Expression and purification of full-length Alanyl-tRNA-synthetase from Thermus thermophilus HB27
Aim. To gain insight into structural and functional properties of alanyl-tRNA,synthetase (AlaRS), we genetically engineered constructs for expression and purification of full-length AlaRS and checked its activity in aminoacylation assays. Methods. The genomic DNA for the AlaS gene from the T. thermo...
Saved in:
| Published in: | Вiopolymers and Cell |
|---|---|
| Date: | 2018 |
| Main Authors: | , , , , , |
| Format: | Article |
| Language: | English |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
2018
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154370 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Expression and purification of full-length Alanyl-tRNA-synthetase from Thermus thermophilus HB27 / M.Yu. Rybak, A.E. Priss, O.I. Gudzera, A.O. Kovalchuk, I.A. Kryklyvyi, M.A. Tukalo // Вiopolymers and Cell. — 2018. — Т. 34, № 6. — С. 435-444. — Бібліогр.: 29 назв. — англ. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1862750674899435520 |
|---|---|
| author | Rybak, M.Yu. Priss, A.E. Gudzera, O.I. Kovalchuk, A.O. Kryklyvyi, I.A. Tukalo, M.A. |
| author_facet | Rybak, M.Yu. Priss, A.E. Gudzera, O.I. Kovalchuk, A.O. Kryklyvyi, I.A. Tukalo, M.A. |
| citation_txt | Expression and purification of full-length Alanyl-tRNA-synthetase from Thermus thermophilus HB27 / M.Yu. Rybak, A.E. Priss, O.I. Gudzera, A.O. Kovalchuk, I.A. Kryklyvyi, M.A. Tukalo // Вiopolymers and Cell. — 2018. — Т. 34, № 6. — С. 435-444. — Бібліогр.: 29 назв. — англ. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Вiopolymers and Cell |
| description | Aim. To gain insight into structural and functional properties of alanyl-tRNA,synthetase (AlaRS), we genetically engineered constructs for expression and purification of full-length AlaRS and checked its activity in aminoacylation assays. Methods. The genomic DNA for the AlaS gene from the T. thermophilus (HB 27 strain) was amplified by PCR and cloned into vectors with and without a histidine tag. To optimize conditions for the protein expression in E. coli and to develop efficient purification procedure, the molecular biology techniques were applied. AlaRS was purified by affinity and size-exclusion chromatography. The molecular weight of enzyme was determined by gel filtration. Results. The expression and purification conditions for recombinant AlaRS were optimized. Approximately 1.5 mg of the pure active recombinant enzyme can be obtained from 1 L of bacterial culture. AlaRS from T. thermophilus is a dimer in solution with an experimental MW of 204 kDa. Conclusions. The purified recombinant enzyme will be used for further studies on the functional kinetics and structure of the crystal complex with tRNA.
Мета. Для детального вивчення структурних та функціональних властивостей аланіл-тРНК-синтетази (АлаРС) було створено генно-інженерну конструкцію для експресії та очищення повнорозмірної синтетази та перевірено її активність у реакції аміноацилювання. Методи. Ген AlaS з T. thermophilus (штам HB27) геномної ДНК ампліфікували за допомогою ПЛР з відповідними праймерами та клонували у вектор з та без гістидинової послідовності. Для оптимізації умов експресії білка в E.coli та розробки ефективної процедури очищення були застосовані сучасні методи молекулярної біології. AлаРС очищали методами афінної хроматографії та гель-фільтрації. Молекулярна маса ферменту визначалася на гель-фільтраційній колонці. Результати. Умови експресії та очистки рекомбінантної АлаРС були оптимізовані. Близько 1,5 мг чистого рекомбінантного активного ферменту можна одержати з 1 л бактеріальної культури. АлаРС з T. thermophilus є димером у розчині з експериментальною масою 204 кДа. Висновки. Отриманий рекомбінантний фермент буде використовуватися для подальших експериментів з функціональної кінетики та структурних досліджень кристалічного комплексу з тРНК.
Цель. Для детального изучения структурных и функциональных свойств аланил-тРНК-синтетазы (АлаРС) было создано генно-инженерную конструкцию для экспрессии и очистки полноразмерной синтетазы и проверено ее активность в реакции аминоацилирования. Методы. Ген аlaS из геномной ДНК T. thermophilus (штамм HB27) амплифицировали с помощью ПЦР с соответствующими праймерами и клонировали в вектор с и без гистидиновой последовательностью. Для оптимизации условий экспрессии белка в E. coli и разработки эффективной процедуры очистки были применены современные методы молекулярной биологии. AлаРС очищали методами аффинной хроматографии и гель-фильтрации. Молекулярная масса фермента определялась на гель-фильтрационной колонке. Результаты. Условия экспрессии и очистки рекомбинантной АлаРС были оптимизированы. Около 1,5 мг чистого рекомбинантного активного фермента можно получить с 1 л бактериальной культуры. АлаРС с T. thermophilus является димером в растворе с экспериментальной массой 204 кДа. Выводы. Полученный рекомбинантный фермент будет использован для дальнейших экспериментов с функциональной кинетики и структурных исследований кристаллического комплекса с тРНК
|
| first_indexed | 2025-12-07T21:07:03Z |
| format | Article |
| fulltext | |
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-154370 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7657 |
| language | English |
| last_indexed | 2025-12-07T21:07:03Z |
| publishDate | 2018 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Rybak, M.Yu. Priss, A.E. Gudzera, O.I. Kovalchuk, A.O. Kryklyvyi, I.A. Tukalo, M.A. 2019-06-15T14:38:54Z 2019-06-15T14:38:54Z 2018 Expression and purification of full-length Alanyl-tRNA-synthetase from Thermus thermophilus HB27 / M.Yu. Rybak, A.E. Priss, O.I. Gudzera, A.O. Kovalchuk, I.A. Kryklyvyi, M.A. Tukalo // Вiopolymers and Cell. — 2018. — Т. 34, № 6. — С. 435-444. — Бібліогр.: 29 назв. — англ. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00098E https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154370 577.217.32 Aim. To gain insight into structural and functional properties of alanyl-tRNA,synthetase (AlaRS), we genetically engineered constructs for expression and purification of full-length AlaRS and checked its activity in aminoacylation assays. Methods. The genomic DNA for the AlaS gene from the T. thermophilus (HB 27 strain) was amplified by PCR and cloned into vectors with and without a histidine tag. To optimize conditions for the protein expression in E. coli and to develop efficient purification procedure, the molecular biology techniques were applied. AlaRS was purified by affinity and size-exclusion chromatography. The molecular weight of enzyme was determined by gel filtration. Results. The expression and purification conditions for recombinant AlaRS were optimized. Approximately 1.5 mg of the pure active recombinant enzyme can be obtained from 1 L of bacterial culture. AlaRS from T. thermophilus is a dimer in solution with an experimental MW of 204 kDa. Conclusions. The purified recombinant enzyme will be used for further studies on the functional kinetics and structure of the crystal complex with tRNA. Мета. Для детального вивчення структурних та функціональних властивостей аланіл-тРНК-синтетази (АлаРС) було створено генно-інженерну конструкцію для експресії та очищення повнорозмірної синтетази та перевірено її активність у реакції аміноацилювання. Методи. Ген AlaS з T. thermophilus (штам HB27) геномної ДНК ампліфікували за допомогою ПЛР з відповідними праймерами та клонували у вектор з та без гістидинової послідовності. Для оптимізації умов експресії білка в E.coli та розробки ефективної процедури очищення були застосовані сучасні методи молекулярної біології. AлаРС очищали методами афінної хроматографії та гель-фільтрації. Молекулярна маса ферменту визначалася на гель-фільтраційній колонці. Результати. Умови експресії та очистки рекомбінантної АлаРС були оптимізовані. Близько 1,5 мг чистого рекомбінантного активного ферменту можна одержати з 1 л бактеріальної культури. АлаРС з T. thermophilus є димером у розчині з експериментальною масою 204 кДа. Висновки. Отриманий рекомбінантний фермент буде використовуватися для подальших експериментів з функціональної кінетики та структурних досліджень кристалічного комплексу з тРНК. Цель. Для детального изучения структурных и функциональных свойств аланил-тРНК-синтетазы (АлаРС) было создано генно-инженерную конструкцию для экспрессии и очистки полноразмерной синтетазы и проверено ее активность в реакции аминоацилирования. Методы. Ген аlaS из геномной ДНК T. thermophilus (штамм HB27) амплифицировали с помощью ПЦР с соответствующими праймерами и клонировали в вектор с и без гистидиновой последовательностью. Для оптимизации условий экспрессии белка в E. coli и разработки эффективной процедуры очистки были применены современные методы молекулярной биологии. AлаРС очищали методами аффинной хроматографии и гель-фильтрации. Молекулярная масса фермента определялась на гель-фильтрационной колонке. Результаты. Условия экспрессии и очистки рекомбинантной АлаРС были оптимизированы. Около 1,5 мг чистого рекомбинантного активного фермента можно получить с 1 л бактериальной культуры. АлаРС с T. thermophilus является димером в растворе с экспериментальной массой 204 кДа. Выводы. Полученный рекомбинантный фермент будет использован для дальнейших экспериментов с функциональной кинетики и структурных исследований кристаллического комплекса с тРНК en Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Вiopolymers and Cell Structure and Function of Biopolymers Expression and purification of full-length Alanyl-tRNA-synthetase from Thermus thermophilus HB27 Експресія та очистка повнорозмірної аланіл-тРНК-синтетази Thermus thermophilus штаму HB27 Экспрессия и очистка полноразмерной аланил-тРНК-синтетазы Thermus thermophilus штамма HB27 Article published earlier |
| spellingShingle | Expression and purification of full-length Alanyl-tRNA-synthetase from Thermus thermophilus HB27 Rybak, M.Yu. Priss, A.E. Gudzera, O.I. Kovalchuk, A.O. Kryklyvyi, I.A. Tukalo, M.A. Structure and Function of Biopolymers |
| title | Expression and purification of full-length Alanyl-tRNA-synthetase from Thermus thermophilus HB27 |
| title_alt | Експресія та очистка повнорозмірної аланіл-тРНК-синтетази Thermus thermophilus штаму HB27 Экспрессия и очистка полноразмерной аланил-тРНК-синтетазы Thermus thermophilus штамма HB27 |
| title_full | Expression and purification of full-length Alanyl-tRNA-synthetase from Thermus thermophilus HB27 |
| title_fullStr | Expression and purification of full-length Alanyl-tRNA-synthetase from Thermus thermophilus HB27 |
| title_full_unstemmed | Expression and purification of full-length Alanyl-tRNA-synthetase from Thermus thermophilus HB27 |
| title_short | Expression and purification of full-length Alanyl-tRNA-synthetase from Thermus thermophilus HB27 |
| title_sort | expression and purification of full-length alanyl-trna-synthetase from thermus thermophilus hb27 |
| topic | Structure and Function of Biopolymers |
| topic_facet | Structure and Function of Biopolymers |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154370 |
| work_keys_str_mv | AT rybakmyu expressionandpurificationoffulllengthalanyltrnasynthetasefromthermusthermophilushb27 AT prissae expressionandpurificationoffulllengthalanyltrnasynthetasefromthermusthermophilushb27 AT gudzeraoi expressionandpurificationoffulllengthalanyltrnasynthetasefromthermusthermophilushb27 AT kovalchukao expressionandpurificationoffulllengthalanyltrnasynthetasefromthermusthermophilushb27 AT kryklyvyiia expressionandpurificationoffulllengthalanyltrnasynthetasefromthermusthermophilushb27 AT tukaloma expressionandpurificationoffulllengthalanyltrnasynthetasefromthermusthermophilushb27 AT rybakmyu ekspresíâtaočistkapovnorozmírnoíalaníltrnksintetazithermusthermophilusštamuhb27 AT prissae ekspresíâtaočistkapovnorozmírnoíalaníltrnksintetazithermusthermophilusštamuhb27 AT gudzeraoi ekspresíâtaočistkapovnorozmírnoíalaníltrnksintetazithermusthermophilusštamuhb27 AT kovalchukao ekspresíâtaočistkapovnorozmírnoíalaníltrnksintetazithermusthermophilusštamuhb27 AT kryklyvyiia ekspresíâtaočistkapovnorozmírnoíalaníltrnksintetazithermusthermophilusštamuhb27 AT tukaloma ekspresíâtaočistkapovnorozmírnoíalaníltrnksintetazithermusthermophilusštamuhb27 AT rybakmyu ékspressiâiočistkapolnorazmernoialaniltrnksintetazythermusthermophilusštammahb27 AT prissae ékspressiâiočistkapolnorazmernoialaniltrnksintetazythermusthermophilusštammahb27 AT gudzeraoi ékspressiâiočistkapolnorazmernoialaniltrnksintetazythermusthermophilusštammahb27 AT kovalchukao ékspressiâiočistkapolnorazmernoialaniltrnksintetazythermusthermophilusštammahb27 AT kryklyvyiia ékspressiâiočistkapolnorazmernoialaniltrnksintetazythermusthermophilusštammahb27 AT tukaloma ékspressiâiočistkapolnorazmernoialaniltrnksintetazythermusthermophilusštammahb27 |