Функциональная роль С-концевого домена лейцил-тРНК синтетазы Thermus thermophilus - Гудзера, О.И.; Яремчук, А.Д.; Тукало, М.А. (Вiopolymers and Cell, 2010)
Цель. Исследовать роль С-концевого домена лейцил-тРНК синтетазы T. thermophilus (ЛейРСТТ) в реакциях аминоацилирования и редактирования. Методы. Мутант ЛейРСТТ без С-концевого домена (ΔС) получен методом мутагенеза. Кинетические константы в реакции аминоацилирования ЛейРС и ее мутанта ΔС определяли методами ферментативной кинетики cтационарного состояния. Для оценки вклада С-концевого домена во взаимодействие фермента с тРНКLeu методом флуоресцентного титрования рассчитаны Кd комплекса тРНК с ЛейРСТТ и ее мутантом ΔС. Результаты. Показано, что С-концевой домен играет существенную роль в реакциях аминоацилирования и редактирования ЛейРСТТ и не существен для активности в реакции активации аминокислоты. Определены также кинетические параметры в реакции аминоацилирования ЛейРС и ΔС мутанта для тРНКLeu и тРНКTyr, анализ которых свидетельствует о том, что С-домен не является критическим для проявления специфичности фермента в узнавании гомологичной тРНК. В то же время выявлено значительное влияние С-концевого домена на величину каталитической константы реакции аминоацилирования. Делеция последнего приводит к снижению kcat в 152 раза. Выводы. С-концевой домен ЛейРСТТ эволюционно приобретен для повышения скорости катализа в реакциях амино-ацилирования и редактирования и не вносит существенного вклада в обеспечение специфичности фермента при узнавании тРНК. Мета. Дослідити роль С-кінцевого домену лейцил-тРНК синтетази T. thermophilus (ЛейРСТТ) у реакціях аміноацилювання та редагування. Методи. Мутант ЛейРСТТ без С-кінцевого домену (ΔС) отримано методом мутагенезу. Кінетичні константи в реакції аміноацилювання ЛейРС та її мутанта С визначали методами ферментативної кінетики стаціонарного стану. Для оцінювання внеску С-кінцевого домену у взаємодію ферменту з тРНКLeu методом флуоресцентного титрування розраховано Кd комплексу тРНК з ЛейРСТТ та її мутантом ΔС. Результати. Показано, що С-кінцевий домен відіграє істотну роль у реакціях аміноацилюванняя і редагування ЛейРСТТ і не є важливим для активності в реакції активації амінокислоти. Визначено також кінетичні параметри в реакції аміноацилювання ЛейРС і ΔС мутанта для тРНКLeu і тРНКTyr, аналіз яких свідчить про те, що С-домен є некритичним для прояву специфічності ферменту у розпізнаванні гомологічної тРНК. У той же час встановлено суттєвий вплив С-кінцевого домену на величину каталітичної константи реакції аміноацилювання. Делеція останнього призводить до зниження kcat у 152 рази. Висновки. С-кінцевий домен ЛейРСТТ еволюційно придбаний для підвищення швидкості каталізу в реакціях аміно-ацилювання і редагування і не робить значного внеску у забезпечення специфічності ферменту при розпізнаванні тРНК. Aim. To study a role of C-terminal domain of T. thermophilus leucyl-tRNA synthetase (LeuRSTT) in the reactions of aminoacylation and editing. Methods. A mutant of LeuRSTT without C- terminal domain (ΔC) was obtained by the method of mutagenesis. The kinetic constants in aminoacylation reaction catalyzed by LeuRS and its mutant (ΔC) were determined by the methods of equilibrium enzyme kinetics. To evaluate the contribution of C-terminal domain to interaction of the enzyme with tRNALeu, Kd of a complex between tRNA and LeuRSTT and its mutant C was determined by fluorescence titration. Results. The C-terminal domain is shown to play a significant role in the aminoacylation and editing reactions of LeuRSTT and not essential for the activity in the reaction of amino acid activation. The kinetic parameters of aminoacylation of tRNALeu and tRNATyr by LeuRS and C mutant were also determined, their analysis suggests that the C-domain is not critical for the manifestation of specificity of the enzyme in the recognition of homologous RNAs. At the same time a significant influence of the C-terminal domain on the value of catalytic constant was shown. At the domain deletion the kcat value is lower by 152-fold. Conclusion. The C-terminal domain of LeuRSTT is evolutionarily acquired to enhance the rate of catalysis in the aminoacylation and editing reactions, and makes no significant contribution to the specificity of the enzyme in the recognition of tRNA.