein p35. Авторы выражают признательность за ценные методические рекомендации И. А. Рязанкину и П. А. Белавину, а также О. И. Рязанкиной — за предоставление клонированных HindIII /,/С и /.-фрагментов ДН К ВОВ. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Структура и функции биополимеров Выделение специфической мРНК с помощью антисыворотки к белку р35 оболочки вируса осповакцины и картирование гена белка р35 Виділення специфічної мРНК за допомогою антисироватки до білка р35 оболонки вірусу осповакцини та картування гена білка р35 Isolation of specific mRNA using antiserum against the p35 protein of vaccinia virus envelope and mapping of the p35 protein gene Article published earlier |
| spellingShingle | Выделение специфической мРНК с помощью антисыворотки к белку р35 оболочки вируса осповакцины и картирование гена белка р35 Муравлев, А.И. Чикаев, Н.А. Нетесова, Н.А. Чешенко, Н.В. Беклемишев, А.Б. Мертвецов, Н.П. Структура и функции биополимеров |
| title | Выделение специфической мРНК с помощью антисыворотки к белку р35 оболочки вируса осповакцины и картирование гена белка р35 |
| title_alt | Виділення специфічної мРНК за допомогою антисироватки до білка р35 оболонки вірусу осповакцини та картування гена білка р35 Isolation of specific mRNA using antiserum against the p35 protein of vaccinia virus envelope and mapping of the p35 protein gene |
| title_full | Выделение специфической мРНК с помощью антисыворотки к белку р35 оболочки вируса осповакцины и картирование гена белка р35 |
| title_fullStr | Выделение специфической мРНК с помощью антисыворотки к белку р35 оболочки вируса осповакцины и картирование гена белка р35 |
| title_full_unstemmed | Выделение специфической мРНК с помощью антисыворотки к белку р35 оболочки вируса осповакцины и картирование гена белка р35 |
| title_short | Выделение специфической мРНК с помощью антисыворотки к белку р35 оболочки вируса осповакцины и картирование гена белка р35 |
| title_sort | выделение специфической мрнк с помощью антисыворотки к белку р35 оболочки вируса осповакцины и картирование гена белка р35 |
| topic | Структура и функции биополимеров |
| topic_facet | Структура и функции биополимеров |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154149 |
| work_keys_str_mv | AT muravlevai vydeleniespecifičeskoimrnkspomoŝʹûantisyvorotkikbelkur35oboločkivirusaospovakcinyikartirovaniegenabelkar35 AT čikaevna vydeleniespecifičeskoimrnkspomoŝʹûantisyvorotkikbelkur35oboločkivirusaospovakcinyikartirovaniegenabelkar35 AT netesovana vydeleniespecifičeskoimrnkspomoŝʹûantisyvorotkikbelkur35oboločkivirusaospovakcinyikartirovaniegenabelkar35 AT češenkonv vydeleniespecifičeskoimrnkspomoŝʹûantisyvorotkikbelkur35oboločkivirusaospovakcinyikartirovaniegenabelkar35 AT beklemiševab vydeleniespecifičeskoimrnkspomoŝʹûantisyvorotkikbelkur35oboločkivirusaospovakcinyikartirovaniegenabelkar35 AT mertvecovnp vydeleniespecifičeskoimrnkspomoŝʹûantisyvorotkikbelkur35oboločkivirusaospovakcinyikartirovaniegenabelkar35 AT muravlevai vidílennâspecifíčnoímrnkzadopomogoûantisirovatkidobílkar35obolonkivírusuospovakcinitakartuvannâgenabílkar35 AT čikaevna vidílennâspecifíčnoímrnkzadopomogoûantisirovatkidobílkar35obolonkivírusuospovakcinitakartuvannâgenabílkar35 AT netesovana vidílennâspecifíčnoímrnkzadopomogoûantisirovatkidobílkar35obolonkivírusuospovakcinitakartuvannâgenabílkar35 AT češenkonv vidílennâspecifíčnoímrnkzadopomogoûantisirovatkidobílkar35obolonkivírusuospovakcinitakartuvannâgenabílkar35 AT beklemiševab vidílennâspecifíčnoímrnkzadopomogoûantisirovatkidobílkar35obolonkivírusuospovakcinitakartuvannâgenabílkar35 AT mertvecovnp vidílennâspecifíčnoímrnkzadopomogoûantisirovatkidobílkar35obolonkivírusuospovakcinitakartuvannâgenabílkar35 AT muravlevai isolationofspecificmrnausingantiserumagainstthep35proteinofvacciniavirusenvelopeandmappingofthep35proteingene AT čikaevna isolationofspecificmrnausingantiserumagainstthep35proteinofvacciniavirusenvelopeandmappingofthep35proteingene AT netesovana isolationofspecificmrnausingantiserumagainstthep35proteinofvacciniavirusenvelopeandmappingofthep35proteingene AT češenkonv isolationofspecificmrnausingantiserumagainstthep35proteinofvacciniavirusenvelopeandmappingofthep35proteingene AT beklemiševab isolationofspecificmrnausingantiserumagainstthep35proteinofvacciniavirusenvelopeandmappingofthep35proteingene AT mertvecovnp isolationofspecificmrnausingantiserumagainstthep35proteinofvacciniavirusenvelopeandmappingofthep35proteingene |