Количественная оценка индуцированных межнитчатых сшивок ДНК в наномолярном интервале
При ренатурации препарата модифицированной ДНК животного происхождения полностью восстанавливается структура дуплекса после тепловой денатурации, если число межнитчатых сшивок (МС) составляет ≥1 на фрагмент ДНК Уменьшение числа сшивок до величины менее одной МС на фрагмент приводит к пропорционально...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Дата: | 1996 |
| Автор: | |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Російська |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1996
|
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154176 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Количественная оценка индуцированных межнитчатых сшивок ДНК в наномолярном интервале / А.В. Шугалий // Биополимеры и клетка. — 1996. — Т. 12, № 5. — С. 34-37. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860030818351579136 |
|---|---|
| author | Шугалий, А.В. |
| author_facet | Шугалий, А.В. |
| citation_txt | Количественная оценка индуцированных межнитчатых сшивок ДНК в наномолярном интервале / А.В. Шугалий // Биополимеры и клетка. — 1996. — Т. 12, № 5. — С. 34-37. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Биополимеры и клетка |
| description | При ренатурации препарата модифицированной ДНК животного происхождения полностью восстанавливается структура дуплекса после тепловой денатурации, если число межнитчатых сшивок (МС) составляет ≥1 на фрагмент ДНК Уменьшение числа сшивок до величины менее одной МС на фрагмент приводит к пропорциональному снижению уровня ренатурации. Детектируемое количество сшитых нуклеотидных пар в комплексе ДНК с противоопухолевым соединением цисплатином составляет при спектрофотометрической регистрации единицы наномолей.
При ренатурації препарату модифікованої ДНК тваринного походження відбувається повне відновлення структури дуплексу після теплової денатурації, якщо число міжниткових зшивок (МЗ) становить ≥ 1 на фрагмент ДНК Зменшення числа зшивок до величини менше одноі МС на фрагмент призводить до пропорційного падіння рівня ренатурації Детектована кількість зшитих нуклеотидних пар у комплексі ДНК з протипухлинною сполукою цисплатином дорівнює при спектрофотометричній регістраціїодиницям наномоль.
The method of estimation is based on the comparison of renaturatton degree for DNA samples with a different quantity of the interstrand crosslinks (1C). Atrenaturation of modified animal DNA the complete recovery of duplex structure after the metting occurs if the Quantity of 1C is > 1 per fragment. The decrease of this Quantity to a value <1 per fragment causes the proportional reduction of renaturation degree. The quantity of cross linked nucleotide pairs in DNA complex with an anticancer drug cisplatin may be detected in nanomoles by spectrophotometric method.
|
| first_indexed | 2025-12-07T16:52:12Z |
| format | Article |
| fulltext |
Количественная оценка индуцированных межнитчатых
сшивок ДНК в наномолярном интервале
А. В. Шугалий
Институт химической физики в Черноголовке
142432, Московская обл., п/о Черноголовка
При ренатурации препарата модифицированной ДНК животного происхождения
полностью восстанавливается структура дуплекса после тепловой денатура-
ции, если число межнитчатых сшивок (МС) составляет >7 на фрагмент ДНК
Уменьшение числа сшивок до величины менее одной МС на фрагмент приводит к
пропорциональному снижению уровня ренатурации. Детектируемое количество
сшитых нуклеотидных пар в комплексе ДНК с противоопухолевым соединением
цисплатином составляет при спектрофотометрической регистрации единицы
наномолей.
Цитотоксичность соединений различной природы обусловлена, прежде все-
го, индукцией геномных повреждений, нерепарируемых ( или ограниченно
репарируемых) в процессе жизнедеятельности клетки [1, 2]. К числу
подобных повреждений относят сшивки ДНК как внутри-, так и межнитча-
тые; их появление ассоциирует, в частности, с противоопухолевой активно-
стью многочисленных терапевтических соединений, в первую очередь,
цис-изомера дихлордиамминплатины (цисплатина, цисРО [3, 4].
Для оценки сшивок в ДНК необходимо каждый раз решать самостоя-
тельную задачу их детектирования — или в составе суммарного препарата,
или гидролизата (энзиматического, химического).
Мы предлагаем для суммарного препарата сравнительно простой метод
оценки количества межнитчатых сшивок (МС) в интервале значений, не
превышающих одну сшивку на фрагмент ДНК. Метод основан на сравнении
характеристик ренатурации препаратов ДНК, содержащих различное число
МС. Присутствие, как минимум, по одной МС во всех фрагментах ДНК
известной молекулярной массы (м. м.) приводит при охлаждении к полной
ренатурации всего препарата. В случае, когда в том же препарате вклад МС
составляет величину менее 1 МС на фрагмент, доля молекул, восстановив-
ших дуплексную структуру, снижается. Это регистрируется при спектрофо-
тометрическом измерении как уменьшение общей степени ренатурации
препарата.
В опытах использовали коммерческий препарат ДНК селезенки быка со
средней м. м. » 7 МДа, что отвечает «104 пар нуклеотидов (п. н.) или
2-Ю4 н. ДНК с циcPt инкубировали в течение 24 ч в 0,01 М Катбикарбо-
натном буфере (рН 7) при исходных соотношениях реагентов в интервале
1,125:1—25:1.
Связанный циcPt регистрировали методом атомной абсорбционной
спектроскопии (количество связанного циcPt выражено как молярное отно-
© А. В. ШУГАЛИЙ. 1996
34
КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА МЕЖНИТЧАТЫХ СШИВОК ДНК
шение г - Pt/нуклеотид). После достижения полной денатурации (95 °С)
проводили медленное охлаждение со скоростью «10 °С/ч и определяли
уровень ренатурации с последующим повторным плавлением.
Как известно, основным типом повреждений ДНК, возникающих при
взаимодействии с imcPt, являются внутринитчатые сшивки, их доля для
комплексов in vitro составляет «90 % [3]. В то же время вклад МС,
предположительно включающих G противоположных нитей ДНК, не пре-
вышает 1 % [5 ], однако именно с их возникновением связывают, например,
мутабильность іщсРі в отношении Ha-ras человека [6].
На рисунке представлена кривая плавления препарата исходной ДНК
(кривая І) При охлаждении исходная ДНК не восстанавливает структуру
дуплекса (кривая І'), тем более что в наших ионных условиях (0,01 М Na)
какая-либо реассоциация исключена [7]. Некоторое снижение оптической
плотности ассоциировано с однонитчатым стэкингом, при нагревании он
нарушается и оптическая плотность возрастает до значения денатурирован-
ной ДНК. Комплекс с г = 0,05 ведет себя совершенно иначе. При
охлаждении отмечается полное восстановление структуры, повторное плав-
ление происходит так же, как и плавление исходного препарата (кривые 2
и 2'). Цикл нагревание — охлаждение может быть повторен несколько раз
с одинаковым результатом.
Кривые начального U—3) и повторного (Г—3') плавления ДНК селезенки быка и комплексов
цисРі/ДНК при различных молярных соотношениях г - Pt/нуклеотид в 0,01 M Na-бикарбонат-
ном буфере, рН 7. / и Г — исходная ДНК; 2 и 2' — комплекс с г - 0,05; 3 и 3' — комплекс
с г - 0,015. По оси ординат — отношение текущего значения оптической плотности D к
значению Dk при 95 °С
Характер ренатурации комплекса с г - 0,015 несколько иной, что
следует из сравнения кривых 2' и J'. Кривая доплавления имеет практиче-
ски те же термодинамические характеристики, что и первоначальное
плавление, Tw = 68 и 67,7 °С, AT = 13,5 и 14 °С соответственно.
Единственное отличие от комплекса с г = 0,05 — уровень ренатурации. Если
для г « 0,05 он отвечал полному восстановлению дуплексной структуры у
всех молекул препарата, то для г - 0,015 — лишь у 30—40 % молекул.
Отметим специально, что речь идет именно о 30—40 % молекул препарата,
а не 30—40 % структуры всех молекул — в противном случае мы бы имели
значения Тт и AT при доплавлении, отличающиеся от исходных. Если
восстановление структуры дуплекса однрзначно ассоциировано с нерасхож-
дением нитей в конце денатурации, то следует признать, что эффект
35
ШУГАЛИЙ А. В.
обусловлен присутствием МС, образованных благодаря реакции соответст-
вующих нуклеофильных сайтов нуклеотидов с 1ЩС?Х [4 ].
При реассоциации ДНК, когда осуществляется свободный поиск комп-
лементарной нити, именно образование «ядра» дуплекса является лимити-
рующим этапом восстановления структуры, дальнейшее «зашнуровывание»
происходит достаточно быстро [8 ]. В данном случае роль «ядра» выполняет
короткий участок дуплекса в месте межнитчатой сшивки, подобная ситуа-
ция реализуется для всех молекул комплекса с г - 0,05.
С переходом к комплексу с г = 0,015 общее число образованных
аддуктов на молекулу ДНК уменьшается с «103 до 3-102 (2-104 н. • 0,05 =
= 103; 2-104 н. • 0,015 - 3-102). При этом возникает ситуация, когда
структуру восстанавливают 30—40 % молекул. Это означает, что лишь
30—40 % молекул содержат по МС, их вклад, таким образом, составляет
для данного препарата величину, равную 1 МС на 300: (0,3—0,4) = 1000—
750 аддуктов, или 0,1—0,15 % от всех образованных аддуктов. Если учесть,
что в наших экспериментах концентрация ДНК в кювете спектрофотометра
при регистрации кривых плавления составляла 15 мкг/мл или 2-10"5 М н.
п., а мы детектируем присутствие 1 МС на двунитчатый фрагмент из 104 п.
н., то чувствительность подобной регистрации МС составляет величину
2-10"9 М при отнесении на нуклеотидную пару.
Следовательно, для количественной оценки необходимо «попасть» в
интервал значений МС, не превышающих 1 МС на фрагмент. Ход наших
рассуждений о единичности МС у комплекса с г - 0,05 мы проверили
следующим образом. Если на молекулу ~104 п. н. приходится единичная
МС, то фрагментация уже образованного комплекса приведет к тому, что
лишь у части новых, более коротких фрагментов, будет присутствовать МС.
Пропорция этой части молекул должна определяться соотношением длин
фрагментов исходной ДНК и полученной в результате фрагментации.
Комплекс с г - 0,05 и м. м. ~104 п. н. мы продробили путем
продавливания через подобранную иглу шприца, при этом фрагмент умень-
шился до «2,5-103 п. н. Этот препарат ренатурировал при охлаждении на
«30 %, в отличие от уже приводимой нами полной ренатурации исходного
комплекса с г = 0,05 и фрагментами »104 п. н. Это означает, что у
фрагментов 2,5-103 п. н. лишь 1/3 молекул содержит по одной МС.
Результат достаточно хорошо согласуется с 4-кратным снижением молеку-
лярной массы фрагментов в результате дробления.
Таким образом, предлагаемый метод* позволяет оценить вклад «сшитых»
нуклеотидных пар ДНК, составляющий единицы наномолей. Для оценки
необходимо сравнить степени ренатурации препаратов с различным уровнем
сшивок в интервале < 1 МС на используемый фрагмент.
Автор признателен сотрудникам группы Н. Д. Соколова за проведение
измерений методом атомной абсорбционной спектроскопии; М. В. Личи-
ной — за техническую помощь в работе.
О. В. Шугалій
Кількісна оцінка індукованих міжниткових зшивок ДНК у наномолярному інтервалі
Резюме
При ренатурації препарату модифікованої ДНК тваринного походження відбувається повне
відновлення структури дуплексу після теплової денатурації, якщо число міжниткових зиіивок
(МЗ) становить на фрагмент ДНК Зменшення числа зшивок до величини менше одноі МС на
фрагмент призводить до пропорційного падіння рівня ренатурації Детектована кількість
зшитих нуклеотидних пар у комплексі ДНК з протипухлинною сполукою цисплатином дорівнює
при спектрофотометричній регістраціїодиницям наномоль.
36
КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА МЕЖНИТЧАТЫХ СШИВОК ДНК
А. V. Shugalii
The quantitative estimation of induced DNA interstrand crosslinks in nanomoles interval
Summary
The method of estimation is based on the comparison of renaturation degree for DNA samples with a
different quantity of the interstrand crosslinks (1С). At renaturationof modified animal DNA the complete
recovery of duplex structure after the metting occurs if the quantity of 1С is>l per fragment The decrease of
this quantity to a value <1 per fragment causes the proportional reduction of renaturation degree. The
quantity of cross linked nucleotide pairs in DNA complex woth an anticancer drug cisplatin may be detected
in nanomoles by spectrophotometry method.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Mechanisms of DNA damage and repair: implication for carcinogenesis and risk assessment.—
New York: Pergamon press, 1985.—Vol. 38.—578 p.
2. Johnson N. P., Butour J. L.t Villani G. Progress in clinical biochemistry and medicine.—
Heidelberg.: Springer, 1989.—Vol. 10.—P. 59—68.
3. Roberts J. /., Thomson A. J. The mechanisms of action of antitumor platinum compounds / /
Progr. Nucl. Acid. Res. Мої. Biol.—1979.—22, N 1.—P. 71—133.
4. Lippard S. J. Chemistry and molecular biology of platinum anticancer drugs 11 Pure and Appl.
Chem.—1987.—59, N 6.—P. 731—742.
5. Page J. D.t Husain /., Sancar A., Chaney S. G. Effects of the diaminocyclohexane carrier
ligand on the platinum adduct formation, repair and lethality 11 Biochemistry.—1990.—29,
N 4.—P. 1016—1024.
6. Pillaire M. /., Margot A., Villani G. et aL Mutagenesis in monkey cells of a vector containing
a single d(GpG) cisdiamminedichloroplatinim (II) adduct plased on codon 13 of the human
H-ras proto-oncogene / / Nucl. Acid&Res.—1994.—22, N 13.—P. 2519—2524.
7. Britten R. J., Graham D. E.t Neufeld B. R. Analysis of repeating DNA sequences by
reassosiation / / Meth. Enzymol.—1974.—29, pt E.—P. 363—418.
8. Прима В. Я., Тарантул В. 3Шугалий А. В., Газарян JC Г. Реассоциация ДНК:
физические и биологические аспекты / / Укр. біохім. журн.—1974.—46, № 2.—С. 255—
271.
УДК 577.113.4 Поступила в редакцию 16.11.95
37
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-154176 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7657 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T16:52:12Z |
| publishDate | 1996 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Шугалий, А.В. 2019-06-15T09:32:17Z 2019-06-15T09:32:17Z 1996 Количественная оценка индуцированных межнитчатых сшивок ДНК в наномолярном интервале / А.В. Шугалий // Биополимеры и клетка. — 1996. — Т. 12, № 5. — С. 34-37. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000446 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154176 577.113.4 При ренатурации препарата модифицированной ДНК животного происхождения полностью восстанавливается структура дуплекса после тепловой денатурации, если число межнитчатых сшивок (МС) составляет ≥1 на фрагмент ДНК Уменьшение числа сшивок до величины менее одной МС на фрагмент приводит к пропорциональному снижению уровня ренатурации. Детектируемое количество сшитых нуклеотидных пар в комплексе ДНК с противоопухолевым соединением цисплатином составляет при спектрофотометрической регистрации единицы наномолей. При ренатурації препарату модифікованої ДНК тваринного походження відбувається повне відновлення структури дуплексу після теплової денатурації, якщо число міжниткових зшивок (МЗ) становить ≥ 1 на фрагмент ДНК Зменшення числа зшивок до величини менше одноі МС на фрагмент призводить до пропорційного падіння рівня ренатурації Детектована кількість зшитих нуклеотидних пар у комплексі ДНК з протипухлинною сполукою цисплатином дорівнює при спектрофотометричній регістраціїодиницям наномоль. The method of estimation is based on the comparison of renaturatton degree for DNA samples with a different quantity of the interstrand crosslinks (1C). Atrenaturation of modified animal DNA the complete recovery of duplex structure after the metting occurs if the Quantity of 1C is > 1 per fragment. The decrease of this Quantity to a value <1 per fragment causes the proportional reduction of renaturation degree. The quantity of cross linked nucleotide pairs in DNA complex with an anticancer drug cisplatin may be detected in nanomoles by spectrophotometric method. Автор признателен сотрудникам группы Н. Д. Соколова за проведение измерений методом атомной абсорбционной спектроскопии; М. В. Личиной — за техническую помощь в работе. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Количественная оценка индуцированных межнитчатых сшивок ДНК в наномолярном интервале Кількісна оцінка індукованих міжниткових зшивок ДНК у наномолярному інтервалі The quantitative estimation of induced DNA interstrand crosslinks in nanomoles interval Article published earlier |
| spellingShingle | Количественная оценка индуцированных межнитчатых сшивок ДНК в наномолярном интервале Шугалий, А.В. |
| title | Количественная оценка индуцированных межнитчатых сшивок ДНК в наномолярном интервале |
| title_alt | Кількісна оцінка індукованих міжниткових зшивок ДНК у наномолярному інтервалі The quantitative estimation of induced DNA interstrand crosslinks in nanomoles interval |
| title_full | Количественная оценка индуцированных межнитчатых сшивок ДНК в наномолярном интервале |
| title_fullStr | Количественная оценка индуцированных межнитчатых сшивок ДНК в наномолярном интервале |
| title_full_unstemmed | Количественная оценка индуцированных межнитчатых сшивок ДНК в наномолярном интервале |
| title_short | Количественная оценка индуцированных межнитчатых сшивок ДНК в наномолярном интервале |
| title_sort | количественная оценка индуцированных межнитчатых сшивок днк в наномолярном интервале |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154176 |
| work_keys_str_mv | AT šugaliiav količestvennaâocenkainducirovannyhmežnitčatyhsšivokdnkvnanomolârnomintervale AT šugaliiav kílʹkísnaocínkaíndukovanihmížnitkovihzšivokdnkunanomolârnomuíntervalí AT šugaliiav thequantitativeestimationofinduceddnainterstrandcrosslinksinnanomolesinterval |