Функциональная роль С-концевого домена лейцил-тРНК синтетазы Thermus thermophilus

Цель. Исследовать роль С-концевого домена лейцил-тРНК синтетазы T. thermophilus (ЛейРСТТ) в реакциях аминоацилирования и редактирования. Методы. Мутант ЛейРСТТ без С-концевого домена (ΔС) получен методом мутагенеза. Кинетические константы в реакции аминоацилирования ЛейРС и ее мутанта ΔС определяли...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2010
Автори:	Гудзера, О.И., Яремчук, А.Д., Тукало, М.А.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2010
Назва видання:	Вiopolymers and Cell
Теми:	Structure and Function of Biopolymers
Онлайн доступ:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154207
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Функциональная роль С-концевого домена лейцил-тРНК синтетазы Thermus thermophilus / О.И. Гудзера, А.Д. Яремчук, М.А. Тукало // Вiopolymers and Cell. — 2010. — Т. 26, № 6. — С. 478-485. — Бібліогр.: 18 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-154207
record_format	dspace
spelling	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1542072025-02-10T00:55:44Z Функциональная роль С-концевого домена лейцил-тРНК синтетазы Thermus thermophilus Функціональна роль С-кінцевого домену лейцил-тРНК синтетази Thermus thermophilus Functional role of C-terminal domain of Thermus thermophilus leucyl-tRNA synthetase Гудзера, О.И. Яремчук, А.Д. Тукало, М.А. Structure and Function of Biopolymers Цель. Исследовать роль С-концевого домена лейцил-тРНК синтетазы T. thermophilus (ЛейРСТТ) в реакциях аминоацилирования и редактирования. Методы. Мутант ЛейРСТТ без С-концевого домена (ΔС) получен методом мутагенеза. Кинетические константы в реакции аминоацилирования ЛейРС и ее мутанта ΔС определяли методами ферментативной кинетики cтационарного состояния. Для оценки вклада С-концевого домена во взаимодействие фермента с тРНКLeu методом флуоресцентного титрования рассчитаны Кd комплекса тРНК с ЛейРСТТ и ее мутантом ΔС. Результаты. Показано, что С-концевой домен играет существенную роль в реакциях аминоацилирования и редактирования ЛейРСТТ и не существен для активности в реакции активации аминокислоты. Определены также кинетические параметры в реакции аминоацилирования ЛейРС и ΔС мутанта для тРНКLeu и тРНКTyr, анализ которых свидетельствует о том, что С-домен не является критическим для проявления специфичности фермента в узнавании гомологичной тРНК. В то же время выявлено значительное влияние С-концевого домена на величину каталитической константы реакции аминоацилирования. Делеция последнего приводит к снижению kcat в 152 раза. Выводы. С-концевой домен ЛейРСТТ эволюционно приобретен для повышения скорости катализа в реакциях амино-ацилирования и редактирования и не вносит существенного вклада в обеспечение специфичности фермента при узнавании тРНК. Мета. Дослідити роль С-кінцевого домену лейцил-тРНК синтетази T. thermophilus (ЛейРСТТ) у реакціях аміноацилювання та редагування. Методи. Мутант ЛейРСТТ без С-кінцевого домену (ΔС) отримано методом мутагенезу. Кінетичні константи в реакції аміноацилювання ЛейРС та її мутанта С визначали методами ферментативної кінетики стаціонарного стану. Для оцінювання внеску С-кінцевого домену у взаємодію ферменту з тРНКLeu методом флуоресцентного титрування розраховано Кd комплексу тРНК з ЛейРСТТ та її мутантом ΔС. Результати. Показано, що С-кінцевий домен відіграє істотну роль у реакціях аміноацилюванняя і редагування ЛейРСТТ і не є важливим для активності в реакції активації амінокислоти. Визначено також кінетичні параметри в реакції аміноацилювання ЛейРС і ΔС мутанта для тРНКLeu і тРНКTyr, аналіз яких свідчить про те, що С-домен є некритичним для прояву специфічності ферменту у розпізнаванні гомологічної тРНК. У той же час встановлено суттєвий вплив С-кінцевого домену на величину каталітичної константи реакції аміноацилювання. Делеція останнього призводить до зниження kcat у 152 рази. Висновки. С-кінцевий домен ЛейРСТТ еволюційно придбаний для підвищення швидкості каталізу в реакціях аміно-ацилювання і редагування і не робить значного внеску у забезпечення специфічності ферменту при розпізнаванні тРНК. Aim. To study a role of C-terminal domain of T. thermophilus leucyl-tRNA synthetase (LeuRSTT) in the reactions of aminoacylation and editing. Methods. A mutant of LeuRSTT without C- terminal domain (ΔC) was obtained by the method of mutagenesis. The kinetic constants in aminoacylation reaction catalyzed by LeuRS and its mutant (ΔC) were determined by the methods of equilibrium enzyme kinetics. To evaluate the contribution of C-terminal domain to interaction of the enzyme with tRNALeu, Kd of a complex between tRNA and LeuRSTT and its mutant C was determined by fluorescence titration. Results. The C-terminal domain is shown to play a significant role in the aminoacylation and editing reactions of LeuRSTT and not essential for the activity in the reaction of amino acid activation. The kinetic parameters of aminoacylation of tRNALeu and tRNATyr by LeuRS and C mutant were also determined, their analysis suggests that the C-domain is not critical for the manifestation of specificity of the enzyme in the recognition of homologous RNAs. At the same time a significant influence of the C-terminal domain on the value of catalytic constant was shown. At the domain deletion the kcat value is lower by 152-fold. Conclusion. The C-terminal domain of LeuRSTT is evolutionarily acquired to enhance the rate of catalysis in the aminoacylation and editing reactions, and makes no significant contribution to the specificity of the enzyme in the recognition of tRNA. 2010 Article Функциональная роль С-концевого домена лейцил-тРНК синтетазы Thermus thermophilus / О.И. Гудзера, А.Д. Яремчук, М.А. Тукало // Вiopolymers and Cell. — 2010. — Т. 26, № 6. — С. 478-485. — Бібліогр.: 18 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000177 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154207 577.217.32 ru Вiopolymers and Cell application/pdf Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Structure and Function of Biopolymers Structure and Function of Biopolymers
spellingShingle	Structure and Function of Biopolymers Structure and Function of Biopolymers Гудзера, О.И. Яремчук, А.Д. Тукало, М.А. Функциональная роль С-концевого домена лейцил-тРНК синтетазы Thermus thermophilus Вiopolymers and Cell
description	Цель. Исследовать роль С-концевого домена лейцил-тРНК синтетазы T. thermophilus (ЛейРСТТ) в реакциях аминоацилирования и редактирования. Методы. Мутант ЛейРСТТ без С-концевого домена (ΔС) получен методом мутагенеза. Кинетические константы в реакции аминоацилирования ЛейРС и ее мутанта ΔС определяли методами ферментативной кинетики cтационарного состояния. Для оценки вклада С-концевого домена во взаимодействие фермента с тРНКLeu методом флуоресцентного титрования рассчитаны Кd комплекса тРНК с ЛейРСТТ и ее мутантом ΔС. Результаты. Показано, что С-концевой домен играет существенную роль в реакциях аминоацилирования и редактирования ЛейРСТТ и не существен для активности в реакции активации аминокислоты. Определены также кинетические параметры в реакции аминоацилирования ЛейРС и ΔС мутанта для тРНКLeu и тРНКTyr, анализ которых свидетельствует о том, что С-домен не является критическим для проявления специфичности фермента в узнавании гомологичной тРНК. В то же время выявлено значительное влияние С-концевого домена на величину каталитической константы реакции аминоацилирования. Делеция последнего приводит к снижению kcat в 152 раза. Выводы. С-концевой домен ЛейРСТТ эволюционно приобретен для повышения скорости катализа в реакциях амино-ацилирования и редактирования и не вносит существенного вклада в обеспечение специфичности фермента при узнавании тРНК.
format	Article
author	Гудзера, О.И. Яремчук, А.Д. Тукало, М.А.
author_facet	Гудзера, О.И. Яремчук, А.Д. Тукало, М.А.
author_sort	Гудзера, О.И.
title	Функциональная роль С-концевого домена лейцил-тРНК синтетазы Thermus thermophilus
title_short	Функциональная роль С-концевого домена лейцил-тРНК синтетазы Thermus thermophilus
title_full	Функциональная роль С-концевого домена лейцил-тРНК синтетазы Thermus thermophilus
title_fullStr	Функциональная роль С-концевого домена лейцил-тРНК синтетазы Thermus thermophilus
title_full_unstemmed	Функциональная роль С-концевого домена лейцил-тРНК синтетазы Thermus thermophilus
title_sort	функциональная роль с-концевого домена лейцил-трнк синтетазы thermus thermophilus
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	2010
topic_facet	Structure and Function of Biopolymers
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154207
citation_txt	Функциональная роль С-концевого домена лейцил-тРНК синтетазы Thermus thermophilus / О.И. Гудзера, А.Д. Яремчук, М.А. Тукало // Вiopolymers and Cell. — 2010. — Т. 26, № 6. — С. 478-485. — Бібліогр.: 18 назв. — рос.
series	Вiopolymers and Cell
work_keys_str_mv	AT gudzeraoi funkcionalʹnaârolʹskoncevogodomenaleiciltrnksintetazythermusthermophilus AT âremčukad funkcionalʹnaârolʹskoncevogodomenaleiciltrnksintetazythermusthermophilus AT tukaloma funkcionalʹnaârolʹskoncevogodomenaleiciltrnksintetazythermusthermophilus AT gudzeraoi funkcíonalʹnarolʹskíncevogodomenuleiciltrnksintetazithermusthermophilus AT âremčukad funkcíonalʹnarolʹskíncevogodomenuleiciltrnksintetazithermusthermophilus AT tukaloma funkcíonalʹnarolʹskíncevogodomenuleiciltrnksintetazithermusthermophilus AT gudzeraoi functionalroleofcterminaldomainofthermusthermophilusleucyltrnasynthetase AT âremčukad functionalroleofcterminaldomainofthermusthermophilusleucyltrnasynthetase AT tukaloma functionalroleofcterminaldomainofthermusthermophilusleucyltrnasynthetase
first_indexed	2025-12-02T08:44:23Z
last_indexed	2025-12-02T08:44:23Z
_version_	1850385433980043264
fulltext	Функциональная роль С-концевого домена лейцил-тРНК синтетазы Thermus thermophilus О. И. Гуд зе ра, А. Д. Ярем чук, М. А. Ту ка ло Инсти тут мо ле ку ляр ной би о ло гии и ге не ти ки НАН Укра и ны Ул. Академика За бо лот но го, 150, Киев, Укра и на, 03680 mtukalo@imbg.org.ua Цель. Иссле до вать роль С-кон це во го до ме на лей цил-тРНК син те та зы T. thermophilus (ЛейРСТТ) в ре ак ци ях ами но а ци ли ро ва ния и ре дак ти ро ва ния. Ме то ды. Му тант ЛейРСТТ без С-кон це во го до ме - на (∆С) по лу чен ме то дом му та ге не за. Ки не ти чес кие кон стан ты в ре ак ции ами но а ци ли ров ания ЛейРС и ее му тан та ∆С опре де ля ли ме то да ми фер мен та тив ной ки не ти ки cта ци о нар но го со сто я - ния. Для оцен ки вкла да С-кон це во го до ме на во вза и мо де йствие фер мен та с тРНКLeu ме то дом флу о - рес цен тно го тит ро ва ния рас счи та ны Кd ком плек са тРНК с ЛейРСТТ и ее му тан том ∆С. Ре зуль- таты. По ка за но, что С-кон це вой до мен иг ра ет су щес твен ную роль в ре ак ци ях ами но а ци ли ро ва ния и ре дак ти ро ва ния ЛейРСТТ и не су щес твен для ак тив нос ти в ре ак ции ак ти ва ции ами но кис ло ты. Опре де ле ны так же ки не ти чес кие па ра мет ры в ре ак ции ами но а ци ли ро ва ния ЛейРС и ∆С му тан та для тРНКLeu и тРНКTyr, ана лиз ко то рых сви де т ельству ет о том, что С-до мен не яв ля ет ся кри ти - чес ким для про яв ле ния спе ци фич нос ти фер мен та в узна ва нии го мо ло гич ной тРНК. В то же вре мя вы яв ле но зна чи тель ное вли я ние С-кон це во го до ме на на ве ли чи ну ка та ли ти чес кой кон стан ты ре ак - ции ами но а ци ли ро ва ния. Де ле ция по след не го при во дит к сни же нию kcat в 152 раза. Вы во ды. С-кон це - вой до мен ЛейРСТТ эво лю ци он но при об ре тен для по вы ше ния ско рос ти ка та ли за в ре ак ци ях амино- аци ли ро ва ния и ре дак ти ро ва ния и не вно сит су щес твен но го вкла да в об ес пе че ние спе ци фич нос ти фер мен та при узна ва нии тРНК. Клю че вые сло ва: лей цил-тРНК син те та за, тРНКLeu, ре дак ти ро ва ние. Вве де ние. Вы со кая точ ность пе ре да чи ге не ти чес - кой ин фор ма ции яв ля ет ся не об хо ди мым усло ви ем функ ци о ни ро ва ния жи вых орга низ мов. Боль шое зна че ние в этом име ют ами но а цил-тРНК син те та зы (АРСазы), ко то рые ка та ли зи ру ют двух ста дий ную ре ак цию при со е ди не ния со от ве тству ю щей ами но - кис ло ты к 3'-кон це во му аде но зи ну спе ци фи чес кой тРНК и вы пол ня ют важ ную роль в про цес се транс - ля ции ге не ти чес кой ин фор ма ции. Каж дая АРСаза вы би ра ет спе ци фи чес кую ами но кис ло ту из 20 при - су тству ю щих в кле точ ном пуле. Не ко то рые ами но - кис ло ты име ют очень сход ные раз ме ры и хи ми чес - кую струк ту ру бо ко вых це пей, что иног да при во - дит к не кор рек тной ак ти ва ции ами но кис ло ты и не кор рек тно му ами но а ци ли ро ва нию тРНК. Вслед- ствие это го це лый ряд АРСаз (ИлейРС, ЛейРС, ВалРС, АлаРС, ТреРС, ПроРС и ФенРС) об ла да ют ре дак ти ру ю щей ак тив нос тью, бла го да ря ко то рой про ис хо дит гид ро лиз оши боч но го ами но а ци ла де - ни ла та (пре тран сфер ное ре дак ти ро ва ние) или оши - боч ной ами но а цил-тРНК (по сттран сфер ное ре дак - ти ро ва ние) [1]. На осно ва нии кон сер ва тив ных по сле до ва тель нос тей и ха рак тер ных струк тур ных мо ти вов 20 АРСаз раз де ле ны на два клас са – по 10 в каж дом [2, 3]. Изу ча е мая нами лей цил-тРНК син те - та за T. thermоphilus (ЛейРСТТ) от но сит ся к клас су 478 ISSN 0233-7657. Biopolymers and Cell. 2010. Vol. 26. N 6. P. 478–485  Institute of Molecular Biology and Genetics NAS of Ukraine, 2010 1а, к ко то ро му так же при над ле жат ва лил- и изо лей - цил-тРНК син те та зы. Крис тал ли чес кая струк ту ра ЛейРСТТ вы яс не на в при су тствии раз лич ных суб стра тов, вклю чая тРНКLeu [4–7]. Прос тра нствен ная струк ту ра это го фер мен та име ет удли нен ную фор му, ха рак тер ную для всех АРСаз клас са 1а, и слож ное мо дуль ное стро е ние [5]. В ее со став вхо дят че ты ре чет ких мо - дуля-вклю че ния (ре дак ти ру щий до мен, до мен Zn- 1, лей цин-спе ци фи ческий до мен и С-до мен), под - виж но со е ди нен ных с те лом мак ро мо ле ку лы че рез экс по ни ро ван ные в рас твор β-тя жи (рис. 1). Ре дак ти ру ю щие до ме ны (CP1) яв ля ют ся уни - каль ны ми для лей цил-, изо лей цил- и ва лил-тРНК син те таз, одна ко они име ют раз лич ные точ ки вклю че ния в по ли пеп тид ной це пи мо ле ку лы фер - мен та. Пос ле де таль но го срав не ния пер вич ных струк тур АРСаз уста нов ле но, что у ар хе бак те ри - аль ных, эу ка ри от ных ЛейРС и всех изо лей цил- и ва лил-тРНК син те таз ре дак ти ру ю щий до мен на хо - дит ся межу дву мя час тя ми до ме на Zn-1, тог да как у бак те ри аль ных и ми то хон дри аль ных ЛейРС этот до мен рас по ло жен по сле до ме на Zn-1. Ха рак тер - ной осо бен нос тью АРСаз клас са 1а яв ля ет ся на ли - чие ме нее кон сер ва тив но го С-до ме на, ко то рый (в от ли чие от дру гих АРСаз) не вза и мо де йству ет с ан - ти ко до ном в про цес се узна ва ния тРНК [8]. Этот до - мен, со сто я щий при бли зи тель но из 60 ами но кис - лот ных остат ков (а. о.), свя зан с те лом мо ле ку лы че рез под виж ный лин кер и вза и мо де йству ет с углом L-фор мы РНКLeu. C-кон це вой до мен Лей- РСТТ (а. о. 815–878), ко то рый не ви ден в струк ту ре сво бод но го фер мен та [5, 6], в ком плек се ЛейРС с тРНКLeu пред став ля ет со бой ком пак тный аль фа-бе - та-до мен и рас по ло жен над тре тич ной па рой осно - ва ний тРНК G19–C56. В ря де ра бот из уче но вли я ние де ле ции С-до ме - на ЛейРС из раз лич ных об ъ ек тов на ами но а ци ли - ру ю щую и ре дак ти ру ю щую ак тив нос ти фер мен та. Так, для усе чен ной ЛейРС Pyrо cоccus hоr ikоshi [9] по ка за но по лное от су тствие ами но а ци ли ру ю щей ак тив нос ти, в то вре мя как ак тив ность в ре ак ции ак - ти ва ции ами но кис ло ты в три раза вы ше по срав не - нию с та ко вой по лно раз мер но го фер мен та. Инте - рес но, что де ле ция С-кон це во го до ме на прак ти чес - ки не вли я ет на ре дак ти ру ю щую ак тив ность ЛeйРС P. hоr ikоshi. В ра бо те [10] со пос тав ле ны ак тив нос - ти в би о син те зе бел ка для ∆С-му тан тов ЛейРС Escherichia со li и ми то хон дрий дрож жей. В от сут- ствие С-до ме на фер мент из Е. со li по лнос тью те ря - ет ами но а ци ли ру ю щую и ре дак ти ру ю щую ак тив - нос ти, тог да как де ле ция С-кон це во го до ме на Лей- РС из ми то хон дрий дрож жей по вы ша ет ука зан ные актив нос ти. ∆С-му тан ты ЛейРС Е. со li и ми то хонд- рий дрож жей ак ти ви ру ют лей цин так же, как со от - ве тству ю щие фер мен ты ди ко го ти па. Та ким об ра зом, роль С-до ме на в функ ци о ни ро - ва нии ЛейРС окон ча тель но не вы яс не на. B свя зи с тем, что для ЛейРСТТ крис тал ли чес кая струк ту ра ком плек са фер мен та с тРНКLeu из вес тна, пред став - ля ет ин те рес из уче ние функ ци о наль ной ро ли ее С-кон це во го до ме на. Ма те ри а лы и ме то ды. В ра бо те ис поль зо ва ны трис, HEPES («ICN Biomedicals», США), ДЭАЭ-се - фа ро за, ге па рин-се фа ро за («Pharmacia», Шве ция), MgCl2, ЭДТА, Norit A, ПЭИ-цел лю ло за («Merck», ФРГ), тРНКLeu и тРНКTyr («Boehringer», ФРГ), 14С- лей цин (238 мКи/ммоль) (Инсти тут ис сле до ва ния, про из во дства и ис поль зо ва ния изо то пов, Че хия), [14С]изо лей цин (318 мКи/ммоль), [14C]ATP (50 мКи/ ммоль) фир мы «Amersham» (Англия). Осталь ные ре а ген ты име ют ква ли фи ка цию «осч» и «хч». Очис тка на тив ной и му тан тной ЛейРС Т. ther- mophilus. ЛейРСТТ (а. о. 1–878) и ∆С-му тант Лей- РСТТ (а. о. 1–812) кло ни ро ва ны [10], сек ве ни ро ва - РОЛЬ С-КОНЦЕВОГО ДОМЕНА ЛЕЙЦИЛ-тРНК СИНТЕТАЗЫ THERMUS THERMOPHILUS 479 С-домен Редактирующий домен Лейцин- специфический домен Домен Zn-1 Рис. 1. Мо дель про стра нствен ной струк ту ры ком плек са ЛейРС–тРНКLeu из T. thermophilus (3,3 C) [6] ны и су перэ кспрес си ро ва ны в клет ках E. сoli штам - ма BL21 (DE 3) pLysS [4]. Вы со ко о чи щен ные пре - па ра ты ЛейРСТТ ди ко го ти па и ее де ле ти ро ван ной фор мы (ЛейРСТТ ∆С) вы де ля ли, как опи са но в ра - бо те [11]. Му та ге нез ге на ЛейРСТТ про во ди ли со глас но [12]. Определе ние ак тив нос ти ЛейРС в ре ак ции ами но а ци ли ро ва ния тРНКLeu. Ре ак цию ами но а ци - ли ро ва ния тРНКLeu осу ще ствля ли при t = 37 °С в ре - акци он ной сме си об ъ емом 25 мкл, со дер жа щей 100 мМ трис-HCl, pH 7,9, 15 мМ MgCl2, 2 мМ АТР, 25 мкМ [14C]лей цин, 0,2 мг/мл бычь е го сы во ро точ - но го аль бу ми на (БСА) и 4 мг/мл сум мар ной тРНК E. coli. Ре ак цию ини ци и ро ва ли до бав ле ни ем 10 нМ ЛейРС. Че рез опре де лен ные про ме жут ки вре ме ни от би ра ли алик во ты по 10 мкл и на но си ли на бу маж - ные фи льтры Whatman 3MM, пред ва ри тель но об ра - бо тан ные 10 %-м рас тво ром трих ло рук сус ной кис - ло ты (ТХУ), триж ды про мы ва ли 5 %-й ТХУ и один раз – эта но лом. Фи льтры вы су ши ва ли, их ра ди о ак - тив ность опре де ля ли на сцин тил ля ци он ном счет - чи ке RacBeta («LKB», Шве ция). Опре де ле ние ак тив нос ти ЛейРС в ре ак ции АТР-РРi-об ме на. Ре ак ци он ная смесь об ъ е мом 50 мкл со дер жа ла 50 мМ трис-HCl, pH 7,9, 10 мM MgCl2, 1 мM ATP, 15 мM KCl, 1 мМ лей цин, 1 мМ [32P]пи ро фос фат ам мо ния. Ре ак цию ини ци и ро ва ли до бав ле ни ем 10 нМ ЛейРС и ин ку би ро ва ли при тем пе ра ту ре 37 °С. Че рез опре де лен ные про ме жут - ки вре ме ни от би ра ли алик во ты об ъ е мом 15 мкл и вно си ли их в 200 мкл сме си, со дер жа щей 2 %-й ак - ти ви ро ван ный уголь (Norit A), 5 %-ю ТХУ и 0,2 М пи ро фос фат на трия. Смесь фи льтро ва ли че рез стек лян ные фи льтры Whatman GF/C, про мы ва ли во дой, а за тем 5 мл 2 %-го раствора по ли ви ни ло во го спир та. Ра ди о ак - тив ность фи льтров опре де ля ли на сцин тил ля ци он - ном счет чи ке RackBeta. По лу че ние оши боч но ами но а ци ли ро ван ной изо - лей цил-тРНКLeu. Ре ак ци он ная смесь для пре па ра - тив но го по лу че ния изо лей цил-тРНКLeu в об ъ е ме 200 мкл со дер жа ла 100 мМ HEPES, pH 7,5, 15 мМ MgCl2, 2 мM ATP, 1 мM ДTT, 40 мкг БСА, 30 мкM изо лей цин, 40 мкМ [14C]изо лей цин (318 мКи/ ммоль), 7 мкМ тРНКLeu и 1,5 мкМ му тан тную Лей- РС D347A. Смесь ин ку би ро ва ли в те че ние 15 мин при t = 60 °С, ре ак цию оста нав ли ва ли до бав ле ни ем рав но го об ъ е ма фе но ла, на сы щен но го 0,2 М аце та - том на трия, рН 5,2, цен три фу ги ро ва ли при 10000 об/мин и вод ную фа зу осаж да ли тре мя об ъ е ма ми эта но ла в при су тствии 0,3 М аце та та на трия, рН 5,2. Оса док изо лей цил-тРНКLeu со би ра ли цен три фу ги - ро ва ни ем, про мы ва ли 75 %-м эта но лом, со дер жа - щим 5 мМ аце тат на трия, цен три фу у ги ро ва ли при 10000 об/мин и вы су ши ва ли. Изо лей цил-тРНКLeu рас тво ря ли в 30 мкл 5 мМ аце та та на трия (рН 5,2) и хра ни ли при t = –30 °С. Де а ци ли ро ва ние изо лей цил-ТРНКLeu (по сттранс- фер ное ре дак ти ро ва ние). Ре ак цию про вод или при t = = 20 °С в 20 мкл сме си, со дер жа щей 100 мМ НЕРЕS, pH 7,0, 10 мM MgCl2, 2,5 мкМ изо лей цил-тРНКLeu, 0,2 мкМ ЛейРСТТ или ее му тант. Че рез опре де лен - ные про ме жут ки вре ме ни из ре ак ци он ной сме си от - би ра ли алик во ты (3 мкл) и на но си ли на бу маж ные фи льтры Whatman 3MM, пред ва ри тель но об ра бо тан - ные 10 %-й ТХУ. Фи льтры вы су ши ва ли, про мы ва ли 3 раза 5 %-й ТХУ и один раз – эта но лом, их ра ди о ак - тив ность опре де ля ли на сцин тил ля ци о ном счет чи ке. Изу че ние про цес са об ще го (сум мар но го) ре дак - ти ро ва ния по ско рос ти об ра зо ва ния [14C]AMP. Ре - ак цию про во ди ли при t = 37 °С в ре ак ци он ной сме - си об ъ е мом 25 мкл, в со став ко то рой вхо ди ли 25 мМ НЕРЕS, pH 7,5, 25 мM KCl, 10 мM MgCl2, 1 мM ATP, 4 мМ нор ва лин, 12 мкМ тРНКLeu T. ther- mophilus, 80 мкМ [14C]ATP (50 мКи/ммоль), 1 мкМ ЛейРСТТ или ее му тант. Че рез опре де лен ные про - ме жут ки времени от би ра ли алик во ты (2 мкл) и на - но си ли на плас ти ны для тон кос лой ной хро ма тог ра - фии ПЕИ-цел лю ло зы, пред ва ри тель но от мы тые во - дой и вы су шен ные. В ка чес тве мар ке ра на каж дую до рож ку на но си ли 1 мкл 30 мМ сме си АТР, АDР и АМР. Хро ма тог ра фию про во ди ли в 0,75 М КН2РО4, рН 3,5. Плас ти ну вы су ши ва ли на воз ду хе, по ло же - ние по лос, со от ве тству ю щих АТР, АDР и АМР, вы - яв ля ли в ультра фи о ле те. По лос ки вы ре за ли и опре - де ля ли их ра ди о ак тив ность на сцин тил ля ци он ном счет чи ке в то лу о ло вом сцин тил ля то ре. Рас чет Kd ком плек са ЛейРСТТ–ТРНК ме то дом ту ше ния флу о рес цен ции трип то фа на. ЛейРСТТ тит ро ва ли рас тво ром тРНК, как опи са но в ра бо те [13]. Рас твор фер мен та (0,1 мкМ) в 100 мМ трис- 480 РОЛЬ С-КОНЦЕВОГО ДОМЕНА ЛЕЙЦИЛ-тРНК СИНТЕТАЗЫ THERMUS THERMOPHILUS HCl, pH 7,8, 30 мМ KCl, 12 мМ MgCl2, 0,5 мM ДТТ тит ро ва ли рас тво ром тРНКLeu E. coli в со от ве тству - ю щей кон цен тра ции при ком нат ной тем пе ра ту ре. Флу о рес цен цию трип то фа на воз буж да ли при дли - не волны 280 нм, а эмис сию – при 340 нм. Зна че ния Kd рас счи ты ва ли по кри вой за ви си мос ти из ме не ния ин тен сив нос ти флу о рес цен ции от кон цен тра ции тРНКLeu E. coli с использованием про грам мы Ori- ginpro 7.5. Вы чис ле ние ки не ти чес ких па ра мет ров ре ак ции ами но а ци ли ро ва ния, ка та ли зи ру е мой ЛейРСТТ и ЛейРС ∆С, для ТРНК Leu и ТРНКTyr. Ре ак цию ами но- аци ли ро ва ния про во ди ли, как опи са но вы ше. Кон - цен тра цию тРНК варь и ро ва ли от 0,1 до 10 мкМ (вос емь зна че ний). Ре ак цию ини ци и ро ва ли до бав - ле ни ем фер мен та: кон цен тра ция ЛейРСТТ со став - ля ла 2 нМ, кон цен тра ция ЛейРС ∆С – 0,5 мкМ. Ре - ак ци он ную смесь ин ку би ро ва ли в те че ние 1 мин при t = 37 °С, осаж да ли 100 мкл 10 %-й ТХУ и филь- тро ва ли че рез стек лян ные фи льтры GF/C. Фи льтры вы су ши ва ли и опре де ля ли их ра ди о ак тив ность на сцин тил ля ци о ном счет чи ке. Ки не ти чес кие па ра - мет ры рас cчи ты ва ли с ис поль зо ва ни ем про грам мы Enzfitter. Ре зуль та ты и об суж де ние. В ре зуль та те из уче - ния струк ту ры ком плек са ЛейРСТТ с ее го мо ло - гич ной тРНК уста нов ле но, что С-кон це вой до мен фер мен та учас тву ет во вза и мо де йствии с тРНК [6]. Этот до мен, со сто я щий из 60 а. о., свя зы ва ет ся с углом L-фор мы тРНКLeu. Так как на основании струк тур ных дан ных вы яв ле но толь ко его вза и мо - де йствие с кон сер ва тив ной тре тич ной па рой мо ле - ку лы тРНК G19–C56, оста ва лось не яс но, учас тву ет ли он в об ес пе че нии спе ци фи чес ко го узна ва ния тРНК. Анализ пер вич ных струк тур С-до ме на Лей- РС из про ка ри о тов, ар хей и эу ка ри отов по ка зал их зна чи тель ное от ли чие, что мо жет сви де т ельство - вать о раз личной роли С-кон це во го до ме на в функ - ци о ни ро ва нии ЛейРС в за ви си мос ти от ис точ ни ка ее вы де ле ния. На ми по лу чен му тант ЛейРСТТ без С-кон це во - го до ме на и опре де ле на его ак тив ность в ре ак ци ях ак ти ва ции ами но кис ло ты и ами но а ци ли ро ва ния тРНК. Как вид но из рис. 2, де ле ция С-до ме на при - во дит к зна чи тель ной по те ре ак тив нос ти фер мен та в ре ак ции ами но а ци ли ро ва ния, в то вре мя как ак ти - ва ция ами но кис ло ты про ис хо дит прак ти чес ки с той же ско рос тью, что и для фер мен та ди ко го ти па (рис. 3). Кро ме ами но а ци ли ру ю щей, ЛейРСТТ об ла да ет еще и ре дак ти ру ю щей ак тив нос тью. Пос тран сфер - ную ре дак ти ру ющ щую ак тив ность вы яв ля ли, изу- чая гид ро лиз оши боч но ами но а ци ли ро ван ной тРНК – изо лей цил-тРНКLeu. Уста нов ле но, что гид - ро ли ти чес кая ак тив ность му тан та ∆С фак ти чес ки по лнос тью те ря ет ся (рис. 4). Та ким об ра зом, мож - но сде лать вы вод о том, что С-кон це вой до мен иг - ра ет клю че вую роль в по сттран сфер ной ак тив нос - ти ЛейРСТТ. На вер ное, этот до мен ва жен для фик - са ции тРНК в ее по сттран сфер ной кон фор ма ции, что по ка за но для крис тал ли чес кой струк туры ком - плек са ЛейРСТТ–тРНК [6]. 481 РОЛЬ С-КОНЦЕВОГО ДОМЕНА ЛЕЙЦИЛ-тРНК СИНТЕТАЗЫ THERMUS THERMOPHILUS 2 0 5 10 15 Время, мин 0 10 20 30 40 50 1 3 0 2 4 6 8 10 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Время, мин Рис. 2. Аминоацилирование тРНКLeu ЛейРСТТ ди ко го типа (1) и му тан том ∆С (2, 3) 0 5 10 15 20 25 Время, мин 0 200 400 600 800 1000 2 1 Рис. 3. Активность ЛейРСТТ ди ко го типа (1) и ∆С-му тан та (2) в ре ак ции лей цин-за ви си мо го ATP-PPi-изо топ но го об ме на Да лее про ве ря ли сум мар ную (пре- и по ст- транс фер ная) ре дак ти ру ю щую ак тив ность де ле ти - ро ван но го му тан та, из ме ряя уро вень об ра зо ва ния АМР в про цес се ре ак ции. Вы яв ле но, что ре дак ти - ру ю щая ак тив ность му тан та ∆С зна чи тель но ни же, чем ЛейРСТТ ди ко го ти па (рис. 5). Вклад С-кон це во го до ме на во вза и мо де йствие тРНКLeu с фер мен том оце ни ва ли, определяя ве ли чи- ну Kd ком плек са тРНК с ЛейРСТТ и ее му тан том ∆С ме то дом флу о рес цен тно го тит ро ва ния. Для полно - раз мер но го фер мен та по лу че но зна че ние Kd, рав ное 0,13 мкМ, что ле жит в пред е лах зна че ний, по ка зан - ных для дру гих тРНК-син те таз ных вза и мо дейст- вий. Тит ро ва ние ∆С му тан та тРНКLeu по зво ли ло ус- та но вить ве ли чи ну Kd, составляющую 0,75 мкМ (рис. 6). Эти дан ные сви де т ельству ют о том, что С- до мен ЛейРСТТ об ес пе чи ва ет пя ти крат ное уве ли - че ние аффин нос ти свя зы ва ния го мо ло гич ной тРНК с фер мен том. Спе ци фи чес кое свя зы ва ние син те та зы с го мо - ло гич ной тРНК за ви сит от эле мен тов узна ва ния, на хо дя щих ся на мо ле ку ле РНК. По дан ным рен тге - нос трук тур но го ана ли за ком плек са ЛейРСТТ– тРНКLeu C-до мен вза и мо де йству ет с па рой G19– C56, яв ля ю щей ся уни вер саль ной для всех тРНК. По э то му ин те рес но бы ло про а на ли зо вать, как де ле - ция С-кон це во го до ме на вли я ет на спе ци фич ность фер мен та. Для это го ис сле до ва ли спо соб ность ЛейРСТТ и ее му тан та ∆С ами но а ци ли ро вать тРНКTyr E. coli, ко то рая, кро ме па ры G19–C56, со - дер жит тот же дис кри ми на тор ный нук ле о тид А73, что и тРНКLeu. Сле ду ет от ме тить, что нук ле о тид А73 яв ля ет ся одним из основ ных эле мен тов узна ва - ния тРНК ЛейРС про ка ри о тов [14, 15]. Опре де ле ны так же ки не ти чес кие па ра мет ры об оих фер мен тов для тРНКLeu и тРНКTyr (таб ли ца). Как вид но, де ле ция С-кон це во го до ме на при во дит к не зна чи тель но му ко ле ба нию ве ли чи ны Кm для тРНКLeu и тРНКTyr в слу чае ЛейРСТТ ди ко го ти па и ЛейРС ∆С (уве ли - чи ва ет ся в 2 и 4 раза со от ве тствен но), что ле жит в пред е лах из ме не ния Kd для тРНК, опре де лен но го на ми ме то дом флу о рес цен тно го тит ро ва ния. Фак - то ры спе ци фич нос ти (kcat/Km тРНКLeu/kcat/Km тРНКTyr) фер мен та ди ко го ти па и ∆С-му тан та так же от ли ча - ют ся не зна чи тель но (94 и 140 раз со от ве тствен но), что сви де т ельству ет о не кри тич нос ти С-до ме на для 482 ГУДЗЕРА О. И., ЯРЕМЧУК А. Д., ТУКАЛО М. А. 0 5 10 15 Время, мин 0 20 40 60 80 100 3 2 1 Рис. 4. Де а ци ли ро ва ние изо лей цил-тРНКLeu: 1 – ЛейРСТТ ди ко - го типа; 2 – ЛейРСТТ ∆С; 3 – в от су тствие фер мен та 0 10 20 30 Время, мин 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 1 2 4 3 Рис. 5. Ре дак ти ро ва ние нор ва ли на ЛейРСТТ: 1, 2 – ЛейРСТТ ди - ко го типа в при су тствии и в от су тствие тРНКLeu со от ве тствен но; 3, 4 – то же для ЛейРСТТ ∆С 0 1 2 3 4 ТРНКLeu, мкМ 0 10 20 30 40 50 60 70 2 1 Рис. 6. Туше ние со бствен ной флу о рес цен ции остат ков трип то - фа на ЛейРСТТ с по мощью тРНКLeu: 1 – ЛейРСТТ ди ко го типа (Кd = 0,13 мкМ); 2 – ЛейРСТТ ∆С (Кd = 0,75 мкМ) про яв ле ния спе ци фич нос ти фер мен та в узна ва нии го мо ло гич ной тРНК. Та ким об ра зом, как и пред по - ла га лось на осно ва нии дан ных по струк ту ре ком - плек са ЛейРСТТ–тРНКLeu, для вы бо ра меж ду го мо - ло гич ной тРНКLeu и тРНКTyr ЛейРСТТ ис поль зу ет раз ли чие в их про стра нствен ных струк ту рах, вза и - мо де йствуя од но вре мен но в не сколь ких мес тах с ри бо зо-фос фат ным осто вом тРНК, и эти кон так ты ле жат за пред е ла ми вза и мо де йствия с С-до ме ном. В то же вре мя об ра ща ет на се бя вни ма ние факт су щес твен но го вли я ния С-кон це во го до ме на на зна че ние ка та ли ти чес кой кон стан ты ре ак ции ами - но а ци ли ро ва ния. Де ле ция по след не го при во дит к сни же нию kcat в 152 раза (таб ли ца). Сле до ва тель но, С-кон це вой до мен ЛейРСТТ (а воз мож но, и дру гих ЛейРС про ка ри о тов) эво лю ци он но при об ре тен для по вы ше ния ско рос ти ка та ли за в ре ак ци ях ами но а - ци ли ро ва ния и ре дак ти ро ва ния. На осно ва нии па - ра мет ров Кm и kcat, по лу чен ных при из уче нии ки- не - ти ки ста ци о нар но го со сто я ния ре ак ции ами но- аци ли ро ва ния, слож но ин тер пре ти ро вать, на ка ком из эта пов ре ак ции (свя зы ва ние суб стра тов, кон фор - ма ци он ные из ме не ния, хи ми чес кая ре ак ция ами но - а ци ли ро ва ния, дис со ци а ция про дук та) С-до мен наибо лее важен. Для окон ча тель но го вы яс не ния это го воп ро са не об хо ди мо ис поль зо вать ме то ды ки не ти ки пе ре ход но го со сто я ния, но ре зуль та ты струк тур но го ана ли за ком плек сов ЛейРСТТ– тРНКLeu да ют осно ва ние пред по ло жить важ ную роль С-кон це во го до ме на ЛейРСТТ. Cрав не ние по - лу чен ных на ми крис тал ли чес ких струк тур комп- лек са ЛейРСТТ– тРНКLeu с раз лич ны ми суб стра та - ми и в раз ных кон фор ма ци ях, а так же ре зуль та тов мо ле ку ляр но го мо де ли ро ва ния, по зво ли ло про сле - дить ди на ми ку учас тия тРНК в ря де по сле до ва тель - ных про цес сов, на чи ная от при со е ди не ния ее к фер мен ту, ами но а ци ли ро ва ния, по сттран сфер но го ре дак ти ро ва ния и вы сво бож де ния из ком плек са [6, 16]. В про цессe ами но а ци ли ро ва ния и ре дак ти ро ва - ния при фак ти чес ки не из мен ной кон фор ма ции ос- нов ной час ти мо ле ку лы тРНК про ис хо дит пе ре дви - же ние ее 3'-кон ца из ак тив но го цен тра ре дак ти ру ю - ще го до ме на в ак тив ный центр син те ти чес ко го до - ме на и на о бо рот. При этом на блю да ют ся су щест- вен ные кон фор ма ци он ные из ме не ния фер мен та, свя зан ные с дви же нем СР1, лей цин-спе ци фи чес ко - го домена и домена Zn-1. Пе ре ме ще ние по след не го осо бен но кри тич но, так как он пе ре кры ва ет дви же - ние 3'-кон ца тРНКLeu из ами но а ци ли ру ю ще го цен - тра в ре дак ти ру ю щий. В то же вре мя тРНК оста ет ся свя зан ной с С-кон це вым до ме ном на всех пе ре чис - лен ных вы ше че ты рех эта пах функ ци о ни ро ва ния фер мен та. Та ким об ра зом, С-кон це вой до мен иг ра - ет су щес твен ную роль при фик са ции тРНК в не об - хо ди мой по зи ции в про цес се ами но а ци ли ро ва ния и по сттранс фер но го ре дак ти ро ва ния оши бок. Инте - рес но, что, как сви де т ельству ют струк тур ные и по - лу чен ные ки не ти чес кие дан ные, не об хо ди мая фик - са ция С-кон це во го до ме на ре а ли зу ет ся за счет от - но си тель но сла бых вза и мо де йствий: в кон так те С- до ме на с тРНК учас тву ют все го не сколь ко во до - род ных свя зей и при его де ле ции об на ру же но сни - же ние зна че ния Кd тРНК лишь в пять раз. Для дру гих АРСаз струк тур но го клас са 1а (ВалРС и ИлеРС Т. thermophilus) так же по ка за но, что де ле ция С-кон це во го до ме на при во дит к по те ре ами но а ци ли ру ю щей и по сттран сфер ной ре дак ти - ру ю щей ак тив нос ти [17]. Одна ко в от ли чие от ЛейРСТТ, где от су тствие С-кон це во го до ме на в боль шей сте пе ни вли я ет на умень ше ние ка та ли ти - чес кой кон стан ты ами но а ци ли ро ва ния, в слу чае ВалРСТТ де ле ция со от ве тству ю ще го до ме на, кро - ме умень ше ния kcat (в 19 раз), вы зы ва ет так же су ще- ствен ное уве ли че ние Кm – в 28 раз [18]. Пос лед нее ука зы ва ет на важ ную роль С-кон це во го до ме на ВалРСТТ еще и в спе ци фи чес ком свя зы ва нии го мо - ло гич ной тРНК. В це лом для АРСаз струк тур но го клас са 1а про ка ри о тов С-кон це вой до мен ва жен как для ре ак ции ами но а ци ли ро ва ния, так и по ст- 483 РОЛЬ С-КОНЦЕВОГО ДОМЕНА ЛЕЙЦИЛ-тРНК СИНТЕТАЗЫ THERMUS THERMOPHILUS тРНК Km, мкM kcat, с–1 kcat/Km, мкM–1с–1 ЛейРСТТ ди ко го ти па тРНКLeu 0,48 ±0,02 0,91 ± 0,05 1,89 тРНКTyr 24,7 ± 1,7 0,54 ± 0,03 0,022 ЛейРСТТ ∆С тРНКLeu 0,88 ± 0,09 0,006 ± 0,0005 0,007 тРНКTyr 96 ± 12,7 0,0045 ± 0,001 0,00005 Ки не ти чес кие па ра мет ры ре ак ции ами но аци ли ро ва ния, ка та ли зи ру е мой ЛейРСТТ ди ко го типа и ЛейРСTT ∆С, для тРНКLeu и тРНКTyr E. coli транс фер но го ре дак ти ро ва ния. И хо тя в де та лях ме ха низм его функ ци о ни ро ва ния для АРСаз раз ной ами но кис лот ной спе ци фич нос ти от ли ча ет ся, во всех трех сис те мах пе ре ме ще ние 3'-кон ца тРНК из ак тив но го цен тра ами но а ци ли ро ва ния в ак тив ный центр ре дак ти ро ва ния свя зан с пре одо ле ни ем сте - ри чес ких пре пя тствий ли бо со сто ро ны Zn-1-до ме - на (для ЛейРС), ли бо со сто ро ны β-тя жей, со е ди ня - ю щих СР1 до мен с основ ной час тью мо ле ку лы фер - мен та (для ВалРС и ИлеРС). В слу чае ЛейРС ар хей, для ко то рых по ка за но, что С-кон це вой до мен ва - жен толь ко для ами но а ци ли ро ва ния и не вли я ет на по сттран сфер ное ре дак ти ро ва ние, ори ен та ция ре - дак ти ру ю го до ме на от ли ча ет ся по во ро том на 180° по срав не нию с ВалРС и ИлеРС про ка ри о тов [8]. Кро ме то го, до мен Zn-1 не за кры ва ет син те ти чес- ко го ак тив ного центра, как это на блю да ет ся для ЛейРС про ка ри о тов. По э то му для ЛейРС ар хей, да - же ког да тРНК име ет мень ше кон так тов с фер мен - том, что на блю да ет ся при де ле ции С-кон це во го до - ме на, ее 3'-ко нец бес пре пя тствен но мо жет быть по - зи ци о ни ро ван в ак тив ный центр ре дак ти ру ю ще го до ме на. Та ким об ра зом, на блю да ют ся ва ри а ции ро - ли С-кон це во го до ме на ЛейРС из раз ных ис точ ни - ков в про цес се ами но а ци ли ро ва ния и ре дак ти ро ва - ния тРНК. O. I. Gudzera, A. D. Yaremchuk, M. A. Tukalo Functional role of C-terminal domain of Thermus thermophilus leucyl-tRNA synthetase Institute of Molecular Biology and Genetics NAS of Ukraine 150, Akademika Zabolotnoho Str., Kyiv, Ukraine, 03680 Summary Aim. To study a role of C-terminal domain of T. thermophilus leucyl-tRNA synthetase (LeuRSTT) in the reactions of aminoacy- lation and editing. Methods. A mutant of LeuRSTT without C- terminal domain (∆С) was obtained by the method of mutagenesis. The kinetic constants in aminoacylation reaction catalyzed by Leu- RS and its mutant (∆С) were determined by the methods of equi- librium enzyme kinetics. To evaluate the contribution of C-terminal domain to interaction of the enzyme with tRNALeu, Kd of a complex between tRNA and LeuRSTT and its mutant ∆С was determined by fluorescence titration. Results. The C-terminal domain is shown to play a significant role in the aminoacylation and editing reactions of LeuRSTT and not essential for the activity in the reaction of ami- no acid activation. The kinetic parameters of aminoacylation of tRNALeu and tRNATyr by LeuRS and ∆С mutant were also deter- mined, their analysis suggests that the C-domain is not critical for the manifestation of specificity of the enzyme in the recognition of homologous RNAs. At the same time a significant influence of the C-terminal domain on the value of catalytic constant was shown. At the domain deletion the kcat value is lower by 152-fold. Conclusion. The C-terminal domain of LeuRSTT is evolutionarily acquired to enhance the rate of catalysis in the aminoacylation and editing reactions, and makes no significant contribution to the specificity of the enzyme in the recognition of tRNA. Keywords: leucyl-tRNA synthetase, tRNALeu, editing. О. Й. Гуд зе ра, Г. Д. Ярем чук, М. А. Ту ка ло Функціональ на роль С-кінце во го до мену лей цил-тРНК син те та зи Thermus thermophilus Ре зю ме Мета. Дослідити роль С-кінце во го до ме ну лей цил-тРНК син - те та зи T. thermophilus (ЛейРСТТ) у ре акціях аміно а ци лю ван ня та ре да гу ван ня. Ме то ди. Му тант ЛейРСТТ без С-кінце во го до ме ну (∆С) от ри ма но ме то дом му та ге не зу. Кіне тичні кон - стан ти в ре акції аміно а ци лю ван ня ЛейРС та її му тан та ∆С виз на ча ли ме то да ми фер мен та тив ної кіне ти ки стаціонар но - го ста ну. Для оціню ван ня внес ку С-кінце во го до ме ну у взаємо- дію фер мен ту з тРНКLeu ме то дом флу о рес цен тно го тит ру - ван ня роз ра хо ва но Кd ком плек су тРНК з ЛейРСТТ та її му тан - том ∆С. Ре зуль та ти. По ка за но, що С-кінце вий до мен відіграє істот ну роль у ре акціях аміно а ци лю ван няя і ре да гу ван ня Лей- РСТТ і не є важ ли вим для ак тив ності в ре акції ак ти вації амі- но кис ло ти. Виз на че но та кож кіне тичні па ра мет ри в ре акції аміно а ци лю ван ня ЛейРС і ∆С му тан та для тРНКLeu і тРНКTyr, аналіз яких свідчить про те, що С-до мен є не кри тич ним для про я ву спе цифічності фер мен ту у розпізна ванні го мо логічної тРНК. У той же час встановле но суттєвий вплив С-кінце во го до ме ну на ве ли чи ну ка талітич ної кон стан ти ре акції аміно аци - лю ван ня. Де леція остан ньо го при зво дить до зни жен ня kcat у 152 рази. Вис новки. С-кінце вий до мен ЛейРСТТ ево люційно при - дба ний для підви щен ня швид кості ка талізу в ре акціях аміно- аци лю ван ня і ре да гу ван ня і не ро бить знач но го внес ку у за без- пе чен ня спе цифічності фер мен ту при розпізна ванні тРНК. Клю чові сло ва: лей цил-ТРНК син те та за, тРНКLeu, ре да гу - ван ня. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Jakubowski H., Goldman E. Editing of errors in selection of amino acids for protein synthesis // Microbiol. Rev.–1992.– 56, N 3.–P. 412–429. 2. Eriani G., DelarueM., Poch O., Gangloff J., Moras D. Parti- tion of tRNA synthetases into two classes based on mutually exclusive sets of sequence motifs // Nature.–1990.–347, N 6289.–P. 203–206. 3. Сusack S. Eleven down and nine to go // Nat. Struct. Biol.– 1995.–2, N 10.–P. 824–831. 4. Yaremchuk A., Cusack S., Gudzera O., Grotli M., Tukalo M. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of Thermus thermophillus leucyl-tRNA synthetase and its com- plexes with leucine and non-hydrolysable leucyl-adenylate analogue // Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr.–2000.–56, pt 5.–P. 667–669. 5. Cusack S., Yaremchuk A., Tukalo M. The 2 C crystal structure of leucyl-tRNA synthetase and its complex with a leucyl-ade- nylate analogue // EMBO J.–2000.–19, N 10.–P. 2351–2361. 6. Tukalo M., Yaremchuk A., Fukunaga R., Yokoyama S., Cu- sack S. The crystal structure of leucyl-tRNA synthetase com- 484 ГУДЗЕРА О. И., ЯРЕМЧУК А. Д., ТУКАЛО М. А. plexed with tRNALeu in the post-transfer-editing conforma- tion // Nat. Struct. Mol. Biol.–2005.–12, N 10.–P. 923–930. 7. Lincecum T. L. Jr., Tukalo M., Yaremchuk A., Mursinna R. S., Williams A. M., Sproat B. S., Van Den Eynde W., Link A., Van Calenbergh S., Grotli M., Martinis S. A., Cusack S. Structural and mechanistic basis of pre- and posttransfer editing by leu- cyl-tRNA synthetase // Mol. Cell.–2003.–11, N 4.–P. 951– 963. 8. Larkin D. C., Williams A. M., Martinis S. A., Fox G. E. Identi- fication of essential domains of Esсherichia coli tRNALeu ami- noacylation and amino acid editing using minimalist RNA molecules // Nucl. Acids Res.–2002.–30, N 10.–P. 2103– 2113. 9. Fukunaga R., Yokoyama S. Crystal structure of leucyl-tRNA synthetase Pyrococcus horikoshii reveals a novel editing do- main orientation // J. Mol. Biol.–2005.–346, N 1.–P. 57–71. 10. Hsu J. L., Rho S. B., Vanella K. M., Martinis S. A. Functional divergence of a unique C-terminal domain of leucyl-tRNA synthetase to accommodate its splicing and aminoacylation roles // J. Biol. Chem.–2006.–281, N 32.–P. 23075–23082. 11. Yaremchuk A. D., Gudzera O. I., Egorova S. P., Rozhko D. I., Kriklivy I. A., Tukalo M. A. Leucyl-tRNA synthetase from Thermus thermophilus. Purification and some properties of the crystallizing enzyme // Biopolym. Cell.–2001.–17, N 3.– P. 216–220. 12. Krikliviy I. A., Kovalenko O. P., Gudzera O. Y., Yaremchuk A. D., Tukalo M. A. Isolation and purification of Thermus thermophilus tRNALys and determination of its modified nuc- leotides // Biopolym. Cell.–2008.–24, N 1.–P. 21–27. 13. Tan M., Zhu B., Zhou X-L., He R., Chen X., Eriani G., Wang E. D. tRNA depended pre-transfer editing by prokaryotic leucyl-tRNA synthetase // J. Biol. Chem.–2010.–285, N 5.– P. 3235–3244. 14. Giege R., Sissler M., Florentz C. Universal rules and idiosyn- cratic features in tRNA identity // Nucl. Acids Res.–1998.– 26, N 22.–P. 5017–5035. 15. Hou Y. M. Discriminating among the discriminator bases of tRNAs // Chem. Biol.–1997.–4, N 1.–P. 93–96. 16. Rock F. L., Mao W., Yaremchuk A., Tukalo M., Crepin N., Zhou H., Zhang Y. K., Hernandez V., Akama T., Baker S. J., Plattner J. J., Shapiro L., Martinis S. A., Benkovic S. J., Cu- sack S., Alley M. R. An antifungal agent inhibits an amino- acyl-tRNA synthetase by trapping tRNA in the editing site // Science.–2007.–316, N 5832.–P. 1759–1761. 17. Fukunaga R., Yokoyama S. The C-terminal domain of the ar- chaeal leucyl-tRNA synthetase prevents misediting of isoleu- cyl-tRNA(Ile) // Biochemistry.–2007.–46, N 17.–P. 4985– 4996. 18. Fukai S., Nureki O., Sekine S., Shimada A., Tao J., Vassylyev D. G., Yokoyama S. Structural basic for double-sieve discri- mination of L-valine from L-isoleucine and L-threonine by the complex of tRNA (Val) and valyl-tRNA synthetase // Cell.–2000.–103, N 5.–P. 793–803. UDC 577.217.32 Received 10.09.10 485 РОЛЬ С-КОНЦЕВОГО ДОМЕНА ЛЕЙЦИЛ-тРНК СИНТЕТАЗЫ THERMUS THERMOPHILUS

Функциональная роль С-концевого домена лейцил-тРНК синтетазы Thermus thermophilus

Репозитарії

Схожі ресурси