Разработка стратегии получения рекомбинантных одноцепочечных антител против поверхностных клеточных биомаркеров на примере антигена CD34 человека

Разработка стратегии получения рекомбинантных одноцепочечных антител против поверхностных клеточных биомаркеров на примере антигена CD34 человека

Антитела против поверхностных клеточных белков выполняют важную функцию в процедурах детектирования, определения стадии дифференциации и выделения целевых популяций клеток. Поверхностные клеточные антигены часто имеют сложную структуру внеклеточного участка молекулы, характеризующуюся сильным гликоз...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
Bibliographische Detailangaben
Veröffentlicht in:Вiopolymers and Cell
Datum:2010
Hauptverfasser: Николаев, Ю.С., Горбатюк, О.Б., Цапенко, М.В.
Format: Artikel
Sprache:Russian
Veröffentlicht: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2010
Schlagworte:
Molecular and Cell Biotechnologies
Online Zugang:https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154210
Tags: Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:Разработка стратегии получения рекомбинантных одноцепочечных антител против поверхностных клеточных биомаркеров на примере антигена CD34 человека / Ю.С. Николаев, О.Б. Горбатюк, М.В. Цапенко // Вiopolymers and Cell. — 2010. — Т. 26, № 6. — С. 492-498. — Бібліогр.: 12 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-154210
record_format dspace
spelling Николаев, Ю.С.
Горбатюк, О.Б.
Цапенко, М.В.
2019-06-15T10:03:01Z
2019-06-15T10:03:01Z
2010
Разработка стратегии получения рекомбинантных одноцепочечных антител против поверхностных клеточных биомаркеров на примере антигена CD34 человека / Ю.С. Николаев, О.Б. Горбатюк, М.В. Цапенко // Вiopolymers and Cell. — 2010. — Т. 26, № 6. — С. 492-498. — Бібліогр.: 12 назв. — рос.
DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000179
0233-7657
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154210
57.083.3
Антитела против поверхностных клеточных белков выполняют важную функцию в процедурах детектирования, определения стадии дифференциации и выделения целевых популяций клеток. Поверхностные клеточные антигены часто имеют сложную структуру внеклеточного участка молекулы, характеризующуюся сильным гликозилированием и стабилизированную дисульфидными связями. При этом получение антител против таких белков является нетривиальной задачей. Цель. Разработать стратегию получения рекомбинантных антител против поверхностных клеточных биомаркеров. Методы. Конструирование библиотеки кДНК генов VH и VL иммуноглобулинов животных, иммунизированных рекомбинантным антигеном, и использование биопеннинга на антиген-позитивных клетках для обогащения исходной библиотеки последовательностями целевых антител. Детектирование и отбор клонов – продуцентов целевых антител осуществляли с помощью высокопродуктивных автоматизированных систем. Результаты. Получена панель из пяти антител, распознающих антиген на поверхности CD34-позитивных клеток. Выводы. Предложенная стратегия может быть использована для получения антител против поверхностных клеточных антигенов.
Антитіла проти поверхневих клітинних білків відіграють важливу роль у процедурах детектування, визначення стадії диференціації та виділення цільових популяцій клітин. Поверхневі клітинні антигени часто мають складну структуру зовнішньоклітинної ділянки молекули, яка характеризується сильним глікозилюванням та стабілізується дисульфідними зв’язками. При цьому одержання антитіл проти таких білків є нетривіальною задачею. Мета. Розробка стратегії одержання рекомбінантних антитіл проти поверхневих клітинних біомаркерів. Методи. Конструювання бібліотеки кДНК генів VH та VL імуноглобулінів тварин, імунізованих рекомбінантним антигеном, та використання біопенінгу на антиген-позитивних клітинах для збагачення вихідної бібліотеки послідовностями цільових антитіл. Детектування та відбір клонів – про дуцентів цільових антитіл здійснювали за допомогою високопродуктивних автоматизованих систем. Результати. Одержано панель з п’яти антитіл, що розпізнають антиген на поверхні клітин CD34+, методами імуноцитохімії та проточної цитометрії. Висновки. Запропоновану стратегію можна використовувати для одержання антитіл проти поверхневих клітинних антигенів.
Antibodies against cell-surface proteins play an important role in cell detection, separation and determination of differentiation stage. The globular structure of extracellular region of cell-surface antigens is frequently characterized by heavily glycosilation and/or is stabilized by disulphide bonds. In this case the obtaining of antibodies against such proteins is a substantive problem. Aim. The development of strategy for obtaining recombinant antibodies against cell-surface biomarkers. Methods. The research strategy is based on the construction of cDNA library of VH and VL genes of animals, immunized with recombinant antigen, and subsequent cell-based bio-panning for the library enrichment with desired phage clones. High-throughput automated systems were used for the detection and isolation of antigen-specific clones. Results. We have obtained a panel of five antibodies that recognize an antigen on CD34+ cell surface using the methods of immunocytochemistry and flow cytometry. Conclusions. The proposed strategy may be used for obtaining antibodies against cell-surface antigens.
ru
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
Вiopolymers and Cell
Molecular and Cell Biotechnologies
Разработка стратегии получения рекомбинантных одноцепочечных антител против поверхностных клеточных биомаркеров на примере антигена CD34 человека
Розробка стратегії одержання рекомбінантних одноланцюгових антитіл проти поверхневих клітинних біомаркерів на прикладі антигену CD34 людини
The development of strategy for obtaining single-chain recombinant antibodies against cell-surface biomarkers on the example of human CD34
Article
published earlier
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
title Разработка стратегии получения рекомбинантных одноцепочечных антител против поверхностных клеточных биомаркеров на примере антигена CD34 человека
spellingShingle Разработка стратегии получения рекомбинантных одноцепочечных антител против поверхностных клеточных биомаркеров на примере антигена CD34 человека
Николаев, Ю.С.
Горбатюк, О.Б.
Цапенко, М.В.
Molecular and Cell Biotechnologies
title_short Разработка стратегии получения рекомбинантных одноцепочечных антител против поверхностных клеточных биомаркеров на примере антигена CD34 человека
title_full Разработка стратегии получения рекомбинантных одноцепочечных антител против поверхностных клеточных биомаркеров на примере антигена CD34 человека
title_fullStr Разработка стратегии получения рекомбинантных одноцепочечных антител против поверхностных клеточных биомаркеров на примере антигена CD34 человека
title_full_unstemmed Разработка стратегии получения рекомбинантных одноцепочечных антител против поверхностных клеточных биомаркеров на примере антигена CD34 человека
title_sort разработка стратегии получения рекомбинантных одноцепочечных антител против поверхностных клеточных биомаркеров на примере антигена cd34 человека
author Николаев, Ю.С.
Горбатюк, О.Б.
Цапенко, М.В.
author_facet Николаев, Ю.С.
Горбатюк, О.Б.
Цапенко, М.В.
topic Molecular and Cell Biotechnologies
topic_facet Molecular and Cell Biotechnologies
publishDate 2010
language Russian
container_title Вiopolymers and Cell
publisher Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
format Article
title_alt Розробка стратегії одержання рекомбінантних одноланцюгових антитіл проти поверхневих клітинних біомаркерів на прикладі антигену CD34 людини
The development of strategy for obtaining single-chain recombinant antibodies against cell-surface biomarkers on the example of human CD34
description Антитела против поверхностных клеточных белков выполняют важную функцию в процедурах детектирования, определения стадии дифференциации и выделения целевых популяций клеток. Поверхностные клеточные антигены часто имеют сложную структуру внеклеточного участка молекулы, характеризующуюся сильным гликозилированием и стабилизированную дисульфидными связями. При этом получение антител против таких белков является нетривиальной задачей. Цель. Разработать стратегию получения рекомбинантных антител против поверхностных клеточных биомаркеров. Методы. Конструирование библиотеки кДНК генов VH и VL иммуноглобулинов животных, иммунизированных рекомбинантным антигеном, и использование биопеннинга на антиген-позитивных клетках для обогащения исходной библиотеки последовательностями целевых антител. Детектирование и отбор клонов – продуцентов целевых антител осуществляли с помощью высокопродуктивных автоматизированных систем. Результаты. Получена панель из пяти антител, распознающих антиген на поверхности CD34-позитивных клеток. Выводы. Предложенная стратегия может быть использована для получения антител против поверхностных клеточных антигенов. Антитіла проти поверхневих клітинних білків відіграють важливу роль у процедурах детектування, визначення стадії диференціації та виділення цільових популяцій клітин. Поверхневі клітинні антигени часто мають складну структуру зовнішньоклітинної ділянки молекули, яка характеризується сильним глікозилюванням та стабілізується дисульфідними зв’язками. При цьому одержання антитіл проти таких білків є нетривіальною задачею. Мета. Розробка стратегії одержання рекомбінантних антитіл проти поверхневих клітинних біомаркерів. Методи. Конструювання бібліотеки кДНК генів VH та VL імуноглобулінів тварин, імунізованих рекомбінантним антигеном, та використання біопенінгу на антиген-позитивних клітинах для збагачення вихідної бібліотеки послідовностями цільових антитіл. Детектування та відбір клонів – про дуцентів цільових антитіл здійснювали за допомогою високопродуктивних автоматизованих систем. Результати. Одержано панель з п’яти антитіл, що розпізнають антиген на поверхні клітин CD34+, методами імуноцитохімії та проточної цитометрії. Висновки. Запропоновану стратегію можна використовувати для одержання антитіл проти поверхневих клітинних антигенів. Antibodies against cell-surface proteins play an important role in cell detection, separation and determination of differentiation stage. The globular structure of extracellular region of cell-surface antigens is frequently characterized by heavily glycosilation and/or is stabilized by disulphide bonds. In this case the obtaining of antibodies against such proteins is a substantive problem. Aim. The development of strategy for obtaining recombinant antibodies against cell-surface biomarkers. Methods. The research strategy is based on the construction of cDNA library of VH and VL genes of animals, immunized with recombinant antigen, and subsequent cell-based bio-panning for the library enrichment with desired phage clones. High-throughput automated systems were used for the detection and isolation of antigen-specific clones. Results. We have obtained a panel of five antibodies that recognize an antigen on CD34+ cell surface using the methods of immunocytochemistry and flow cytometry. Conclusions. The proposed strategy may be used for obtaining antibodies against cell-surface antigens.
isbn DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000179
issn 0233-7657
url https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154210
citation_txt Разработка стратегии получения рекомбинантных одноцепочечных антител против поверхностных клеточных биомаркеров на примере антигена CD34 человека / Ю.С. Николаев, О.Б. Горбатюк, М.В. Цапенко // Вiopolymers and Cell. — 2010. — Т. 26, № 6. — С. 492-498. — Бібліогр.: 12 назв. — рос.
work_keys_str_mv AT nikolaevûs razrabotkastrategiipolučeniârekombinantnyhodnocepočečnyhantitelprotivpoverhnostnyhkletočnyhbiomarkerovnaprimereantigenacd34čeloveka
AT gorbatûkob razrabotkastrategiipolučeniârekombinantnyhodnocepočečnyhantitelprotivpoverhnostnyhkletočnyhbiomarkerovnaprimereantigenacd34čeloveka
AT capenkomv razrabotkastrategiipolučeniârekombinantnyhodnocepočečnyhantitelprotivpoverhnostnyhkletočnyhbiomarkerovnaprimereantigenacd34čeloveka
AT nikolaevûs rozrobkastrategííoderžannârekombínantnihodnolancûgovihantitílprotipoverhnevihklítinnihbíomarkerívnaprikladíantigenucd34lûdini
AT gorbatûkob rozrobkastrategííoderžannârekombínantnihodnolancûgovihantitílprotipoverhnevihklítinnihbíomarkerívnaprikladíantigenucd34lûdini
AT capenkomv rozrobkastrategííoderžannârekombínantnihodnolancûgovihantitílprotipoverhnevihklítinnihbíomarkerívnaprikladíantigenucd34lûdini
AT nikolaevûs thedevelopmentofstrategyforobtainingsinglechainrecombinantantibodiesagainstcellsurfacebiomarkersontheexampleofhumancd34
AT gorbatûkob thedevelopmentofstrategyforobtainingsinglechainrecombinantantibodiesagainstcellsurfacebiomarkersontheexampleofhumancd34
AT capenkomv thedevelopmentofstrategyforobtainingsinglechainrecombinantantibodiesagainstcellsurfacebiomarkersontheexampleofhumancd34
first_indexed 2025-11-25T04:42:50Z
last_indexed 2025-11-25T04:42:50Z
_version_ 1850506803922599936
fulltext MOLECULAR AND CELL BIOTECHNOLOGIES Раз ра бот ка стра те гии по лу че ния ре ком би нан тных од но це по чеч ных ан ти тел про тив по вер хнос тных кле точ ных би о мар ке ров на при ме ре ан ти ге на CD34 че ло ве ка Ю. С. Ни ко ла ев, О. Б. Гор ба тюк1, М. В. Ца пен ко ГУ «Инсти тут ге не ти чес кой и ре ге не ра тив ной ме ди ци ны АМН Укра и ны» Ул. Выш го род ская, 67, Киев, Укра и на, 04114 1Ки ев ский на ци о наль ный уни вер си тет име ни Тараса Шев чен ко Ул. Вла ди мир ская, 60, Киев, Укра и на, 01033 ulian_s@ukr.net Антитела про тив по вер хнос тных кле точ ных бел ков вы пол ня ют важ ную функцию в про це ду рах де - тек ти ро ва ния, опре де ле ния ста дии диф фе рен ци а ции и вы де ле ния це ле вых по пу ля ций кле ток. По - вер хнос тные кле точ ные ан ти ге ны час то име ют слож ную струк ту ру внек ле точ но го учас тка мо ле ку лы, ха рак те ри зу ю щу ю ся силь ным гли ко зи ли ро ва ни ем и ста би ли зи ро ван ную дис ульфид ны ми свя зя ми. При этом по лу че ние ан ти тел про тив та ких бел ков яв ля ет ся не три ви аль ной за да чей. Цель. Раз ра бо тать стра те гию по лу че ния ре ком би нан тных ан ти тел про тив по вер хнос тных кле точ ных би о мар ке ров. Ме то ды. Ко нстру и ро ва ние биб ли о те ки кДНК ге нов VH и VL им му ног ло бу ли нов жи - вот ных, им му ни зиро ван ных ре ком би нан тным ан ти ге ном, и ис поль зо ва ние би о пен нин га на ан ти - ген-по зи тив ных клет ках для об ога ще ния ис ход ной биб ли о те ки по сле до ва тель нос тя ми це ле вых ан ти тел. Де тек ти ро ва ние и от бор кло нов – про ду цен тов це ле вых ан ти тел осу ще ствля ли с по - мощью вы со коп ро дук тив ных ав то ма ти зи ро ван ных сис тем. Ре зуль та ты. По лу че на па нель из пяти ан ти тел, рас поз на ю щих ан ти ген на по вер хнос ти CD34-по зи тив ных кле ток. Вы во ды. Пред ло жен - ная стра те гия мо жет быть использована для по лу че ния ан ти тел про тив по вер хнос тных кле точ - ных ан ти ге нов. Клю че вые сло ва: CD34, фа го вый дис плей, ре ком би нан тные од но це по чеч ные ан ти те ла (ScFv), би о - пен нинг. Вве де ние. Де тек ти ро ва ние и от бор раз но об раз ных по пу ля ций кле ток из об ще го пула лейкоцитов кро - ви про во дят, ис поль зуя в ка чес тве мар ке ров бел ки, спе ци фи чес ки пред став лен ные на по вер хнос ти кле ток дан ной по пу ля ции, об озна ча е мые CD (Clus- ter of Differentiation). CD34 был от крыт в ре зуль та те ис поль зо ва ния стра те гии по лу че ния ан ти тел про тив ан ти ге нов на по вер хнос ти не боль ших суб по пу ля ций лей ко ци тов че ло ве ка [1]. Он пред став ля ет со бой силь но гли ко - зи ли ро ванный по вер хностный кле точ ный бе лок с мо ле ку ляр ной мас сой око ло 110 кДа. В даль ней шем было по ка за но, что CD34 можно ис поль зо вать для де тек ти ро ва ния и вы де ле ния из кос тно го моз га и пе ри фе ри чес кой кро ви по пу ля - ции кле ток, об ес пе чи ва ю щих воз об нов ле ние ге ма - то по э за у ле таль но об лу чен ных жи вот ных при транс план та ции [2]. В на сто я щее вре мя он яв ля ет ся 492 ISSN 0233-7657. Biopolymers and Cell. 2010. Vol. 26. N 6. Р. 492–498  Institute of Molecular Biology and Genetics NAS of Ukraine, 2010 одним из трех основ ных мар ке ров ге ма то по э ти чес - ких ство ло вых кле ток. В мо ле ку ляр ном от но ше нии CD34 пред став ля - ет со бой транс мем бран ный бе лок пер во го ти па, со - дер жа щий внек ле точ ный до мен со слож ной струк - ту рой, вклю ча ю щей силь но гли ко зи ли ро ван ный N-кон це вой учас ток, а так же гло бу ляр ный учас ток, ста би ли зи ро ван ный тре мя дис ульфид ны ми свя зя - ми. Та кое раз но об ра зие ан ти ген ных де тер ми нант в со ста ве мо ле ку лы об услов ли ва ет ши ро кий спектр анти тел, спо соб ных рас поз на вать дан ные ан ти ген - ные детерминанты. В на сто я щее вре мя основ ны ми спо со ба ми по лу - че ния ан ти тел про тив ши ро ко го спек тра ан ти ге нов яв ля ют ся гиб ри дом ная тех но ло гия и тех но ло гия фа го во го дис плея. Дис плей од но це по чеч ных ре - ком би нан тных ан ти тел (single-chain fragment vari- able – scFv) на по вер хнос ти бак те ри о фа га М13 име - ет ряд пре и му ществ пе ред гиб ри дом ной тех но ло ги - ей: у не го бо лее высокая про из во ди тель ность, и его использование на прав лено на по лу че ние боль ше го ко ли чес тва и раз но об ра зия це ле вых ан ти тел, в том чис ле ан ти тел, от су тству ю щих в им мун ном ре пер - ту а ре жи вот ных-до но ров. Кро ме то го, стан дар тны- ми мо ле ку ляр но-би о ло ги чес кими ма ни пу ля циями мо гут быть ско нстру и ро ваны раз ные фор ма ты ре - ком би нан тных ан ти тел, при год ных для экс прес сии клет ками как про- так и эукариотов. При по лу че нии на бо ра ан ти тел, об ла да ю щих раз лич ной эпи топ ной спе ци фич нос тью и аф фин - нос тью (па не ли ан ти тел), час то используют им мун - ные биб ли о те ки ва ри а бель ных ге нов им му ног ло - бу ли нов. Пре и му щес твом им мун ных биб ли о тек кДНК яв ля ет ся из на чаль ное об ога ще ние биб ли о те - ки по сле до ва тель нос тя ми ан ти ген-спе ци фич ных ан ти тел. Кро ме то го, бла го да ря аф фин но му доз ре - ва нию по сле до ва тель нос тей це ле вых ан ти тел в ре - зуль та те им му ни за ции с вы со кой до лей ве ро ят но- сти уда ет ся вы де лить вы со ко аф фин ные ре ком би - нан тные ан ти те ла из ис ход ной биб ли о те ки [3]. Целью дан ной ра бо ты бы ла раз ра бот ка стра те - гии по лу че ния ре ком би нан тных од но це по чеч ных ан ти тел про тив по вер хнос тных кле точ ных би о мар - ке ров на при ме ре ан ти ге на CD34 че ло ве ка. Ма те ри а лы и ме то ды. Ген но-ин же нер ные ма - ни пу ля ции с ДНК про во ди ли со глас но ме то дам, опи сан ным в ру ко во дстве [4]. Имму ни за цию мы- шей ре ком би нан тным внек ле точ ным фраг мен том CD34 чело ве ка (rhExCD34), а так же ко нстру и ро ва - ние ком би на тор ной биб ли о те ки кДНК ва ри а бель - ных ге нов им му ног ло бу ли нов осу ще ствля ли, как описа но в ра бо те [5]. Фа го вую биб ли о те ку по лу ча ли по инструк ции к на бо ру ре ак ти вов «Expression Module Recombi- nant Phage Antibody System» («Amersham Bioscien- ces», Шве ция). Клет ки ли нии KG1 ми е лоб лас то ид - но го про ис хож де ния (Рос сий ская кол лек ция кле - точ ных куль тур по зво ноч ных, Инсти тут ци то ло гии РАН) куль ти ви ро ва ли в сре де RPMI1640 («Sigma», США), со дер жа щей 20 %-й раствор эм бри о наль ной бычьей сы во ротки («Invitrogen», США). Клет ки ли - нии SP2/0-Ag14 (Рос сий ская кол лек ция кле точ ных куль тур по зво ноч ных) куль ти ви ро ва ли в сре де RPMI1640, со дер жа щей 10 %-ю эм бри о наль ную бычью сы во рот ку. Кло ни ро ва ние и по лу че ние rhExCD34 в очи щен - ной рас тво ри мой фор ме. Фрак цию по ли-А(+) РНК вы де ля ли из кле ток KG1 с ис поль зо ва ни ем на бо ра ре ак ти вов «QuickPrep Micro mRNA Purification Kit» («GE Healthcare», Ве ли коб ри та ния) со глас но ре - ком мен да ци ям про из во ди те ля. кДНК син те зи ро ва - ли в ре ак ции об рат ной транс крип ции с по мощью вы рож ден ных гек са нук ле о тид ных прай ме ров. По - лу чен ная кДНК слу жи ла мат ри цей для ПЦР с прай - ме ра ми Sense-СD34 (5'-ATC TGA ATT CAT ATG ATG AGT CTT GAC AAC AAC GG-3') и Antisense- СD34 (5'-TCA ATC TCG AGG GTC TTT TGG GAA TAG CTC T-3'), со дер жа щи ми сай ты эн до нук ле аз рес трик ции NdeI и XhoI соответственно. Амплификацию про во ди ли при сле ду ю щих усло ви ях: 30 цик лов при тем пе ра ту ре 95 °С в те че - ние 30 с; 55 °С – 30 с, 72 °С – 60 с. По лу чен ную ДНК гид ро ли зо ва ли со от ве тству ю щи ми рес трик та за ми, ли ги ро ва ли с век то ром pET-24a+ и ис поль зо ва ли для транс фор ма ции кле ток Escherichia coli BL21 (DE3). Для экс прес сии rhExCD34 клетками E. coli при ме ня ли мо ди фи ци ро ван ный про то кол ау то ин - дук ции [6]. Ре ком би нан тный антиген rhExCD34 очи - щали и ре на ту рировали из те лец вклю че ния ме то - дом им мо би ли за ци он ной ме талл-аф фин ной хро ма - тог ра фии (IMAX) [7]. 493 РАЗ РА БОТ КА СТРА ТЕ ГИИ ПО ЛУ ЧЕ НИЯ РЕ КОМ БИ НАН ТНЫХ ОД НО ЦЕ ПО ЧЕЧ НЫХ АН ТИ ТЕЛ Се лек ция фа го вой биб ли о те ки. 1,4⋅1011 фа го вых час тиц ре сус пен ди ро ва ли в 100 мкл фос фат но-со - ле во го бу фе ра (ФСБ, 0,14 М NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 1,8 мМ KH2PO4, pH 8,0), со дер жа - ще го 1 %-й бы чий сы во ро точ ный аль бу мин (БСА) («Sigma») и 1 мМ ЭДТА (ФСБ/БСА/ЭДТА), за тем сме ши ва ли с 2⋅107 кле ток KG1 в 200 мкл ФСБ/БСА/ ЭДТА. Сус пен зию ин ку би ро ва ли в те че ние 1 ч при тем пе ра ту ре 4 оС, про мы ва ли ФСБ/БСА/ЭДТА, ре - сус пен ди ро ва ли в 400 мкл ФСБ/БСА и де ли ли на две рав ные час ти. По лу чен ную сус пен зию кле ток ис поль зо ва ли для вы де ле ния це ле вых фа го вых кло - нов по схе мам се лек ции А и Б (схе му се лек ции Б про во ди ли со глас но ме то ди ке, опи сан ной в [8]), се - лек цию на ре ком би нан тном ан ти ге не про во ди ли по схе ме В: А – клет ки осаж да ли цен три фу ги ро ва ни ем при 400 g (5 мин), ре сус пен ди ро ва ли в 200 мкл ФСБ/ БСА, со дер жа щем раз ве ден ную в 10 раз сы во рот ку им му ни зи ро ван ных rhExCD34 мы шей. Инку ба цию про во ди ли в те че ние 20 мин при ком нат ной тем пе - ра ту ре, клет ки осаж да ли цен три фу ги ро ва ни ем. Су - пер на тант вно си ли в 1 мл сус пен зии кле ток TG1 в ло га риф ми чес кой фа зе рос та (A600~0,4–0,5) в сре де 2 × YT (17 г/л бак тот рип то на, 10 г/л дрож же во го экс трак та, 5 г/л NaCl), со дер жа щей 100 мкг/мл ам - пи цил ли на и 1 %-й рас твор глю ко зы (2 × YT-AG), и ин ку би ро ва ли (1 ч, 37 °С). В – в им му но ло ги чес кую про бир ку фир мы «Nunc» вно си ли рас твор rhExCD34 с кон цен тра ци - ей 10 мкг/мл в ФСБ и ин ку би ро ва ли в те че ние 1 ч при ком нат ной тем пе ра ту ре. Мес та не спе ци фи чес - кой со рбции бло ки ро ва ли ин ку ба ци ей с ФСБ, со - дер жа щим 0,1 %-й твин-20 (ФСБТ), на про тя же нии 30 мин. Да лее в про бир ку вно си ли 7⋅1010 фа го вых час тиц, ре сус пен ди ро ван ных в ФСБТ, и ин ку би ро - ва ли в те че ние 1 ч при ком нат ной тем пе ра ту ре. Про бир ку с им мо би ли зиро ван ны ми фа го вы ми час - ти ца ми про мы ва ли 10 раз ФСБТ и 2 раза – ФСБ, за - тем фаги элю и ро ва ли ин ку ба ци ей с клет ка ми TG1 (1 ч, 37 °С). Пос ле ин ку ба ции элю и ро ван ных фа гов с клет - ка ми TG1 алик во ты сус пен зии кле ток рас се ва ли на чаш ки Пет ри для под сче та ко ли чес тва элю и ро ван - ных фа го вых час тиц. Остав шу ю ся сус пен зию кле - ток ис поль зо ва ли для ре ам пли фи ка ции биб ли о те- ки, как опи са но в ру ко во дстве к «Expression Module Recombinant Phage Antibody System». Скри нинг фа го вой биб ли о те ки. Клет ки E. coli, полу чен ные по сле се лек ции, с по мощью сис те мы Colony Picker QPixII («Genetix», США) по ме ща ли в 384-лу ноч ные по лис ти ро ло вые план ше ты фир мы «Nunc» в 100 мкл сре ды 2 × YT-AG, на ра щи ва ли в те че ние 14 ч при t = 30 °С и хра ни ли при тем пе ра ту - ре 4 °С для даль ней ше го ис поль зо ва ния в ка чес тве сто ко вой куль ту ры. Для ин дук ции экс прес сии сус - пен зию кле ток со от ве тству ю щих кло нов из сто ко - вой куль ту ры пе ре но си ли в сре ду 2 × YT-AG и на - ра щи ва ли в те че ние 4 ч при t = 30 °С. Клет ки осаж - да ли цен три фу ги ро ва ни ем, су перна тант от би ра ли, клет ки ре сус пен ди ро ва ли в сре де 2 × YT, со дер жа - щей 100 мкг/мл ам пи цил ли на и 1 мМ изо про пил- β-D-ти о га лак то пи ра но зид (ИПТГ). Индук цию экс - прес сии проводили в те че ние 12–14 ч при t = 30 °С, клет ки осаж да ли и ис поль зо ва ли для по лу че ния пе - рип лаз ма ти чес ких экс трак тов по [9]. Вне се ние и от бор куль ту раль ных сред и кле точ - ных сус пен зий при им му но а на ли зе кло нов осу ще - ствля ли с по мощью сис те мы Hydra System («Rob- bins», США). Свя зы ва ние ан ти тел из пе рип лаз ма - ти чес ких экс трак тов с ан ти ге ном на по вер хнос ти кле ток KG1 и rhExCD34 тес ти ро ва ли ме то да ми FMAT (Fluorometric Microvolume Assay Technolo- gy) и им му но фер мен тно го ана ли за (ИФА) со от вет- ствен но. ИФА про во ди ли, как опи са но в [5]. FMAT-а н а л и з: в рас твор RPMI1640 («Sigma») со дер жа щий 20 %-ю эм бри о наль ную бычью сы во - рот ку («Invitrogen»), вно си ли ан ти-E-tag-ан ти те ла, конъ ю ги ро ван ные с Alexa 633. Рас твор ан ти тел по - ме ща ли в 384-лу ноч ные план ше ты, опти ми зи ро - ван ные для FMAT («Applied Biosystems», США). В со от ве тству ю щие лун ки вно си ли пе рип лаз ма ти - чес кие экс трак ты, ин ку би ро ва ли в те че ние 1 ч при ком нат ной тем пе ра ту ре. Пос ле это го до бав ля ли сус пен зию кле ток KG1 и ин ку би ро ва ли на про тя - же нии 4 ч в СО2-ин ку ба то ре (t = 37 °С). Флу о рес - цен цию кле ток из ме ря ли на при бо ре FMAT 8100 HTS («Applied Biosystems»). Свя зы ва ние ScFv с rh- ExCD34 в рас тво ре ви зу а ли зи ро ва ли, опре де ляя их вза и мо де йствие в при су тствии rhExCD34 с по верх- нос тным кле точ ным ан ти ге ном по сни же нию ин- тен сив нос ти флу о рес цен ции. Спе ци фич ность свя- 494 НИ КО ЛА ЕВ Ю. С., ГОР БА ТЮК О. Б., ЦА ПЕН КО М. В. зы ва ния ан ти тел с бел ка ми на по вер хнос ти кле ток KG1 вы яв ля ли ин ку ба ци ей с клет ка ми SP2/0-Ag14. Имму но хи ми чес кое окра ши ва ние пре па ра тов кле ток KG1. Сус пен зию кле ток KG1 на но си ли на пред мет ные стек ла, фик си ро ва ли в па рах фор ма ли - на. Пре па ра ты по сле до ва тель но ин ку би ро ва ли с пе рип лаз ма ти чес ки ми экс трак та ми и ан ти те ла ми про тив мет ки E-tag, ко ъню ги ро ван ны ми с пе рок си - да зой хре на. Окра ши ва ли с ис поль зо ва ни ем кра си - те ля 3, 3'-ди а ми но бен зи ди на («Sigma»). Анализ свя зы ва ния ScFv с клет ка ми KG1 ме то - дом про точ ной ци то мет рии. Пе рип лаз ма ти чес кие экс трак ты раз во ди ли бу фе ром ФСБ до ко неч ной кон цен тра ции ScFv 2 мкг/мл, сме ши ва ли с мы ши - ны ми ан ти-E-tag-ан ти те ла ми и ин ку би ро ва ли в те - че ние 20 мин при t = 4 °С. Клет ки KG1 (5⋅105 на про- бу) осаж да ли цен три фу ги ро ва ни ем (400 g, 5 мин, 4 оС), ре сус пен ди ро ва ли в бу фе ре ФСБ/БСА/NaN3 (ФСБ, со дер жа щий 1 % БСА и 0,02 % ази да на трия) и ин ку би ро ва ли (40 мин, 4 °С) с при го тов лен ны ми рас тво ра ми ан ти тел. Клет ки про мы ва ли бу фе ром ФСБ/БСА/NaN3 и ин ку би ро ва ли с ан ти те ла ми про - тив им му ног ло бу ли нов мы ши, конъ ю ги ро ва ны ми с ФИТЦ (F(ab')2-FITC, «Sigma»). Свя зы ва ние ScFv с клет ка ми ана ли зи ро ва ли, ис поль зуя про точ ный ци тоф лу о ри метр EPICS XL («Beckman Coulter», США). Кон тро лем ау тоф лу о - рес цен ции для ка на ла ФИТЦ слу жи ла сус пен зия не окра шен ных кле ток. Экспрес сию мар ке ра CD34 клет ка ми KG1 опре де ля ли с по мощью ФИТЦ- конъ ю ги ро ван ных мо нок ло наль ных ан ти тел про - тив CD34 (клон 581, «Beckman Coulter»). Ре зуль та - ты ана ли зи ро ва ли с ис поль зо ва ни ем про грам мно го об ес пе че ния BD FACS Diva 6.1.2. Ре зуль та ты и об суж де ние. Ра нее для по лу че - ния и очис тки по лик ло наль ных ан ти тел про тив по - вер хнос тно го кле точ но го мар ке ра CD34 мы успеш - но ис поль зо ва ли не гли ко зи ли ро ван ный ре ком би - нан тный внек ле точ ный фраг мент мо ле ку лы (rhExCD34), по лу чен ный экс прес си ей в клет ках E. coli. Пос коль ку ре ком би нан тный ан ти ген со хра - ня ет ряд ан ти ген ных де тер ми нант, сво йствен ных на тив но му CD34, пред став ля ет ся воз мож ным вы- де лить ScFv, ис поль зуя для им му ни за ции жи вот - ных – до но ров rhExCD34. В свя зи с этим пер вым эта пом ра бо ты ста ло по лу че ние им мун ной ком би - на тор ной биб ли о те ки ва ри а бель ных учас тков им - му ног ло бу ли нов мы ши. Для син те за кДНК V-ге нов и ко нстру и ро ва ния биб ли о те ки ис поль зо ва ли мРНК из се ле зе нок трех им мунизированных мы шей (титр спе ци фич ных ан - ти тел в сы во рот ках 1:256000). Пос ле стан дар тных ма ни пу ля ций по со став ле нию биб ли о те ки под сче - том транс фор ман тов опре де ле на ее пред став лен - ность – 1,8⋅106 ин ди ви ду аль ных кло нов. Фун кци о - наль ный размер биб ли о те ки, от ра жа ю щий про цент кло нов, не су щих по лно раз мер ную встав ку ScFv– ДНК, со ста вил око ло 90 % про а на ли зи ро ван ных кло нов (n = 19). Для даль ней шей ра бо ты биб ли о те - ка бы ла упа ко ва на в бак те ри о фаг M13KO7. Что бы по лу чить ре ком би нан тные ан ти те ла, спе ци фич ные к по вер хнос тно му кле точ но му ан ти - ге ну, в про це ду рах би о пен нин га об ыч но при ме ня - ют клет ки ан ти ген-по зи тив ных ли ний [10, 11]. По э - то му для эф фек тив но го от бо ра ан ти тел про тив по - вер хнос тно го кле точ но го ан ти ге на в про це ду рах би о пен нин га ис поль зо ва ли клет ки CD34+ ли нии KG1. Для по лу че ния на и боль ше го спек тра це ле вых ан ти тел в даль ней шей ра бо те ис поль зо ва ли две схемы би о пен нин га на клет ках. Пер вая схе ма (А) по зво ля ет про во дить на прав лен ный от бор ан ти тел, рас поз на ю щих эпи то пы, пе ре кры ва ю щи е ся с эпи - то па ми, рас поз на ва е мы ми по лу чен ны ми на ми по - лик ло наль ны ми ан ти те ла ми. Сог лас но схе ме А, по - сле ин ку ба ции фа го вой биб ли о те ки с клет ка ми фа - ги элю и ро ва ли, добавляя в кле точ ную сус пен зию сы во рот ки им мун изированных мы шей как ис точ - ни к ан ти ген-спе ци фич ных ан ти тел. Вто рая схе ма се лек ции (Б) пред по ла га ет вы де - ле ние всех фа го вых час тиц, спе ци фи чес ки свя зав - ших ся с по вер хнос тным кле точ ным ан ти ге ном. Ее ис поль зо ва ние a priori по зво ля ет по лу чить бо лее ши ро кий спектр ан ти тел, свя зы ва ю щих ся с це ле - вым ан ти ге ном, по срав не нию с пред ы ду щей схе - мой се лек ции. Эта про це ду ра со сто ит в нанесении ин ку ба ци он ной сме си клет ки –фа ги на орга ни чес - кую фа зу (ди бу тилфта лат:цик ло гек сан, о/о = 9:1) с по сле ду ю щим цен три фу ги ро ва ни ем. При этом клет ки с фа го вы ми час ти ца ми, спе ци фи чес ки свя - зав ши ми ся с по вер хнос тным кле точ ным ан ти ге - ном, про хо дят сквозь орга ни чес кую фа зу и об ра зу - ют оса док на дне цен три фуж ной про бир ки. В то же 495 РАЗ РА БОТ КА СТРА ТЕ ГИИ ПО ЛУ ЧЕ НИЯ РЕ КОМ БИ НАН ТНЫХ ОД НО ЦЕ ПО ЧЕЧ НЫХ АН ТИ ТЕЛ вре мя бак те ри о фа ги, не спе ци фи чес ки свя зав ши е ся с клет ка ми, оста ют ся в вод ной фа зе [11]. Кро ме то го, что бы про ве рить эф фек тив ность ис поль зо ва ния rhExCD34 в про це ду рах би о пен - нин га для по лу че ния ан ти тел про тив дан но го кле - точ но го ан ти ге на, про во ди ли се лек цию биб ли о те - ки на им мо би ли зиро ван ном rhExCD34 (по схеме В). Свя зав ши е ся с ан ти ге ном фа го вые час ти цы по - сле би о пен нин га по схе мам се лек ции Б и В элю и ро - ва ли, ин ку би руя их с сус пен зи ей кле ток E. coli, как опи са но в [10]. Пред по ла га ет ся, что та ким об ра зом смывают ся фа го вые час ти цы с экс по ни ро ван ны ми на по вер хнос ти вы со ко аф фин ны ми ScFv, что не всег да воз мож но при элю ции как кис лым, так и ще - лоч ным бу фе ром [12]. Пос ле очередного ра ун да се лек ции оценивали ко ли чество элю и ро ван ных фа го вых час тиц по каж - дой из схем се лек ции. Как вид но из рис. 1, во всех по сле ду ю щих циклах се лек ции по вышалось ко ли - чество элю и ро ван ных фа го вых час тиц. Это сви де- тельству ет о це ле нап рав лен ном об ога ще нии по пу - ля ции фа го вых кло нов, экс по ни ру ю щих ан ти те ла, спе ци фич ные к кле точ ным ан ти ге нам, на по верх- нос ти кле ток KG1 (ли бо к rhExCD34 при испо льзо - ва нии схе мы В). Даль ней шая ра бо та бы ла на прав ле на на от бор кло нов – про ду цен тов ан ти тел, свя зы ва ю щих ся с ан ти ге на ми, пред став лен ны ми на по вер хнос ти кле - ток CD34+ ли нии KG1. Для это го ис сле до ва ли свя - зы ва ние ан ти тел, про ду ци ру е мых слу чай ным об ра - зом ото бран ны ми кло на ми по сле двух цик лов се - лек ции по схе мам А и В (А2 и В2), а так же по сле вто ро го и треть е го цик лов се лек ции по схе ме Б (Б2 и Б3), с ан ти ге на ми на по вер хнос ти кле ток ли нии KG1 с по мощью FMAT-ана ли за. Кон тро лем в экс - пе ри мен те слу жи ли клет ки ли нии SP2/0-Ag14. Сре - ди про а на ли зи ро ван ных кло нов, по лу чен ных по сле се лек ции по схе мам А2 (n = 250) и Б2 (n = 250), ото - бра ны четыре и 11 кло нов со от ве тствен но, свя зы ва - ю щих ся с по вер хнос тным кле точ ным ан ти ге ном на клет ках KG1. Из 96 кло нов, селек ци о ни ро ван ных по схе ме Б3, вос емь вза и мо де йство ва ли с ан ти ге - ном на по вер хнос ти кле ток KG1. Для ан ти тел, по - лу чен ных по схе ме В2, свя зы ва ния с кле точ ным ан - ти ге ном не на блю да лось. Вза и мо де йствие с им мо би ли зиро ван ным rhEx- CD34 ана ли зи ро ва ли ме то дом ИФА. При этом свя - зы ва ние с ан ти ге ном отмечено для 208 ан ти тел из изученных кло нов (n = 384), ото бран ных по схе ме В2. В то же вре мя свя зы ва ния ан ти тел, про ду ци ру е - мых кло на ми, ото бран ны ми с по мощью се лек ции на клет ках, не зафиксировано. Раз ли чия в свя зы ва нии ан ти тел, по лу чен ных с по мощью ука зан ных вы ше схем се лек ции, мож но об ъ яс нить эпи топ ны ми от ли чи я ми в струк ту ре ре - ком би нан тно го и на тив но го CD34. Всле дствие гли - ко зи ли ро ва ния кле точ но го ан ти ге на сай ты свя зы - ва ния ан ти тел, ото бран ных по схе ме В, мо гут быть бло ки ро ваны. И на о бо рот, в ре зуль та те би о пен нин - га на клет ках CD34+ мо гут вы де лять ся ан ти те ла, не спо соб ные свя зы вать ся с не гли ко зи ли ро ван ным, ре на ту ри ро ван ным in vitro rhExCD34. Та ким об ра - зом, от су тствие взаимодействия ан ти тел при ис - поль зо ва нии схе мы би о пен нин га В с кле точ ным ан - ти ге ном де мо нстри ру ет не эф фек тив ность дан ной схе мы се лек ции для по лу че ния ан ти тел про тив на - тив но го CD34. На осно ва нии дан ных FMAT-ана ли за ото бра ны 23 кло на, для ко то рых де тек ти ро ва лось свя зы ва ние про ду ци ру е мых ан ти тел с ан ти ге ном на по вер хно- сти кле ток KG1. Отли чия в по сле до ва тель нос тях ScFv-ДНК вы де лен ных кло нов пред ва ри тель но ана ли зи ро ва ли ме то дом фин гер прин та (дан ные не пред став ле ны). В итоге сре ди ото бран ных по сле до - ва тель нос тей ан ти тел вы яв ле ны три рес трик ци он - ные кар ти ны. Все они пред став ле ны сре ди кло нов, ото бран ных по схе ме Б2, две из них – по схе ме А2. В то же вре мя кло ны, ото бран ные по схе ме би о пен- 496 НИ КО ЛА ЕВ Ю. С., ГОР БА ТЮК О. Б., ЦА ПЕН КО М. В. 1 2 3 108 107 106 105 104 103 109 А В Б Рис. 1. Оцен ка ко ли чес тва элю и ро ван ных фа го вых час тиц в за - ви си мос ти от цик ла и схе мы би о пен нин га: 1–3 – цик лы се лек - ции; А, Б, В – схе мы би о пен нин га ни нга Б3, ограничены все го од ной рес трик ци он ной кар ти ной. Это, а так же низ кий уро вень свя зы ва ния ан ти тел, по лу чен ных по схе ме Б3, с ан ти ге ном на клет ках KG1 по зво ляют пред по ло жить эли ми ни ро - ва ние в треть ем цик ле би о пен нин га кло нов с бо лее низ ким уров нем про ду цирования фа гов. То есть, по-ви ди мо му, при ис поль зо ва нии вы - со коп ро дук тив ных сис тем скри нин га кло нов про - ве де ние треть е го цик ла се лек ции не це ле со об раз но, по сколь ку мо жет вызывать сни же ние раз но об ра зия по сле до ва тель нос тей ScFv в по лу чен ной па не ли ан ти тел. По итогам сек ве ни ро ва ния 12 по сле до ва тель - нос тей ScFv–ДНК из кло нов, по лу чен ных по схе - мам се лек ции А2 и Б2, вы яв ле ны пять ва ри ан тов по сле до ва тель нос тей ге нов, ко ди рующих раз лич - ные по ли пеп тид ные про дук ты. В ами но кис лот ном со ста ве по ли пеп тид ных по сле до ва тель нос тей дан - ных ScFv обнаружены су щес твен ные от ли чия. Все пять по сле до ва тель нос тей ан ти тел пред став ле ны сре ди кло нов, отобранных по схе ме се лек ции Б2, две из них – по схе ме А2. По лу чен ные ре зуль та ты хо ро шо де мо нстри ру ют осо бен нос ти ис поль зо ван - ных схем се лек ции, опи сан ные выше. Далее ис сле до вали свя зы ва ние ан ти тел с ан ти - ге ном на по вер хнос ти фик си ро ван ных и ин так тных кле ток KG1. Имму но хи ми чес кое окра ши ва ние пре - па ра тов кле ток CD34+ вы я ви ло вза и мо де йствие по - лу чен ных ан ти тел с по вер хнос тным кле точ ным ан - ти ге ном для всех пя ти ан ти тел (рис. 2, см. вклейку). Свя зы ва ние с ан ти ге ном на по вер хнос ти жи вых кле ток KG1 опре де ля ли ме то дом про точ ной ци то - мет рии (рис. 3, см. вклейку). Вне се ние rhExCD34 в ин ку ба ци он ную сре ду ан ти тел с клет ка ми в ка чест- ве кон ку рен тно го ан ти ге на не при во ди ло к из ме не - нию ин тен сив нос ти флу о рес цен ции об раз цов. Это сви де т ельству ет об от су тствии в составе rhExCD34 ан ти ген ных де тер ми нант, рас поз на ва е мых по лу - чен ны ми ан ти те ла ми в со ста ве на тив но го по верх- нос тно го кле точ но го ан ти ге на. Отсу тствие в па не ли ScFv ан ти тел, спо соб ных рас поз на вать ан ти ген ные де тер ми нан ты в со ста ве ре ком би нан тно го и на тив но го CD34, де мо нстри ру - ет не об хо ди мость ис поль зо ва ния до пол ни тель ных схем се лек ции при по лу че нии ука зан ных ан ти тел. Применение опи сан ных вы ше схем се лек ции, по- ви ди мо му, при водит к эли ми нации по сле до ва тель - нос тей та ких ан ти тел в про цес се об ога ще ния фа го - вой биб ли о те ки. Та ким об ра зом, им му ни за ци ей мы шей ре ком - би нан тным не гли ко зи ли ро ван ным внек ле точ ным фраг мен том CD34 и по сле ду ю щи ми ген но-ин же - нер ны ми ма ни пу ля ци я ми по лу че на биб ли о те ка ва - ри а бель ных учас тков им му ног ло бу ли нов, со дер - жа щая 1,8 ⋅ 106 ин ди ви ду аль ных кло нов, с функ ци о - наль ным размером ~90 %. Для об ога ще ния биб- ли о те ки ис поль зо ва ны схе мы се лек ции с при ме не - ни ем кле ток CD34+, по зво ля ю щие по лу чить на и - боль шее раз но об ра зие по сле до ва тель нос тей це ле - вых ан ти тел. Пока за но, что фаг мид ная ДНК ото - бран ных кло нов – про ду цен тов ScFv ко ди ру ет пять по сле до ва тель нос тей ан ти тел, име ю щих от ли чия в ва ри а бель ных учас тках лег кой и тя же лой це пей. По лу чен ные ан ти те ла можно ис поль зо вать для де - тек ти ро ва ния ан ти ген-по зи тив ных кле ток в ме то - дах им му но ци то хи мии и про точ ной ци то мет рии. Спе ци фич ность свя зы ва ния данных ан ти тел с по- верхнос тным кле точ ным мар ке ром CD34 тре бу ет даль ней ше го из уче ния. Авторы вы ра жа ют бла го дар ность В. М. Ки ри ку за про ве де ние и ин тер пре та цию ре зуль та тов ме то - да про точ ной ци то мет рии. Iu. S. Nikolaiev, O. B. Gorbatiuk, M. V.Tsapenko The development of strategy for obtaining single-chain recombinant antibodies against cell-surface biomarkers on the example of human CD34 State Organization of Genetic and Regenerative Medicine NАМS Ukraine 67, Vyshgorodska Str., Kyiv, Ukraine, 04114 Taras Shevchenko National University of Kyiv 64, Volodymyrska Str., Kyiv, Ukraine, 01033 Summary Antibodies against cell-surface proteins play an important role in cell detection, separation and determination of differentiation stage. The globular structure of extracellular region of cell-surface antigens is frequently characterized by heavily glycosilation and/or is stabilized by disulphide bonds. In this case the obtaining of anti- bodies against such proteins is a substantive problem. Aim. The de- velopment of strategy for obtaining recombinant antibodies against cell-surface biomarkers. Methods. The research strategy is based on the construction of cDNA library of VH and VL genes of animals, immunized with recombinant antigen, and subsequent cell-based bio-panning for the library enrichment with desired phage clones. 497 РАЗ РА БОТ КА СТРА ТЕ ГИИ ПО ЛУ ЧЕ НИЯ РЕ КОМ БИ НАН ТНЫХ ОД НО ЦЕ ПО ЧЕЧ НЫХ АН ТИ ТЕЛ 498 НИ КО ЛА ЕВ Ю. С., ГОР БА ТЮК О. Б., ЦА ПЕН КО М. В. High-throughput automated systems were used for the detection and isolation of antigen-specific clones. Results. We have obtained a panel of five antibodies that recognize an antigen on CD34+ cell surface using the methods of immunocytochemistry and flow cytometry. Conclusions. The proposed strategy may be used for ob- taining antibodies against cell-surface antigens. Keywords: CD34, phage display, single-chain recombinant antibodies (ScFv), biopanning. Ю. С. Ніколаєв, О. Б. Гор ба тюк, М. В. Ца пен ко Роз роб ка стра тегії одер жан ня ре комбіна нтних од но лан цю го вих ан титіл про ти по вер хне вих клітин них біомар керів на при кладі ан ти ге ну CD34 лю ди ни Ре зю ме Антитіла про ти по вер хне вих клітин них білків відігра ють важ ли ву роль у про це ду рах де тек ту ван ня, виз на чен ня стадії ди фе ренціації та виділен ня цільо вих по пу ляцій клітин. По верх- неві клітинні ан ти ге ни час то ма ють склад ну струк ту ру зовнішньоклітин ної ділян ки мо ле ку ли, яка ха рак те ри зується силь ним гліко зи лю ван ням та стабілізується дис ульфідни ми зв’яз ка ми. При цьо му одер жан ня ан титіл про ти та ких білків є не тривіаль ною за да чею. Мета. Роз роб ка стра тегії одер жан - ня ре комбіна нтних ан титіл про ти по вер хне вих клітин них біо- мар керів. Ме то ди. Ко нстру ю ван ня бібліот е ки кДНК генів VH та VL іму ног ло булінів тва рин, імунізо ва них ре комбіна нтним ан ти ге ном, та ви ко рис тан ня біопенінгу на ан ти ген-по зи тив - них кліти нах для зба га чен ня вихідної бібліот е ки послідов нос - тя ми цільо вих ан титіл. Де тек ту ван ня та відбір клонів – про- ду центів цільо вих ан титіл здійсню ва ли за до по мо гою ви со коп - ро дук тив них ав то ма ти зо ва них сис тем. Ре зуль та ти. Одер - жа но па нель з п’я ти ан титіл, що розпізна ють ан ти ген на по верхні клітин CD34+, ме то да ми іму но ци тохімії та про точ - ної ци то метрії. Вис нов ки. Зап ро по но ва ну стра тегію мож на ви ко рис то ву ва ти для одер жан ня ан титіл про ти по вер хне вих клітин них ан ти генів. Клю чові сло ва: CD34, фа го вий дис плей, ре комбіна нтні од - но лан цю гові ан титіла (ScFv), біопеннінг. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Civin C. I., Strauss L. C., Brovall C., Fackler M. J., Schwartz J. F., Shaper J. H. Antigenic analysis of hematopoiesis. III. A hematopoietic progenitor cell surface antigen defined by a monoclonal antibody raised against KG-1a cells // J. Immu- nol.–1984.–133, N 1.–P. 156–165. 2. Berenson R. J., Andrews R. G., Bensinger W. I., Kalamasz D., Knitter G., Buckner C. D., Bernstein I. D. Antigen CD34+ marrow cells engraft lethally irradiated baboons // J. Clin. Invest.–1988.– 81, N 3.–P. 951–955. 3. Azzazy H. M., Highsmith W. E., Jr. Phage display technology: clinical applications and recent innovations // Clin. Bio- chem.–2002.–35, N 6.–P. 425–445. 4. Maniatis T., Sambrook J., Fritsch E. F. Molecular cloning: A laboratory manual.–New York: Cold Spring Harbor Lab. publ., 1982.–545 p. 5. Pavlova M. V., Gilchuk P. V., Pokholenko Ya. O., Nikolayev Yu. S., Kordium V. A. Construction and characterization of immune cDNA combinatorial antibody library of mouse va- riable immunoglobuline genes // Cytology and Genetics.– 2008.–42, N 2.–P. 10–15. 6. Studier F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures // Protein Expr. Purif.–2005.–41, N 1.–P. 207–234. 7. Gilchuk P. V., Okunev O. V., Irodov D. M., Pavlova M. V., Yakovenko O. Ya. Immobilized single chain antibodies for af- finity purification of recombinant human IFN-α2b // Biopo- lym. Cell.–2006.–22, N 2.–P. 157–161. 8. Giordano R. J., Cardo-Vila M., Lahdenranta J., Pasqualini R., Arap W. Biopanning and rapid analysis of selective inter- active ligands // Nat. Med.–2001.–7, N 11.–P. 1249–1253. 9. Gilchuk P. V., Okunev O. V., Irodov D. М., Pavlova M. V. Overproduction of single-chain antibodies against human IFN-α2b in Escherichia coli and its obtaining in biologically active form // Ukr. Biochem. J.– 2006.–78, N 1.–P. 163–171. 10. Lipes B. D., Chen Y. H., Ma H., Staats H. F., Kenan D. J., Gunn M. D. An entirely cell-based system to generate single- chain antibodies against cell surface receptors // J. Mol. Biol.–2008.–79, N 2.–Р. 261–272. 11. Huie M. A., Cheung M. C., Muench M. O., Becerril B., Kan Y. W., Marks J. D. Antibodies to human fetal erythroid cells from a nonimmune phage antibody library // Proc. Natl Acad. Sci. USA.–2001.–98, N 5.–P. 2682–2687. 12. de Bruin R., Spelt K., Mol J., Koes R., Quattrocchio F. Selec- tion of high-affinity phage antibodies from phage display libraries // Nat. Biotechnol.–1999.–17, N 4.–P. 397–399. UDC 57.083.3 Received 02.09.10 Figures to article by Iu. S. Nikolaiev et al. ISSN 0233-7657. Biopolymers and Cell. 2010. Vol. 26. N 6 Èíòåíñèâíîñòü ôëóîðåñöåíöèè, àáñ. åä Á îê îâ îå ñâ åò îð àñ ñå èâ àí èå ,ó ñë . åä 7 10 1 9 102 103 104 105 102 103 104 105 K250 200 150 100 50 8 102 103 104 105 250 200 150 100 50 FITC-1 FITC FITC-1 FITC FITC-1 FITC FITC-1 FITC FITC-1 FITC FITC-1 FITC Ðèñ. 3. Îöåí êà ñâÿ çû âà íèÿ ScFv ñ êëåò êà ìè KG1 ìå òî äîì ïðî òî÷ íîé öè òî ìåò ðèè: Ê – êîí òðîëü àó òîô ëó î ðåñ öåí öèè êëå òîê; 1, 7, 8, 9, 10 – ñâÿ çû âà íèå ñ êëåò êà ìè ScFv, îò - ëè ÷à þ ùèõ ñÿ àìè íî êèñ ëîò íû ìè ïî ñëå äî - âà òåëü íîñ òÿ ìè è ýêñ ïðåñ ñè ðó þ ùèõ ñÿ êëî - íà ìè ¹ 1, 7, 8, 9, 10. Ãåé òîì îá îçíà ÷åí ó÷àñ òîê ãèñ òîã ðàì ìû, óñëîâ íî îò äå ëÿ þ - ùèé îêðà øåí íûå êëåò êè îò íå îêðà øåí íûõ 10 ìêì 10 ìêì à á Ðèñ. 2. Èììó íî õè ìè ÷åñ êîå îêðà øè âà íèå ïðå ïà ðà òîâ êëå òîê KG1: à – òè ïè÷ íàÿ ìèê - ðî ôî òîã ðà ôèÿ ïðå ïà ðà òà êëå òîê, îêðà - øåí íûõ ñ èñ ïîëü çî âà íè åì ïî ëó ÷åí íûõ ScFv; á – ìèê ðî ôî òîã ðà ôèÿ êëå òîê, èí êó - áè ðî âàí íûõ ñî âòî ðè÷ íû ìè è òðå òè÷ íû ìè àí òè òå ëà ìè áåç ScFv (êîí òðîëü ñïå öè ôè÷ - íîñ òè)

Ähnliche Einträge