Клонування та надекспресія фрагмента гена структурного білка El штама Ші-Минь вірусу класичної чуми свиней в Escherichia coli
З використанням зворотньо-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції клоновано та секвеновано фрагмент гена білка Е1 вірулентного штама Ші-Минь вірусу класичної чуми свиней довжиною 775 пар нуклеотидів. Отримано експресію цього фрагмента в Е. coli у вигляді злитого з глутатіон-й-трансферазою бі...
Gespeichert in:
| Veröffentlicht in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Datum: | 1996 |
| Hauptverfasser: | , , , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Ukrainisch |
| Veröffentlicht: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1996
|
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154232 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Клонування та надекспресія фрагмента гена структурного білка El штама Ші-Минь вірусу класичної чуми свиней в Escherichia coli / С.Д. Кириленко, О.М. Дерябін, О.Л. Кириленко, О.Г, Дерябіна, В.О. Бусол // Биополимеры и клетка. — 1996. — Т. 12, № 5. — С. 93-99. — Бібліогр.: 20 назв. — укр. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860069137567449088 |
|---|---|
| author | Кириленко, С.Д. Дерябін, О.М. Кириленко, О.Л. Дерябіна, О.Г. Бусол, В.О. |
| author_facet | Кириленко, С.Д. Дерябін, О.М. Кириленко, О.Л. Дерябіна, О.Г. Бусол, В.О. |
| citation_txt | Клонування та надекспресія фрагмента гена структурного білка El штама Ші-Минь вірусу класичної чуми свиней в Escherichia coli / С.Д. Кириленко, О.М. Дерябін, О.Л. Кириленко, О.Г, Дерябіна, В.О. Бусол // Биополимеры и клетка. — 1996. — Т. 12, № 5. — С. 93-99. — Бібліогр.: 20 назв. — укр. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Биополимеры и клетка |
| description | З використанням зворотньо-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції клоновано та секвеновано фрагмент гена білка Е1 вірулентного штама Ші-Минь вірусу класичної чуми свиней довжиною 775 пар нуклеотидів. Отримано експресію цього фрагмента в Е. coli у вигляді злитого з глутатіон-й-трансферазою білка. Молекулярна маса частини білка E1 збігалася з розрахованою теоретично та становила близько 31 к Да. Рекомбінантний білок знаходився головним чином у нерозчинній фракції, його кількість становила до 15% від загального білка клітини. Обговорюються можливості застосування отриманого рекомбінантного білка.
С использованием обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции клонирован и секвенирован фрагмент гена белка Е1 вирулентного штамма Ши-Мынь вируса классической чумы свиней длиной775 пар нуклеотидов. Получена экспрессия этого фрагмента в Е. coli в виде слитого сглутатион-З-трансферазой белка. Молекулярная масса части белка Е1 совпала с рассчитанной теоретически и составила около 31 к Да. Рекомбинантный белок находится, главным образом, в нерастворимой фракции, его количество составляет до 15% общего белка клетки. Обсуждаются возможности применения полученного рекомбинантного белка.
A fragment of El gene of virulent strain Shi-Min of classical swine fever virus(CSFV) 775 bp in length has been cloned using reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). Primary sequence of the cloned fragment has been determined. This fragment has been fused to glutathione-S-transferase and expressed in E. coli. Molecular weight of the part of El protein was estimated to be 31 kD as expected. The recombinant protein has been found mainly in insoluble fraction, its yield was up to 15% of the total cellular protein. Possible use of the protein is discussed.
|
| first_indexed | 2025-12-07T17:09:59Z |
| format | Article |
| fulltext |
ISSN 0233-7657. Биополимеры и клетка. 1996. Т. 12. № 5
Клонування та надекспресія фрагмента гена структурного
білка El штама Ші-Минь вірусу класичної чуми свиней в
Escherichia coli
С. Д. Кириленко*, О. М. Дерябін1, О. Л. Кириленко, О. Г, Дерябіна1,
В. О. Бусол2
Інститут молекулярної біології та генетики НАН України
252143, Київ, вул. Академіка Заболотного, 150
1 Інститут ветеринарної медицини Української ААН
252151, Київ, вул. Донецька, 30,
2Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини Української ААН
310023, Харків, вул. Пушкінська, 83
З використанням зворотньо-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції
клоновано та секвеновано фрагмент гена білка Е1 вірулентного штама Ші-Минь
вірусу класичної чуми свиней довжиною 775 пар нуклеотидів. Отримано експресію
цього фрагмента в Е. coli у вигляді злитого з глутатіон-й-трансферазою білка.
Молекулярна маса частини білка EJ збігалася з розрахованою теоретично та
становила близько 31 к Да. Рекомбінантний білок знаходився головним чином у
нерозчинній фракції, його кількість становила до 15% від загального білка клі-
тини. Обговорюються можливості застосування отриманого рекомбінантного
білка.
Вступ, Класична чума свиней (КЧС) — одне з найнебезпечніших вірусних
інфекційних захворювань свиней, яке щорічно наносить великі економічні
збитки тваринництву в багатьох країнах світу, в тім числі і в Україні.
Збудником КЧС є вірус роду Pestivirus, віднесений до родини Flaviviridae
[1 ]. Інші представники роду пестивірусів — вірус вірусної діареї (ВВД)
великої рогатої худоби та вірус прикордонної хвороби (ВПХ) овець. Геном
вірусу КСЧ (ВКЧС) представлений одним позитивним ланцюгом РНК
розміром 12,5 тис. нуклеотидів, молекулярна маса — біля 4 МДа, ко-
ефіцієнт седиментації 42 S. Геном має одну велику відкриту рамку
зчитування, яка кодує загальний поліпротеїн-попередник розміром біля
3898 амінокислотних залишків. У клітинах, інфікованих пестивірусами,
субгеномні РНК не виявлені [2].
Серед ідентифікованих структурних білків ВКЧС — капсидного gpl4
( С л глікопротеїнів gp44/48 (Е2), gp33 (ЕЗ) і gp51—55 ( E l ) [3 ] —самим
імуногенним є EJ: використання його рекомбінантного аналога як субоди-
ничної вакцини (навіть без трансмембранної області) було достатнім для
формування у тварин протективної імунної відповіді [4 ]. Вірусо-
нейтралізуючі антитіла є специфічними, головним чином, до Е1 [5], а
також до Е2.
•Correspondence address.
© с . Д. КИРИЛЕНКО, О. М. ДЕРЯБІН, О. Л. КИРИЛЕНКО, О. Г. ДЕРЯБІНА, В. О. БУСОЛ, 1996
93
КИРИЛЕНКО С. Д. ТА ІН.
Для білка El ВКЧС показано [19], що його амінокінцева частина несе
дві структурно незалежні антигенні субодиниці, на одній з яких знаходяться
висококонсервативний домен А та домен D, а на другій — неконсервативні
В та С.
Для специфічної профілактики захворювання КЧС використовують
інактивовані та живі вакцини, лапінізовані (пасовані на кролях як на
неспецифічних хазяях) та отримані на культурах клітин. Однак існуючі
вакцини не забезпечують повного захисту свиней від інфекції. У той же час
все частіше зустрічаються слабовірулентні штами, які викликають імунну
толерантність і довгочасне вірусоносійство, що призводить до появи атипо-
вих форм КЧС. Все вищезгадане, а також наявність перехресних реакцій з
іншими пестивірусами у серологічних дослідженнях ускладнюють діагно-
стику КЧС і диференціацію вірусу КЧС від інших пестивірусів. Одним з
перспективних шляхів вирішення цієї проблеми є отримання методами
генної інженерії рекомбінантних продуктів для специфічної профілактики
та діагностики захворювання [6].
Метою даної роботи було отримання фрагмента кодуючої частини гена
структурного найімуногеннішого білка оболонки E1 (gp51—55) вірулентного
штама Ші-Минь ВКЧС та експресії його в Е. coli; саме такого фрагмента,
який несе антигенну субодиницю з антигенними доменами А та D.
Матеріали та методи. Реактиви. В роботі використано наступні реак-
тиви: глікоген — «Invitrogene»; трис, бромистий етидій — «Calbiochem»
(США); EDTA (етилендіамінтетраоцтова кислота), DTT (дитіотреїтол),
твін-20, сульфат амонію, хлорид гуанідину — «Fluka» (Швейцарія); DS-Na
(додецилсульфат натрію), агароза — «BioRad» (США); хлорид магнію —
«Мегск» (ФРГ); акриламід, бісакриламід, персульфат натрію, TEMED,
гліцин — «Reanal» (Угорщина); ДНК фага лямбда — «Біопол» (Росія); де-
зоксинуклеотидтрифосфати — «Pharmacia» (Швеція); бактотриптон, бакто-
агар, дріжджовий екстракт — «Difсо» (США); бромфеноловий синій —
«Serva» (ФРГ); ПЕГ 8000, гліцерин — «Sigma» (США); ампіциліну натрієва
сіль — ВО «Дарниця» (Україна); всі інші реактиви — виробників країн СНД
та вітчизняних виробників з кваліфікацією не нижче хч; IPTG (ізопропіл-
/J-D-тіогалактопіранозид) та Z-Gal (аналог 5-бромо-4-хлоро-3-індоліл-/?-0-
галактозиду) були синтезовані та люб'язно надані А. Г. Терентьєвим (ІМБіГ
НАНУ).
Ферменти: протеїназа К — «Sigma»; РНКазин — «Promega»; ДНК-
полімераза БіоТад — «Біомастер» (Росія); Sacl — «Біопол»; ВатНІ —
«Amersham» (Велика Британія); EcoRI, PstI та ДНК-лігаза фага Т4 —
«Fermentas» (Латвія); зворотна транскриптаза із вірусу мієлобластозу
птахів була виділена у відділі біосинтезу НК та люб'язно надана В. М. Кав-
саном (ІМБіГ НАНУ).
Штами та культури. У роботі використовували вірулентний штам
ВКЧС Ші-Минь, адаптований до перевивної культури клітин нирки свині
РК-15, на рівні 37-го пасажу в даній системі (цей штам в Україні і Росії
використовується для контрольного зараження свиней при перевірці
імуногенних властивостей вакцин); патматеріал з господарства, де спо-
стерігалася гостра форма хвороби, діагностований на наявність ВКЧС
референтним методом. Усі маніпуляції з інфекційним матеріалом
здійснювалися у лабораторії епізоотології Інституту ветеринарної медицини
(IBM) УААН. Штам Ші-Минь та зразок патматеріалу (експертиза № 67)
для виділення віріонної РНК ВКЧС були люб'язно надані провідним
науковим співробітником JI. П. Гришок. Для генноінженерних маніпуляцій
та отримання рекомбінантного білка використовувався штам Е. coli JM109.
Як вектор загального призначення була використана плазміда pUC18; для
експресії — pGEX-2T фірми «Pharmacia».
94
КЛОНУВАННЯ ТА НАДВКСПРЕСІЯ ФРАГМЕНТА ГЕНА БІЛКА El
Виділення віріонної РНК. Інфіковану вірусом культуру клітин через
72 год культивування промивали забуференим фізіологічним розчином
(ЗФР), після чого клітини руйнували, тричі проморожуючи в мінімальному
об'ємі, та освітлювали лізат центрифугуванням. Віріонну РНК виділяли за
схемою [7 ] з модифікаціями. В пробірки Eppendorf вносили 5 мкл глікогена
(20 мг/мл), 5 мкл трис-НСІ (1 М, рН 8,0, 25 °С), 5 мкл EDTA (500 мМ),
10 мкл протеїнази К (10 мг/мл) та по 450 мкл вірусного матеріалу,
додавали по 20 мкл DS-Na (10 %) та інкубували протягом 30 хв у водяній
бані при 56 °С. Препарат екстрагували фенолом, двічі — сумішшю фенол —
хлороформ та двічі — хлороформом. Додавали 2,5 об'єма етилового спирту
з 300 мМ ацетатом натрію. Пробірки витримували 1 год чи протягом ночі
при -20 °С, центрифугували 10 хв у центрифузі Eppendorf, осади промива-
ли почергово 70 %-м та 96 %-м етанолом і висушували.
Олігонуклеотидні затравки. Комп'ютерний аналіз і підбір олігонуклео-
тидних праймерів, що фланкують фрагмент гена Е1 ВКЧС, проводили з
програмним забезпеченням Primer Detective (Clontech Labs, v. 1.01). Як
вихідну матрицю було використано послідовність ВКЧС штама Brescia
(GenBank, ідентифікаційний номер М31768). Прямий праймер Chum-А має
послідовність 5'-TTACCCACTTCCGTGACATTCG-3' та локалізацію 2647—
2668, зворотний (Chum-B, 5-TATCTTCCTCCCAACGTGCC-3') ло-
калізується на послідовності РНК штама Brescia в позиціях 3492—3471.
Олігонуклеотидні праймери синтезували за фосфорамідитним методом на
ДНК-синтезаторі Gene Assembler Special («Pharmacia») з використанням
відповідних реактивів цієї ж фірми.
Зворотньо-транскриптазна полімеразна ланцюгова реакція (ЗТ-
ПЛР). Зворотну транскрипцію препарату вірусної РНК проводили в об'ємі
20 мкл у присутності 25 мМ трис-НСІ (рН 8,7, 25 °С), 50 мМ хлориду
натрію, 10 мМ хлориду магнію, 1 мМ DTT, 200 мМ кожного з чотирьох
дезоксинуклеотидтрифосфатів, по 7 пмоль прямого та зворотного праймерів,
10 од. акт. РНКазину та 5 од. акт. зворотної транскриптази із вірусу
мієлобластозу птахів. Реакцію здійснювали у водяній бані при 42 °С
протягом 1 год. По 2,5 мкл матеріалу брали для ПЛР. У пробірки вносили
2,5 мкл буферу lOxTth (170 мМ сульфату амонію, 670 мМ трис-НСІ, рН 8,8
(25 °С), 0,1 % твін-20), 1 мкл хлориду магнію (25 мМ, кінцева концент-
рація в ПЛР-реакційній суміші з урахуванням магнію, привнесеного з
ЗТ-сумішшю, була 2 мМ), 1 мкл дезоксинуклеотидтрифосфатів (5 мМ
кожний), по 3,5 мкл прямого та зворотного праймерів (1 оптична одиниця
в 1 мл при 260 нм), 2 од. акт. полімерази Biotaq та воду до об'єму 25 мкл,
після чого додавали 2 краплі мінеральної олії. ПЛР проводили на термоцик-
лері Gene Ataq Controller («Pharmacia») за звичайною методикою [8] з
модифікаціями для нашого об'єкту у наступному режимі: 94 °С — 1 хв, 57
°С — 2 хв і 70 °С — 2 хв. У першому циклі тривалість усіх стадій була
збільшена до 3 хв, а в останньому (стадія елонгації, 70 °С) — була
подовжена до 10 хв. Кількість циклів становила 35. По 10 мкл реакційних
сумішей брали для розділення методом гель-електрофорезу в 1,5 %-й
агарозі в буфері 0,5*ТВЕ. Візуалізацію та фотографування гелів після
забарвлення бромистим етидієм проводиди на трансілюмінаторі («LKB») під
ультрафіолетовим світлом.
Генноінженерні маніпуляції проводили у відповідності з рекомен-
даціями Маніатіса [9 ]. Плазмідну ДНК виділяли за методом лужного лізису
[10]. Бактерії трансформували за методом [11]. Після фенольної екстракції
матеріал ПЛР гідролізували почергово ендонуклеазами рестрикції EcoRI та
SacI в умовах, рекомендованих виготовлювачем, з проміжною фенольною
екстракцією. Фрагмент 775 п. н. було елюйовано з 1 %-ї агарози за методом
заморожування з фенолом [12] та клоновано в плазмідний вектор pUC18
95
КИРИЛЕНКО С. Д. ТА ІН.
по сайтах пізнавання EcoRI та Sacl. Первинну послідовність фрагмента
отриманої плазміди pUC 18-115 було визначено за методом Сангера [13] на
автоматизованому лазерному секвенаторі A. L. F. фірми «Pharmacia» з
використанням Auto Read Sequencing Kit цієї ж фірми. Фрагмент ВатНІ-
EcoRI плазміди pUC18-115 розміром 794 п. н. було переклоновано по
відповідних сайтах в експресуючий вектор pGEX-2T («Pharmacia») зі
збереженням рамки зчитування, отримавши, таким чином, вектор pGEX-
Одержання рекомбінантного білка. Індукцію культури Е. coli JM109,
що несла експресуючі плазміди, здійснювали у відповідності з рекомен-
даціями фірми «Pharmacia». Нічну культуру розводили 1:100 у середовищі
LB з 100 мкг/мл ампіциліну, нарощували до густини 0,3 опт. од. на довжині
хвилі 540 нм та додавали індуктор IPTG до концентрації 0,1 мМ, після чого
інкубували ще протягом 3—4 год з енергійною аерацією при 37 °С. Клітини
збирали центрифугуванням, відмивали ЗФР та руйнували на ультразвуко-
вому дезінтеграторі MSE (6 циклів по 10 с з перервами у 20 с на льоду).
Матеріал центрифугували протягом 5 хв у центрифузі Eppendorf. Аліквоти
осаду та супернатанту брали для білкового денатуруючого електрофорезу в
12,5 %-му ПААГ по Лемлі [14].
Результати та обговорення. Оскільки нуклеотидну послідовність геном-
ної РНК штама Ші-Минь ще не було визначено, як вихідну матрицю для
розрахунків було використано послідовність ВКЧС штама Brescia. Останнє
пояснюється тим, що картування геномної області, яка кодує структурні
білки цього штама, було виконане з синтезом відповідних пептидів і
перевіркою специфічності отриманих на них антисироваток з нативними
афінно очищеними вірусними білками [3 ]. Відомо, що геномні послідовності
різних штамів ВКЧС мають досить високу гомологію [15] і тому викори-
стання гетерологічної послідовності було цілком виправданим.
Виходячи з послідовності РНК цього штама, було підібрано та синтезо-
вано праймери Chum-А та Chum-B, які фланкують фрагмент гена білка Е1
з сайтами пізнавання ендонуклеазами рестрикції Sacl (з 5'-кінця фраг-
мента, позиція 2673 на РНК штама Brescia) та EcoRI (з 3'-кінця фраг-
мента, позиція 3448). На рис. 1, доріжка б, показано фрагмент ЗТ-ПЛР з
праймерами Chum-А та Chum-B та віріонною РНК вірусу КЧС, яка була
виділена з патматеріалу. Розмір фрагмента збігається з розрахованим
теоретично значенням 845 п. н. Після обробки цього фрагмента ендонукле-
азою рестрикції Sacl розмір його зменшився до 819 п. н. (доріжка 5).
Обробка EcoRI не призводить до подальшого зменшення розміру до 775 п.
н. (доріжка 4), тому що, вірогідно, наявність нуклеотидних замін в РНК
польового ізолята по відношенню до штама Brescia призводить до втрати
794.
Рис. 1. Електрофореграма рестриктних фраг-
ментів рекомбінантних плазмід та продуктів
ПЛР: 1 — маркер величини фрагментів ДНК
(гідроліз ДНК фага лямбда рестриктазою
PstI, розміри фрагментів вказані зліва); 2 —
фрагменти гідролізу ендонуклеазами рестрик-
ції ВатНІ та EcoRI рекомбінантної плазміди
pUC18-775\ 3 — те саме, що 2, але плазміди
pGEX-794; 4 — продукт ЗТ-ПЛР з праймера-
ми Chum-A та Chum-B та PHK ВКЧС поль-
ового ізоляту, гідролізований ендонуклеазами
рестрикції Sacl та EcoRI; J — той же про-
дукт, гідролізований тільки Sacl; 6 — той же
продукт без обробки рестриктазами
96
КЛОНУВАННЯ ТА НАДВКСПРЕСІЯ ФРАГМЕНТА ГЕНА БІЛКА El
відповідного сайту пізнавання. На доріжці 3 показано фрагменти подвійного
гідролізу SacI та EcoRI рекомбінантної плазміди pUC18-775, у якій по цих
сайтах клоновано фрагмент 775 п. н. кДНК штама Ші-Минь. В цьому штамі
зберігаються як сайт SacI, так і EcoRI (даних не наведено).
Клонований фрагмент у складі pUC18-775 було секвеновано та його
послідовність порівняно з відповідними послідовностями референтних
штамів ВКЧС [16]. Це дало змогу зробити висновок стосовно того, що
клонований фрагмент дійсно походить від кДНК вірусу КЧС. На доріжці 2
наведено фрагменти подвійного гідролізу EcoRI та ВатНІ рекомбінантної
плазміди pGEX-794. У ній вищезгаданий фрагмент знаходиться у формі
злитого з глутатіон-Б-трансферазою гена під контролем індуцибельного
промотора Ршс. Індукція цієї плазміди в Е. соїі призводить до синтезу
злитого білка розміром близько 59 к Да (рис. 2), у якому 27,5 кДа походить
від глутатіон-Б-трансферази, а 31 кДа являє собою рекомбінантно
відтворену внутрішню частину білка El (gp51—55) ВКЧС штама Ші-Минь.
На послідовності геномної РНК штама Brescia білок EJ кодується нуклео-
тидними залишками 2428—3535 [3], розрахована маса неглікозильованого
білка становить близько 44 кДа, тобто нами було відтворено значну частину
(близько 70 %) білка Е1. N-кінець згаданого фрагмента містить попередньо
картовані антигенні домени А та D [19], С-кінцева його частина безпосе-
редньо межує з гідрофобним трансмембранним доменом (кодується нуклео-
тидами 3454—3507 на РНК штама Brescia) [3 ].
Рекомбінантний білок 59 кДа знаходиться головним чином у нероз-
чинній фракції (доріжки 6—9) на відміну від контрольної індукції вихідної
плазміди pGEX-2T (доріжки 1—4), де білок 27,5 кДа знаходиться як у
нерозчинній фракції (осад), так і в розчинній (супернатант). Білок 59 кДа
розчиняється у 8 М хлористому гуанідині, але випадає в осад при діалізі
супроти низькосольових буферних розчинів (даних не наведено).
Ведуться роботи з отримання розчинної форми білка 59 кДа з застосу-
ванням стабілізуючих домішок під час діалізу [17], а також методом
коекспресії зі спеціальними білками шаперонами, наприклад, GroE або
тіоредоксином [18].
Експресія в Е. соїі супроводжується утворенням неглікозильованої
форми вірусного білка, що може накладати певні обмеження на його
антигенні та імуногенні властивості. Зменшення імуногенної активності у
неглікозильованих білків, імовірно, викликане зниженням їх резистентності
до протеолізу і швидкою деградацією in vivo. У білковій інженерії запропо-
новано правило, згідно з яким амінокислота на N-кінці білка може
визначати час його деградації in vivo. У нашому випадку рекомбінантний
білок Е1, експресований з вектора pGEX-794, після відщеплення тромбіном
від носія глутатіон-Б-трансферази несе на амінокінці залишок глутамінової
Рис. 2. Електрофореграма білкового
DS-Na-електрофорезу препаратів інду-
кованих культур Е. соїі JM109, що
несуть експресуючі вектори pGEX-2T
або pGEX-794: J, 2 — різні кількості
препарату осаду після озвучення інду-
кованої культури JM109 [pGEX-2T]; З,
4 — те саме для супернатанту; 5 —
маркер молекулярної маси білкових
продуктів (LMW Kit фірми «Phar-
macia») ; 6, 7 — різні кількості препара-
ту осаду після озвучення індукованої
культури JM109 [pGEX-194]; 8, 9 — те
саме для супернатанту
97
КИРИЛЕНКО С. Д. ТА ІН.
кислоти, яка здатна подовжувати час- деградації порівняно з багатьма
іншими залишками. Для подальшого підвищення стабільності існують мето-
ди, які дозволяють маскувати центри протеолізу на білку.
Іншим важливим стабілізуючим фактором білкової молекули є наси-
ченість її дисульфідними зв'язками. Кількість і позиції цистеїнових за-
лишків, що формують ці зв'язки, взагалі відносяться до розряду консерва-
тивних характеристик вірусних глікопротеїнів. Принципове значення для
збереження антигенних властивостей Е1 мають цистеїнові залишки Cys-792
(нумерація подана у відповідності з такою на загальному поліпротеїні-попе-
реднику штама Brescia), що утворює дисульфідний місток з Cys-856, і
Cys-818 з Cys-828, які беруть участь у формуванні доменів А і D [19]. В
експресованому нами білку позиції цих амінокислотних залишків збережені
[16], але питання відносно правильного згортання поліпептидного ланцюга
і утворення дисульфідних зв'язків між ними потребує подальшого вивчення.
Відомо, що для правильного згортання поліпептиду in vivo часто
необхідне глікозилювання, але внесок олігосахаридних ланцюгів до оформ-
лення антигенної унікальності глікопротеїнів ВКЧС ще не визначений. Для
білка Е1 ВКЧС було показано [16], що більшість моноклональних антитіл,
отриманих до Е1 референтного штама Alfort ВКЧС і нейтралізуючих вірус
у стандартних серологічних реакціях, реагувала з бактеріальним, злитим з
глутатіон-Б-трансферазою, фрагментом білка EL
Одержані результати являють собою початковий етап досліджень анти-
генних і імуногенних властивостей білків ВКЧС. Рекомбінантний білок та
антитіла до нього передбачаєтьмся використати для спроб виявлення пес-
тивірусів серологічними методами; при вивченні антигенної різноманітності
Е1 у штамів ВКЧС різного походження (вірулентних, вакцинних та
польових ізолятів); вивченні механізмів, що визначають формування рези-
стентності до КЧС у вакцинованих тварин, у яких відсутні вірусо-
нейтралізуючі антитіла.
С. Д Кириленко, О. М. Дерябин, О. Л. Кириленко, Е. Г. Дерябина, В. О. Бусол
Клонирование и суперэкспрессия фрагмента гена структурного белка E l штамма Ши-Мынь
вируса классической чумы свиней в Escherichia coli
Резюме
С использованием обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции клонирован и секве-
нирован фрагмент гена белка Е1 вирулентного штамма Ши-Мынь вируса классической чумы
свиней длиной775 пар нуклеотидов. Получена экспрессия этого фрагмента в Е. coli в виде слитого
сглутатион-З-трансферазой белка. Молекулярная масса части белка Е1 совпала с рассчитанной
теоретически и составила около 31 к Да. Рекомбинантный белок находится, главным образом, в
нерастворимой фракции, его количество составляет до 15% общего белка клетки. Обсуждают-
ся возможности применения полученного рекомбинантного белка.
S. D. Kirilenko, О. М. Deriabin, О. L Kirilenko, Е. G. Deriabina, V. О. Busol
Cloning and overexpression of the part of envelope protein E l gene of classical swine fever virus
(Strain Shi-Min) in Escherichia coli
Summary
A fragment of El gene of virulent strain Shi-Min of classical swine fever virus (CSFV) 775 bp in length has
been cloned using reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). Primary sequence of the
cloned fragment has been determined. This fragment has been fused to glutathione- S-transferase and
expressed in E. coli. Molecular weight of the part of El protein was estimated tobe31kDas expected. The
recombinant protein has been found mainly in insoluble fraction, its yield was up to 15 % of the total cellular
protein. Possible use of the protein is discussed.
98
КЛОНУВАННЯ ТА НАДВКСПРЕСІЯ ФРАГМЕНТА ГЕНА БІЛКА El
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ
1. Collett J. M., Anderson D. К, Retzel E. Comparisons of the pestivirus bovine viral diarrhea
virus with members of the flaviviridae / / J. Gen. Virol.—1988.—69, N 6.—P. 2637—2643.
2. Collett M. S., Moennig V., Horzinek M. C. Recent advances in pestivirus research 11
Ibid.—1989.—70, N 2.—P. 253—266.
3. Moormann R. J., Warmerdam P. A., Van der Meer B. et al Molecular cloning and nucleotide
sequence of hog cholera virus strain Brescia and mapping of the genomic region encoding
envelope E l U Virology.—1990.—177, N 1.—P. 184—198.
4. Van Rijn P. A., Bossers A., Terpstra C. et al. A deletion subunit vaccine against classical swine
fever virus and accompanying diagnostic test based on envelope glycoprotein E l 11 Abstr. Third
Congr. Eur. Soc. Vet. Virol.—Interlaken, 1994.—W3—7.
5. Greiser-Wilke I., Moennig K, Coulibaly С. O. Z. et ^Identification of conserved epitopes on
a hog cholera virus protein 11 Arch. Virol.—1990.—Ill, N 3—4.—P. 213—225.
6. Moser C., Ruggli N., Tratschin J. D., Hofmann AT. A. Detection of antibodies against classical
swine fever virus in swine sera by indirect ELISA using recombinant envelope glycoprotein E2
II Immunobiology of viral infections. Proc. 3rd Congr. Eur. Soc. Vet. Virol.—Interlaken,
1994.—P. 327—330.
7. Rasschaert D. Etude d'un coronavirus, le virus de la gastro-enterite transmissible du pore:
identification des genes structuraux et non-structuraux et localization d'un site antigenique
majeur sur la sequence de la glycoproteine de spicule E2 II These de docteur en
sciences.—Paris, 1988.—P. 18.
8. Saiki R. К., Bugavan T. L, Horn С. T. et al. Analysis of enzymatically amplified /?-globin and
HLA DQ-cc DNA with a thermostable DNA polymerase / / Nature.—1986.—324, N 6093.—
P. 163—166.
9. Sambrook /., Fritsch E. F., Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual. The second
edition.— New York: Cold Spring Harbor Lab., 1989.
10. Birnboim H. C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant
plasmid DNA / / Nucl. Acids Res.—1979.—7, N 6.—P. 1513—1523.
11. Nishimura A., Morita M., Nishimura Y., Sugino Y. A rapid and highly efficient method for
preparation of competent Escherichia coli cells / / Ibid.—1990.—18.—P. 6169.
12. Hojman F. A novel electrophoretic strategy allows detection of very low amounts of circular
retroviral DNA by PCR II Meth. Мої. and Cell. Biol.—1990.—2.—P. 66—69.
13. Sanger F., Nicklen S., Coulson A. R. DNA sequencing with chain terminating inhibitors 11
Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1977.—74, N 12.—P. 5463—5467.
14. Laemmli U. К Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage
T4 / / Nature.—1970.—227.—P. 680.
15. Classical swine fever virus and related infections / / Ed. B. Liess.— Boston: Martinus Nijhoff
Publ, 1988.
16. Кириленко С. Д., Дерябін О. А/., Кириленко О. Л.> Трояновський Б. М. Порівняльний
філогенетичний аналіз кодуючої частини генів структурного білка Е1 штама Ші-Минь та
інших штамів вірусу класичної чуми свиней / / Цитологія та генетика.—1997.—№ 6.—
(У друці).
17. Seroude JL, Cribbs D. L. Differential effects of detergents on enzyme and DNA-binding
activities of a glutathione-S-transferase — homeodomain fusion protein / / Nucl. Acids Res.—
1994.—22, N 20.—P. 4356—4357.
18. Yasukawa C.t Kanei-Ishii Т., Maekawa J. et aL Increase of solubility of foreign proteins in
Escherichia coli by coproduction of the bacterial thioredoxin 11 J. Biol. Chem.—1995.—270,
N 43.—P. 25328—25331.
19. Van Rijn A., Miedema G. M. K, Wensvoort G. et aL Antigenic structure of envelope
glycoprotein E l of hog cholera virus 11 J. Virol.—1994.—68, N 6.—P. 3934—3942.
20. Weiland E., Stark R., Haas B. et al Pestivirus glycoprotein which induces neutralizing
antibodies forms part of a disulfide-linked heterodimer 11 Ibid.—1990.—64, N 8.—P. 3563—
3569.
УДК 619:616:575.11.833.31 Надійшла до редакції 16.10.96
99
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-154232 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7657 |
| language | Ukrainian |
| last_indexed | 2025-12-07T17:09:59Z |
| publishDate | 1996 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Кириленко, С.Д. Дерябін, О.М. Кириленко, О.Л. Дерябіна, О.Г. Бусол, В.О. 2019-06-15T11:14:58Z 2019-06-15T11:14:58Z 1996 Клонування та надекспресія фрагмента гена структурного білка El штама Ші-Минь вірусу класичної чуми свиней в Escherichia coli / С.Д. Кириленко, О.М. Дерябін, О.Л. Кириленко, О.Г, Дерябіна, В.О. Бусол // Биополимеры и клетка. — 1996. — Т. 12, № 5. — С. 93-99. — Бібліогр.: 20 назв. — укр. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00044F https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154232 619:616:575.11.833.31 З використанням зворотньо-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції клоновано та секвеновано фрагмент гена білка Е1 вірулентного штама Ші-Минь вірусу класичної чуми свиней довжиною 775 пар нуклеотидів. Отримано експресію цього фрагмента в Е. coli у вигляді злитого з глутатіон-й-трансферазою білка. Молекулярна маса частини білка E1 збігалася з розрахованою теоретично та становила близько 31 к Да. Рекомбінантний білок знаходився головним чином у нерозчинній фракції, його кількість становила до 15% від загального білка клітини. Обговорюються можливості застосування отриманого рекомбінантного білка. С использованием обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции клонирован и секвенирован фрагмент гена белка Е1 вирулентного штамма Ши-Мынь вируса классической чумы свиней длиной775 пар нуклеотидов. Получена экспрессия этого фрагмента в Е. coli в виде слитого сглутатион-З-трансферазой белка. Молекулярная масса части белка Е1 совпала с рассчитанной теоретически и составила около 31 к Да. Рекомбинантный белок находится, главным образом, в нерастворимой фракции, его количество составляет до 15% общего белка клетки. Обсуждаются возможности применения полученного рекомбинантного белка. A fragment of El gene of virulent strain Shi-Min of classical swine fever virus(CSFV) 775 bp in length has been cloned using reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). Primary sequence of the cloned fragment has been determined. This fragment has been fused to glutathione-S-transferase and expressed in E. coli. Molecular weight of the part of El protein was estimated to be 31 kD as expected. The recombinant protein has been found mainly in insoluble fraction, its yield was up to 15% of the total cellular protein. Possible use of the protein is discussed. uk Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Клонування та надекспресія фрагмента гена структурного білка El штама Ші-Минь вірусу класичної чуми свиней в Escherichia coli Клонирование и суперэкспрессия фрагмента гена структурного белка El штамма Ши-Мынь вируса классической чумы свиней в Escherichia coli Cloning and overexpression of the part of envelope protein El gene of classical swine fever virus (Strain Shi-Min) in Escherichia coli Article published earlier |
| spellingShingle | Клонування та надекспресія фрагмента гена структурного білка El штама Ші-Минь вірусу класичної чуми свиней в Escherichia coli Кириленко, С.Д. Дерябін, О.М. Кириленко, О.Л. Дерябіна, О.Г. Бусол, В.О. |
| title | Клонування та надекспресія фрагмента гена структурного білка El штама Ші-Минь вірусу класичної чуми свиней в Escherichia coli |
| title_alt | Клонирование и суперэкспрессия фрагмента гена структурного белка El штамма Ши-Мынь вируса классической чумы свиней в Escherichia coli Cloning and overexpression of the part of envelope protein El gene of classical swine fever virus (Strain Shi-Min) in Escherichia coli |
| title_full | Клонування та надекспресія фрагмента гена структурного білка El штама Ші-Минь вірусу класичної чуми свиней в Escherichia coli |
| title_fullStr | Клонування та надекспресія фрагмента гена структурного білка El штама Ші-Минь вірусу класичної чуми свиней в Escherichia coli |
| title_full_unstemmed | Клонування та надекспресія фрагмента гена структурного білка El штама Ші-Минь вірусу класичної чуми свиней в Escherichia coli |
| title_short | Клонування та надекспресія фрагмента гена структурного білка El штама Ші-Минь вірусу класичної чуми свиней в Escherichia coli |
| title_sort | клонування та надекспресія фрагмента гена структурного білка el штама ші-минь вірусу класичної чуми свиней в escherichia coli |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154232 |
| work_keys_str_mv | AT kirilenkosd klonuvannâtanadekspresíâfragmentagenastrukturnogobílkaelštamašíminʹvírusuklasičnoíčumisvineivescherichiacoli AT derâbínom klonuvannâtanadekspresíâfragmentagenastrukturnogobílkaelštamašíminʹvírusuklasičnoíčumisvineivescherichiacoli AT kirilenkool klonuvannâtanadekspresíâfragmentagenastrukturnogobílkaelštamašíminʹvírusuklasičnoíčumisvineivescherichiacoli AT derâbínaog klonuvannâtanadekspresíâfragmentagenastrukturnogobílkaelštamašíminʹvírusuklasičnoíčumisvineivescherichiacoli AT busolvo klonuvannâtanadekspresíâfragmentagenastrukturnogobílkaelštamašíminʹvírusuklasičnoíčumisvineivescherichiacoli AT kirilenkosd klonirovanieisuperékspressiâfragmentagenastrukturnogobelkaelštammašimynʹvirusaklassičeskoičumysvineivescherichiacoli AT derâbínom klonirovanieisuperékspressiâfragmentagenastrukturnogobelkaelštammašimynʹvirusaklassičeskoičumysvineivescherichiacoli AT kirilenkool klonirovanieisuperékspressiâfragmentagenastrukturnogobelkaelštammašimynʹvirusaklassičeskoičumysvineivescherichiacoli AT derâbínaog klonirovanieisuperékspressiâfragmentagenastrukturnogobelkaelštammašimynʹvirusaklassičeskoičumysvineivescherichiacoli AT busolvo klonirovanieisuperékspressiâfragmentagenastrukturnogobelkaelštammašimynʹvirusaklassičeskoičumysvineivescherichiacoli AT kirilenkosd cloningandoverexpressionofthepartofenvelopeproteinelgeneofclassicalswinefevervirusstrainshimininescherichiacoli AT derâbínom cloningandoverexpressionofthepartofenvelopeproteinelgeneofclassicalswinefevervirusstrainshimininescherichiacoli AT kirilenkool cloningandoverexpressionofthepartofenvelopeproteinelgeneofclassicalswinefevervirusstrainshimininescherichiacoli AT derâbínaog cloningandoverexpressionofthepartofenvelopeproteinelgeneofclassicalswinefevervirusstrainshimininescherichiacoli AT busolvo cloningandoverexpressionofthepartofenvelopeproteinelgeneofclassicalswinefevervirusstrainshimininescherichiacoli |