Исследование комплексообразования бромистого этидия с одноцепочечным некомплементарным дезокситетрануклеотидом 5'-d(CpGpApA) в водном растворе методом ¹Н-ЯМР спектроскопии

Методом одно- и двухмерной ¹Н-ЯМР спектроскопии (500 и 600 МГц) изучено комплексообразование в водно-солевом растворе красителя бромистого этидия (3,8-диамино-6-фенил-5-этил-фенантридин) с одноцепочечным некомплементарным дезокситетрануклеотидом 5' -d( CpGpApA). Измерены концентрационные зависи...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	1996
Автори:	Веселков, А. Н., Веселков, А.Н., Барановский, С.Ф., Дымант, Л.Н., Петренко, Н.В., Осетров, С.Г., Такер, А., Дэвис, Д.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1996
Назва видання:	Биополимеры и клетка
Онлайн доступ:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154199
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Исследование комплексообразования бромистого этидия с одноцепочечным некомплементарным дезокситетрануклеотидом 5'-d(CpGpApA) в водном растворе методом ¹Н-ЯМР спектроскопии / А.Н. Веселков, С.Ф. Барановский, Л.Н. Дымант, Н.В. Петренко, С.Г. Осетров, А. Такер, Д. Дэвис // Биополимеры и клетка. — 1996. — Т. 12, № 6. — С. 36-49. — Бібліогр.: 24 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-154199
record_format	dspace
spelling	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1541992025-02-09T09:38:49Z Исследование комплексообразования бромистого этидия с одноцепочечным некомплементарным дезокситетрануклеотидом 5'-d(CpGpApA) в водном растворе методом ¹Н-ЯМР спектроскопии Дослідження комплексоутворення бромистого етидію з одноланцюговим некомплементарним дезокситетрануклеотидом 5'-d(CpGpApA) у водному розчині методом ¹Н-ЯМР спектроскопії ¹H-NMR investigation of complex fonnation of ethidium bromide with single-stranded non-complementary deoxytetranucleotide 5'-d(CpGpApA) in aqueous solution Веселков, А. Н. Веселков, А.Н. Барановский, С.Ф. Дымант, Л.Н. Петренко, Н.В. Осетров, С.Г. Такер, А. Дэвис, Д. Методом одно- и двухмерной ¹Н-ЯМР спектроскопии (500 и 600 МГц) изучено комплексообразование в водно-солевом растворе красителя бромистого этидия (3,8-диамино-6-фенил-5-этил-фенантридин) с одноцепочечным некомплементарным дезокситетрануклеотидом 5' -d( CpGpApA). Измерены концентрационные зависимости химических сдвигов протонов взаимодействующих молекул при различных температурах (T1 = 298 K и Т2= 308 K). Исследования самоассоциации тетрануклеотида показали малую вероятность образования дуплексов в растворе. В связи с этим в растворе основную роль играют комплексы красителя с одиночной нитью тетрануклеотида, что дает возможность проанализировать специфику взаимодействия ароматического лиганда с одноцепочечной ДНК. Рассмотрены различные схемы комплексообразования, определены равновесные константы и предельные значения химических сдвигов протонов бромистого этидия в комплексах. Сделан анализ относительного содержания комплексов различного типа и выявлены особенности динамического равновесия в зависимости от соотношения концентраций красителя и тетрануклеотида. На основе полученных данных сделан вывод о существовании сиквенс-специфичности связывания бромистого этидия с одноцепочечной нуклеотидной последовательностью. По расчетным значениям индуцированных химических сдвигов протонов красителя построены наиболее вероятные структуры комплексов 1:1 бромистого этидия с одиночной нитью дезокситетрануклеотида, соответствующие двум возможным типам встраивания красителя между основаниями цитозина и гуанина – с диаметрально противоположных сторон фенантридинового хромофора. Методом одномірної та двомірної ¹Н-ЯМР спектроскопії (500 і 600 МГц) вивчено комплексоутворення у водно-сольовому розчині барвника бромистого етидію (3,8-діаміно-6-феніл-5-етил-фенантридин) з одноланцюговим некомплементарним дезокситетрануклеотидом 5'-d(CpGp- АрА). Виміряно концентраційні залежності хімічних зсувів протонів взаємодіючих молекул за різних температур (T1= 298 і Т2 = 308 К). Дослідження самоасоціації тетрануклеотиду засвідчили малу вірогідність утворення дуплексів у розчині У зв'язку з цим у розчині основну роль відіграють комплекси барвника з одиничною ниткою тетрануклеотиду, що дає змогу проаналізувати специфіку взаємодії ароматичного ліганда з одноланцюговою ДНК. Розглянуто різні схеми комплексоутворення, визначено рівноважні константи і граничні значення хімічних зсувів протонів бромистого етидію у комплексах. Зроблено аналіз відносного вмісту комплексів різного типу і виявлено особливості динамічної рівноваги в залежності від співвідношення концентрацій барвника і тетрануклеотиду. На основі отриманих даних зроблено висновок про існування сиквенсспецифічності зв'язування бромистого етидію з одноланцюговою нуклеотидною послідовністю. За розрахунками індукованих хімічних зсувів протонів барвника побудовано найвірогідніду, які відповідають двом можливим типам вбудовування барвника між основами цитозину і гуаніну – з діаметрально протилежних сторін фенантридинового хромофора. Complex formation between the aromatic dye ethidium bromide (3,8-diamino-6-phenyl-5-ethyl-phenan-thridine) and single-stranded non-complementary deoxytetranucleotide 5'-d(CpGpApA) in aqueous solution has been studied by one- and two-dimensional ¹H-NMR spectroscopy (500 and 600 MHz). Concentration dependences of proton chemical shifts of the interacting molecules were measured at different temperatures T1 – 298 K and T2 – 305 K. Investigations of the self-association of the tetranucleotide molecules have shown that there is a very tow probability of duplex formation at the experimental conditions studied. Itfollows that the complexations of the dye molecules with the monomer of the tetranucleotide play the main rote in the complex equilibrium in solution giving an opportunity to analyze the specificity of interactions of aromatic ligand with the single-stranded DNA. Different schemes of complex formation have been examined, equilibrium reaction constants and limiting chemical shifts of dye protons in different complexes have been determined. Analysis of the relative content of different types of complexes was made and special features of the dynamic equilibrium were revealed as a function of both the dye and tetranucleotide concentrations. The analysis has shown that there is a sequence-specific binding of ethidium bromide with the single-stranded oligonucleotide. The most favorable structures of1:1 complexes of the dye with the single strand of the tetranucleotide corresponding to the drug binding from the opposite aromatic rings of the phenanthridine chromophore were constructed using the calculated values of induced chemical shifts of ethidium bromide protons. Выражаем благодарность Королевскому обществу Великобритании за частичное финансирование (А. Н. В.) экспериментальных исследований; Объединенному исследовательскому центру Лондонского университета — за предоставленную возможность в Беркбек колледже и Куин Мери колледже использовать для измерений ЯМР-спектрометры 500 и 600 МГц; Центральному исследовательскому Фонду Лондонского университета — за финансирование (Д. Д.) приобретения образцов олигонуклеотидов. Проведенные исследования частично финансированы Грантом N UD 7200 Международного научного фонда. 1996 Article Исследование комплексообразования бромистого этидия с одноцепочечным некомплементарным дезокситетрануклеотидом 5'-d(CpGpApA) в водном растворе методом ¹Н-ЯМР спектроскопии / А.Н. Веселков, С.Ф. Барановский, Л.Н. Дымант, Н.В. Петренко, С.Г. Осетров, А. Такер, Д. Дэвис // Биополимеры и клетка. — 1996. — Т. 12, № 6. — С. 36-49. — Бібліогр.: 24 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000453 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154199 577.113 ru Биополимеры и клетка application/pdf Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
description	Методом одно- и двухмерной ¹Н-ЯМР спектроскопии (500 и 600 МГц) изучено комплексообразование в водно-солевом растворе красителя бромистого этидия (3,8-диамино-6-фенил-5-этил-фенантридин) с одноцепочечным некомплементарным дезокситетрануклеотидом 5' -d( CpGpApA). Измерены концентрационные зависимости химических сдвигов протонов взаимодействующих молекул при различных температурах (T1 = 298 K и Т2= 308 K). Исследования самоассоциации тетрануклеотида показали малую вероятность образования дуплексов в растворе. В связи с этим в растворе основную роль играют комплексы красителя с одиночной нитью тетрануклеотида, что дает возможность проанализировать специфику взаимодействия ароматического лиганда с одноцепочечной ДНК. Рассмотрены различные схемы комплексообразования, определены равновесные константы и предельные значения химических сдвигов протонов бромистого этидия в комплексах. Сделан анализ относительного содержания комплексов различного типа и выявлены особенности динамического равновесия в зависимости от соотношения концентраций красителя и тетрануклеотида. На основе полученных данных сделан вывод о существовании сиквенс-специфичности связывания бромистого этидия с одноцепочечной нуклеотидной последовательностью. По расчетным значениям индуцированных химических сдвигов протонов красителя построены наиболее вероятные структуры комплексов 1:1 бромистого этидия с одиночной нитью дезокситетрануклеотида, соответствующие двум возможным типам встраивания красителя между основаниями цитозина и гуанина – с диаметрально противоположных сторон фенантридинового хромофора.
format	Article
author	Веселков, А. Н. Веселков, А.Н. Барановский, С.Ф. Дымант, Л.Н. Петренко, Н.В. Осетров, С.Г. Такер, А. Дэвис, Д.
spellingShingle	Веселков, А. Н. Веселков, А.Н. Барановский, С.Ф. Дымант, Л.Н. Петренко, Н.В. Осетров, С.Г. Такер, А. Дэвис, Д. Исследование комплексообразования бромистого этидия с одноцепочечным некомплементарным дезокситетрануклеотидом 5'-d(CpGpApA) в водном растворе методом ¹Н-ЯМР спектроскопии Биополимеры и клетка
author_facet	Веселков, А. Н. Веселков, А.Н. Барановский, С.Ф. Дымант, Л.Н. Петренко, Н.В. Осетров, С.Г. Такер, А. Дэвис, Д.
author_sort	Веселков, А. Н.
title	Исследование комплексообразования бромистого этидия с одноцепочечным некомплементарным дезокситетрануклеотидом 5'-d(CpGpApA) в водном растворе методом ¹Н-ЯМР спектроскопии
title_short	Исследование комплексообразования бромистого этидия с одноцепочечным некомплементарным дезокситетрануклеотидом 5'-d(CpGpApA) в водном растворе методом ¹Н-ЯМР спектроскопии
title_full	Исследование комплексообразования бромистого этидия с одноцепочечным некомплементарным дезокситетрануклеотидом 5'-d(CpGpApA) в водном растворе методом ¹Н-ЯМР спектроскопии
title_fullStr	Исследование комплексообразования бромистого этидия с одноцепочечным некомплементарным дезокситетрануклеотидом 5'-d(CpGpApA) в водном растворе методом ¹Н-ЯМР спектроскопии
title_full_unstemmed	Исследование комплексообразования бромистого этидия с одноцепочечным некомплементарным дезокситетрануклеотидом 5'-d(CpGpApA) в водном растворе методом ¹Н-ЯМР спектроскопии
title_sort	исследование комплексообразования бромистого этидия с одноцепочечным некомплементарным дезокситетрануклеотидом 5'-d(cpgpapa) в водном растворе методом ¹н-ямр спектроскопии
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1996
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154199
citation_txt	Исследование комплексообразования бромистого этидия с одноцепочечным некомплементарным дезокситетрануклеотидом 5'-d(CpGpApA) в водном растворе методом ¹Н-ЯМР спектроскопии / А.Н. Веселков, С.Ф. Барановский, Л.Н. Дымант, Н.В. Петренко, С.Г. Осетров, А. Такер, Д. Дэвис // Биополимеры и клетка. — 1996. — Т. 12, № 6. — С. 36-49. — Бібліогр.: 24 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT veselkovan issledovaniekompleksoobrazovaniâbromistogoétidiâsodnocepočečnymnekomplementarnymdezoksitetranukleotidom5dcpgpapavvodnomrastvoremetodom1nâmrspektroskopii AT veselkovan issledovaniekompleksoobrazovaniâbromistogoétidiâsodnocepočečnymnekomplementarnymdezoksitetranukleotidom5dcpgpapavvodnomrastvoremetodom1nâmrspektroskopii AT baranovskijsf issledovaniekompleksoobrazovaniâbromistogoétidiâsodnocepočečnymnekomplementarnymdezoksitetranukleotidom5dcpgpapavvodnomrastvoremetodom1nâmrspektroskopii AT dymantln issledovaniekompleksoobrazovaniâbromistogoétidiâsodnocepočečnymnekomplementarnymdezoksitetranukleotidom5dcpgpapavvodnomrastvoremetodom1nâmrspektroskopii AT petrenkonv issledovaniekompleksoobrazovaniâbromistogoétidiâsodnocepočečnymnekomplementarnymdezoksitetranukleotidom5dcpgpapavvodnomrastvoremetodom1nâmrspektroskopii AT osetrovsg issledovaniekompleksoobrazovaniâbromistogoétidiâsodnocepočečnymnekomplementarnymdezoksitetranukleotidom5dcpgpapavvodnomrastvoremetodom1nâmrspektroskopii AT takera issledovaniekompleksoobrazovaniâbromistogoétidiâsodnocepočečnymnekomplementarnymdezoksitetranukleotidom5dcpgpapavvodnomrastvoremetodom1nâmrspektroskopii AT dévisd issledovaniekompleksoobrazovaniâbromistogoétidiâsodnocepočečnymnekomplementarnymdezoksitetranukleotidom5dcpgpapavvodnomrastvoremetodom1nâmrspektroskopii AT veselkovan doslídžennâkompleksoutvorennâbromistogoetidíûzodnolancûgovimnekomplementarnimdezoksitetranukleotidom5dcpgpapauvodnomurozčinímetodom1nâmrspektroskopíí AT veselkovan doslídžennâkompleksoutvorennâbromistogoetidíûzodnolancûgovimnekomplementarnimdezoksitetranukleotidom5dcpgpapauvodnomurozčinímetodom1nâmrspektroskopíí AT baranovskijsf doslídžennâkompleksoutvorennâbromistogoetidíûzodnolancûgovimnekomplementarnimdezoksitetranukleotidom5dcpgpapauvodnomurozčinímetodom1nâmrspektroskopíí AT dymantln doslídžennâkompleksoutvorennâbromistogoetidíûzodnolancûgovimnekomplementarnimdezoksitetranukleotidom5dcpgpapauvodnomurozčinímetodom1nâmrspektroskopíí AT petrenkonv doslídžennâkompleksoutvorennâbromistogoetidíûzodnolancûgovimnekomplementarnimdezoksitetranukleotidom5dcpgpapauvodnomurozčinímetodom1nâmrspektroskopíí AT osetrovsg doslídžennâkompleksoutvorennâbromistogoetidíûzodnolancûgovimnekomplementarnimdezoksitetranukleotidom5dcpgpapauvodnomurozčinímetodom1nâmrspektroskopíí AT takera doslídžennâkompleksoutvorennâbromistogoetidíûzodnolancûgovimnekomplementarnimdezoksitetranukleotidom5dcpgpapauvodnomurozčinímetodom1nâmrspektroskopíí AT dévisd doslídžennâkompleksoutvorennâbromistogoetidíûzodnolancûgovimnekomplementarnimdezoksitetranukleotidom5dcpgpapauvodnomurozčinímetodom1nâmrspektroskopíí AT veselkovan 1hnmrinvestigationofcomplexfonnationofethidiumbromidewithsinglestrandednoncomplementarydeoxytetranucleotide5dcpgpapainaqueoussolution AT veselkovan 1hnmrinvestigationofcomplexfonnationofethidiumbromidewithsinglestrandednoncomplementarydeoxytetranucleotide5dcpgpapainaqueoussolution AT baranovskijsf 1hnmrinvestigationofcomplexfonnationofethidiumbromidewithsinglestrandednoncomplementarydeoxytetranucleotide5dcpgpapainaqueoussolution AT dymantln 1hnmrinvestigationofcomplexfonnationofethidiumbromidewithsinglestrandednoncomplementarydeoxytetranucleotide5dcpgpapainaqueoussolution AT petrenkonv 1hnmrinvestigationofcomplexfonnationofethidiumbromidewithsinglestrandednoncomplementarydeoxytetranucleotide5dcpgpapainaqueoussolution AT osetrovsg 1hnmrinvestigationofcomplexfonnationofethidiumbromidewithsinglestrandednoncomplementarydeoxytetranucleotide5dcpgpapainaqueoussolution AT takera 1hnmrinvestigationofcomplexfonnationofethidiumbromidewithsinglestrandednoncomplementarydeoxytetranucleotide5dcpgpapainaqueoussolution AT dévisd 1hnmrinvestigationofcomplexfonnationofethidiumbromidewithsinglestrandednoncomplementarydeoxytetranucleotide5dcpgpapainaqueoussolution
first_indexed	2025-11-25T10:27:12Z
last_indexed	2025-11-25T10:27:12Z
_version_	1849757726131879936
fulltext	ISSN 0233-7657. Биополимеры и клетка. 1996. Т. 12. № 6 Исследование комплексообразования бромистого этидия с одноцепочечным некомплементарным дезокситетрануклеотидом 5'-d(CpGpApA) в водном растворе методом 1Н-ЯМР спектроскопии А. Н. Веселков, С. Ф. Барановский, Л. Н. Дымант, Н. В. Петренко, С. Г. Осетров, А. Такер1, Д. Дэвис1 Севастопольский Государственный техн. университет Министерства образования Украины 335053, Севастополь, Студгородок 1 Лондонский университет, Беркбек колледж Лондон, WC1H ОРР, Великобритания Методом одно- и двухмерной 1 Н - Я М Р спектроскопии (500 и 600 МГц) изучено комплексообразование в водно-солевом растворе красителя бромистого этидия (3,8-диамино-6-фенил-5-этил-фенантридин) с одноцепочечным некомплемен- тарным дезокситетрануклеотидом 5' -d( CpGpApA). Измерены концентрацион- ные зависимости химических сдвигов протонов взаимодействующих молекул при различных температурах (Tj — 298 КиТ2= 308 К). Исследования самоассоциации тетрануклеотида показали малую вероятность образования дуплексов в рас- творе. В связи с этим в растворе основную роль играют комплексы красителя с одиночной нитью тетрануклеотида, что дает возможность проанализировать специфику взаимодействия ароматического лиганда с одноцепочечной ДНК. Рас- смотрены различные схемы комплексообразования, определены равновесные кон- станты и предельные значения химических сдвигов протонов бромистого этидия в комплексах. Сделан анализ относительного содержания комплексов различного типа и выявлены особенности динамического равновесия в зависимости от соот- ношения концентраций красителя и тетрануклеотида. На основе полученных данных сделан вывод о существовании сиквенс-специфичности связывания броми- стого этидия с одноцепочечной нуклеотидной последовательностью. По расчет- ным значениям индуцированных химических сдвигов протонов красителя по- строены наиболее вероятные структуры комплексов 1:1 бромистого этидия с одиночной нитью дезокситетрануклеотида, соответствующие двум возмож- ным типам встраивания красителя между основаниями цитозина и гуанина — с диаметрально противоположных сторон фенантридинового хромофора. Введение. Избирательность комплексообразования лигандов с одноцепочеч- ными последовательностями нуклеиновых кислот может играть важную роль в функционировании биологически активных веществ, в частности, в процессах транскрипции и репликации ДНК. Известно, что в некоторых бактериофагах молекула ДНК существует в виде одноцепочечной структу- ры [1]. Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о Correspondence address. © А Н. ВЕСЕЛКОВ, с . Ф БАРАНОВСКИЙ, Л. Н. ДЫМАНТ, Н. В. ПЕТРЕНКО, С Г. ОСЕТРОВ, А. ТАКЕР, Д. ДЭВИС, 1996 36 ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЯ БРОМИСТОГО ЭТИДИЯ высоком сродстве и избирательном связывании антибиотика актиномицина D [2, 3 ], акридинового красителя профлавина [4 ] и фенантридинового красителя бромистого этидия [5—7] с одноцепочечными дезоксиолигонук- леотидами. Ароматические лиганды проявляют селективность взаимодейст- вия и с одноцепочечной РНК. Так, недавно показано [8 ], что интеркалятор диимид нафталина, к которому присоединены две молекулы тимидина, преимущественно связывается с одноцепочечной поли-А. Наблюдаемая селективность связывания, по мнению авторов, является результатом обра- зования специфических водородных связей между основаниями аденина и тимина. Экспериментально установлено, что специфичность связывания ароматических лигандов с нативной ДНК проявляется уже на коротких самокомплементарных олигонуклеотидах, включающих в себя соответству- ющий участок [4—7, 9, 10]. Следовательно, можно ожидать, что необходи- мые энергетические и структурные характеристики комплексов лигандов с однонитчатой ДНК в растворе могут быть выявлены путем изучения их взаимодействия с малыми фрагментами одноцепочечных нуклеиновых кис- лот — некомплементарными олигонуклеотидами заданной последовательно- сти оснований. В настоящей работе методом одномерной и двухмерной 'Н-ЯМР спектроскопии (500 и 600 МГц) проведено исследование взаимо- действия бромистого этидия с некомплементарным дезокситетрарибонукле- озидтрифосфатом 5'-d(CpGpApA) в водном растворе. Такой тетрануклеотид содержит пиримидин-пуриновую d(C-G) последовательность, к которой бромистый этидий проявляет сиквенс-специфичность взаимодействия в дуплексе [5—7]. Вместе с тем специфика связывания может существенно изменяться при взаимодействии красителя с мономерными формами олиго- нуклеотидов [4 ]. Проведенный нами анализ комплексообразования броми- стого этидия с самокомплементарными дезокситетрануклеотидами различ- ной последовательности оснований в цепи [5—7 ] свидетельствует о доста- точно высоких значениях равновесных констант образования комплексов 1:1 красителя с мономерами тетрануклеотидов в растворе. В связи с этим важным представляется непосредственное исследование комплексообразова- ния красителя с однонитчатыми некомплементарными дезокситетрануклео- тидами в идентичных экспериментальных условиях. Для получения наибо- лее полной информации о характере избирательного связывания лиганда с одноцепочечной нуклеотидной последовательностью целесообразно проведе- ние подобных исследований со всевозможными комбинациями азотистых оснований в коротких некомплементарных олигонуклеотидах. Материалы и методы. Бромистый этидий (рис. 1) фирмы «Sigma» (США) растворяли в D20 с изотопной чистотой 99,95 % D («Sigma») и лиофилизовали. Затем взвешенное количество лиганда растворяли в дейте- рированном 0,1 М фосфатном буфере (pD = 7,15). Концентрацию красителя Рис. 1. Структурная формула катиона этидия (3,8-диамино-6-фенил-5-этил- фенантридин) с указанием необменива- ющихся протонов красителя 37 ВЕСЕЛКОВ А. Н. И ДР. определяли спектрофотометрически: для бромистого этидия коэффициент экстинкции є = 5860 М 1 с м 1 (Я = 480 нм) [11 ]. Дезокситетрарибонуклео- зидтрифосфат 5'-d(CpGpApA) синтезирован компанией «Oswel DNA Service» (Великобритания). Образец также лиофилизовали из D20 и растворяли в дейтерированном 0,1 М фосфатном буфере. Одномерные спектры 1 Н-ЯМР измерены на импульсном спектрометре «JEOL GSX 500» с резонансной частотой 500 МГц. Концентрационные измерения протонных химических сдвигов молекул выполнены при двух температурах Т, = 298 К и Т2 = 308 К в интервале концентраций от 3,1 ммоль до 0,1 ммоль тетрануклеотида и при постоянной концентрации бромистого этидия (С0 = 1,15 ммоль) в растворе. Двухмерные гомоядерные TOCSY- и NOESY-эксперименты, использованные для отнесения сигналов необменивающихся протонов молекул и качественного определения харак- тера комплексообразования красителя с олигонуклеотидом, выполнены на спектрометре «Bruker АМХ» (600 МГц). Методика проведения эксперимента достаточно подробно описана в [12]. Одномерные и двухмерные спектры измеряли в стандартных ампулах с внешним диаметром 5 мм, минимальный объем раствора 5 мл. Химический сдвиг определяли относительно ДСС (2,2-диметил-2-силапентан-5-сульфокислота), в качестве внутреннего стан- дарта использовали ТМА (бромистый тетраметиламмоний). Результаты и обсуждение Предварительно выполненные отнесения сигналов протонов дезокситетрануклеотида d(CGAA) [12], а также прото- нов бромистого этидия [13] позволили отождествить спектры смешанных растворов и выявить в спектрах 2M-NOESY возможные связи ядер молеку- лы красителя и тетрануклеотида. Отметим, что положение резонансов протонов в суммарном спектре достаточно надежно определяется по харак- теру изменения интенсивности сигналов в процессе титрования при посто- янной концентрации красителя. На рис. 2 представлен спектр 2M-NOE (600 МГц) раствора бромистого этидия с тетрануклеотидом d(CGAA), полученный при времени смешивания хт = 200 мс. Существенно, что в Рис. 2. 2М-1ЧОЕ-спектр (600 МГц, г т = 200 мс) раствора бромистого этидия с дезокситетрануклеотидом 5'-d(CpGpApA) при исходных кон- центрациях красителя D0 = - 1,15-10"3 моль/л и тетрануклео- тида N0 - 1,66 10"3 моль/л (Т - - 298 К) 38 ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЯ БРОМИСТОГО ЭТИДИЯ 2M-NOE-спектре при указанных условиях проведения эксперимента не наблюдаются межмолекулярные кросс-пики между протонами бромистого этидия и тетрануклеотида. Отсутствие, а точнее, пренебрежимо малая интенсивность кросс-пиков между протонами красителя и дезокситетранук- леотида может быть обусловлено следующими причинами: относительно большими расстояниями между протонами красителя и некомплементарного тетрануклеотида в месте связывания лиганда, а также сложным динамиче- ским равновесием взаимодействующих молекул и их комплексов, приводя- щим к относительно малому процентному содержанию любого типа комп- лекса, образующегося в растворе. Измеренные концентрационные зависимости химических сдвигов бро- мистого этидия в смешанном растворе приведены на рис. 3. Качественный анализ кривых свидетельствует о разном характере изменения химических сдвигов протонов красителя в растворе с некомплементарным дезокситетра- нуклеотидом по сравнению с самокомплементарными дезокситетрануклео- тидами в тех же экспериментальных условиях [5—7 ]. В случае комплексо- образования красителя с самокомплементарными дезокситетрануклеотида- ми, которые при низких температурах с большей вероятностью образуют в растворе дуплексные структуры [14], наблюдается существенное уменьше- ние наклона концентрационных зависимостей при отношении исходных концентраций дуплекса и лиганда г = jV2/A)-1> ч т ° предполагает формиро- вание преимущественно комплекса 1:2 одной молекулы красителя с двумя нитями тетрануклеотида [5—7 ]. Однако для комплекса бромистого этидия с некомплементарным дезокситетрануклеотидом d(CGAA) эксперимент сви- детельствует о монотонном падении протонных химических сдвигов краси- теля при увеличении концентрации тетрануклеотида в растворе во всем исследованном диапазоне концентраций как при Т, = 298 К, так и при Т2 = = 308 К (см. рис. 3). Последнее, по-видимому, объясняется тем, что комплексы бромистого этидия с одноцепочечным некомплементарным де- зокситетрануклеотидом обладают существенно большими степенями свобо- ды в сравнении с таковыми с двухспиральными последовательностями самокомплементарных тетрануклеотидов. Для количественного анализа вза- имодействия красителя с некомплементарным дезокситетрануклеотидом рассмотрена следующая схема молекулярных ассоциатов в растворе: Рис. 3. Зависимости химических сдвигов протонов бромистого этидия от концентрации тетрануклеотида при постоянной концентрации бромистого этидия D0 - 1,15-10"3 моль/л, Т, - 298 К (а) и Т2 - 308 К (б): J — HI; 2 — НЮ; 3 — Н9; 4 — Н4; 5 — Н2; 6 — Н7 39 ВЕСЕЛКОВ А. Н. И ДР. В предлагаемой схеме учтено, что в растворе имеет место равновесие взаимодействующих молекул, включающее в себя различные процессы образования комплексов красителя с тетрамером, а также реакции самоас- социации молекул. Ранее показано [12], что равновесная константа само- ассоциации некомплементарного тетрануклеотида d(CGAA) (KN = = 23,4 ±6,8 л/моль) существенно меньше таковой для самокомплементар- ных дезокситетрануклеотидов [14]. Оценки показывают, что в этом случае можно пренебречь реакцией образования комплекса 1:2 путем непосредст- венного связывания красителя (D) с тетрануклеотидным дуплексом W2) , которая является определяющей при связывании бромистого этидия с самокомплементарными дезокситетрануклеотидами [5—7]. Вместе с тем в расчетной схеме предусмотрена возможность образования 1:2-комплекса DN2 за счет взаимодействия мономера тетрануклеотида с 1:1-комплексом DN (реакция 1е), где бромистый этидий играет роль «скрепки» [5—7]. Несмотря на то, что при комплексообразовании красителя с некомплемен- тарным тетрануклеотидом наиболее значимыми являются комплексы 1:1 и 2:1 красителя с мономерными нуклеотидными последовательностями, расчет по моделям, в которых пренебрегали реакцией (1е) образования 1:2 комп- лекса через «скрепку», не приводил к удовлетворительным результатам. Что касается самоассоциации бромистого этидия, то при использованных в эксперименте концентрациях красителя можно ограничиться процессом димеризации молекул. Применительно к условиям эксперимента константа димеризации Kd с учетом ее зависимости от температуры принята равной 149 л/моль при Т, = 298 К и Kd = 114 л/моль при Т2 = 308 К [13]. Химические сдвиги рассчитывали с использованием аддитивной модели: 40 Здесь Д), N0 — исходные молярные концентрации красителя и тетра- нуклеотида; D и N — равновесные молярные концентрации мономеров бромистого этидия и тетрануклеотида соответственно; дт, dd, ди д2, б3 — протонные химические сдвиги молекулы красителя в мономерной и димер- ной формах и в составе комплексов 1:1 (DN), 2:1 (D2N) и 1:2 (DN2) соответственно. Величины дт и dd определены ранее [13] при исследовании самоассоци- ации бромистого этидия исходя из концентрационных зависимостей протон- ных химических сдвигов красителя в тех же экспериментальных условиях. Тогда наблюдаемый химический сдвиг д является функцией неизвестных (5,-ьдз, К { +К г . Такую многопараметрическую задачу целесообразно решать методом последовательного усложнения модели [5—7 ]: в качестве первона- чального приближения использовали четырехпараметрическую модель, включающую в себя реакции самоассоциации молекул и комплексообразо- вания красителя с мономером дезокситетрануклеотида (реакции а—d систе- мы уравнений (1)). В следующей расчетной схеме дополнительно учтена равновесная реакция 1(e) формирования 1:2-комплекса через «скрепку». В процессе расчетов были также проанализированы другие схемы образования комплексов в растворе, учитывающие, например, дополнительное формиро- вание комплексов 1:2 и 2:2 путем непосредственного связывания одной и двух молекул красителя с дуплексом тетрануклеотида. Однако вклад дополнительных реакций в суммарное равновесие в растворе оказался ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЯ БРОМИСТОГО ЭТИДИЯ пренебрежимо мал и в дальнейшем не учитывался при анализе процессов комплексообразования. Вычислительная процедура нахождения параметров модели, основанная на минимизации квадратичного функционала невязки с использованием экспериментальных концентрационных зависимостей хи- мических сдвигов различных протонов красителя, достаточно подробно описана в [15 ]. Сравнение рассчитанных равновесных констант образования комплексов 1:1, 2:1 и 1:2 бромистого этидия с некомплементарным дезокси- тетрануклеотидом d(CGAA) (таблица) со значениями констант К х +К 3 для подобных комплексов этого красителя с самокомплементарными тетранук- леотидами [5—7 ] показывает их качественное отличие. Прежде всего обращает на себя внимание тот факт, что константа Кх образования 1:1-комплекса бромистого этидия существенно больше значения Къ связы- вания красителя с димером некомплементарного тетрануклеотида (Кх > Къ). В случае комплексообразования бромистого этидия с самокомплементарны- ми дезокситетрануклеотидами наблюдается обратная картина, когда К3 > > К], т. е. вероятность связывания красителя с дуплексом заметно выше, чем с одиночной нитью тетрамеров [5—7 ]. Следует отметить, что возмож- ность специфического спаривания оснований при скольжении нитей неком- плементарного дезокситетрануклеотида d(CGAA) одна относительно другой [12], по-видимому, сказывается на величине равновесной константы Къ связывания красителя с димерной нуклеотидной последовательностью. Чис- ленные значения равновесных констант для реакций комплексообразова- ния бромистого этидия с мономерами самокомплементарных дезокситетра- нуклеотидов [5—7 ] оказываются одного порядка с величиной Кх для некомплементарного тетрануклеотида d(CGAA). Вместе с тем сравнитель- ный анализ значений Кх для исследованных тетрамеров показывает их существенную зависимость от нуклеотидной последовательности. Так, рав- новесная константа образования 1:1-комплекса бромистого этидия с d(ACGT) [6] примерно в три раза превышает величину Кх для тетрамера 41 ВЕСЕЛКОВ А. Н. И ДР. Оценки показывают, что для комплексов 1:1 и 2:1 красителя с мономе- ром тетрануклеотида d(CGAA) энтальпии равны АН] = - ( 4 7 ±13) кДж/моль и А# 2 = -(77±20) кДж/моль соответственно. Связывание бромистого этидия с димером d(CGAA) характеризуется значением АН ъ = -(53±22) кДж/моль, что по абсолютной величине примерно в два раза меньше энтальпии образования 1:2-комплексов красителя с самокомплементарными тетранук- леотидами в водном растворе [16]. Следует отметить, что проведенные расчеты АН і (і = 1, 2, 3) носят лишь оценочный характер. Детальный анализ вкладов отдельных реакций в термодинамику комплексообразования молекул в условиях сложного равновесия в растворе может быть сделан на основании результатов расчетов термодинамических параметров исходя из температурных зависимостей протонных химических сдвигов красителя в смеси с тетрамером [16]. Значения индуцированных химических сдвигов протонов бромистого этидия Ад і = дт—dh где і = 1, 2, 3, соответствуют типу комплекса (см. таблицу), для всех протонов в комплексах одиночной нити тетрануклеотида с одной молекулой красителя Ад{ превышают значения Ад2 для соответст- вующих комплексов с двумя молекулами красителя. Очевидно, что расчет- ные значения Ад2 в 2:1-комплексе — средние для двух связанных с тетра- нуклеотидом молекул бромистого этидия. Это позволяет предположить, что при комплексообразовании двух молекул красителя имеет место существен- но различная экранировка протонов бромистого этидия в разных сайтах одноцепочечной тетрануклеотидной последовательности d(CGAA). Что же касается значений индуцированных химических сдвигов Ад3 в 1 ̂ -комплек- се при связывании бромистого этидия с димером тетрануклеотида, то они для всех протонов оказываются близкими к величине Д(3, в комплексе однонитчатого тетрануклеотида с одной молекулой красителя. Высокая экранировка протонов красителя нуклеотидами одной нити может быть обеспечена только при условии уменьшения расстояния между хромофором бромистого этидия и ароматическими основаниями в месте связывания лиганда и изменения угловых конформационных параметров по сравнению с комплексом красителя с димером тетрануклеотида. Анализ значений индуцированных химических сдвигов для всех протонов бромистого этидия в комплексе 1:1 красителя с одиночной нитью дезокситетрануклеотида d(CGAA) дает основание полагать, что в этом комплексе существует 42 d(CGAA) при одинаковых условиях эксперимента (Т = 298 К, 0,1 М фосфатный буфер). Этот результат свидетельствует о существовании сик- венс-специфичности при связывании ароматического лиганда бромистого этидия с одноцепочечными олигонуклеотидными последовательностями. Из данных таблицы видно, что равновесная константа К2> Ки т. е. связывание второй молекулы бромистого этидия с одиночной нитью тетрануклеотида имеет антикооперативный характер. Подобная картина наблюдалась и при комплексообразовании красителя с мономерами самокомплементарных де- зокситетрануклеотидов различной последовательности оснований в цепи [5—7]. Повышение температуры (см. таблицу) закономерно приводит к уменьшению равновесных констант комплексообразования бромистого эти- дия как с мономерной, так и с димерной формами дезокситетрануклеотида d(CGAA) и к сравнительно небольшому изменению д( (і = 1, 2, 3). Таким образом, увеличение температуры от Т, = 298 К до Т2 = 308 К не оказывает значительного влияния на величины предельных химических сдвигов кра- сителя в составе комплексов, т. е. параметров, которые используются для анализа молекулярных структур. Знание равновесных констант образования комплексов при двух температурах позволяет оценить энтальпии комплек- сообразования молекул, используя соотношение Вант-Гоффа: ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЯ БРОМИСТОГО ЭТИДИЯ Рис. 4. Относительное содержание молеку- лярных комплексов в растворе в зависимо- сти от г - Nq/Dq при Dq = 1,15-10 3 моль/л, Т - 298 К: 1 — комплекс 1:2 (DN2)\ 2 — комплекс 1:1 (DN); 3 — комплекс 2:1 (D2N)\ 4— мономер бромистого этидия (./)); 5 — димер бромистого этидия (D2) большая вероятность присоединения красителя к нити тетрануклеотида как со стороны ароматического кольца, содержащего протоны Н2 и Н4, так и с противоположной стороны хромофора, где находятся протоны Н7 и Н9. По найденным значениям констант реакций (см. таблицу) было рассчи- тано относительное содержание молекулярных ассоциатов в растворе в зависимости от г = N j D0 — соотношения исходных концентраций нитей тетрануклеотида и красителя (рис. 4). Качественный характер полученных зависимостей для комплексообразования бромистого этидия с некомплемен- тарным дезокситетрануклеотидом d(CGAA) согласуется с наблюдаемыми для самокомплементарных А—Т-содержащих дезокситетрануклеотидов [5— 7 ]. Прежде всего следует отметить тот факт, что вклад в общее равновесие различного типа комплексов, как и в случае комплексообразования краси- теля с самокомплементарными тетрануклеотидами [5—7 ], определяется не только значениями равновесных констант реакций, но существенно зависит и от г. При г < 1,0 велика относительная концентрация комплексов 1:1 и 2:1 красителя с одноцепочечным тетрануклеотидом (кривые 2, 3). С ростом г наблюдается возрастание доли 1:2-комплекса, формирующегося через «скрепку» (кривая У), несмотря на относительно малое значение равновес- ной константы К3. Высокая доля комплекса 1:2 при г > 1, образующегося через «скрепку», связана с увеличением концентрации мономеров тетранук- леотида с ростом г. Важно отметить, что как и в [5—7 ], максимумы на концентрационных кривых для комплексов 1:1 и 2:1 наблюдаются при значениях г, близких к стехиометрическим соотношениям исходных кон- центраций тетрануклеотида и красителя для соответствующих типов комп- лексов. Качественное объяснение такого хода зависимостей дано в работе [4 ]. Анализ динамического равновесия при комплексообразовании молекул существен для установления вклада каждого типа комплекса в эксперимен- тально наблюдаемый протонный химический сдвиг и для корректной интер- претации двухмерных спектров 2M-NOESY, когда возникает вопрос о расчете структур образующихся комплексов по значениям интенсивностей сигналов NOE [5]. Структура комплексов. Анализ структур комплексов бромистого эти- дия с d(CGAA) проводили на основании рассчитанных предельных значений протонных химических сдвигов. Из таблицы видно, что А<3/ = дт—dh определяющие индуцированные химические сдвиги протонов красителя в область сильного поля, находятся в пределах 0,32-^0,82 млн 1 для рассмот- ренных типов комплексов при Т = 298 К, что свидетельствует о значитель- ном экранирующем влиянии азотистых оснований на все протоны бромисто- го этидия и предполагает встраивание красителя между плоскостями осно- 43 ВЕСЕЛКОВ А. Н. И ДР. где jUj — магнитный момент эквивалентного диполя /-го ароматического кольца азотистого основания; гу — расстояние от у-го диполя до рассматри- ваемого протона; Oj — угол между направлением поля и вектором г/, f (R, 4х) — параметрическое регрессионное соотношение в виде многочлена для аппроксимации квантово-механических кривых экранирования; R, — полярные координаты в системе отсчета, связанной с осью спирали молеку- лы и плоскостью, в которой располагается хромофор ароматической моле- кулы красителя. Экспериментальные исследования свидетельствуют о том, что гомопо- лимеры могут находиться в виде одноцепочечных спиралей [19]. В настоя- щей работе рассчитывали экранирование протонов бромистого этидия сосед- ними основаниями в комплексах 1:1 и 2:1 при вариации конформационных параметров спирали. Использовали алгоритм преобразований координат атомов нуклеотидных пар и программу, реализующую этот алгоритм, разработанные в ИТЭБ РАН [20]. Последовательность преобразований координат при расчетах индуцированных химических сдвигов протонов красителя отвечала изменению параметров со (пропеллер), к (излом пары), г (наклон пары), р (крен), Dx (сдвиг), Dy (скольжение), Q (закручивание) и Dz (поднятие) [12]. Для того чтобы использовать такие преобразования координат нуклеотидных пар в двойной спирали, в процессе вычислений для одноцепочечного тетрануклеотида d(CGAA) достраивали вторую нить дуплекса из комплементарных оснований (d(GCTT)). Однако при расчете экранирования протонов красителя учитывали основания только одной нити спирали, а комплементарные основания второй нити исключали из рассмот- рения. Построение структур комплексов проводили путем минимизации квадратичного функционала невязки значений индуцированных протонных химических сдвигов, полученных из экспериментальных концентрационных зависимостей (см. таблицу) и рассчитанных по соотношению (4) при вариации параметров спирали. Оценки с использованием суммарных кон- стант спин-спинового взаимодействия для НГ и Н2', Н2" протонов дезок- сирибозы [22 ] позволили сделать заключение о том, что дезоксирибозные остатки тетрануклеотида 5'-d(CpGpApA) в растворе с бромистым этидием находятся преимущественно в С2'-эндо-конформации, соответствующей В-форме ДНК. Ранее показано [5—7], что в случае комплексообразования бромистого этидия с мономерами самокомплементарных дезокситетранукле- отидов краситель преимущественно связывается с сайтами, содержащими чередующиеся типы оснований в цепи (пиримидин-пуриновые или пурин- пиримидиновые сайты в последовательности). В связи с этим в расчетах полагали, что пиримидин-пуриновый участок (CG-сайт) последовательно- сти d(CGAA) является местом преимущественной посадки красителя в 44 ваний тетрануклеотида. Квантово-механические расчеты [17] показывают что кольцевые токи азотистых оснований нуклеиновых кислот дают основ ной вклад (~70 %) в экранирование ядер соседних молекул в сравнении < локальными диа- и парамагнитными эффектами и поляризуемостью связей Для расчета химических сдвигов, вызванных кольцевыми токами, обычш применяют модель эквивалентного диполя [18], в которой действие круго вых токов заменяется эквивалентным действием магнитных диполей, поме щенных в центр каждого ароматического кольца молекулы. Соответствую щим подбором величин магнитных моментов диполей и введением аппрок симирующих соотношений для учета дополнительного экранирования, н< связанного с круговыми токами, можно получить достаточно точную оценку общего экранирования ядер азотистыми основаниями. Индуцированньк химические сдвиги протонов красителя тогда могут быть рассчитаны следу ющим образом [4 ]: ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЯ БРОМИСТОГО ЭТИДИЯ 1:1-комплексе. На рис. 5 и 6 представлены в различных проекциях рассчитанные наиболее вероятные структуры комплексов 1:1 бромистого этидия с одноцепочечным дезокситетрануклеотидом d(CGAA), отвечающие встраиванию красителя в d(CG)-cam тетрамера соответственно со стороны ароматического кольца, содержащего протоны Н7 и Н9, и с противополож- ной стороны хромофора, где находятся протоны Н2 и Н4. Структуры таких комплексов фактически отличаются тем, что в них имеет место антипарал- лельная ориентация хромофора красителя в С—G-участке тетрамера (фе- нантридиновый хромофор в структуре комплекса на рис. 5 развернут на 180° по отношению к представленной на рис. 6). Пространственное изобра- жение структуры получено с помощью программы «Mathematica 2.0» (Wolfram Res. Ltd). Длины связей и валентные углы в структуре молекулы бромистого этидия, необходимые для проведения расчетов, взяты по данным рентгеноструктурного анализа [23 J. При построении структур учитывали, что расчетные значения Ад] в 1:1-комплексе являются средними для двух возможных ориентаций красителя в интеркалированном комплексе. Комп- лекс 1:1 характеризуется следующими параметрами спирали: Dz = 6,38 А, Рис. 5. Расчетная структура комплекса 1:1 бромистого этидия с 5'-d(CpGpApA), соответству- ющая встраиванию красителя в сНСО-сайт одноцепочечного тетрануклеотида со стороны ароматического кольца, содержащего протоны Н7 и Н9: а — вид на комплекс сбоку. Хромофор красителя заштрихован; б — вид на сНСО-сайт со встроенным красителем сверху, показыва- ющий взаимное расположение плоскостей оснований и хромофора бромистого этидия в 1:1 комплексе 45 ВЕСЕЛКОВ А. Н. И ДР. Рис. 6. Расчетная структура комплекса 1:1 бромистого этидия с 5'-d(CpGpApA), соответству- ющая встраиванию красителя в сНСО-сайт одноцепочечного тетрануклеотида со стороны ароматического кольца, содержащего протоны Н2 и Н4. Обозначения см. рис. 5 Q = 28,5°, 0)=5\т = 0°, Dx = -0,77 A, Dy = 1,95 А, р - 3,5°, к = 3°. Хромофор красителя в 1:1-комплексах располагается перпендикулярно оси спирали на равных расстояниях (3,19 А от плоскостей оснований верхнего гуанина и нижнего цитозина в CG-сайте. Обращает на себя внимание уменьшение расстояния между плоскостями азотистых оснований, существенно больший сдвиг и угол закручивания оснований в 1:1-комплексе по сравнению с интеркалированным 1:2-комплексом красителя с тетрануклеотидным дуп- лексом [5—7 ]. Одноцепочечная структура олигонуклеотида в отличие от дуплексной обладает значительно большей конформационной свободой. Можно предположить, что определенную роль в стабилизации 1 ^-комплек- са оказывает электростатическое взаимодействие между положительно за- ряженным азотом бромистого этидия и отрицательным фосфатом тетранук- леотида. Наиболее вероятная структура комплекса 2:1 бромистого этидия с одиночной нитью дезокситетрануклеотида d(CGAA), отвечающая встраива- нию красителя в CG- и АА-сайты тетрамера, рассчитана по методике, аналогичной описанной выше для 1:1-комплекса. Существенно, что в CG-сайте комплекса 2:1 возрастает (в сравнении с комплексом 1:1) рассто- яние между плоскостями соседних оснований (Dz — 6,85 А) и изменяются 46 ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЯ БРОМИСТОГО ЭТИДИЯ некоторые угловые параметры спирали, в частности, углы спирального вращения и крена. Как уже отмечалось, получаемые в результате расчетов величины экранирования протонов бромистого этидия в 2:1-комплексе фактически являются средними для двух возможных мест связывания в сайты d(C-G) и d(A-A) дезокситетрануклеотида, отличающиеся составом и последовательностью оснований в цепи. В связи с этим для исследуемого некомплементарного тетрануклеотида не представляется возможным строго рассчитать структуру комплексов красителя с различными участками одно- цепочечной последовательности. Такая задача может быть решена в резуль- тате изучения взаимодействия лигандов со специально синтезированными дезокситетрануклеотидами различной последовательности оснований [24 ]. Что касается 1:2-комплекса бромистого этидия с димером d(CGAA), то сравнение индуцированных химических сдвигов Ад3 протонов красителя (см. таблицу) с рассчитанными значениями Ад3 для 1:2-комплекса красите- ля с самокомплементарным тетрануклеотидом d(ACGT) [6] показывает их хорошее соответствие. Следовательно, можно предположить, что так же, как и в 1 ̂ -комплек- се бромистого этидия с d(ACGT), краситель преимущественно встраивается в CG-сайт димера тетрануклеотида d(CGAA). При этом достаточно близкие значения величин экранирования всех протонов красителя в 1:2-комплексах бромистого этидия с этими тетрануклеотидами в одних и тех же экспери- ментальных условиях предполагают подобное пространственное расположе- ние плоскостей пар оснований и хромофора красителя в интеркалированных комплексах. Выражаем благодарность Королевскому обществу Великобритании за частичное финансирование (А. Н. В.) экспериментальных исследований; Объединенному исследовательскому центру Лондонского университета — за предоставленную возможность в Беркбек колледже и Куин Мери колледже использовать для измерений ЯМР-спектрометры 500 и 600 МГц; Централь- ному исследовательскому Фонду Лондонского университета — за финанси- рование (Д. Д.) приобретения образцов олигонуклеотидов. Проведенные исследования частично финансированы Грантом N UD 7200 Международного научного фонда. О. Н. Веселков, С. Ф. Барановський, Л. Н. Димант, М. В. Петренко, С. Г. Осетров, А. Такер, Д. Девіс Дослідження комплексоутворення бромистого етидію з одноланцюговим некомплементарним дезокситетрануклеотидом 5'-d(CpGpApA) у водному розчині методом Н-ЯМР спектроскопії Резюме Методом одномірної та двомірної1 Н-ЯМР спектроскопії (500 і 600 МГц) вивчено комплексоут- ворення у водно-сольовому розчині барвника бромистого етидію (3,8-діаміно-6-феніл-5-етил- фенантридин) з одноланцюговим некомплементарним дезокситетрануклеотидом 5'-d(CpGp- АрА). Виміряно концентраційні залежності хімічних зсувів протонів взаємодіючих молекул за різних температур (Tt= 298 і Т2 = 308 К). Дослідження самоасоціації тетрануклеотиду засвід- чили малу вірогідність утворення дуплексів у розчині У зв'язку з цим у розчині основну роль віді- грають комплекси барвника з одиничною ниткою тетрануклеотиду, що дає змогу проаналізува- ти специфіку взаємодії ароматичного ліганда з одноланцюговою ДНК. Розглянуто різні схеми комплексоутворення, визначено рівноважні константи і граничні значення хімічних зсувів про- тонів бромистого етидію у комплексах. Зроблено аналіз відносного вмісту комплексів різного типу і виявлено особливості динамічної рівноваги в залежності від співвідношення концентрацій барвника і тетрануклеотиду. На основі отриманих даних зроблено висновок про існування сик- венсспецифічності зв'язування бромистого етидію з одноланцюговою нуклеотидною послідов- ністю. За розрахунками індукованих хімічних зсувів протонів барвника побудовано найвірогідні- иіі структури комплексів І:І бромистого етидію з одиничною ниткою дезокситетрануклеоти- 47 ВЕСЕЛКОВ А. Н. И ДР. ду, які відповідають двом можливим типам вбудовування барвника між основами цитозину і гуаніну — з діаметрально протилежних сторін фенантридинового хромофора. А. N. Veselkov, S. F. Baranovsky, L. N. Djimant, N. V. Petrenko, S. G. Osetrov, A. Tucker, D. B. Dames !H-NMR investigation of complex formation of ethidium bromide with single-stranded non- complementary deoxytetranucleotide 5'-d(CpGpApA) in aqueous solution Summary Complex formation between the aromatic dye ethidium bromide (3,8-diamino-6-phenyl-5-ethyl-phenan- thridine) and single-stranded non-complementary deoxytetranucleotide 5'-d(CpGpApA) in aqueous so- lution has been studied by one- and two-dimensional 1H-NMR spectroscopy (500 and 600 MHz). Con- centration dependences of proton chemical shifts of the interacting molecules were measured at different temperatures T1 - 298 К and T2 = 308 K. Investigations of the self-association of the tetranucleotide molecules have shown that there is a very low probability of duplex formation at the experimental conditions studied. It follows that the complexations of the dye molecules with the monomer of the tetranucleotide play the main role in the complex equilibrium in solution giving an opportunity to analyze the specificity of interactions of aromatic ligand with the single-stranded DNA. Different schemes of complex formation have been examined, equilibrium reaction constants and limiting chemical shifts of dye protons in different complexes have been determined. Analysis of the relative content of different types of complexes was made and special features of the dynamic equilibrium were revealed as a function of both the dye and tetra- nucleotide concentrations. The analysis has shown that there is a sequence-specific binding of ethidium bromide with the single-stranded oligonucleotide. The most favorable structures of 1:1 complexes of the dye with the single strand of the tetranucleotide corresponding to the drug binding from the opposite aromatic rings of the phenanthridine chromophore were constructed using the calculated values of induced chemical shifts of ethidium bromide protons. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Льюн Б. Гены.—М.: Мир, 1987.—544 с. 2. Rill R. L., Hecker K. N. Biochemistry, mapping of drug binding sites on single-stranded DNA using Sequanase T7 DNA polymerase 11 Biochemistry.—1995.—34.—P. 15987—15999. 3. Graves D. E. Sequence selective binding of actinomycin D to duplex and single-strand DNA. Book of abstracts / / Workshop on DNA-drug interactions (Madrid, 15—17 Nov., 1993).— P. 39. 4. Davies D. В., Djimant L. N., Veselkov A. N. ! H NMR structure analysis of the interactions of proflavine with self-complementary deoxytetranucleotides of different base sequence / / Nucleosides and Nucleotides.—1994.—13.—P. 637—655. 5. Веселков A. H., Дымант Л. H., Болотин П. А. и др. Исследование взаимодействия бромистого этидия с дезокситетрарибонуклеозидтрифосфатом 5'-d(GCGC) методом 'Н- ЯМР спектроскопии / / Молекуляр. биология.—1995.—29, № 2.—С. 326-338. 6. Веселков А. Н., Дымант Л. Н., Болотин П. А. и др. Исследование взаимодействия бромистого этидия с самокомплементарным дезокситетрануклеотидом 5'-d(ApCpGpT) в водном растворе методом 1 Н-ЯМР спектроскопии / / Биополимеры и клетка. —1995.—11, № 3—4.—С. 42—54. 7. Веселков А. Н., Дымант Л. Н., Болотин П. А. и др. Исследование взаимодействия бромистого этидия с самокомплементарным дезокситетрануклеотидом 5'-d(CpGpCpG) в водном растворе методом !Н-ЯМР спектроскопии / / Журн. структур, химии.—1996.—37, № 1.—С. 124—1255. 8. Takenaka S., Manabe М., Yokoyama М. et ai Specific binding to poly A of a naphthalene diimide carrying thymine groups / / J. Chem. Soc. Chem. Communs.—1996.—22.—P. 379— 380. 9. Bailey S. A., Graves D. A., Rill R., Marsh G. Influence of DNA base sequence on binding energetics of actinomycin D 11 Biochemistry.—1993.—32.—P. 5881—5887. 10. Bailey S. A., Graves D. A., Rill R. Binding of actinomycin D to the T(G)„T motif of double-stranded DNA. Determination of the guanine requirement in nonclassical, non-GpC binding sites / / Ibid.—1994.—33.—P. 11493—11500. 11. Bresloff J. L., Crothers D. M. Equilibrium studies of ethidium-polynucleotide interaction / / Ibid.—1981.—20.—P. 3547—3553. 12. Веселков A. H., Барановский С. Ф., Петренко Н. В. и др. Исследование самоассоциации молекул некомплементарных дезокситетрануклеотидов различной последовательности оснований в водном растворе методом 1 Н-ЯМР спектроскопии / / Биополимеры и клетка.—1996. —12, № 4.—С. 38—48. 13. Davies D. В., Djimant L. N., Veselkov А. N. 'Н NMR investigation of self-association of 48 ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЯ БРОМИСТОГО ЭТИДИЯ aromatic drug molecules in aqueous solution. Structural and thermodynamical analysis / / J. Chem. Soc. Faraday Trans.—1996.—92, N 3.—P. 383—390. 14. Веселков A. H., Дэвис Д, Дымант Л. И. и др. 1М- и 2М- !Н ЯМР исследование самоассоциации дезокситетрарибонуклеозидтрифосфатов различной последовательности оснований в водном растворе / / Биополимеры и клетка.—1991.—7, № 5.—С. 15—22. 15. Veselkov A. jV., Djimant L. N., Karawajew L. S., Kulikov E. L. Investigation of the aggregation of acridine dyes in aqueous solution by ! H NMR / / Stud. Biophys.—1985.—106, N 3.— P. 171 — 180. 16. Веселков A. #., Дымант Л. #., Болотин П. А. и др. Термодинамический анализ взаимодействия бромистого этидия с дезокситетрарибонуклеотидом 5'-d(GpCpGpC) по данным протонного магнитного резонанса / / Молекуляр. биология.—1996.—30, № 1.— С. 1 — 11. 17. Giessner-Prettre С., Pullman В. Quantum mechanical calculations of NMR chemical shifts in nucleic acids / / Quart. Revs Biophys.—1987.—20, N 3/4.—P. 113—172. 18. Abraham R. J. The application of aromatic ring currents in the elucidation of drug-ligand and metallo-porphyrin complexations І і Nuclear magnetic resonance spectroscopy in molecular biology.—Dordrecht: D. Reidel publ. сотр., 1978.—P. 461—479. 19. Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот.—М.: Мир, 1987.— 584 с. 20. Полтев В. ИТеплухин А. В. Взаимодействие оснований и конформационные проявле- ния последовательностей повторяющихся нуклеотидов / / Молекуляр. биология.—1987.— 21, № 1.—С. 102—115. 21. Dickerson R. Е. Definitions and nomenclature of nucleic acid structure parameters / / J. Biomol. Struct, and Dyn.—1989.—6, N 4.—P. 627—634. 22. Searle M. S. NMR studies of drug-DNA interactions / / Progr. NMR Spectr.—1993.—25.— P. 403—480. 23. Jain S. C., Tsai C.-C., Sobell H. M. Visualization of drug-nucleic acid interactions at atomic resolution. II. Structure of an ethidium/dinucleoside monophosphate crystalline complex ethidium: 5'-iodocytidyl-(3'-5')-guanosine / / J. Мої. Biol.—1977.—14, N 2.—P. 317-331. 24. Веселков A. H., Завьялова О. С., Дымант Л. Н., Дэвис Д. Исследование комплексообра- зования бромистого этидия с самокомплементарным дезокситетрануклеотидом 5'- d(TGCA) методом їН-ЯМР спектроскопии / / Журн. физ. химии. —1996.—70, № 9.— С. 1623—1630. удк 577 113 Поступила в редакцию 13.05.96 49

Репозитарії

Схожі ресурси